CN111333723B - 针对狂犬病病毒g蛋白的单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了针对狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体及其用途，所述单克隆抗体包含结合狂犬病病毒G蛋白表位的抗原结合片段，并且具有中和狂犬病病毒的活性。

Description

针对狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体及其用途
相关申请
本申请是中国专利申请第201910706710.9号的分案申请，并且要求于2018年8月9日递交的中国专利申请第201810901518.0号的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本申请大体涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，本申请涉及针对狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体及其用途。
背景技术
狂犬病是狂犬病病毒所致的急性传染病，***共患，主要在犬、狼、猫等动物中传播，但是其他哺乳动物如浣熊、臭鼬、蝙蝠和狐狸也是常见的宿主。动物通过互相间的撕咬而传播病毒，人多因被病兽咬伤而感染。目前对于狂犬病尚缺乏有效的治疗手段，人患狂犬病后的病死率几近100％，患者一般在3-6日内因呼吸或循环衰竭而死亡。估计全球每年有超过70000人因该疾病死亡，数百万人需要暴露后治疗。
狂犬病病毒是一种子弹形状的、有包膜的、单链RNA病毒，属于弹状病毒科，狂犬病病毒属。狂犬病病毒的基因组编码5种病毒蛋白质：RNA依赖性RNA聚合酶(L)、核蛋白(N)、磷酸化蛋白质(P)、位于病毒蛋白包膜内侧的基质蛋白(M)及外表面糖蛋白(G)。狂犬病病毒的糖蛋白(G蛋白)能与乙酰胆碱结合，决定了狂犬病病毒的噬神经性。G蛋白(62-67kDa)是由505个氨基酸组成的一种I型糖蛋白，G蛋白形成覆盖病毒粒包膜外表面的突起，研究证实G蛋白能够诱导病毒中和抗体。G蛋白至少有5个中和表位，其中表位II是不连续空间表位，包括34-42位氨基酸残基和198-200位氨基酸残基，表位III位于330-338位，是线性表位，报道的抗体中约97％识别的都是表位II和表位III，狂犬病病毒中和抗体CR4098结合表位III。识别表位I和表位IV的抗体很少，狂犬病病毒中和抗体CR57识别线性表位I，即218-240位，核心结合域是226-231位的KLCGVL。表位IV含251和264位残基。还有一个表位是与表位III间隔3个氨基酸残基与表位III不重叠的微表位a，只有两个氨基酸残基342-343。
针对狂犬病病毒的预防和治疗，WHO建议：III类暴露以及野生动物咬伤的II类以上的暴露，应同时进行主动和被动免疫治疗，以获得快速的保护作用。当前用于主动治疗的狂犬病病毒疫苗的研发比较成熟，且在国内外都有多种狂犬病病毒疫苗上市，用于狂犬病病毒的主动预防。而用于狂犬病病毒暴露后的被动治疗的药物主要是人狂犬病免疫球蛋白(human rabies immune globulin，HRIG)和马狂犬病免疫球蛋白(Equine rabies immuneglobulin，ERIG)。ERIG由于对人体是异源蛋白，有时副反应比较严重，而HRIG价格昂贵，供应量有限并且有潜在的血源性病原体污染的风险，因此临床上需要开发新型的狂犬病病毒被动治疗药物。
1989年，Schumacherl等人制备了多株针对狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白的鼠源单抗，这些用称之为鸡尾酒单克隆抗体疗法，对小鼠及地鼠的保护性实验表明：该方法不仅具有被动免疫后完全抵抗致死剂量狂犬病病毒的攻击能力，还具有暴露后保护作用。1990年Bernhard Dietzschold等人利用细胞融合技术制备了多株人源抗狂犬病病毒单克隆抗体，其中Mab57表现出对狂犬病病毒糖蛋白较高的亲和力，可广泛中和狂犬病病毒并对狂犬病病毒攻击的小鼠起到保护作用。在获得抗狂犬病病毒抗体基因后，使得利用生物反应器来制备人源抗狂犬病病毒单克隆抗体成为可能。在2005年，Goudsmit等人和Bakker研究小组报道了两株人源性抗狂犬病病毒G蛋白的单抗CR57和CR4098。直接混合使用这两株单抗，并与HRIG进行比较，结果表明，混合单抗与HRIG在暴露后预防能力相当，且与多株狂犬病病毒有良好的交叉反应性，证明了重组人源抗狂犬病病毒单抗的实际可用性，甚至可以替代RIG。目前基于两种单抗的药物CL184已经在开展临床研究，并且在临床试验时未发现任何副作用，安全有效，临床上可能代替RIG用于暴露后预防。但正在临床研究的CL184是基于两种单抗的混合制剂，制备成本较高。
新的针对狂犬病病毒G蛋白的双特异抗体的开发和应用是本领域所需要的。
发明概述
第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含结合狂犬病病毒G蛋白不同表位的两个抗原结合片段，并且所述双特异性抗体具有中和狂犬病病毒的活性。
在一些实施方案中，双特异性抗体中的一个抗原结合片段结合狂犬病病毒G蛋白的表位I，另一个抗原结合片段结合狂犬病病毒G蛋白的表位III。
在一些实施方案中，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段包含：
氨基酸序列为RYTIN的HCDR1，氨基酸序列为GIIPIFGTANYAQRFQG的HCDR2，氨基酸序列为ENLDNSGTYYYFSGWFDP的HCDR3，氨基酸序列为TGTSSDIGAYDYVS的LCDR1，氨基酸序列为DATKRPS的LCDR2，氨基酸序列为CSYAGDYTPGVV的LCDR3；或者
氨基酸序列为RYSIN的HCDR1，氨基酸序列为GIIPIFGTANYAQRFQG的HCDR2，氨基酸序列为ENLDNSGTYYYFSGWFDP的HCDR3，氨基酸序列为TGTSSDIDGYDFVS的LCDR1，氨基酸序列为DATKRPS的LCDR2，氨基酸序列为CSYAGDYTPGVV的LCDR3；或者
氨基酸序列为GYTIN的HCDR1，氨基酸序列为GIIPIFGTANYAQRFQG的HCDR2，氨基酸序列为ENLDNSGTYYYFSGWFDP的HCDR3，氨基酸序列为TGTSSDLGGYDFVS的LCDR1，氨基酸序列为DATKRPS的LCDR2，氨基酸序列为CSYAGDYTPGVV的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR氨基酸序列根据Kabat定义。
在一些实施方案中，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段包含：
氨基酸序列为SYGMH的HCDR1，氨基酸序列为TISYDGSIKDYADSVKG的HCDR2，氨基酸序列为GDRTGNLDY的HCDR3，氨基酸序列为RASQNIRNALN的LCDR1，氨基酸序列为DASTRQS的LCDR2，氨基酸序列为QQNSEFPPT的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR氨基酸序列根据Kabat定义。
在一些实施方案中，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；或者
所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；或者
所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示。
在一些实施方案中，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些实施方案中，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；或者
所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；或者
所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些实施方案中，两个抗原结合片段的形式独立地选自单链抗体(scFv)或Fab片段。
在一些实施方案中，结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段为单链抗体(scFv)，结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段为Fab片段。在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:32、33、34之一所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
第二方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的双特异性抗体和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗狂犬病。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体在制备用于预防或治疗狂犬病的药物中的用途。
第四方面，本申请提供了预防或治疗狂犬病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的药物组合物。
附图说明
图1显示ELISA分析全人源单克隆抗体C34m和C11m与灭活狂犬病病毒的结合能力。
图2显示ELISA分析全人源单克隆抗体C34m和C11m对噬菌体-C11m与灭活狂犬病病毒结合的抑制作用。
图3显示ELISA分析全人源单克隆抗体C34m和C11m对噬菌体-C34m与灭活狂犬病病毒结合的抑制作用。
图4显示ELISA分析全人源单克隆抗体C11m和C34m对嵌合抗体CR57-mIgG2a与灭活狂犬病病毒结合的抑制作用。
图5显示ELISA分析全人源单克隆抗体C11m和C34m对嵌合抗体CR4098-mIgG2a与灭活狂犬病病毒结合的抑制作用。
图6显示ELISA分析C11m-scFv-Fc单链抗体Fc融合蛋白、3个C11m-scFv突变体的单链抗体Fc融合蛋白以及全人源单克隆抗体C34m与灭活狂犬病病毒的结合能力。
图7显示ELISA分析C11m-scFv-Fc单链抗体Fc融合蛋白和3个C11m-scFv突变体的单链抗体Fc融合蛋白对嵌合抗体C34m-mIgG2a与灭活狂犬病病毒结合的抑制作用。
图8显示ELISA分析C11m-scFv-Fc单链抗体Fc融合蛋白和3个C11m-scFv突变体的单链抗体Fc融合蛋白对嵌合抗体C11m-mIgG2a与灭活狂犬病病毒结合的抑制作用。
图9显示ELISA分析多种抗狂犬病病毒G蛋白抗体与灭活狂犬病病毒的结合能力。
图10显示ELISA分析双特异性抗体S2E3-scFv-FcH+C34m-IgG1K、单链抗体Fc融合蛋白S2E3-scFv-Fc和全人源单克隆抗体C34m对嵌合抗体C34m-mIgG2a与灭活狂犬病病毒结合的抑制作用。
图11显示ELISA分析双特异性抗体S2E3-scFv-FcH+C34m-IgG1K、单链抗体Fc融合蛋白S2E3-scFv-Fc和全人源单克隆抗体C34m对嵌合蛋白S2E3-scFv-mFc与灭活狂犬病病毒结合的抑制作用。
图12显示ELISA分析抗狂犬病病毒G蛋白抗体C34m和S2E3-scFv-Fc与狂犬病病毒毒株CVS-11的G蛋白突变体的结合能力：图12A为ELISA分析C34m和S2E3-scFv-Fc与融合蛋白GCVS11-CCD-His的结合能力；图12B为ELISA分析C34m和S2E3-scFv-Fc与融合蛋白GCVS11-G229E-CCD-His的结合能力；图12C为ELISA分析C34m和S2E3-scFv-Fc与融合蛋白GCVS11-I338T-CCD-His的结合能力。
序列说明
SEQ ID NO：1显示抗体C34m的重链可变区C34mVH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2显示抗体C11m的重链可变区C11mVH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3显示抗体C34m的轻链可变区C34mVK的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4显示抗体C11m的轻链可变区C11mVL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5显示人(homo sapiens)重链恒定区CH-IgG1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6显示人(homo sapiens)轻链恒定区CK的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7显示人(homo sapiens)轻链恒定区CL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8显示单链抗体C34m-scFv的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9显示单链抗体C11m-scFv的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10显示人(homo sapiens)IgG1的Fc段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11显示鼠(mus musculus)IgG2a的Fc段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15分别显示针对狂犬病病毒G蛋白表位I的单克隆抗体CR57的重链可变区CR57VH和轻链可变区CR57VL氨基酸序列。
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16分别显示针对狂犬病病毒G蛋白表位III的单克隆抗体CR4098的重链可变区CR4098VH和CR4098VK的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14显示鼠(mus musculus)IgG2a重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17显示鼠(mus musculus)轻链恒定区mCL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18显示鼠(mus musculus)轻链恒定区mCK的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19显示含有Knob突变的Fc段(FcK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20显示含有Hole突变的Fc段(FcH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21显示单链抗体C11m-scFv的突变体S1C10-scFv的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22显示单链抗体C11m-scFv的突变体S2A1-scFv的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23单链抗体C11m-scFv的突变体S2E3-scFv的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24和25分别显示单链抗体C11m-scFv的突变体S1C10-scFv的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26和27分别显示单链抗体C11m-scFv的突变体S2A1-scFv的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28和29分别显示单链抗体C11m-scFv的突变体S2E3-scFv的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：30显示C34mVK-CK的氨基酸序列。
SEQ ID NO：31显示C34mVH-IgG1K的氨基酸序列。
SEQ ID NO：32显示单链抗体Fc融合蛋白S2E3-scFv-FcH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33显示单链抗体Fc融合蛋白S1C10-scFv-FcH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：34显示单链抗体Fc融合蛋白S2A1-scFv-FcH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35显示野生型狂犬病病毒(Rabies virus)毒株CVS-11的G蛋白GCVS11的氨基酸序列。
SEQ ID NO：36显示狂犬病病毒毒株CVS-11的G蛋白GCVS11的表位I突变体GCVS11-G229E的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37显示狂犬病病毒毒株CVS-11的G蛋白GCVS11的表位III突变体GCVS11-I338T的氨基酸序列。
SEQ ID NO：38显示人(homo sapiens)冠状蛋白1A的三聚体结构域CCD的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39显示融合蛋白GCVS11-CCD-His的氨基酸序列。
SEQ ID NO：40显示融合蛋白GCVS11-G229E-CCD-His的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41显示融合蛋白GCVS11-I338T-CCD-His的氨基酸序列。
发明详细描述
本申请的发明人通过抗体工程技术得到了新的针对狂犬病病毒的双特异性抗体。在本申请的多个方面，提供了新的针对狂犬病病毒的双特异性抗体，编码所述双特异性抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化该双特异性抗体的方法及所述双特异性抗体的医学和生物学应用。根据本申请提供的双特异性抗体的可变区的序列，可构建全长的双特异性抗体分子作为药物在临床上用于预防或治疗狂犬病。
除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
定义
如本文所用术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。标靶包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。
通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链变异区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链变异区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。
如本文所用术语“双特异性抗体”是具有结合两种不同抗原能力的抗体。例如，双特异性抗体可以由两个Fc片段以及分别与其融合的两个抗原结合部分组成。
如本文所用术语“抗原结合部分”或“抗原结合片段”可互换使用，是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(VH)、轻链变异区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即kabat定义和Chothia定义。(参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)；
A1-Lazikani et al.，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。
对于一般抗体而言，抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab')2片段，其可以是具有两个Fab'片段的二价片段，该两个Fab'片段由铰链区的二硫桥(即Fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；以及(5)(scFv)2，其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合。
在双特异性抗体构建中，“抗原结合部分”包括但不限于Fab片段的形式或单链抗体(scFv)的形式。
如本文所用术语“单链抗体(scFv,single chain fragment variable)”是指一般利用基因工程技术构建的单链结构的抗体，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的一条多肽链。在重链可变区和轻链可变区之间通常会设计一段柔性的连接肽(linker)以便重链可变区和轻链可变区可以折叠成为能够结合抗原的正确构象。
如本文所用术语“Fab(fragment antigen binding)片段”、“Fab部分”或类似的术语是指完整的抗体用木瓜蛋白酶处理后产生的能够与抗原结合的抗体片段，包括完整的轻链(VL-CL)、重链可变区和CH1片段(VH-CH1)。
如本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
如本文所用术语“表位”又称抗原决定簇或抗原决定基(antigenic determinant，AD)，是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。
如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。
在本文给出的核酸序列中涉及兼并碱基(除了A、T、C、G常规碱基之外)的使用，其含义与本领域技术人员通常理解的相同。例如，R代表A或G；Y代表C或T，M代表A或C；K代表G或T；S代表C或G；W代表A或T；H代表A或C或T；B代表C或G或T；V代表A或C或G；D代表A或G或T；N代表A或C或G或T。
第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含结合狂犬病病毒G蛋白不同表位的两个抗原结合片段，并且所述双特异性抗体具有中和狂犬病病毒的活性。
在一些实施方案中，双特异性抗体中的一个抗原结合片段结合狂犬病病毒G蛋白的表位I，另一个抗原结合片段结合狂犬病病毒G蛋白的表位III。
在一些实施方案中，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段包含：
氨基酸序列为RYTIN的HCDR1，氨基酸序列为GIIPIFGTANYAQRFQG的HCDR2，氨基酸序列为ENLDNSGTYYYFSGWFDP的HCDR3，氨基酸序列为TGTSSDIGAYDYVS的LCDR1，氨基酸序列为DATKRPS的LCDR2，氨基酸序列为CSYAGDYTPGVV的LCDR3；或者
氨基酸序列为RYSIN的HCDR1，氨基酸序列为GIIPIFGTANYAQRFQG的HCDR2，氨基酸序列为ENLDNSGTYYYFSGWFDP的HCDR3，氨基酸序列为TGTSSDIDGYDFVS的LCDR1，氨基酸序列为DATKRPS的LCDR2，氨基酸序列为CSYAGDYTPGVV的LCDR3；或者
氨基酸序列为GYTIN的HCDR1，氨基酸序列为GIIPIFGTANYAQRFQG的HCDR2，氨基酸序列为ENLDNSGTYYYFSGWFDP的HCDR3，氨基酸序列为TGTSSDLGGYDFVS的LCDR1，氨基酸序列为DATKRPS的LCDR2，氨基酸序列为CSYAGDYTPGVV的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR氨基酸序列根据Kabat定义。
在一些实施方案中，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段包含：
氨基酸序列为SYGMH的HCDR1，氨基酸序列为TISYDGSIKDYADSVKG的HCDR2，氨基酸序列为GDRTGNLDY的HCDR3，氨基酸序列为RASQNIRNALN的LCDR1，氨基酸序列为DASTRQS的LCDR2，氨基酸序列为QQNSEFPPT的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR氨基酸序列根据Kabat定义。
在一些实施方案中，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；或者
所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；或者
所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示。
在一些实施方案中，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些实施方案中，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；或者
所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；或者
所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示，所述结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些实施方案中，两个抗原结合片段的形式独立地选自单链抗体(scFv)或Fab片段。
在一些实施方案中，结合狂犬病病毒G蛋白的表位I的抗原结合片段为单链抗体(scFv)，结合狂犬病病毒G蛋白的表位III的抗原结合片段为Fab片段。在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:32、33、34之一所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
第二方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的双特异性抗体和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗狂犬病。
在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含下述物质中的一种或多种：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。
在一些实施方案中，可将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。
在一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。
在一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体在制备用于预防或治疗狂犬病的药物中的用途。
第四方面，本申请提供了预防或治疗狂犬病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的药物组合物。
在其他方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面所述的双特异性抗体。在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。
本申请还提供包含编码本申请双特异性抗体的分离的核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。
在其他方面，本申请还提供产生本申请双特异性抗体的方法。在一些实施方案中，产生双特异性抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸。在一些实施方案中，产生双特异性抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收双特异性抗体。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
实施例
实施例1：抗狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体的制备和确认
发明人以灭活的狂犬病病毒为抗原筛选并鉴定出两个具有中和活性的人源性单克隆抗体，分别命名为C11m和C34m，并完成两个单抗C11m和C34m的重链和轻链可变区的序列分析。首先根据C11m和C34m的可变区序列，分别制备抗狂犬病病毒G蛋白全人源单克隆抗体C34m和C11m。具体而言，分别将编码抗体重链可变区C34mVH(SEQ ID NO：1)和抗体轻链可变区C34mVK(SEQ ID NO：3)的基因克隆至融合有编码人重链恒定区CH-IgG1(SEQ ID NO：5)和轻链恒定区CK(SEQ ID NO：6)的基因的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，得到C34m重组抗体表达载体。另外，分别将编码抗体重链可变区C11mVH(SEQ ID NO：2)和抗体轻链可变区C11mVL(SEQ ID NO：4)的基因克隆至融合有编码人重链恒定区CH-IgG1(SEQ ID NO：5)和轻链恒定区CL(SEQ ID NO：7)的基因真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，得到C11m重组抗体表达载体。然后利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin)或其他阳离子转染试剂(如PEI等)分别将制备的C34m重组抗体表达载体和C11m重组抗体表达载体转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F细胞)，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天，然后通过离心等方式收获培养上清。
此外，还制备了抗狂犬病病毒G蛋白的单链抗体Fc融合蛋白
(scFv-Fc)。具体而言，分别在单克隆抗体C34m和C11m的重链可变区和轻链可变区间添加柔性连接肽GGGGSGGGGSGGGGS，构建基于VH-连接肽-VK形式的单链抗体C34m-scFv(SEQ ID NO：8)和C11m-scFv(SEQ ID NO：9)，然后分别将编码单链抗体C34m-scFv和C11m-scFv的基因克隆至融合有编码人IgG1的Fc段(Fc，SEQ ID NO：10)或鼠IgG2a的Fc段(mFc，SEQ ID NO：11)的基因的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，得到单链抗体C34m-scFv-Fc/mFc重组抗体表达载体和单链抗体C11m-scFv-Fc/mFc重组抗体表达载体。利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin)或其他阳离子转染试剂(如PEI等)分别将制备的单链抗体C34m-scFv-Fc/mFc重组抗体表达载体和单链抗体C11m-scFv-Fc/mFc重组抗体表达载体转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天，然后通过离心等方式收获培养上清。
将收获的表达抗狂犬病病毒G蛋白的人IgG1全人源单克隆抗体或单链抗体Fc融合蛋白的培养上清用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组抗体保存缓冲液置换为PBS缓冲液(pH7.0)或者其它合适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。
实施例2：单克隆抗体结合狂犬病病毒G蛋白非竞争性表位的验证
使用制备的灭活狂犬病病毒(采用MRC-5细胞制备)包被96孔ELISA板(1IU/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜。利用封闭液(2％牛奶-PBST缓冲液)在37℃封闭1小时后，分别加入等摩尔浓度起始(200nM)3倍梯度稀释(共8个浓度点)的实施例1中制备的全人源单克隆抗体C34m和C11m，37℃结合1小时。用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入HRP抗人IgG(二抗)，37℃结合1小时。然后用PBST缓冲液洗涤ELISA板，并加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H2SO4溶液终止显色，使用酶标仪在490nm/630nm双波长测定光密度值。ELISA分析结果(图1)显示，全人源单克隆抗体C34m和C11m均能与包被的灭活狂犬病病毒结合，且结合能力相当。
分别将编码全人源单克隆抗体C34m和C11m的重链可变区和轻链可变区的基因克隆至双载体呈现***pADK-S和pAG-S(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例4.1)，制备并纯化呈现单一种类Fab的噬菌体-C34m和噬菌体-C11m，进行滴度测定后冻存于-20℃待用。使用制备的灭活狂犬病病毒(采用MRC-5细胞制备)包被96孔ELISA板(1IU/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜。分别用固定浓度(1×10E12cfu/mL)的噬菌体-C34m和噬菌体-C11m对等摩尔浓度起始(200nM)的实施例1中制备的全人源单克隆抗体C34m和C11m进行3倍梯度稀释(共8个浓度点)，以100μL/孔加入96孔板中，37℃孵育1小时。使用HRP抗M13-IgG(二抗)检测全人源单克隆抗体C34m和C11m分别对噬菌体-C34m和噬菌体-C11m与灭活狂犬病病毒结合能力的抑制作用。ELISA分析结果(图2、图3)显示，全人源单克隆抗体C11m能完全阻断噬菌体-C11m与灭活狂犬病病毒的结合，全人源单克隆抗体C34m不能完全阻断噬菌体-C11m与灭活狂犬病病毒的结合；全人源单克隆抗体C34m能完全阻断噬菌体-C34m与灭活狂犬病病毒的结合，全人源单克隆抗体C11m不能阻断噬菌体-C34m与灭活狂犬病病毒的结合，表明全人源单克隆抗体C34m和C11m与狂犬病病毒毒G蛋白拥有非竞争性结合表位。
实施例3：抗狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体表位的确认
分别克隆编码针对狂犬病病毒G蛋白表位I的单克隆抗体CR57的重链可变区CR57VH(SEQ ID NO：12)和针对狂犬病病毒G蛋白表位III的单克隆抗体CR4098的重链可变区CR4098VH(SEQ ID NO：13)的基因(Bakker,A.B.et al.Novel human monoclonalantibody combination effectively neutralizing natural rabies virus variantsand individual in vitro escape mutants.J.Virol.79,9062–9068；美国专利申请US9005624B2)至融合有编码鼠IgG2a重链恒定区(CH-mIgG2a，SEQ ID NO：14)的基因的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)。克隆编码CR57的轻链可变区CR57VL(SEQ IDNO：15)的基因至融合有编码鼠轻链恒定区mCL(SEQ ID NO：17)的基因的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，以及克隆编码CR4098的轻链可变区CR4098VK(SEQ ID NO：16)的基因至融合有编码鼠轻链恒定区mCK(SEQ ID NO：18)的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，参照实施例1中的方法分别构建CR57的嵌合抗体CR57-mIgG2a和CR4098的嵌合抗体CR4098-mIgG2a。
使用制备的灭活狂犬病病毒(采用MRC-5细胞制备)包被96孔ELISA板(1IU/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜。分别用固定浓度(2.5μg/mL)的嵌合抗体CR57-mIgG2a和CR4098-mIgG2a对等摩尔浓度起始(200nM)的全人源单克隆抗体C11m和C34m进行3倍梯度(共12个浓度点)稀释，以100μL/孔加入96孔板中，37℃孵育1小时。使用HRP抗鼠IgG(二抗)检测全人源单克隆抗体C11m和C34m分别对嵌合抗体CR57-mIgG2a和CR4098-mIgG2a与灭活狂犬病病毒结合能力的抑制作用。ELISA分析结果(图4、图5)显示：全人源单克隆抗体C11m与嵌合抗体CR57-mIgG2a竞争性结合狂犬病病毒G蛋白，但是不与嵌合抗体CR4098-mIgG2a竞争性结合狂犬病病毒G蛋白，表明全人源单克隆抗体C11m特异性结合狂犬病病毒G蛋白表位I。全人源单克隆抗体C34m与嵌合抗体CR4098-mIgG2a竞争性结合狂犬病病毒G蛋白，但是不与嵌合抗体CR57-mIgG2a竞争性结合狂犬病病毒G蛋白，表明全人源单克隆抗体C34m特异性结合狂犬病病毒G蛋白表位III。
实施例4：筛选pI值更合适的C11m-scFv突变体
基于KIH策略的双特异抗体更容易形成异源二聚体，但是在大规模的制备过程中仍然很难完全阻止同源二聚体的形成。离子交换色谱(IEC)是双特异性抗体纯化过程中利用Protein A一步纯化后常用的去除杂质的方法，同源二聚体在离子交换树脂中保留的时间取决于抗体分子的等电点(pI)，因此可以通过改变等电点的方式提高抗体在下游制备过程中的效率。
将实施例1中制备的编码单链抗体C11m-scFv的基因克隆至载体pADscFv-s中(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例1.3)，得到重组表达载体pADscFv-C11m-scFv。利用重叠延伸PCR(overlap PCR)技术，在重组表达载体pADscFv-C11m-scFv的CDR区中引入突变，构建了库容量超过4.6×10E6的C11m-scFv突变体库，其中扩增所需的关键引物如表1所示。将灭活狂犬病病毒(采用MRC-5细胞制备)作为抗原，对C11m-scFv突变体库进行三轮筛选。最后鉴定出3个结合特性提高且预测pI值(http://www.bioinformatics.org/sms2/protein_iep.html)降低的突变体S1C10-scFv(SEQ IDNO：21)、S2A1-scFv(SEQ ID NO：22)、S2E3-scFv(SEQ ID NO：23)，各突变体的pI值如表2所示。
参照实施例1中的方法制备上述3个突变体与人IgG1的Fc段融合的单链抗体Fc融合蛋白(scFv-Fc)：S1C10-scFv-Fc、S2A1-scFv-Fc和S2E3-scFv-Fc。同时制备融合有鼠IgG2a重链恒定区(CH-mIgG2a)和轻链恒定区(mCK)的C34m嵌合抗体C34m-mIgG2a，以及融合有鼠IgG2a重链恒定区(CH-mIgG2a)和轻链恒定区(mCL)的C11m的嵌合抗体C11m-mIgG2a，用于功能分析。参照实施例2和实施例3中的方法，分别对3个C11m-scFv突变体的单链抗体Fc融合蛋白进行结合狂犬病病毒G蛋白能力和非竞争性表位验证。ELISA分析结果如图6、图7和图8所示，表明3个突变体的单链抗体Fc融合蛋白与狂犬病病毒G蛋白的结合能力明显提高，并且和全人源单克隆抗体C34m与狂犬病病毒G蛋白的结合能力相当；C11m-scFv-Fc单链抗体Fc融合蛋白及3个C11m-scFv突变体的单链抗体Fc融合蛋白和C34m-mIgG2a非竞争性结合狂犬病病毒G蛋白表位；C11m-scFv-Fc单链抗体Fc融合蛋白及3个C11m-scFv突变体的单链抗体Fc融合蛋白和C11m-mIgG2a竞争性结合狂犬病病毒毒G蛋白表位。
表1.构建C11m-scFv突变库所需的关键引物
Figure BDA0002428658100000191
Figure BDA0002428658100000201
表2.C11m-scFv及其突变体的pI值
抗体名称 pI值
C11m-scFv 7.38
S1C10-scFv 7.13
S2A1-scFv 6.90
S2E3-scFv 6.90
实施例5：双特异性抗体的制备
将针对狂犬病病毒G蛋白的表位I和表位III的抗原结合片段分别设计成scFv形式和Fab形式，构建基于KIH(Knob-Into-Hole)技术的人IgG1异二聚体，即将Fab形式的C34m抗原结合片段融合在含有Knob突变的Fc段(FcK，SEQ ID NO：19)的N端，将scFv形式的C11m突变体的抗原结合片段(scFv)融合在含有Hole突变的Fc段(FcH，SEQ ID NO：20)的N端，构建基于狂犬病病毒G蛋白的双特异性抗体。
分别将构建的表达S1C10-scFv-FcH、表达C34mVH-IgG1K和表达C34mVK-CK的3个真核表达载体利用脂质体共转染入HEK293F细胞，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天，然后通过离心等方式收获培养上清。培养上清中的双特异性抗体用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行纯化，然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组抗体保存缓冲液置换为PBS缓冲液(pH7.0)或者其它合适的缓冲液。将脱盐后蛋白溶液通过尺寸排阻层析(SEC)使用Superdex200(GE)纯化得到双特异性抗体S1C10-scFv-FcH+C34m-IgG1K。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。
类似地，制备S2A1-scFv-FcH+C34m-IgG1K和S2E3-scFv-FcH+C34m-IgG1K两种双特异性抗体。
实施例6：双特异性抗体功能验证
将制备的灭活狂犬病病毒(采用MRC-5细胞制备)包被96孔ELISA板(1IU/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜。利用封闭液(2％的牛奶-PBST缓冲液)在37℃封闭1小时后，分别加入等摩尔浓度起始(200nM)3倍梯度稀释(共12个浓度点)的抗狂犬病病毒G蛋白双特异性抗体(S1C10-scFv-FcH+C34m-IgG1K、S2A1-scFv-FcH+C34m-IgG1K、S2E3-scFv-FcH+C34m-IgG1K、S1C10-scFv-Fc、S2A1-scFv-Fc、S2E3-scFv-Fc、C11m-scFv-Fc和C34m)，37℃结合1小时。用PBST缓冲液洗涤ELISA板，并加入HRP抗人IgG(二抗)，37℃结合1小时。然后用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H2SO4终止显色，使用酶标仪在490nm/630nm双波长测定光密度值。ELISA分析结果(图9)显示，双特异性抗体与灭活狂犬病病毒的结合能力高于单链抗体Fc融合蛋白以及全人源单克隆抗体C34m与灭活狂犬病病毒的结合能力。
挑选具有较低pI值的单链抗体S2E3-scFv，参照实施例1中方法，构建嵌合蛋白S2E3-scFv-mFc，分别用固定浓度(2.5μg/mL)的C34m-mIgG2a和S2E3-scFv-mFc对等摩尔浓度起始(200nM)的双特异性抗体S2E3-scFv-FcH+C34m-IgG1K、单链抗体Fc融合蛋白S2E3-scFv-Fc和全人源单克隆抗体C34m进行3倍梯度稀释(共12个浓度点)，以100μL/孔加入96孔板中，37℃孵育1小时。HRP抗鼠IgG(二抗)检测结合信号。ELISA分析结果(图10和图11)显示，双特异性抗体S2E3-scFv-FcH+C34m-IgG1K能够抑制嵌合抗体S2E3-scFv-mFc和嵌合抗体C34m-mIgG2a与狂犬病病毒疫苗的结合，即针对狂犬病毒G蛋白的双特异抗体S2E3-scFv-FcH+C34m-IgG1K拥有两个非竞争性的结合表位，能够同时结合狂犬病病毒G蛋白表位I和表位III。
实施例7：基于抗狂犬病病毒中和抗体快速荧光灶抑制实验(RFFIT)进行抗体效价测定
根据抗狂犬病病毒中和抗体快速荧光灶抑制实验(Rapid Fluorescent FocusInhibition Test，RFFIT)，将标准血清(0.5IU/mL)和预稀释的供试抗体(双特异性抗体S2E3-scFv-FcH+C34m-IgG1K、单链抗体Fc融合蛋白S2E3-scFv-Fc和全人源单克隆抗体C34m，10μg/mL)3倍梯度系列稀释，在96孔板中每孔加50μL标准血清或供试抗体，每个样品设置3个重复孔，每孔加入50μL经适当比例稀释的中和用狂犬病病毒。同时设置不加标准血清或供试抗体的孔作为病毒稀释对照孔，设置不加标准血清或供试抗体以及狂犬病毒的孔作为细胞对照孔。37℃孵育1小时，每孔加入50μL BSR细胞(1x10E6个/ml),于37℃，5％CO2培养箱培养。24小时后加入50μL冷丙酮固定30min，然后使用PBST缓冲液洗涤。每孔加入50μL狂犬病病毒荧光抗体工作液，37℃孵育30min。PBS缓冲液洗涤，每孔加入80％甘油，倒置荧光显微镜下进行荧光染色检测，根据Reed-Muench方法计算待测样品效价。
用狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11分别对3种抗体进行检测，实验结果见表3。结果标明，双特异性抗体S2E3-scFv-FcH+C34m-IgG1K、单链抗体Fc融合蛋白S2E3-scFv-Fc和全人源单克隆抗体C34m均具有较好的中和活性。
表3.RFFIT检测各抗体效价
Figure BDA0002428658100000221
Figure BDA0002428658100000231
实施例8：抗狂犬病病毒抗体保护金黄色地鼠避免致死性狂犬病病毒攻击
通过对已注射致死剂量狂犬病病毒的金黄色地鼠进行免疫球蛋白暴露后免疫保护，与商业化产品进行比较，确定各组抗体的保护效果。
使用6.67lgLD50/mL的狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11对金黄色地鼠进行右后腿攻击(0.2ml/只)。并在24小时后在相同部位给予抗狂犬病病毒抗体。按注射剂量IU/kg进行分组，其中将双特异性抗体S2E3-scFv-FcH+C34m-IgG1K按注射剂量5IU/kg、20IU/kg和30IU/kg分为三组；分别将单链抗体Fc融合蛋白S2E3-scFv-Fc、全人源单克隆抗体C34m和商业化来源(同路生物制药有限公司)的人狂犬病病毒免疫球蛋白(简称同路生物免疫球蛋白)按注射剂量5IU/kg和20IU/kg各分为两组；未注射过抗狂犬病病毒抗体的金黄色地鼠作为对照组，共计10组，9只/组。根据金黄色地鼠称重结果用PBS缓冲液对各样品进行稀释，为方便注射，最终每只动物同侧注射量为100μL样品。
实验结果如表4所示：对照组的所有金黄色地鼠都在攻击2周内死于狂犬病，而在治疗组的金黄色地鼠都具有较高的存活率，其中本申请的抗狂犬病病毒抗体的保护效果均不弱于同路生物免疫球蛋白注射液。
表4.金黄色地鼠暴露后保护实验结果
Figure BDA0002428658100000241
实施例9抗狂犬病病毒G蛋白抗体结合表位的确认
为了确定抗狂犬病毒中和性全人源单克隆抗体C34m和C11m-scFv突变体的单链抗体Fc融合蛋白S2E3-scFv-Fc的识别表位，测试狂犬病病毒糖蛋白中和性表位I-III中的氨基酸替换对抗狂犬病病毒G蛋白抗体结合能力的影响。研究证实对狂犬病病毒G蛋白的表位I-III中任一个进行突变，可以使得狂犬病病毒G蛋白的突变表位能够逃逸结合该表位的抗体的识别。本申请选择单点突变对狂犬病病毒毒株CVS-11野生型G蛋白的中和性表位I和表位III进行了氨基酸突变以获得对应逃逸株的氨基酸序列(Novel rabies virus-neutralizing epitope recognized by human monoclonal antibody:fine mapping andescape mutant analysis；Rabies virulence:effect on pathogenicity and sequencecharacterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III ofthe glycoprotein)。利用常规分子生物学方法，PCR扩增得到编码野生型的狂犬病病毒毒株CVS-11的G蛋白GCVS11(SEQ ID NO：35)及其表位I突变体GCVS11-G229E(SEQ ID NO：36)和表位III突变体GCVS11-I338T(SEQ ID NO：37)的胞外区基因，分别在它们的C端融合编码人冠状蛋白1A的三聚体结构域CCD(SEQ ID NO：38)的基因，以保证分泌的糖蛋白更好地形成三聚体，维持它们的天然蛋白构象和免疫原性。将得到的编码狂犬病病毒G蛋白以及两种突变体(G229E和I338T)胞外区与CCD的融合蛋白的基因分别克隆至C端融合有His标签的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin)分别将制备的重组抗原表达载体转染入HEK293细胞，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天，离心过滤收获培养上清。将得到的培养上清利用超滤离心管浓缩约10倍后，放置-80℃备用。
分别用制备的全人源单克隆抗体C34m和单链抗体Fc融合蛋白S2E3-scFv-Fc包被96孔ELISA板(5μg/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜。利用封闭液(2％的牛奶-PBST缓冲液)在37℃封闭1小时后，分别将得到的融合蛋白GCVS11-CCD-His(SEQ ID NO：39)、GCVS11-G229E-CCD-His(SEQ ID NO：40)、GCVS11-I338T-CCD-His(SEQ ID NO：41)浓缩液进行3倍梯度稀释(共11个浓度梯度)，以100μL/孔加入到包被有C34m和S2E3-scFv-Fc的96孔板中，37℃孵育1小时。使用HRP标记的抗His标签抗体(二抗)检测结合信号。
ELISA分析结果(如图12A、12B、12C)显示，C34m和S2E3-scFv-Fc与融合蛋白GCVS11-CCD-His结合的能力相当(图12A)；融合蛋白GCVS11-G229E-CCD-His与S2E3-scFv-Fc的结合能力明显低于与C34m的结合能力(图12B)，表明S2E3-scFv-Fc的结合表位为狂犬病病毒G蛋白表位I；类似地，融合蛋白GCVS11-I338T-CCD-His与C34m的结合能力明显低于与S2E3-scFv-Fc的结合能力(图12C)，表明C34m的结合表位为狂犬病病毒G蛋白表位III。
序列表
<110> 北京智仁美博生物科技有限公司
智翔（上海）医药科技有限公司
重庆智翔金泰生物制药有限公司
<120> 针对狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体及其用途
<150> 201810901518.0
<151> 2018-08-09
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Asp Arg Thr Gly Asn Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Glu Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp
85 90 95
Tyr Thr Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 5
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 7
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 8
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Asp Arg Thr Gly Asn Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
130 135 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Asn Ile Arg Asn Ala Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
165 170 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro
180 185 190
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn
210 215 220
Ser Glu Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 9
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser
130 135 140
Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr Asn Tyr
165 170 175
Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile
180 185 190
Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr
225 230 235 240
Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 10
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 11
<211> 232
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 11
Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile
20 25 30
Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val
50 55 60
Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln
85 90 95
Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val
115 120 125
Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu
145 150 155 160
Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr
165 170 175
Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr
195 200 205
Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys
210 215 220
Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
225 230
<210> 12
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Arg Tyr
20 25 30
Thr Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Leu Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ala Val Ala Gly Thr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 330
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 14
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp
85 90 95
Tyr Thr Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 17
Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Glu Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Val Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro
35 40 45
Val Thr Gln Gly Met Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Met Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu
65 70 75 80
Arg His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
85 90 95
Glu Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser
100 105
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 18
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 19
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 20
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 21
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser
130 135 140
Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ala Tyr Asp Tyr
165 170 175
Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile
180 185 190
Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr
225 230 235 240
Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 22
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser
130 135 140
Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Asp Gly Tyr Asp Phe
165 170 175
Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile
180 185 190
Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr
225 230 235 240
Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 23
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser
130 135 140
Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Leu Gly Gly Tyr Asp Phe
165 170 175
Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile
180 185 190
Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr
225 230 235 240
Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 24
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ala Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp
85 90 95
Tyr Thr Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 26
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Asp Gly Tyr
20 25 30
Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp
85 90 95
Tyr Thr Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 28
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Leu Gly Gly Tyr
20 25 30
Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp
85 90 95
Tyr Thr Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Glu Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Asp Arg Thr Gly Asn Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 32
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Gly Tyr
20 25 30
Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser
130 135 140
Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Leu Gly Gly Tyr Asp Phe
165 170 175
Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile
180 185 190
Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr
225 230 235 240
Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ser
245 250 255
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
260 265 270
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
355 360 365
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 33
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser
130 135 140
Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ala Tyr Asp Tyr
165 170 175
Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile
180 185 190
Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr
225 230 235 240
Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ser
245 250 255
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
260 265 270
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
355 360 365
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 34
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Ser Gly
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser
130 135 140
Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Asp Gly Tyr Asp Phe
165 170 175
Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile
180 185 190
Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr
225 230 235 240
Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ser
245 250 255
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
260 265 270
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
355 360 365
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 35
<211> 440
<212> PRT
<213> 狂犬病病毒(Rabies virus)
<400> 35
Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro
1 5 10 15
Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp
20 25 30
Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val
50 55 60
Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr Thr
65 70 75 80
Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala
85 90 95
Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu
100 105 110
His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val Arg Thr Thr
115 120 125
Lys Glu Ser Leu Ile Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp Leu Asp Pro
130 135 140
Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly Lys Cys Ser
145 150 155 160
Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr Thr
165 170 175
Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Arg Thr Pro Cys Asp Ile Phe
180 185 190
Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Asn Lys Thr Cys Gly
195 200 205
Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Arg
210 215 220
Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp
225 230 235 240
Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln
245 250 255
Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val
260 265 270
Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu
275 280 285
Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu
290 295 300
Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys
305 310 315 320
Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn
325 330 335
Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly Arg Cys His
340 345 350
Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp
355 360 365
Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His
370 375 380
Met Glu Leu Leu Lys Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala
385 390 395 400
Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val
405 410 415
Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly Val Asp Leu
420 425 430
Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr
435 440
<210> 36
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro
1 5 10 15
Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp
20 25 30
Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val
50 55 60
Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr Thr
65 70 75 80
Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala
85 90 95
Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu
100 105 110
His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val Arg Thr Thr
115 120 125
Lys Glu Ser Leu Ile Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp Leu Asp Pro
130 135 140
Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly Lys Cys Ser
145 150 155 160
Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr Thr
165 170 175
Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Arg Thr Pro Cys Asp Ile Phe
180 185 190
Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Asn Lys Thr Cys Gly
195 200 205
Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Arg
210 215 220
Leu Lys Leu Cys Glu Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp
225 230 235 240
Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln
245 250 255
Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val
260 265 270
Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu
275 280 285
Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu
290 295 300
Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys
305 310 315 320
Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn
325 330 335
Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly Arg Cys His
340 345 350
Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp
355 360 365
Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His
370 375 380
Met Glu Leu Leu Lys Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala
385 390 395 400
Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val
405 410 415
Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly Val Asp Leu
420 425 430
Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr
435 440
<210> 37
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro
1 5 10 15
Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp
20 25 30
Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val
50 55 60
Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr Thr
65 70 75 80
Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala
85 90 95
Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu
100 105 110
His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val Arg Thr Thr
115 120 125
Lys Glu Ser Leu Ile Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp Leu Asp Pro
130 135 140
Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly Lys Cys Ser
145 150 155 160
Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr Thr
165 170 175
Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Arg Thr Pro Cys Asp Ile Phe
180 185 190
Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Asn Lys Thr Cys Gly
195 200 205
Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Arg
210 215 220
Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp
225 230 235 240
Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln
245 250 255
Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val
260 265 270
Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu
275 280 285
Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu
290 295 300
Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys
305 310 315 320
Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn
325 330 335
Glu Thr Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly Arg Cys His
340 345 350
Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp
355 360 365
Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His
370 375 380
Met Glu Leu Leu Lys Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala
385 390 395 400
Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val
405 410 415
Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly Val Asp Leu
420 425 430
Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr
435 440
<210> 38
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Val Ser Arg Leu Glu Glu Glu Met Arg Lys Leu Gln Ala Thr Val Gln
1 5 10 15
Glu Leu Gln Lys Arg Leu Asp Arg Leu Glu Glu Thr Val Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 39
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro
1 5 10 15
Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp
20 25 30
Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val
50 55 60
Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr Thr
65 70 75 80
Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala
85 90 95
Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu
100 105 110
His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val Arg Thr Thr
115 120 125
Lys Glu Ser Leu Ile Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp Leu Asp Pro
130 135 140
Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly Lys Cys Ser
145 150 155 160
Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr Thr
165 170 175
Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Arg Thr Pro Cys Asp Ile Phe
180 185 190
Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Asn Lys Thr Cys Gly
195 200 205
Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Arg
210 215 220
Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp
225 230 235 240
Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln
245 250 255
Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val
260 265 270
Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu
275 280 285
Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu
290 295 300
Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys
305 310 315 320
Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn
325 330 335
Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly Arg Cys His
340 345 350
Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp
355 360 365
Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His
370 375 380
Met Glu Leu Leu Lys Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala
385 390 395 400
Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val
405 410 415
Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly Val Asp Leu
420 425 430
Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Arg
435 440 445
Leu Glu Glu Glu Met Arg Lys Leu Gln Ala Thr Val Gln Glu Leu Gln
450 455 460
Lys Arg Leu Asp Arg Leu Glu Glu Thr Val Gln Ala Lys Ala Ser Gly
465 470 475 480
Ala Ala His His His His His His
485
<210> 40
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro
1 5 10 15
Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp
20 25 30
Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val
50 55 60
Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr Thr
65 70 75 80
Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala
85 90 95
Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu
100 105 110
His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val Arg Thr Thr
115 120 125
Lys Glu Ser Leu Ile Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp Leu Asp Pro
130 135 140
Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly Lys Cys Ser
145 150 155 160
Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr Thr
165 170 175
Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Arg Thr Pro Cys Asp Ile Phe
180 185 190
Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Asn Lys Thr Cys Gly
195 200 205
Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Arg
210 215 220
Leu Lys Leu Cys Glu Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp
225 230 235 240
Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln
245 250 255
Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val
260 265 270
Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu
275 280 285
Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu
290 295 300
Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys
305 310 315 320
Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn
325 330 335
Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly Arg Cys His
340 345 350
Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp
355 360 365
Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His
370 375 380
Met Glu Leu Leu Lys Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala
385 390 395 400
Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val
405 410 415
Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly Val Asp Leu
420 425 430
Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Arg
435 440 445
Leu Glu Glu Glu Met Arg Lys Leu Gln Ala Thr Val Gln Glu Leu Gln
450 455 460
Lys Arg Leu Asp Arg Leu Glu Glu Thr Val Gln Ala Lys Ala Ser Gly
465 470 475 480
Ala Ala His His His His His His
485
<210> 41
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro
1 5 10 15
Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp
20 25 30
Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val
50 55 60
Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr Thr
65 70 75 80
Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala
85 90 95
Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu
100 105 110
His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val Arg Thr Thr
115 120 125
Lys Glu Ser Leu Ile Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp Leu Asp Pro
130 135 140
Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly Lys Cys Ser
145 150 155 160
Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr Thr
165 170 175
Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Arg Thr Pro Cys Asp Ile Phe
180 185 190
Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Asn Lys Thr Cys Gly
195 200 205
Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Arg
210 215 220
Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp
225 230 235 240
Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln
245 250 255
Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val
260 265 270
Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu
275 280 285
Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu
290 295 300
Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys
305 310 315 320
Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn
325 330 335
Glu Thr Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly Arg Cys His
340 345 350
Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp
355 360 365
Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His
370 375 380
Met Glu Leu Leu Lys Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala
385 390 395 400
Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val
405 410 415
Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly Val Asp Leu
420 425 430
Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Arg
435 440 445
Leu Glu Glu Glu Met Arg Lys Leu Gln Ala Thr Val Gln Glu Leu Gln
450 455 460
Lys Arg Leu Asp Arg Leu Glu Glu Thr Val Gln Ala Lys Ala Ser Gly
465 470 475 480
Ala Ala His His His His His His
485

Claims (9)

1.抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体，其包含：
氨基酸序列为SYGMH的HCDR1，氨基酸序列为TISYDGSIKDYADSVKG的HCDR2，氨基酸序列为GDRTGNLDY的HCDR3，氨基酸序列为RASQNIRNALN的LCDR1，氨基酸序列为DASTRQS的LCDR2，氨基酸序列为QQNSEFPPT的LCDR3；或者
氨基酸序列为RYTIN的HCDR1，氨基酸序列为GIIPIFGTANYAQRFQG的HCDR2，氨基酸序列为ENLDNSGTYYYFSGWFDP的HCDR3，氨基酸序列为TGTSSDIGAYDYVS的LCDR1，氨基酸序列为DATKRPS的LCDR2，氨基酸序列为CSYAGDYTPGVV的LCDR3；或者
氨基酸序列为RYSIN的HCDR1，氨基酸序列为GIIPIFGTANYAQRFQG的HCDR2，氨基酸序列为ENLDNSGTYYYFSGWFDP的HCDR3，氨基酸序列为TGTSSDIDGYDFVS的LCDR1，氨基酸序列为DATKRPS的LCDR2，氨基酸序列为CSYAGDYTPGVV的LCDR3；或者
氨基酸序列为GYTIN的HCDR1，氨基酸序列为GIIPIFGTANYAQRFQG的HCDR2，氨基酸序列为ENLDNSGTYYYFSGWFDP的HCDR3，氨基酸序列为TGTSSDLGGYDFVS的LCDR1，氨基酸序列为DATKRPS的LCDR2，氨基酸序列为CSYAGDYTPGVV的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR氨基酸序列根据Kabat定义。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：1、24、26或28所示。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：3、25、27或29所示。
4.如权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体，其中
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示。
5.如权利要求4所述的单克隆抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：21、22或23所示的氨基酸序列。
6.抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：2所示的重链可变区和如SEQ ID NO：4所示的轻链可变区。
7.核酸分子，其编码权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体。
8.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体。
9.权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体、权利要求7所述的核酸分子、或者权利要求8所述的药物组合物在制备用于预防或治疗狂犬病的药物中的用途。
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