CN115369130A - 基于辅因子调控发酵生产1,3-丙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于辅因子调控发酵生产1,3‑丙二醇的方法，通过发酵肺炎克雷伯菌生产1,3‑丙二醇，在发酵培养的培养基中添加核黄素；或利用肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌混菌发酵生产1,3‑丙二醇。本发明通过发酵条件优化和核黄素调节策略，提高肺炎克雷伯菌生产1,3‑丙二醇的产量和收率，并减少了副产物和生成，此外，本发明发现肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌可实现混菌发酵，肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌的混菌发酵和单添加核黄素对1,3‑丙二醇产量的提高效果接近，但更大程度的降低了副产物的产量，为1,3‑丙二醇的工业化生产带来巨大的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及基于辅因子调控发酵生产1,3-丙二醇的方法。
背景技术
1,3-丙二醇（1,3-PDO）是一种多用途的化学原料，可用于合成聚酯、聚氨酯、聚醚和杂环化合物，并且广泛用于食品、药品、化妆品和生物可降解塑料领域。例如，1,3-丙二醇可以作为单体用于合成一种新型聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT），由于其具有出色的性能和广泛的应用，因此具有广阔的市场前景。
1,3-丙二醇的化学合成方法主要有两种：一种是环氧乙烷被加氢甲酰化成3-羟基丙醛（3-HPA），进而催化加氢生成1,3-丙二醇。另一中是丙烯醛通过水合反应转化为 3-羟基丙醛，然后通过催化加氢进一步转化为1,3-丙二醇。这些化学催化过程需要昂贵的催化剂，并会有有毒中间产物的产生。与化学合成方法相比，生物发酵方法可采用可再生资源（甘油、葡萄糖等）来生产 1,3-丙二醇，通常在温和且环境友好的条件下进行。其中甘油作为生物柴油生产过程的副产品，随着生物柴油市场的不断发展，甘油的产量也得到较大提升。1,3-丙二醇的高价值和甘油市场的过剩使得生物法利用甘油合成1,3-丙二醇成为研究热点。迄今为止，已有一系列微生物被报道从甘油、葡萄糖和其他原料中生产1,3-PDO，包括克雷伯菌、梭状芽孢杆菌、柠檬酸杆菌、肠杆菌等。其中，克雷伯菌因其明确的遗传背景和优良的甘油利用能力而备受关注，显示出大规模生产1,3-PDO的潜力。然而，生物法生产1,3-PDO存在还原力不足和副产物多的问题。从甘油还原代谢途径来看，由甘油合成的1,3-PDO的每个分子需要两个NADH分子。因此，由甘油生产1,3-PDO的经典厌氧发酵工艺受到NADH含量的限制。在肺炎克雷伯菌中，通过甘油还原代谢合成1,3-PDO所需的NADH主要在甘油氧化为丙酮酸的过程中再生。丙酮酸在细胞中进一步转化为2,3-丁二醇（2,3-BDO）、乳酸、乙醇、乙酸等副产物。该过程将竞争性消耗甘油和NADH，从而影响1,3-PDO的效价和产量。同时副产物的形成不仅会导致碳损失，还会对微生物细胞有毒并抑制其生长。
发明内容
本发明的目的在于提供基于辅因子调控发酵生产1,3-丙二醇的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于辅因子调控发酵生产1,3-丙二醇的方法，通过发酵肺炎克雷伯菌生产1,3-丙二醇，在发酵培养的培养基中添加核黄素；或利用肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌混菌发酵生产1,3-丙二醇。
作为一种优选的实施方式，所述核黄素添加浓度为0.5-1.5mM；优选1mM。
作为一种优选的实施方式，发酵培养的温度为25-37℃；优选30℃。
作为一种优选的实施方式，所述发酵培养的培养基配方为：碳源，K2HPO4·3H2O4.45 g/L，KH2PO4 1.3 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 1.6 g/L，CaCO3 4 g/L，微量元素溶液1 mL/L；
所述微量元素溶液成分为FeSO4·7H2O 5 g/L，CaCl2 2 g/L，ZnCl2 0.14 g/L，MnCl2·4H2O 0.2 g/L，H3BO3 0.12 g/L，CoCl2·6H2O 0.4 g/L，CuCl2·2H2O 0.04 g/L，NiCl2·6H2O 0.05 g/L， Na2MoO4·2H2O 0.07 g/L。
作为一种优选的实施方式，发酵培养的培养基中碳源为甘油，浓度为40-80 g/L；优选50-60 g/L。
作为一种优选的实施方式，发酵方法为补料发酵，在碳源浓度降低至10g/L时，添加碳源至30 g/L。
作为一种优选的实施方式，利用肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌混菌发酵生产1,3-丙二醇的方式为：肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌分别经种子培养后，种子液接种至发酵培养基混菌发酵。
作为一种优选的实施方式，所述肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌的种子液等比例接种至发酵培养基。
作为一种优选的实施方式，所述希瓦氏菌种子培养的培养基为LB液体培养基。
作为一种优选的实施方式，在厌氧的条件下进行发酵培养。
本发明通过发酵条件优化和核黄素调节策略，提高肺炎克雷伯菌生产1,3-丙二醇的产量和收率，并减少了副产物和生成，此外，本发明发现肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌可实现混菌发酵，希瓦氏菌可产核黄素，肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌的混菌发酵和单添加核黄素对1,3-丙二醇产量的提高效果接近，但更大程度的降低了副产物的产量，为1,3-丙二醇的工业化生产带来巨大的经济效益。
具体实施方式
实施例使用的肺炎克雷伯菌为肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）KG1，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10781；希瓦氏菌为希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）MR-1，购自美国典型培养物保藏中心，保藏编号为ATCC 700550。
本发明所采用生物量测定方法为：
以比浊法对生物量进行测定。取适量培养物稀释一定倍数，使用分光光度计在600nm处测定其吸光度（吸光度值范围为0.2~0.8），吸光度读数乘以稀释倍数得到培养液的OD600值。
本发明所采用甘油、1,3-丙二醇和副产物产物的测定方法为：
甘油、1,3-丙二醇和副产物产物的浓度测定均使用高效液相色谱（HighPerformance
Liquid Chromatography，HPLC）进行检测。液相色谱仪为赛默飞 Ultimate 3000，检测器为 Shodex RI-101，色谱柱为美国伯乐AminexR HPX-87H有机酸和醇分析柱，柱温55℃，流动相为5 mM硫酸，流速为 0.6 mL/min，进样量为 20 μL。
标准曲线的绘制：将分析纯的样品（甘油、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乳酸、乙酸、丁二酸和乙醇）分别配制成0.05 g/L、0.1 g/L、 0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1 g/L浓度的溶液，在每次检测时与样品一起 进行色谱分析，绘制浓度-峰面积标准曲线。
样品处理：取发酵液 1 mL，12000 rpm 离心6 min，取上清液并用流动相稀释相应倍数，用13 mm、0.2 μm无菌针头式滤器过滤去除杂质，处理后的样品用液相色谱法测定发酵液中底物和产物含量。
实施例涉及的培养基配方如下：
肺炎克雷伯菌种子培养基：甘油 20 g/L，K2HPO4·3H2O 4.45 g/L，KH2PO4 1.3 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，酵母粉 1 g/L，CaCO3 2 g/L，微量元素溶液 1mL/L（FeSO4·7H2O 5 g/L，CaCl2 2 g/L，ZnCl2 0.14 g/L，MnCl2·4H2O 0.2 g/L，H3BO3 0.12g/L，CoCl2·6H2O 0.4 g/L，CuCl2·2H2O 0.04 g/L，NiCl2·6H2O 0.05 g/L， Na2MoO4·2H2O0.07 g/L）。
发酵培养基：甘油40-80g/L，K2HPO4·3H2O 4.45 g/L，KH2PO4 1.3 g/L，(NH4)2SO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1.6 g/L，CaCO3 4 g/L，微量元素溶液1 mL/L。微量元素溶液和种子培养基中微量元素溶液成分相同。
希瓦氏菌种子培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl10 g/L。
实施例存在不同批次的发酵，使得部分发酵实验虽发酵条件相同但发酵结果不完全相同，不同批次间发酵结果差距在±1%以内。
以下实施例对本发明做了详细说明。
实施例1
使用发酵培养基发酵培养肺炎克雷伯菌KG1，设4组实验，甘油浓度分别为40 g/L、50 g/L、60 g/L、80 g/L。在100 mL厌氧瓶中配制50 mL发酵培养基。
种子液制备：预先在试管和250 mL 锥形瓶中配制好肺炎克雷伯菌种子培养基。将-80℃保存的菌种以 1% 的比例接种于含有种子培养基的试管中，于转速为 180 rpm、温度为 37℃的摇床中培养 12 h。然后将获得的培养物以 1%的比例接种至含有种子培养基的锥形瓶中，以相同条件培养 8 h，使菌体达到对数生长期的中后期作为发酵种子液。
以 10%（V/V）的接种比例将种子液接种至发酵培养基，于转速 180 rpm，温度 37℃条件下摇床培养 72 h。
表1实施例1的发酵结果
| 甘油浓度（g/L） | 1,3-丙二醇（g/L） | 2,3-丁二醇（g/L） | 乙醇（g/L） | 乳酸（g/L） | OD<sub>600</sub> |
| 40 | 20.29 | 7.97 | 5.39 | 3.28 | 2.46 |
| 50 | 22.68 | 8.68 | 4.69359 | 5.07537 | 2.56 |
| 60 | 21.34 | 8.45 | 3.76201 | 5.28256 | 2.53 |
| 80 | 20.21 | 8.36 | 3.9822 | 5.9251 | 2.34 |
实施例2
实施例2中研究了不同发酵温度对产量的影响。甘油浓度为50g/L，发酵温度分别为25℃、30℃、37℃和 40℃，其他条件和实施例1相同。
表2实施例2的发酵结果
| 发酵温度（℃） | 1,3-丙二醇（g/L） | 2,3-丁二醇（g/L） | 乙醇（g/L） | 乳酸（g/L） | OD<sub>600</sub> |
| 25 | 24.23 | 8.78 | 5.50 | 2.03 | 2.81 |
| 30 | 26.63 | 8.71 | 4.85 | 3.04 | 2.79 |
| 37 | 22.70 | 7.20 | 3.97 | 5.35 | 2.48 |
| 40 | 16.12 | 6.80 | 3.76 | 7.12 | 2.29 |
实施例3
实施例3中研究了不同核黄素添加量对产量的影响。设置5组实验，发酵培养基分别添加0、0.5、1、1.5 mg/L的核黄素，其他条件和实施例1相同。
表3实施例3的发酵结果
| 核黄素（mM） | 1,3-丙二醇（g/L） | 2,3-丁二醇（g/L） | 乙醇（g/L） | 乳酸（g/L） | 收率（g/g） |
| 0 | 24.93 | 8.29 | 4.35 | 3.931 | 0.33 |
| 0.5 | 25.92 | 8.33 | 4.15 | 4.41 | 0.38 |
| 1 | 28.01 | 8.38 | 3.40 | 4.70 | 0.41 |
| 1.5 | 26.56 | 8.15 | 3.80 | 4.33 | 0.37 |
实施例4
补料分批发酵在5 L发酵罐中进行，接种量为10%（V/V），初始装液量为 2.5 L，搅拌转速为250 rpm，发酵温度为30℃，用 4 mol/L 的氢氧化钠溶液调节 pH 使其维持在7.0。发酵罐不通气，维持厌氧条件。发酵培养基中甘油浓度 50 g/L。设置添加1mM核黄素和不添加核黄素的对照发酵组。当发酵液中甘油浓度低于10 g/L时，添加甘油至30 g/L，发酵96h。
表4实施例4的发酵结果
| 1,3-丙二醇 | 2,3-丁二醇 | 乙醇 | 乳酸 | 乙酸 | 丁二酸 | |
| 无核黄素组（g/L） | 60.76 | 13.54 | 2.39 | 9.69 | 5.63 | 7.82 |
| 添加核黄素组（g/L） | 63.73 | 12.49 | 3.46 | 8.38 | 6.22 | 5.97 |
| 增长率（%） | 4.89 | -7.76 | 44.77 | -13.43 | -10.48 | -23.66 |
实施例5
希瓦氏菌种子液制备：预先在试管和250 mL 锥形瓶中配制好种子培养基。将-80℃保存的菌种以 1% 的比例接种于含有种子培养基的试管中，于转速为 180 rpm、温度为37℃的摇床中培养 18 h。然后将获得的培养物以 1%的比例接种至含有种子培养基的锥形瓶中，以相同条件培养 18-20 h，使菌体达到对数生长期的中后期作为发酵种子液。
添加希瓦氏菌的混菌体系补料分批发酵在5 L发酵罐中进行，肺炎克雷伯氏菌和希瓦氏菌接种量均为10%（V/V），初始装液量为 2.5 L，搅拌转速为250 rpm，发酵温度为30℃，用 4 mol/L 的氢氧化钠溶液调节 pH 使其维持在 7.0。发酵罐不通气，维持厌氧条件。发酵培养基中甘油浓度 50 g/L。同时设置不添加希瓦氏菌的对照发酵组。当发酵液中甘油浓度低于10 g/L时，添加甘油至30 g/L，发酵144h，发酵结果如表5所示。
表5实施例5的发酵结果
| 1,3-丙二醇 | 2,3-丁二醇 | 乙醇 | 乳酸 | 乙酸 | 丁二酸 | |
| 单菌发酵（g/L） | 59.82 | 13.76 | 2.47 | 9.71 | 5.68 | 7.81 |
| 混菌发酵（g/L） | 62.89 | 10.25 | 3.05 | 6.86 | 5.23 | 6.49 |
| 增长率（%） | 5.13 | -25.51 | 23.48 | -29.35 | -7.92 | -16.90 |
从表5中可以看出，混菌发酵时可以生产62.89 g/L的1,3-丙二醇，和单菌发酵的发酵结果比较产量提高5.13%。同时副产物2,3-丁二醇、乳酸、乙酸、丁二酸的积累均有降低。且除了提高1,3-丙二醇产量，混菌发酵相比添加核黄素，更大程度的减少了副产物的生成，该方案可为利用肺炎克雷伯菌发酵生产1,3-丙二醇的工业化应用带来可观的经济效益。
本发明所述的肺炎克雷伯菌的辅因子调节发酵工艺与现有技术中的发酵结果相比，提高了肺炎克雷伯菌的生产1,3-丙二醇的产量和收率，并减少了副产物和生成。
Claims (10)
1.一种基于辅因子调控发酵生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，通过发酵肺炎克雷伯菌生产1,3-丙二醇，在发酵培养的培养基中添加核黄素；或利用肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌混菌发酵生产1,3-丙二醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核黄素添加浓度为0.5-1.5mM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养的温度为25-37℃。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基配方为：碳源，K2HPO4·3H2O 4.45 g/L，KH2PO4 1.3 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 1.6 g/L，CaCO3 4g/L，微量元素溶液1 mL/L；
所述微量元素溶液成分为FeSO4·7H2O 5 g/L，CaCl2 2 g/L，ZnCl2 0.14 g/L，MnCl2·4H2O 0.2 g/L，H3BO3 0.12 g/L，CoCl2·6H2O 0.4 g/L，CuCl2·2H2O 0.04 g/L，NiCl2·6H2O0.05 g/L， Na2MoO4·2H2O 0.07 g/L。
5. 根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，发酵培养的培养基中碳源为甘油，浓度为40-80 g/L。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵方法为补料发酵，在碳源浓度降低至10g/L时，添加碳源至30 g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌混菌发酵生产1,3-丙二醇的方式为：肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌分别经种子培养后，种子液接种至发酵培养基混菌发酵。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述肺炎克雷伯菌和希瓦氏菌的种子液等比例接种至发酵培养基。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述希瓦氏菌种子培养的培养基为LB液体培养基。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在厌氧的条件下进行发酵培养。
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