CN1201493A - 涉及物质在细胞表面的附着和显露的材料和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在革兰氏阳性宿主生物中获得所需蛋白质或多肽的表面表达的方法。另外,还公开了在该方法中有用的载体以及用该载体转化的革兰氏阳性宿主生物。

Description

涉及物质在细胞表面的附着和显露的材料和方法

发明领域

本发明涉及物质(特别是蛋白质和多肽)在诸如乳酸乳球菌的***的细胞表面的输出，细胞壁附着和显露的材料和方法。公开的方法提供了包括抗原，特异性结合蛋白质和酶的蛋白质细胞壁附着的表面表达。

发明背景

多肽在细菌表面的显露是几年来的一个研究主题。由于重组DNA技术使利用细菌细胞作为廉价生产广泛的不同蛋白质成为可能，因此引起了这方面的兴趣。研究集中在多肽在革兰氏阴性细菌表面的显露，例如，参见在美国专利5348867中提供的综述。然而，在革兰氏阴性细菌中，已证实难以找到在细胞表面显露多肽使其以高密度安全附着于表面的适应性方法。

然而，重组产物在细菌表面的高密度表面表达是这些细胞用于某些工业应用，用于疫苗形成，肽文库构建和全细菌细胞吸附剂生产领域的前提。据本发明人所知，没有背景技术导致在细菌表面，更具体地说，在诸如乳酸乳球菌和相似或相关种类的芏半氏阳性细菌的细胞表面恒定，稳定，高密度表达。

以前对细菌表面提供多肽的研究主要集中在使用诸如大肠杆菌和沙门氏菌属的革兰氏阴性细菌(Georgiou等，1993)。在革兰氏阴性细菌中，肽聚糖细胞壁被2个分离的脂膜束缚。外膜对具有相对分子量大于500(Mr)的分子在很大程度上是不可透过的，结果极少有蛋白质释放进生长培养基中。由于外膜的存在，革兰氏阴性细菌表面暴露的蛋白质要么是整合的外膜蛋白，要么是诸如菌毛或鞭毛的蛋白质附器。

由革兰氏阴性生物分泌的少数蛋白质经过可包含达14种不同基因产物的特化运输***运输通过外膜(例如，支链淀粉酶分泌；Kornacker和Pugsley 1990a)。

使C端融合到整合膜蛋白上来显露外源蛋白质的可能性由于许多整合膜蛋白质的C端区域似平对于蛋白质在外膜上的靶向和正确装配是必需的这一事实而复杂化。围绕这一问题的一种方法是使用大肠杆菌主要脂蛋白(Lpp)的N-端靶向序列来指导蛋白质融合到外膜上。由于Lpp不会横断外膜，所以也需要外膜蛋白(OMP；例如，大肠杆菌OmpA)的跨膜区以将融合蛋白定位到细胞表面。然而，已证实了这些Lpp-OmpA融合体对显露诸如β-内酰胺酶，单链Fv抗体和纤维素结合蛋白的功能性蛋白的应用(Georgiou等，1990)。

对于表面显露多肽的其它方法涉及使氨基酸***诸如LamB的整合膜蛋白外膜环内或不含跨膜区的菌毛和鞭毛蛋白质中(Charbit等，1991；Thiry等，1989，Steidler等，1993a，b)。该方法的主要问题是大型氨基酸***/取代破坏了融合蛋白质的正确折叠和/或定位，以致于当用于固定细菌细胞时，从外膜中提取融合蛋白质(Steidler，phDThesis，University of Gent，比利时)。

尽管最近在形成从革兰氏阴性细菌的蛋白质的表面显露的方法中取得了明显的进展，但为达到该目的使用整合膜蛋白的主要缺陷在于融合蛋白质不能牢固地附着到细胞表面。而且，已知膜蛋白质的高水平表达对细胞是有害的，如果需要高密度的表面表达，这一因素可能会限制该***的可能应用。

相反，革兰氏阴性细菌不具有外膜且据认为在细胞表面显露的蛋白质以其C端连接到细胞表面(Schneewind等，1992)。***的许多表面蛋白质具有对这些生物来说特有的某些常见特征。各分子在其N端具有一个充当细胞分泌输出信号的分泌先导肽，一个LPXTG基序，刚好在C端具有一个C端疏水区和带电的氨基酸。针对这些鉴定和功能的大多数研究使用金黄色葡萄球菌蛋白质A的细胞壁分类和锚着区在金黄色葡萄球菌中进行(Navarre和Schneewind，1994)。已表明蛋白质A以尚待阐明的机制共价偶联到金黄色葡萄球菌的细胞壁上。

发明概述

本发明证实了经过构建编码融合蛋白质的嵌合基因使外源蛋白质牢固附着于乳酸乳球菌和其它***的表面成为可能，其中该嵌合基因含编码(1)N端分泌信号，(2)将要进行表面表达的蛋白质和(3)金黄色葡萄球菌蛋白A的细胞壁分类和锚着区的核酸。

与大肠杆菌比较，由于在乳酸乳球菌中以高水平表达的异源性蛋白质相当少，因此在本研究前不能肯定地预期是否能进行任何特定蛋白质的表达或该表达是否对细胞具有毒性。当以高水平表达分泌的或与膜相关的蛋白质时很可能会出现这种毒性，因为蛋白质的输出可能对细胞膜的整合或一般分泌途径的功能具有有害影响。

因此，本发明首次显示蛋白质或多肽当作为与细胞壁锚着区域的融合物进行表达时能牢固附着于***的细胞壁上。如下所示，在正常情况下能释放非共价结合的蛋白质的离子去污剂存在的条件下经过煮沸细胞不能去掉该蛋白质。尽管不希望受任何具体理论的限制，但我们相信乳酸乳球菌似乎具有连接(共价)融合到细胞壁肽聚糖上的表达的蛋白质A所需的必要酶。从这种具有的酶不容易预期与***的许多表面蛋白质共有的蛋白质A的LPXTG基序和C-端疏水区的这种结合，因为这些基序仅仅是必要的，但不是出现共价细胞壁锚着的充分条件。

因此，本发明从这样的发现产生：使用包含编码诸如来自金黄色葡萄球菌蛋白A的分泌信号序列，所需的蛋白质或多肽及细胞壁附着区的核酸的嵌合基因可将感兴趣的蛋白质和多肽(包括但不限于粘附素，抗原，酶和配体)牢固地附着于诸如乳酸乳球菌的***肽聚糖细胞壁的外表面上。

因此，在第一个方面，本发明提供了一种包括编码一种融合蛋白的核酸的重组载体，该融合蛋白质包含分泌信号序列，所需的蛋白质或多肽及细胞壁附着区；以便当载体转化进***宿主并表达融合蛋白质时，所需的蛋白质或多肽附着于并显露于宿主细胞壁的外表面上。

在另一个方面，本发明提供了用如上所述的重组载体转化的革兰氏阳性宿主生物。

在另一个方面，本发明提供了上述革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽被表达并共价附着于细胞壁，且显露于宿主生物表面外表上。

在另一个方面，本发明提供了改造革兰氏阳性宿主生物以在其表面显露所需蛋白质或多肽的方法、包括用编码包含人泌信号序列，所需蛋白质或多肽及细胞壁附着区的融合蛋白的重组核酸转化宿主生物，使宿主能表达融合蛋白质，从而细胞壁锚着区使宿主能在细胞壁表面附着并显露所需的蛋白质或多肽。这一方面还包括以该方法可获得的革兰氏阳性宿主生物的菌株。

优选的是，革兰氏阳性宿主生物是乳球菌宿主，如乳酸乳球菌，或具有表达融合蛋白质并将所需蛋白质或多肽附着并稳定显露于细胞表面之特征的相似或相关种类。蛋白质A融合物相似地附着于L.lactis和金黄色葡萄球菌细胞壁上的预料不到的发现表明，在相似或相关的***中的其它细胞壁结合区也是如此。其它这类***的例子包括枯草芽孢杆菌，格氏链球菌，木糖葡萄球菌，乳芽孢杆菌属种类，同一属中的嗜冷的和向冷的种，芽孢杆菌属种类，梭状芽孢杆菌属种类和棒状杆菌属种类。

优选的是，分泌信号序列能经分泌的Sec依赖性途径靶向用于分泌的蛋白质且来自诸如usp45的天然分泌的蛋白质的信号序列。然而，尽管在实施例中使用这种分泌信号序列，但也可采肜其它分泌信号序列，如来自其它分泌蛋白质的那些分泌信号序列。

优选的是，细胞壁锚着区在C端包括来自金黄色葡萄球菌蛋白质A的锚着区。然而，其它蛋白质可用作细胞壁锚着区，只要它们具有稳定结合于细胞表面的特征且能在细胞表面上体现所需蛋白质或多肽。

优选的是，编码融合蛋白质的核酸可操作地连接到控制序列上以指导其表达。一个这样的例子是用包含在乳球菌宿主中有效的可诱导的启动子控制下的T7或T7-样聚合酶基因的核酸进一步转化的乳球菌宿主生物，其中该控制序列包括对所说的聚合酶特异性的在编码融合蛋白的核酸上游的启动子，作为聚合酶表达的结果该启动子选择性地指导编码融合蛋白质的核酸的转录(见GB-A-2278358)。

已发现使用T7聚合酶***可实现的高水平的异源性蛋白质表达提供了在细菌表面的高水平的蛋白质A-融合多肽的表达。对于本发明设想的许多应用，经过实现在细菌上融合分子的最高可能的表面密度，相联方法的经济学可以在材料上是优惠的。然而，对于某些应用，使用组成型或活性较小的启动子可产生有用的结果，特别是当需要低水平表达的情况。

使用已知技术和本文提供的说明书，本领域的技术人员可按常规制备对所公开的载体的各种变异体。而且，以上面的核酸序列编码的蛋白质或多肽可经过改变其氨基酸序列而基本上不改变其特性来进行修饰，例如，通过***、添加，缺失或取代一个或多个碱基对或氨基酸来改造核酸或氨基酸序列。本文公开的这类多肽的衍生物包括在本发明中。

如上所述，用编码融合蛋白的核酸转化的革兰氏阳性宿主生物具有广泛的应用，用作疫苗以在细胞表面显露生物学活性分子，作为吸附剂及在细胞表面显露酶，例如用作催化剂。

因此，在另一方面，本发明提供了革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽包括至少一个需要引起免疫学反应的表位。优选的是，该蛋白质或多肽是来自病原体的免疫原，抗原或粘附素。

在该方面，本发明还提供了包括上述宿主生物与合适的载体混合的疫苗。本发明还包括在疫苗制品中使用上述革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽是一种需要引起免疫学反应的表位。优选的是，该疫苗经鼻内或肠胃外，或经诸如口腔或***的其它粘膜途径用药。

在进一步的方面，本发明提供了革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽是生物学活性分子。以举例的方式，生物学活性分子可以是药物，激素，酶，DNA/RNA结合蛋白质或能在其它共同表达和分泌的蛋白质上进行二级修饰(糖基化，二硫键异构化)的物质。作为选择，所需的蛋白质或多肽可以是靶基团；例如抗体，或其片段，或受体特异性的粘附素。

在这一方面，本发明还包括包含革兰氏阳性宿主生物的药用组合物和其在医学治疗方法中的应用。

在另一方面，本发明提供了革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽是配体的特异性结合配偶体。在这一方面，本发明还包括在配体的纯化或分离方法中使用革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽是该配体的特异性结合配偶体，从而特异性结合配偶体显露于生物的表面允许结合配偶体结合到配体上。

本发明还提供了将革兰氏阳性宿主生物固定于固相上的方法，例如，经过表达融合到细胞壁锚着区上的抗生蛋白链菌素使在细胞表面体现的抗生物蛋白链菌素能结合到固定于固相的生物素上。因此，本发明提供了固定本发明的革兰氏阳性宿主生物的方法，它包括将本发明这一方面的宿主生物与配体固着于其上的固体表面接触。本发明还提供了经过在也在其表面上表达结合到待检测的配体(例如，抗生蛋白链菌素或蛋白质A)上的蛋白质的细胞中共同表达诸如荧光素酶或荧光蛋白质的报道活性检测与特异性配体(例如，生物素或免疫球蛋白)复合物的方法。

在另一方面，本发明提供了革兰氏阳性宿主生物，其中所需的质白质或多肽是一种酶。本发明的该方面还包括包含革兰氏阳性宿主生物的组合物，其中所需的蛋白质或多肽是表达并显露于宿主细胞表面的一种酶，以及该组合物在由酶，例如可从周围环境分解诸如脂肪和胆固醇的不需要的食物成份的表面酶催化的反应中的应用。

在另一方面，本发明提供了筛选诸如抗体或抗原或其片段的物质库的方法，包括用编码物质与细胞壁锚状区融合体的核酸转化革兰氏阳性宿主生物，表达该融合体使物质显露于细胞表面。然后可使用识别剂，例如标记的抗体检测待筛选的特定物质。

附图的简要描述：

图1显示了下述基因融合体的构建；

图2显示了从(i)生长培养基，(ii)溶葡球菌素处理的细胞上清，(iii)在Laemmli SDS缓冲液“断裂释放”中煮沸的完整细胞，和(iv)溶葡球菌素处理的细胞的细胞沉淀残渣中回收的蛋白质的Western印迹。根据标准程序用兔抗-抗生蛋白链菌素抗血清和第二抗体缀合物经免疫印迹检测所示的蛋白质(见箭头)。这些结果证实在乳酸乳球菌中产生的抗生蛋白链菌素融合的A蛋白牢固地附着地细胞表面；

图3显示了生物素缀合物能特异性地结合到表达抗生蛋白链菌素-蛋白质A融合体的完整细胞的表面上，因此证实了该蛋白质存在于细胞的表面。该附图显示了已在其上收集了表达抗生蛋白链菌素蛋白质A融合体(pL2SAX)或抗生蛋白链菌素(pL2SA)的细胞并与生物素标记的辣根过氧化物酶(B-POD)或预先用抗生蛋白链菌素(SA)处理以封闭其结合位点的B-POD反应的滤膜。经过与辣根过氧化物酶的生色底物温育检测结合B-POD的细胞。只有在其表面表达抗生蛋白链菌素蛋白质A融合蛋白的完整细胞结合生物素标记的酶缀合物B-POD；

图4，标记了pL2SAX的相片显示了结合到用生物素标记的辣根过氧化物酶缀合物覆盖的聚苯乙烯表面的在细胞表面表达抗生蛋白链菌素蛋白质A融合体的乳酸乳球菌细胞的照片。在阴性对照中没有看见细胞，该阴性对照代表了本文所述的所有对照样品。

图5(A)显示了广泛的革兰氏阳性缩主范围的载体pTREXI，pTIL2TT和pTITT的物理和遗传图谱。以粗线表示表达盒，大环内酯，Lincosamides和链阳性菌素B(MLS)抗性决定簇，TTFC基因，usp45的分泌信号序列(L2)，金黄色葡萄球菌蛋白质A锚(SPA-X)和复制子(来自pAMβ1的Ori)；

图5(B)是pTREXI中表达盒的示意图，显示了参与基因表达的各种序列元件，特有的限制性核酸内切酶位点的位置，ShineDalgarno(SD)基序和翻译起动起始密码子(ATG)；

图5(C)显示了pTREXI表达盒的DNA序列和限制性核酸内切酶位点的图谱。在图谱中还显示了关键的表达元件；

图6显示了用于PCR的引物表；

图7显示了将细胞内表达TTFC(pTITT)，分泌TTFC(pTIL2TT)或表达TTFC-蛋白质A融合体蛋白质(pTTA)的完整细胞与兔TTFC多克隆抗血清在其上温育，收集到膜上，然后与抗体过氧化物酶缀合物和底物反应以检测细胞表面的抗TTFC抗体的结合的滤膜。只有表达TTFC-蛋白质A融合体的完整细胞在其细胞表面显露TTFC。

详细描述

用于生产抗多肽抗体的活的或灭活的细菌疫苗和工具

本发明可用于在诸如乳酸乳球菌的***中表面表达抗原，粘附素和生物学活性分子。这些细菌属于已建议作为用于粘膜免疫的疫苗传递载体的那些细菌(Well等，1993)。暴露于细菌细胞表面的抗原更易于被免疫***识别(比仅在细菌死亡和降解后释放的抗原)，因为表达抗原更易被诸如巨噬细胞，树突状细胞和B淋巴细胞的抗原识别和处理细胞上的其受体接近。因此抗原和抗原决定簇的表面表达可增强***疫苗表达的抗原的免疫原性。在其表面表达抗原的全细胞也是有用的免疫原，用于在动物中产生多克隆和单克隆抗体(Charbit等，1987)。

生物学活性分子的细菌传递

除了表达抗原和/或生物学活性分子外，对存在于消化道和其它粘膜组织(例如，呼吸道尿-生殖道和鼻道)中的细胞和/或组织上的受体具有特异性的粘附素的表面表达使重组细菌能靶向特异性的细胞和组织，例如，瘤形成。这种靶向于增强使用这些细菌将抗原和/或生物学活性分子传递到粘膜表面的效率。如果所用的细菌在正常情况下不附着于特定的粘膜表面或不在其上繁殖，这种靶向可增加细菌与粘膜表面间的接触时间，从而帮助该细菌合成的一个或多个分子的传递和/或吸收。

许多生物学活性分子的表面表达经过传递任意一种大量的激素，细胞因子或其它免疫调节分子，细胞受体和/或其配体，酶，细胞特异性毒素而在疾病治疗中具有广泛的应用。这些分子可与侵染素或能使细菌进入细胞和/或从核内体释放进胞质的其它蛋白质共同表达，从而以本发明的方法为将细菌靶向细胞和细胞内区室提供了可行性。

另外，具有足够结合亲和力的表面配体可用于使细菌被各种各样的所需分子覆盖；例如，DNA或RNA结合蛋白质的表面表达可用于使生物在DNA或RNA中被覆盖。可发现这种方法在基因治疗或核酸免疫中的应用。

特异性抗原、抗体和配体的表面显露

最近形成的噬菌体显示技术使得经过淘选表达反配体的重组噬菌体，然后附着于含感兴趣的抗原，抗体或受体的固化支持物上能从复杂的文库中分离特异性的抗原，抗体和其它配体(Chiswell和McCafferty，1992)。一个可选择的方案是使用***用于在表面提供蛋白质和肽。细菌显示技术的优势在于(i)表达所需配体的细菌可直接使用荧光反配体作探针来检测，然后可使用能分拣单个细菌的FACS机器获得不含非表达子细胞的这些细菌。这一程序可避免需要繁殖噬菌体以回收感兴趣的克隆的DNA序列，(ii)，与噬菌体***相比在细菌中可以更高的密度表达表面蛋白质，(iii)不会碰到某些重组噬菌体不能感染大肠杆菌(以使它们能繁殖)的问题。

细菌作为金细胞吸附剂的应用

使用纯化生物学产物的亲和色谱常常可将多步程序转变成单步或几乎单步的程序。接着，这又导致与生物学产物回收相关的下游改造方法的复杂性降低，也意味着可实现大量节约资本投资；可减少操作花费及可更迅速地回收产物本身。事实上，该方案的一个最佳实施例是使用野生型金黄色葡萄球菌来结合和纯化抗体。

在细菌表面发现的蛋白质A对于某些免疫球蛋白的Fc区具有高亲和力，且加热杀死的及化学稳定化的金黄色葡萄球菌细胞已按常规用于纯化抗体。

然而，需要供应足够的固化形式的配体导致亲和色谱不经济。

诸如单链抗体，蛋白质受体，粘附分子等的配体或反配体的功能性片段在细菌表面的表达使得这些分子能经细菌生长廉价地复制；然后截留的细菌细胞可用于提供廉价形式的吸附剂。

诸如乳酸乳球菌的无毒的***不含存在于大肠杆菌中的内毒素，该内毒素起初污染在该细菌中制备的所有重组产物，且必须在纯化程序过程中去除。因此，使用***用于表面显露配体不会导致产物被内毒素污染。

酶覆盖的细菌作为生物催化剂

由***和其它生物产生的许多酶被这些生物分泌进其环境中，并在该处可介导各种生物转化。这些化学转化对于存活和生长是必需的，或者它们可使该生物更有效地与其环境中的其它生物竞争。

为营养目的需要的酶包括，例如，可将诸如糖，脂，核酸和蛋白质的生物学聚合物降解成其取代基并为生长的生物提供营养成份的那些酶。

分泌的酶也执行一系列不同的功能，如能将细菌和其它生物本身固定在其环境中有利的表面上的粘质和粘蛋白(糖蛋白或蛋白聚糖)的生物合成。它们也可灭活从其它生物产出的诸如抗生素或毒素的抗微生物物质；它们可降解由地质学或工业过程遗留在环境中的毒性或难对付的物质。

许多这类分泌的酶具有工业用途，但较理想的是需要存在于固相中，以便通过该相的液体反应物能被固着的酶进行催化转变。

本发明的另一个关键的方面是经过以能产生固相形式酶的细菌形式提供该生物转化过程所需的活性成分改进在工业过程中使用酶的可能性。

生产分泌蛋白的固着细胞的使用

本发明提供了以附着于固相支持物上的***生产分泌的蛋白质的方法。例如，在其表面显露抗生蛋白链菌素并也分泌感兴趣的酶或其它蛋白质的细胞可附着于生物素覆盖的固相上。该方案的一个优势是回收含分泌的感兴趣的蛋白质的生长培养基不需离心去掉细菌细胞。

具有双功能氨基末端区的杂二聚蛋白质在细菌表面的装配

在本发明的该方面，杂二聚体的一个配偶体，例如，包含一个信号肽，一个单链抗体，重链的铰合和/或恒定区及金黄色葡萄球菌蛋白质A的细胞壁锚着区的融合多肽在细菌表面表达，另一个配偶体被分泌且由相似融合多肽组成，例如不同的单链抗体(识别不同的抗原)或酶促活性，但缺乏细胞壁锚。组成型配偶体多肽可在生长于共同培养基中的相同的改造的细胞中或在不同的改造的细胞中合成。

在这一例子中，细菌表面充当具有双功能氨基末端区的专一性杂二聚体分子的装配位点。然后可以收集的细菌特异性地释放和纯化装配的蛋白质，例如，经过溶葡球菌素的作用。可供选择的且优选的是，经过特异性蛋白酶，例如，因子Xa，肠激酶，胶原酶，Igase(来自淋病奈瑟氏球菌)，凝血酶，TEV(烟草蚀刻病毒蛋白酶对全细菌的作用可获得释放，其识别位点在紧接细胞壁锚上游掺入融合多肽。以常规分离技术可以纯化所需的蛋白质。

尽管已知生产双功能杂二聚体的方法，但一般来说目前还没有可从不可避免地共同生产的均二聚体(因而是单功能的)分子中分离它们的可应用的方法。

另外，该方法可用于在细菌表面装配均多聚体蛋白质。

实施例1

表达质粒的构建

步骤1：金黄色葡萄球菌蛋白质A锚着区的克隆

使用以公开序列为基础的引物经聚合酶链反应(PCR)获得编码金黄色葡萄球菌菌株Cowan I NCTC 8530的葡萄球菌蛋白质A(SPA)锚的DNA片段(Saiki等，1985)。以Marmur等(1961)的方法在含dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM，1μM有意义(及反义)引物和1μM以金黄色葡萄球菌菌株Cowan I NCTC 8530分离的基因组DNA的厂家提供的100μl缓冲液中用热稳定性Vent DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)进行PCR。有意义和反意引物设计成分别包括在其5’端的BamHI和XbaI的限制性核酸内切酶位点以利于随后的克隆步骤。经20个循环的变性(94℃45秒)，引物退火(68℃，30秒)和DNA聚合(72℃45秒)后，以琼脂糖凝胶电泳检测预期大小(621bp)的PCR扩增的DNA产物。然后使用标准程序(Maniatis)克隆和测序纯化的DNA片段。编码金黄色葡萄球菌蛋白质A的C端区(nt.1043至2252)的克隆的DNA片段的DNA序列与以前报道的相同(Shuttleworth等)。

步骤2：抗生蛋白链菌素基因的克隆和操作

抗生蛋白链菌素选作报道蛋白以证实本发明的可行性。抗生蛋白链菌素易于检测且已知结合生物素，其抗血清可从商业途径获得。可从一系列质粒获得抗生蛋白链菌素基因片段，其中抗生蛋白链菌素基因突变成在成熟蛋白编码序列的起始和末端***不同的限制性核酸内切酶位点。

编码抗生蛋白链菌素的成熟形式的基因片段连接进NaeI消化的乳酸乳球菌表达质粒pLET2N(Steidler等，1995)以产生usp45信号分泌信号光导序列(存在于pLET2N)和抗生蛋白链菌素编码序列的框内融合(图1)。所得的质粒命名为pL2SA，可用于在乳酸乳球菌中表达和分泌抗生蛋白链菌素(见下面)。然后经过克隆编码蛋白质A锚区的PCR扩增的DNA片段构建含有融合到pL2SA中的抗生蛋白链菌素基因3’端的金黄色葡萄球菌蛋白质AC端锚着区(称为X区)的质粒pL2SAX(见步骤1和图1)。含pL2SAX的乳球菌表达菌株表达抗生蛋白链菌素-蛋白质AC端区融合蛋白，它牢固地附着于细胞壁上(见下面)。

抗生蛋白链菌素和抗生蛋白链菌素-蛋白质A融合蛋白质在乳酸乳球菌中的表达

从大肠杆菌菌株MC1022分离质粒pL2SA和pL2SAX并用于经电穿孔转化含pILPol的乳酸乳球菌T7表达宿主菌株MG1820(菌株UCP1000，Wells等，1993)。经过用乳糖代替生长培养基中的葡萄糖在乳酸乳球菌中诱导抗生蛋白链菌素和抗生蛋白链菌素-蛋白质A融合蛋白的表达(Steidler等，1995)。为了检测抗生蛋白链菌素蛋白产物在乳酸乳球菌中的表达，用已诱导3小时的细胞进行细胞分级分离和免疫印迹分析。首先经离心沉淀10ml细胞，以100,000g第二次离心上清1小时以去掉任何不溶物质。然后如前所述经酚提取从高速上清回收蛋白成份(Steidler等，1995)。在第一步中获得的细胞沉淀在Tris缓冲盐溶液(TBS：0.15M NaCl，0.02M Tris-HCl，pH7.5)中洗涤3次并重悬于含0.6mg溶葡球菌素(Sigma，St.Louis，USA)的250μl 10％蔗糖，20mM Tris-HCl(pH7.5)中并在37℃培养1小时以酶促消化细胞壁。

用溶葡球菌素处理后，经离心从酶促释放的细胞壁物质分离细胞(称为残渣)并经过在Laemmli破碎缓冲液中煮沸溶解。称为“溶葡球菌素释放的蛋白质级分”的上清同样用破碎缓冲液处理。以生长培养基中回收蛋白质，使用标准程序经过用抗抗生蛋白链菌素的抗血清免疫印迹分析溶葡球菌素释放的级分和细胞残渣。溶葡球菌素已显示出特异性地释放连接到存在于细胞壁肽聚糖上的五甘氨酸肽上的蛋白质(Schneewind等，1993)。

细胞分级分离及从含pL2SA的乳酸乳球菌表达菌株UCP1000回收的蛋白质的免疫印迹分析的结果显示乳酸乳球菌产生了抗生蛋白链菌素预期大小的蛋白质并分泌进生长培养基。在用溶葡球菌素处理的细胞的总细胞蛋白残渣中未检测到抗生蛋白链菌素且在溶葡球菌素释放的细胞壁物质中仅检测到痕量的蛋白质(见图2)。在该菌株中，经过用溶葡球菌素处理细胞释放的分泌型抗生蛋白链菌素总量比例相当小可能是抗生蛋白链菌素在通过细胞膜运输后未通过细胞壁扩散的结果。

与这些发现相反，携带pL2SAX的菌株产生的抗生蛋白链菌素-蛋白质A融合蛋白质不分泌进生长培养基。然而，这一融合蛋白质在通过用溶葡球菌素处理从细胞壁释放的物质中大量存在表明它与细胞壁相联系(图2)。在溶葡球菌素处理的细胞沉淀(残渣)中也检测到融合蛋白表明部分释放的蛋白质在用溶葡球菌素培养期间不扩散出细胞壁。当在Laemmli破碎缓冲液中煮沸表达抗生蛋白链菌素-蛋白质A融合蛋白的洗涤细胞时，以免疫印迹分析检测到的蛋白质表观分子量大于在用溶葡球菌素处理的细胞级分上清中检测到的蛋白质(图2)。这种较高分子量的多肽可能代表在将融合蛋白质分类并锚着于细胞壁上的途径中的一种中间产物。在煮沸的溶葡球菌素处理的细胞的细胞沉淀(残渣)部分中发现两种形式的蛋白质，表明用溶葡球菌素更温和地酶促处理细胞不释放较高分子量形式的融合蛋白质进入上清。

在乳酸乳球菌表面显露抗生蛋白链菌素

为显示抗生蛋白链菌素融合到金黄色葡萄球菌蛋白质A的C端区域会导致表达的蛋白质在细胞表面显露，将表达抗生蛋白链菌素或抗生蛋白链菌素蛋白质A融合产物的乳酸乳球菌菌株在含1％牛血清白蛋白(BSA)的TBS中洗涤3次，然后用生物素标记的辣根过氧化物酶(1μg)在室温培养1小时。在可溶性抗生蛋白链菌素存在下也用生物素标记的辣根过氧化物酶培养细胞的对照样品以显示与细胞的结合可通过与游离底物的竞争来抑制。然后用含1％BSA的TBS洗涤细胞3次并借助于真空装置收获得到硝酸纤维素滤膜上。根据厂家建议在TMB(辣根过氧化物酶底物)溶液中培养滤膜检测到生物素与细胞表面的结合。图3的结果显示了生物素辣根过氧化物酶缀合物结合到表达抗生蛋白链菌素-蛋白质A融合蛋白的完整细胞的表面但不结合表达抗生蛋白链菌素的细胞。可排除生物素-辣根过氧化物酶缀合物非特异性地结合表达抗生蛋白链菌素-蛋白质A融合蛋白质的乳酸乳球菌细胞表面的可能性，因为在可溶性抗生蛋白链菌素存在下抑制结合。

特异性固着在其细胞表面表达抗生蛋白链菌素的乳酸乳球菌细胞

为提供特异性结合在其细胞表面表达抗生蛋白链菌素的细菌细胞的固相表面，用1μg/ml生物素标记的碱性磷酸酶(BoehringerMannheim，德国)在1ml TBS中室温下覆盖培养皿(20mm，Maxisotp，Nunc.丹麦)1小时。然后，经过在室温下用含1％BSA的2mlTBS培养平板2小时封闭非特异性结合位点。10ml表达抗生蛋白链菌素或抗生蛋白链菌素-蛋白质A融合蛋白质的细胞在TBS中洗涤3次并重悬于1ml含1％BSA的TBS中室温下1。在该培养步骤期间经过每分钟摇动6秒使细胞保持悬浮。最后，用TBS将细胞悬液稀释成10ml，将1ml该悬液加入预处理的培养皿(见上文)中室温下1小时。然后在轨道摇床上10分钟内用1ml TBS洗涤培养皿3次，然后以光学显微镜检查法检查它们。结果(图4和表1)表明，表达抗生蛋白链菌素-蛋白质A融合蛋白的乳酸乳球菌结合引用生物素-碱性磷酸酶覆盖的培养皿表面，但不结合到未用该缀合物处理的培养皿表面。表达并分泌抗生蛋白链菌素的细胞不结合到覆盖的或未覆盖的培养皿表面。表达抗生蛋白链菌素-蛋白质A融合产物的细胞的结合被加入可溶性抗生蛋白链菌素抑制表明该结合是特异性的且通过生物素与存在于细胞表面的抗生蛋白链菌素来介导(表1)。

      表1：表面结合测定的结果

                           表面处理乳酸乳球菌菌株   (i)1％BSA   (i)1μg/ml B-AP   (i)μg/ml B-AP

                         (ii)1％BSA        (ii)30μg/ml SA

                                           (iii)1％BSAMG1820(pILPol，pL2S ND       ND                 NDA)MG1820(pILPol，pL2S ND       2×10⁵mm^-1       NDAX)

表1的说明，乳酸乳球菌的表达菌株要为携带质粒pL2SAX并产生抗生蛋白链菌素-蛋白质A融合产物，要为携带质粒pL2SA并产生抗生蛋白链菌素，ND；未检测到，B-AP，生物素-碱性磷酸酶缀合物，BSA：牛血清白蛋白，SA：抗生蛋白链菌素。

实施例2

减毒毒素片段C(TTFC)抗原在乳酸乳球菌表面的显露

这一另外的实施例提供了经过构建编码融合蛋白的嵌合基因可将蛋白质抗原牢固地附着于乳酸乳球菌表面的证据，其中该嵌合基因含编码(1)N-端分泌信号，(2)将要进行表面表达的蛋白质抗原和(3)金黄色葡萄球菌蛋白质A细胞壁分类和锚着区的核酸。

第一步：克隆并遗传操作TTFC和金黄色葡萄球菌蛋白质A锚着区(1a)pTREX和pTREX1的构建

经过在200μl1×TBE，150mM NaCl中煮沸20μg各寡核苷酸并使其冷却到室温退火编码推断的RNA稳定序列，翻译起始区和靶基因的多克隆位点的合成寡核苷酸。使用Tf1 DNA聚合酶在含250μM脱氧核苷酸三磷酸酯和1.5mM MgCl₂的1×Tf1缓冲液中35℃、45℃，55℃和65℃各1分钟，接着72℃10分钟延伸退火的寡核苷酸。有义和反义寡核苷酸分别在其5’端含有NheI和BamHI的识别位点以利于进一步克隆。

用NheI和BamHI切割所得的双链DNA片段，并克隆进pUC19NT7的XbaI和BamHI位点之间，pUC19NT7是pUC19的衍生物，它含有来自pLET1(Wells等，1993C)且克隆进EcoRI和Hind III位点之间的T7表达盒。所得的构建体命名为pUCLEX。然后经过用Hind III切割并钝端化，接着在克隆进pIL253的EcoRI和SacI(钝端化)位点之前用EcoRI切割去掉pUCLEX中的完整表达盒以产生载体pTREX。为了构建表达载体pTREX1，含乳球菌启动子P1的PCR扩增的DNA片段克隆进存在于载体pTREX的表达盒中的EcoRI和Bgl II位点之间(图5)。该启动子以前已经使用启动子探针载体pSB292分离并经引物延伸和DNA序列分析鉴定(Waterfield等，1995)。

(1b)质粒pTIL2TT的构建

使用质粒pLET2-TTFC作模板及公开的序列(Wells等，1993b)经聚合酶链反应(PCR)获得编码融合到usp45基因的乳球菌信号分泌先导序列上的减毒毒素片段C基因的DNA片段。用热稳定性vent DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)在含dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM，1μM有义和反义引物(图6)及大约50ng质粒pLET2-TTFC作模板DNA的厂家提供的100μl反应缓冲液中进行PCR。反义引物设计成包括在其5’端的BamHI位点以利于随后的克隆步骤。经30个循环的变性(94℃45秒)，引物退火(50℃30秒)和DNA聚合(72℃120秒)后，以琼脂糖凝胶电泳检测预期大小的PCR扩增的DNA产物(1478bp的双链DNA)。然后用限制性核酸内切酶Barn HI消化纯化的DNA片段并克隆进首先用SphI酶切钝化，然后用BamHI酶切的乳球菌表达质粒pTREX1中。命名为pTIL2TT的所得的质粒在图5中显示。

(1c)pTITT的构建

以PCR(使用标准条件；见上面)产生减毒毒素片段C(TTFC)的片段，在其5’和3’端分别编码XbaI和BamHI位点。在TTFC序列的3’端BamHI位点前导入终止密码子。TTFC PCR片段首先克隆进pUCLEX的XbaI和BamHI位点之间，然后经过用SphI-BamHI剪切取出并再克隆进SphI和BamHI消化的pTRIX1。命名为pTITT的所得的质粒在图5中显示。

(1d)pTTA的构建

使用以公开序列为基础的引物(图6)经PCR获得编码金黄色葡萄球菌菌株Cowan INCTC8530的葡萄球菌属蛋白质A(SPA)锚的DNA片段。有义和反义引物设计成在其5’端分别包括BamHI和BglII的限制性核酸内切酶位点以利于随后的克隆步骤。用热稳定性Vent DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)在含dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM，1μM有义和反义引物(图6)及大约50ng质粒pL2SAX(在本专利中进一步描述)作模板DNA的厂家提供的100μl反应缓冲液中进行PCR。经30个循环的变性(94℃45秒)，引物退火(55℃30秒)和DNA聚合(72℃35秒)后，以琼脂糖凝胶电泳检测预期大小的PCR扩增的DNA产物。然后用限制性核酸内切酶BamHI和BglII消化纯化的DNA片段并克隆进质粒pTIL2TT，该质粒已经首先用BamHI酶切并根据厂家建议的方法使用小牛肠道磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。所得的命名为pTTA的质粒含有融合到TTFC基因3’端的金黄色葡萄球菌蛋白A C端区(称为X区)(图5)。

第二步：TTFC蛋白质A融合蛋白在乳酸乳球菌中的表达和表面显露

为了显示TTFC融合到金黄色葡萄球菌蛋白质A的C端区域会导致表达的蛋白质在细胞表面显露，经离心收获细胞内表面TTFC(即携带质粒pTITT)分泌TTFC(即，携带质粒pTIL2TT)或TTFC蛋白质A融合产物(即，携带质粒pTTA)的乳酸乳球菌菌株，在含1％BSA的TBS(20mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl)中洗涤3次，然后用1μg兔抗-TTFC在室温下培养30分钟。然后用1ml TBS洗涤细胞3次并重悬于1ml TBS中。借助于真空装置将100μl该细胞悬液中的细胞收获得到硝酸纤维素膜(0.22μm)上。然后，在室温下在5ml含5μg连接到辣根过氧化物酶(Boehringer Mannheim)上的抗兔IgG的PBS-2.5％脱脂奶粉中培养膜。根据厂家建议经过在TMB(辣根过氧化物酶底物)溶液中培养滤膜检测到抗兔过氧化物酶与结合于携带pTTA而不是携带pTIL2TT和pTITT的乳酸乳球菌完整细胞表面上的兔抗TTFC抗体结合。显示于图7中的结果表明仅在表达TTFC蛋白质A融合蛋白质的完整细胞表面检测到TTFC。

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Claims (37)

1.一种重组载体，它包括编码融合蛋白的核酸，该融合蛋白包含一个分泌信号序列，一个所需的蛋白质或多肽及一个细胞壁附着区，以便当载体转化进***宿主时表达融合蛋白质，所需的蛋白质或多肽附着并显露于宿主细胞壁的外表面。

2.如权利要求1所要求的重组载体，其中革兰氏阳性宿主生物是乳球菌属种类，枯草芽孢杆菌，格氏链球菌，木糖葡萄球菌，乳芽孢杆菌属种类，芽孢杆菌属的嗜冷的和向冷的种类，梭状芽孢杆菌属种类或棒状杆菌属种类。

3.如权利要求2所要求的重组载体，其中革兰氏阳性宿主生物是乳球菌属宿主，优选是乳酸乳球菌。

4.如权利要求1至3中任一项所要求的重组载体，其中分泌信号序列能经过分泌的sec依赖性途径靶向用于分泌的蛋白质或多肽且来自天然分泌的蛋白质的信号序列。

5.如权利要求4所要求的重组载体。其中分泌信号肽来自蛋白质usp45的信号序列。

6.如权利要求1至5中任一项所要求的重组载体，其中细胞壁附着区包括至少来自金黄色葡萄球菌蛋白质A的C端锚着区。

7.如权利要求1至6中任一项所要求的重组载体，其中编码融合蛋白的核酸可操作地连接到指导其表达的控制序列上。

8.如权利要求7所要求的重组载体，其中的核酸进一步包括在编码融合蛋白的核酸上游的诱导型启动子控制下的T7或T7样聚合酶基因。

9.用权利要求1至8中任一项所限定的重组载体转化的革兰氏阳性宿主生物。

10.如权利要求9所限定的革兰氏阳性宿主生物，其中所需蛋白质或多肽被表达，且共价附着于细胞壁上并显露于宿主生物表面的外表面上。

11.一种改造革兰氏阳性宿主生物使在其表面显露所需蛋白质或多肽的方法，包括用编码包括分泌信号序列。所需蛋白质或多肽及细胞壁附着区的融合蛋白的重组核酸转化宿主生物，使宿主能表达融合蛋白，从而细胞壁附着区使宿主在细胞壁表面附着并显露所需蛋白质或多肽。

12.如权利要求11所要求的方法，以权利要求2至8的任一个或多个特征改进。

13.以权利要求11或权利要求12中所要求的方法可获得的革兰氏阳性宿主生物。

14.权利要求9或权利要求10所限定的革兰氏阳性宿主生物，其中所需蛋白质或多肽包括至少一个需要对其产生免疫学反应的表位。

15.权利要坟14中所要求的革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽是来自病原体的免疫原，抗原或粘附素。

16.一种疫苗，包含权利要求14或权利要求15所限定的革兰氏阳性宿主生物与合适的载体混合。

17.权利要求14或权利要求15中所限定的革兰氏阳性宿主生物在疫苗制备中的应用。

18.权利要求9或权利要求10所限定的革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽是需要诱导耐受性的蛋白质或多肽。

19.权利要求18中所限定的革兰氏阳性宿主生物在诱导对该蛋白质或多肽的耐受性中的应用。

20.权利要求9或权利要求10所限定的革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽是生物学活性分子。

21.如权利要求20所要求的革兰氏阳性宿主生物，其中生物学活性分子是药品，激素，酶，DNA/RNA结合蛋白或能在其它共同表达和分泌的蛋白质上进行次级修饰的物质。

22.如权利要求9或权利要求10所限定的革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽是能指导宿主生物与靶位点结合的靶向基团。

23.如权利要求20所要求的革兰氏阳性宿主生物，其中靶向基团是抗体，或其片段，它能结合靶抗原或半抗原或是粘附素。

24.一种药用组合物，包含如权利要求9，10或18至23中任一项所限定的革兰氏阳性宿主生物。

25.如权利要求9，10，13-15或18至23中任一项所限定的革兰氏阳性宿主生物用于医药。

26.如权利要求9或权利要求10所限定的革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽是配体特异性结合配偶体。

27.权利要求26中所要求的革兰氏阳性宿主生物，其中配体结合到固相表面使宿主生物可固着于其上。

28.权利要求27中所要求的革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽是抗生蛋白链菌素，配体是生物素或生物素连接物，例如生物素标记的酶，如生物素标记的辣根过氧化物酶。

29.固着权利要求26至28中任一项所限定的革兰氏阳性宿主生物的方法，包括将宿主生物与配体固着于其上的表面接触。

30.权利要求26至28中任一项所限定的革兰氏阳性宿主生物在纯化或分离配体中的应用。

31.如权利要求9或权利要求10所限定的革兰氏阳性宿主生物在检测具有特异性配体的复合物中的应用，其中核酸进一步包括表达时产生报道活性的基因。

32.如权利要求31中所要求的应用，其中的报道活性是荧光蛋白或荧光素酶且所需的蛋白质是抗生蛋白链菌素。

33.如权利要求9或权利要求10所限定的革兰氏阳性宿主生物，其中所需的蛋白质或多肽是酶。

34.一种组合物，包含如权利要求33所限定的革兰氏阳性宿主生物，其中该酶被表达且暴露于宿主生物的细胞表面。

35.如权利要求34所限定的组合物用于由反应所催化的反应。

36.一种筛选物质文库的方法，包含用编码该物质与细胞壁锚着区的融合物的核酸转化革兰氏阳性宿主生物并在细胞表面表达该融合物的步骤。

37.如权利要求36所要求的方法，其中该物质是抗体或抗原或其片段。

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