CN1206362C - 1，3－丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
1，3-丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法，属于1，3-丙二醇的生物合成生产方法技术领域。其特征在于，本发明的二级种子培养是以葡萄糖和甘油为混合双底物，将好氧条件下的二级种子培养和厌氧条件下的甘油厌氧转化集成在同一个发酵罐中进行，并以葡萄糖是否消耗完为好氧到厌氧转换的条件。本发明能够减少工艺步骤，提高设备的利用率，缩短工艺周期而不影响1，3-丙二醇最终的浓度，还避免了***转换所造成的感染杂菌的机会。
Description
技术领域：
1，3-丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法，涉及到1，3-丙二醇的生产技术领域，尤其涉及到1，3-丙二醇的生物合成生产方法技术领域。
背景技术：
1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-PD)是一种重要的化工原料，除象其他二元醇一样可以用做溶剂外，主要用做合成聚酯、聚氨酯的单体，以1，3-PD为单体生产的聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)是一种新型聚酯材料，具有易染色、弹性好、优良的柔软性、悬垂性、低静电、可生物降解等优点，主要用于生产纤维和纺织品，如地毯、袜裤、运动服等。目前工业上主要采用化学合成法和生物合成法来进行1，3-丙二醇的生产，化学合成法具有设备投资大、技术难度高、需要重金属催化剂、污染环境、原料不可再生等缺点，因此，各国都致力于开发生物法生产1，3-PD的技术。生物合成法主要是在生物催化剂的作用下，将甘油转化为1，3-丙二醇，目前，可用于1，3-丙二醇的生物合成生产方法的微生物主要有：Klebsiella、Citrobacter、Clostridium、Ilyobacter、Lactobacilllus、Enterobatcer等属，其中研究最多的是Klebsiella pneumoniae(克氏肺炎杆菌)、Citrobacter freundii(弗氏柠檬菌)和Clostridiumbutyricum(丁酸梭状芽孢菌)。其中克氏肺炎杆菌和弗氏柠檬菌属于兼性厌氧菌，兼性厌氧菌在好氧条件下生长更快。
目前，利用兼性厌氧菌作为生物催化剂将甘油转化为1，3丙二醇的工艺步骤主要为：(以发酵液4L为例)：1、种子活化(24小时)；2、在好氧条件下进行一级种子培养，碳源为甘油或葡萄糖(体积50ml，12小时)；3、在好氧条件下进行二级种子培养，碳源为甘油或葡萄糖(体积500ml，12小时)，这一阶段主要是对种子进行扩大培养，使菌种达到一定的规模，为下一步甘油转化创造更好的初始条件；4、厌氧发酵阶段(体积4L，60小时)，底物为甘油，该阶段是在厌氧条件下将甘油转化为1，3-丙二醇，作为生物催化剂的菌体也同时以甘油为碳源进行生长。在上述步骤中，好氧条件下种子的二级培养与下一步的甘油厌氧转化是分别在两个***中进行，这样使发酵周期加长，设备的利用率降低，同时增加操作步骤，并且在从一个***转入另一个***的过程中，增加了感染杂菌的机会，为后续工艺带来不利影响。
发明内容：
本发明的目的在于，克服了现有技术的上述缺点，提出了一种1，3-丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法，该方法以葡萄糖和甘油为混合双底物，将种子在好氧条件下的二级培养和甘油的厌氧转化集成在一个装置中进行，减少了工艺步骤，提高了设备的利用率，也使菌体好氧培养的时间大大缩短，即缩短了发酵的周期，又不影响1，3-丙二醇最终的浓度；由于没有***转换的过程，还减少了感染杂菌的机会，
本发明依次含有以下步骤：
克氏肺炎杆菌的种子活化；
在好氧条件，以葡萄糖为碳源进行一级种子培养；
在好氧条件，以葡萄糖为碳源进行二级种子培养；
在厌氧条件下，以上述克氏肺炎杆菌菌体为生物催化剂，将甘油转化为1，3-丙二醇；
其特征在于，上述二级种子培养以葡萄糖和甘油为混合双底物，将上述好氧条件下的二级种子培养和厌氧条件下的甘油转化集成在同一个发酵罐中进行，并以葡萄糖是否消耗完为好氧到厌氧转换的条件，它含有以下步骤：
(1)克氏肺炎杆菌的种子活化；
(2)以葡萄糖为碳源，在好氧条件下进行一级种子培养；
(3)将含有葡萄糖和甘油的集成发酵培养基装入发酵罐中，将经过上述一级种子培养的克氏肺炎杆菌的种子接入发酵罐中，形成集成发酵液；在35℃～38℃温度下，通入空气，进行搅拌，开始进行以葡萄糖为主要碳源的菌体好氧培养；
(4)当上述集成发酵液中的葡萄糖消耗完时，停止通入空气，加入甘油和硫酸铵；在35℃～38℃温度下，通入氮气，进行搅拌，转入厌氧条件下的将甘油转换为1，3-丙二醇的阶段；在该过程中需要补加甘油以保持甘油的浓度，保证有足够的甘油进行转换；该过程伴随有副产物乙醇、乙酸和乳酸生成；
(5)当菌体不再生长时，工艺过程结束。
在上述集成发酵过程的第(3)步中，所述集成发酵培养基中葡萄糖和甘油的含量比为1∶0.8～1∶1.2。在上述集成发酵过程的第(3)步中，空气的通气比为0.3vvm～1.0vvm。在上述集成发酵过程的第(4)步中，氮气的通气比为0.3vvm～1.0vvm。在上述集成发酵过程的第(4)步中，通过补加甘油，使甘油的浓度保持在10g/L～20g/L之间。在上述集成发酵过程的第(4)步中，当副产物乙醇的含量达到或超过2g/L时，增加氮气通气比，增加搅拌转数。
实验证明，利用本发明所提出的1，3-丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法，能够减少工艺步骤，提高设备的利用率，缩短工艺周期而不影响1，3-丙二醇最终的浓度，还避免了***转换所造成的感染杂菌的机会。
具体实施方式：
选择兼性厌氧的克氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)作为生产菌种。
实验1：
培养基的配方：
LB固体培养基：每升体积培养基含酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，pH7.0。
种子培养基：每升体积培养基含葡萄糖20g，K2HPO4.3H2O 4.45g，KH2PO4，1.3g，(NH4)2SO4
2.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，CaCO3 2.0g，酵母粉1.0g，微量元素溶液I 2.0ml，
Fe2+溶液1.0ml，pH7.0。
集成发酵培养基：每升体积培养基含葡萄糖2.5g，甘油2.0g(葡萄糖和甘油比为1∶0.8)，
K2HPO4.3H2O 4.45g，KH2PO4，1.3g，(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，
CaCl2.2H2O 0.02g/L，酵母粉1.0g，微量元素溶液I 2.0ml，Fe2+溶液
1.0ml，pH7.0。
其中，上述微量元素I的组成(mg/L)：MgSO4.4H2O 100，ZnCl2 70，Na2MoO4.2H2O 35，H3BO360，CoCl2.6H2O 200，CuSO4.5H2O 29.28，NiCl2.6H2O 25，37％HCl 0.9ml
实验步骤：
1)种子活化：由菌种保藏斜面挑取一环Klebsiella pneumoniae菌苔接入LB固体斜面进行活化，37℃培养12小时后，再挑取一环菌苔接入固体LB平板，37℃培养12小时后获得单菌落。
2)好氧条件下的种子一级培养：从步骤1)的LB平板上挑取一个单菌落，接入300ml摇瓶培养，装液量50ml，37℃，搅拌转数150rpm，培养12h。
3)两段双底物集成发酵种子好氧培养阶段：
将4L预先灭菌的集成发酵培养基装入发酵罐中，将第2)步得到的种子液接入发酵罐中，在37℃下，进行搅拌，搅拌转数为400rpm，通入空气，通气比为0.3vvm，加入4N NaOH来调节混合发酵液的酸碱度为中性。在该过程中，通过用生物传感器来检测葡萄糖的含量，当葡萄糖的含量为0时说明葡萄糖已消耗完，此时菌体的OD值为1.5，已达到了甘油厌氧转化对菌体生物量的要求，这时转入下一阶段。本阶段所用的时间为2.5小时。
4)两段双底物集成发酵厌氧转化阶段：
这一阶段停止通入空气，补加甘油至20g/L，同时补加硫酸铵至4g/L以补充氮源。然后通入氮气，通气比为0.3vvm，在37℃下，进行搅拌，搅拌转数为400rpm，并以加入4N NaOH来调节混合发酵液的酸碱度为中性。在这一过程中，通过用高效液相色谱仪(HPLC)检测甘油的浓度，使其浓度保持在10g/L～20g/L之间，当甘油的浓度低于10g/L时，补加甘油，使其浓度达到20g/L，以保证有足够的甘油转化为1，3-丙二醇。转入厌氧条件后4小时左右，开始有1，3-丙二醇生成，同时也伴随有副产物乙酸、乙醇和乳酸生成。整个过程随着甘油的不断加入，菌体和1，3丙二醇的浓度也在不断增加。
5)当菌体的生物量(OD)达到7.4时，不再有菌体生成，也不再有甘油转化为1，3-丙二醇，工艺过程结束，所用的时间为55.5小时，此时测得1，3-丙二醇的浓度为54.23g/L。
以下5组实验在没有改变其它步骤和工艺条件的前提下，分别改变了集成发酵培养基中葡萄糖和甘油的含量比例，改变了空气和氮气的通气比，实验结束后，得到表1中所示的数据，表1中最终产品浓度指的1，3-丙二醇的浓度。
| 组别 | 种子好氧培养 | 甘油厌氧转化 | ||||||||
| 葡萄糖和甘油比例 | 空气通气比(vvm) | 搅拌转度(rpm) | 菌体浓度(OD) | 培养时间(h) | 氮气通气比(vvm) | 搅拌转度(rpm) | 菌体浓度(OD) | 转化时间(h) | 最终产品浓度(g/L) | |
| 1 | 1∶0.8 | 0.5 | 400 | 1.5 | 2.5 | 0.5 | 400 | 7.4 | 55.5 | 54.23 |
| 2 | 1∶1 | 0.5 | 400 | 1.6 | 2.8 | 0.5 | 400 | 9.3 | 56 | 61.2 |
| 3 | 1∶1.2 | 0.5 | 400 | 1.8 | 3 | 0.5 | 400 | 8.6 | 57 | 60.8 |
| 4 | 1∶1 | 0.3 | 400 | 1.5 | 3.5 | 0.3 | 400 | 8.4 | 57 | 57.2 |
| 5 | 1∶1 | 0.8 | 400 | 1.7 | 2.7 | 0.8 | 400 | 7.8 | 55.2 | 63.8 |
| 6 | 1∶1 | 1.0 | 400 | 1.75 | 2.6 | 1.0 | 400 | 8.8 | 56 | 64.1 |
表1
从表1所示的6组实验可知，集成发酵过程的种子好氧培养阶段结束时，所消耗的时间仅为2～3.5小时，跟传统方法(培养相同生物量的菌种，所需时间12h，)相比时间大大缩短。
从实验1，2，3可知，当集成发酵培养基中，葡萄糖和甘油的含量比为1∶(0.8～1.2)时[即在集成发酵培养基中，每升培养基分别含(葡萄糖2.5g，甘油2.0g)、(葡萄糖2.5g，甘油2.5g)、(葡萄糖2.5g，甘油3g)]，以葡萄糖为碳源所生成的菌体在达到甘油转换所需的生物量时，葡萄糖刚好消耗完，不会遗留在甘油厌氧转化阶段，对甘油的转化产生抑制作用。
在甘油厌氧转化过程中，会伴随有副产物乙醇、乙酸和乳酸生成，乙醇的存在会对发酵液产生毒副作用，对菌体和1，3-丙二醇的生成不利。因此，在与第2个实验的其它条件相同的情况下，在集成发酵过程的甘油厌氧转化过程中，当乙醇的浓度达到2g/L时，增加氮气的通气比到0.8vvm，增加搅拌速度到500rpm，当工艺过程结束时，测得菌体的生物量为9.4，1，3-丙二醇的浓度为68.7g/L，说明适当的增加氮气的通气比，加快搅拌速度，可以使乙醇充分挥发，有利于菌体生长和1，3-丙二醇的转化。氮气通气比的增加应当不超过1.0vvm；搅拌速度的增加也应当不超过500rpm(在常规范围内)。
在本发明的两段双底物集成发酵法生产1，3-丙二醇的过程中，集成发酵阶段的温度和搅拌转数都是常规范围，温度选择可以在常规范围35℃～38℃内，搅拌速度可以选择在常规范围200～500rpm内。用于调节酸碱度可以选择其它的碱溶液，如氢氧化钾、氨水等。另外，在好氧阶段空气的通气比和厌氧阶段氮气的通气比可以不相等，只要二者均在0.3～1.0vvm范围内。
通过上述实验可以证明，本发明所提出的1，3-丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法，减少了工艺步骤，提高了设备的利用率，使菌体好氧培养的时间大大缩短，即缩短了发酵的周期，又不影响1，3-丙二醇最终的浓度；由于没有***转换的过程，还减少了感染杂菌的机会。
Claims (6)
1、1，3-丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法，依次含有以下步骤：
克氏肺炎杆菌的种子活化；
在好氧条件，以葡萄糖为碳源进行一级种子培养；
在好氧条件，以葡萄糖为碳源进行二级种子培养；
在厌氧条件下，以上述克氏肺炎杆菌菌体为生物催化剂，将甘油转化为1，3-丙二醇；
其特征在于，上述二级种子培养以葡萄糖和甘油为混合双底物，将上述好氧条件下的二级种子培养和厌氧条件下的甘油转化集成在同一个发酵罐中进行，并以葡萄糖是否消耗完为好氧到厌氧转换的条件，它含有以下步骤：
(1)克氏肺炎杆菌的种子活化；
(2)以葡萄糖为碳源，在好氧条件下进行一级种子培养；
(3)将含有葡萄糖和甘油的集成发酵培养基装入发酵罐中，将经过上述一级种子培养的克氏肺炎杆菌的种子接入发酵罐中，形成集成发酵液；在35℃～38℃温度下，通入空气，进行搅拌，开始进行以葡萄糖为主要碳源的菌体好氧培养；
(4)当上述集成发酵液中的葡萄糖消耗完时，停止通入空气，加入甘油和硫酸铵；在35℃～38℃温度下，通入氮气，进行搅拌，转入厌氧条件下的将甘油转换为1，3-丙二醇的阶段；在该过程中需要补加甘油以保持甘油的浓度，保证有足够的甘油进行转换；该过程伴随有副产物乙醇、乙酸和乳酸生成；
(5)当菌体不再生长时，工艺过程结束。
2、如权利要求1所述的1，3-丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法，其特征在于，在上述集成发酵过程的第(3)步中，所述集成发酵培养基中葡萄糖和甘油的含量比为1∶0.8～1∶1.2。
3、如权利要求1所述的1，3-丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法，其特征在于，在上述集成发酵过程的第(3)步中，空气的通气比为0.3vvm～1.0vvm。
4、如权利要求1所述的1，3-丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法，其特征在于，在上述集成发酵过程的第(4)步中，氮气的通气比为0.3vvm～1.0vvm。
5、如权利要求1所述的1，3-丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法，其特征在于，在上述集成发酵过程的第(4)步中，通过补加甘油，使甘油的浓度保持在10g/L～20g/L之间。
6、如权利要求1所述的1，3-丙二醇的两段双底物集成发酵生产方法，其特征在于，在上述集成发酵过程的第(4)步中，当副产物乙醇的含量达到或超过2g/L时，增加氮气通气比，增加搅拌转数。
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