CN101195837B - 一种发酵法生产1,3-丙二醇的连续发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种发酵法生产1，3-丙二醇的连续发酵方法。工艺过程为：将经过培养的种子液加入发酵培养基中，发酵培养基的甘油浓度为5-100g/l，葡萄糖的浓度为1-15g/l，pH值为5-8，发酵温度为25-40℃；发酵罐里通入0.05-1.0vvm的空气或者氮气，搅拌转速为5-500rpm；按照时间间隔安排2或2批次以上的连续发酵，第一批次发酵后，按正常的控制进行发酵，在发酵液中菌体的浓度达到一定的浓度，并以此类推连续接种N批次发酵。本发明在发酵过程中可以根据需要，进行连续的发酵生产，不需要进行单独的种子培养，减少了生产工序，降低了生产成本；同时也可以根据不同时段要求对于发酵用菌种提取产生不同的抗综合产物抑制的菌种。
Description
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种微生物发酵法生产1，3-丙二醇的发酵工艺。
技术背景：
1，3-丙二醇可以用作单体生成聚酯的材料，也可以生产其它一些生物可降解的聚酯材料。目前1，3-丙二醇仍然存在化学合成的方法和微生物发酵法两种方法，但是由于化学合成法危险性高，越来越多的人关注微生物发酵法，微生物发酵法的优点是发酵条件温和、操作简便、副产物少、环境污染小。
目前少量的能够生产1，3-丙二醇的企业和高等院校一般采取的是正常的发酵方式，即一次接种对应一次完整的发酵。这种方法生产的成功率较高。但每一次完整的发酵需要一次的种子培养，生产工序复杂，生产成本高。不适宜连续化流程生产。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种发酵法生产1，3-丙二醇的连续发酵方法。以连续发酵的方式降低生产成本和对发酵用菌体的定向诱变。本发明在发酵过程中可以根据需要，进行连续的发酵生产，不需要进行单独的种子培养，减少了生产工序，降低了生产成本；同时也可以根据不同时段要求对于发酵用菌种提取产生不同的抗综合产物抑制的菌种。
本发明的工艺过程为：
将经过培养的种子液加入发酵培养基中，发酵培养基的甘油浓度为5-100g/l，葡萄糖的浓度为1-15g/l，pH值为5-8，发酵温度为25-40℃；发酵罐里通入0.05-1.0vvm的空气或者氮气，搅拌转速为5-500rpm；按照时间间隔安排2或2批次以上的连续发酵，第一批次发酵后，按正常的控制进行发酵，在发酵液中菌体的浓度达到一定的浓度，即发酵开始8小时到发酵终了结束之前时段内，选取任意的时间将发酵液的1-40％转种到另外一个已经过灭菌的第二批次的发酵培养基中进行生产发酵，同时第一批次的剩余的发酵液补足培养基继续进行发酵生产。同样，第二批次的发酵液可以同第一批次的发酵液一样，取定量的发酵液转接到第三批次。并以此类推连续接种N批次发酵。
每一批次的发酵进行超过20小时至发酵结束，菌种处于发酵末期，其生长和代谢处于下降阶段。此时发酵液中高产物浓度，以及死亡菌体遗留下来的大量蛋白，对能够存活的菌种定向诱变和保存。存活的菌种可用于以继续发酵生产。
本发明所述的经过培养的种子液菌种包括：克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiella pneumoniae；克雷伯氏产酸杆菌Klebsiella oxytoca；丁酸梭菌Clostridium btyricu。
本发明所述的发酵方式可用于连续发酵和批次发酵，适用于机械搅拌罐、气升发酵罐等可用于液体发酵的容器。
本发明所述的连续接种N批次发酵的N是5批次。
本发明的有益效果为：发酵过程中仅需要一次的种子培养，能够进行多批次的连续发酵，减少了生产工序，降低了生产成本。同时也菌种的定向诱变以及保存提供了一种可行的方法。
具体实施方式
实施例1
(1)菌种：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)；
(2)发酵方式：机械搅拌罐，连续流加发酵；
(3)发酵过程：装液量为发酵罐的70％，发酵的温度控制在25-40℃，pH通过氢氧化钠或氢氧化钾控制在6.86。发酵的初始培养基中含甘油25g/l，葡萄糖10g/l，通入无菌空气。正常发酵至10小时后，选取5％发酵液转节到另一已经灭好菌的发酵容器中发酵，本发酵不停止，补足发酵培养基继续进行。第二次接种的发酵进行正常发酵，在其10小时时同第一次接种方式，接种到第三个已经灭好菌的发酵容器中，第二次接种的发酵补足发酵培养基继续发酵，第三个发酵罐的发酵正常发酵至发酵结束。同时在第三次接种的过程中选取菌种保留，进行复壮后，上发酵罐验证保存。
(4)发酵结果：32小时，第一个发酵罐1，3-丙二醇浓度70.15g/l，第二个发酵罐1，3-丙二醇浓度69.06g/l，第三个发酵罐1，3-丙二醇浓度67.81g/l，均达到了高产的目的。证明此方法可以进行发酵生产。
实施例2：
(1)菌种：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)；
(2)发酵方式：机械搅拌罐，连续流加发酵；
(3)发酵过程：装液量为发酵罐的70％，发酵的温度控制在37℃，pH通过氢氧化钠或氢氧化钾控制在5-8。发酵的初始培养基中含甘油25g/l，葡萄糖10g/l，通入无菌空气。正常发酵至10小时后，选取40％发酵液转节到另一已经灭好菌的发酵容器中发酵，本发酵不停止，补足发酵培养基继续进行。第二次接种的发酵进行正常发酵，在其10小时时同第一次接种方式，接种到第三个已经灭好菌的发酵容器中，第二次接种的发酵补足发酵培养基继续发酵，第三个发酵罐的发酵正常发酵至发酵结束。同时在第三次接种的过程中选取菌种保留，进行复壮后，上发酵罐验证保存。
(4)发酵结果：32小时，第一个发酵罐1，3-丙二醇浓度71.24g/l，第二个发酵罐1，3-丙二醇浓度71.31g/l，第三个发酵罐1，3-丙二醇浓度68.24g/l，均达到了高产的目的。证明此方法可以进行发酵生产。
实施例3：
(1)菌种：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)；
(2)发酵方式：机械搅拌罐，连续流加发酵；
(3)发酵过程：装液量为发酵罐的70％，发酵的温度控制在37℃，pH通过氢氧化钠或氢氧化钾控制在6.86。发酵的初始培养基中含甘油5-100g/l，葡萄糖10g/l，通入无菌空气。正常发酵至10小时后，选取20％发酵液转节到另一已经灭好菌的发酵容器中发酵，本发酵不停止，补足发酵培养基继续进行。第二次接种的发酵进行正常发酵，在其10小时时同第一次接种方式，接种到第三个已经灭好菌的发酵容器中，第二次接种的发酵补足发酵培养基继续发酵，第三个发酵罐的发酵正常发酵至发酵结束。同时在第三次接种的过程中选取菌种保留，进行复壮后，上发酵罐验证保存。
(4)发酵结果：32小时，第一个发酵罐1，3-丙二醇浓度70.33g/l，第二个发酵罐1，3-丙二醇浓度68g/l，第三个发酵罐1，3-丙二醇浓度64.32g/l，均达到了高产的目的。证明此方法可以进行发酵生产。
实施例5
(1)菌种：克雷伯氏产酸杆菌Klebsiella oxytoca；
(2)发酵方式：机械搅拌罐，连续流加发酵；
(3)发酵过程：同上。
实施例6
(1)菌种：丁酸梭菌Clostridium btyricu；
(2)发酵方式：机械搅拌罐，连续流加发酵；
(3)发酵过程：同上。
本发明曾连续接种5批次发酵均成功。在整个可以进行连续发酵的过程中可以分为三段过程，都具有不同的意义：
(1)随着第一批次发酵的进行，菌体生长到8-12小时的时候，在这个时期的转接延续第二批次的发酵，称为第一阶段。这一阶段菌体以生长为主，和由发酵摇瓶接种发酵罐具有等同的作用。
(2)第一批次的发酵进行超过12小时，到20小时左右，在这个时期的转接称为第二阶段。这一阶段的菌体主要是以代谢产生目的产物为主，属于代谢旺盛时期，在这个时候转种，能够减少菌体在新发酵罐中的适应时间，能够达到提高产率的目的。
(3)第一批次的发酵进行超过20小时至发酵结束，在这个时期的转接称为第三阶段。这一阶段的菌种处于发酵末期，其生长和代谢均处于下降阶段。但是其独特的优势在于，此时发酵液中高产物浓度，以及死亡菌体遗留下来的大量蛋白，对于能够存活的菌种起着定向诱变的作用。一旦存活的菌种可以继续发酵生产，那么该菌种具有耐受高产物浓度和蛋白抑制的能力，这也是菌种诱变的方法之一。此阶段最大优点在于可以进行菌种的诱变和保存。
Claims (2)
1.一种发酵法生产1，3-丙二醇的连续发酵方法，其特征在于所述的工艺过程为：
将经过培养的种子液加入发酵培养基中，发酵培养基的甘油浓度为5-100g/l，葡萄糖的浓度为1-15g/l，pH值为5-8，发酵温度为25-40℃；发酵罐里通入0.05-1.0vvm的空气或者氮气，搅拌转速为5-500rpm；按照时间间隔安排2或2批次以上的连续发酵，第一批次发酵后，按正常的控制进行发酵，在发酵液中菌体的浓度达到一定的浓度，即发酵开始8小时到发酵终了结束之前时段内，选取任意的时间将发酵液的1-40％转种到另外一个已经过灭菌的第二批次的发酵培养基中进行生产发酵，同时第一批次的剩余的发酵液补足培养基继续进行发酵生产；同样，第二批次的发酵液可以同第一批次的发酵液一样，取定量的发酵液转接到第三批次；并以此类推连续接种N批次发酵；每一批次的发酵进行超过20小时至发酵结束，菌种处于发酵末期，其生长和代谢处于下降阶段；此时发酵液中高产物浓度，以及死亡菌体遗留下来的大量蛋白，对能够存活的菌种定向诱变和保存；存活的菌种用于继续发酵生产；
其中，经过培养的种子液的菌种是：克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiella pneumoniae或克雷伯氏产酸杆菌Klebsiella oxytoca。
2.如权利要求1所述的一种发酵法生产1，3-丙二醇的连续发酵方法，其特征在于所述的连续接种N批次发酵的N批次是5批次。
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