CN116355940B - 一种猪o型***病毒结构蛋白vp1的表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体及其构建方法，构建得到的猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体在以谷氨酸棒状杆菌作为底盘菌株时能够分泌表达，与现有技术相比，实现了在除大肠杆菌以外的底盘菌株中表达VP1，提高其表达量以及活性；同时本发明还通过更换合成型启动子来构建表达载体，实现VP1表达量的进一步提升，为开发猪O型***亚单位疫苗提供了一种新的更安全的方案。

Description

一种猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体及其构建方法 和应用

技术领域

本发明基因工程属于技术领域，具体涉及到一种猪O型***结构蛋白V P1的表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

现阶段针对猪O型***已实现商品化的疫苗主要包括灭活疫苗和多肽疫苗两种，而灭活的全病毒疫苗存在一定的病毒灭活不彻底、病毒逃逸等潜在风险，故亟需开发一种更安全的疫苗。

目前针对亚单位疫苗的研究主要是以大肠杆菌为底盘菌株，但由于大肠杆菌在生产外源蛋白的过程中，会出现蛋白以包含体的形式表达，或表达过程中有内毒素干扰，导致下游纯化工艺困难、安全性降低的问题。

而谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)在表达外源蛋白质上有很大的潜力，相较于传统的大肠杆菌表达***，C.glutamicum不会产生内毒素，更适合生产医药用、食品级蛋白产品；与同为革兰氏阳性菌的枯草芽孢杆菌相比，C.glut amicum能更大程度上确保蛋白质正确折叠，保证蛋白质活性。

病毒(FMDV)的VP1蛋白暴露在病毒表面的G环上，具有较强的免疫原性，是FMDV疫苗研制中的主要结构蛋白。本研究旨在实现猪O***结构蛋白VP1在谷氨酸棒状杆菌中的表达，并优化蛋白表达元件，实现表达量以及活性的进一步提升。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述载体序列如SE Q IDNO.4和SEQ ID NO.7所示。

本发明的另一目的是，克服现有技术中的不足，提供一种猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，所述表达载体包括pXMJ19-VP1和pXMJ19-H36-VP1，序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ I D NO.7所示。

作为本发明所述猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的构建方法的一种优选方案，其中：所述表达载体pXMJ19-VP1的构建方法包括，

通过快切酶双酶切将序列如SEQ ID NO.10所示的pXMJ19组成型空载质粒切开，获得质粒载体A；

设计上下游引物p1、p2，引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，通过引物***酶切位点，使用estaq聚合酶通过PCR对VP1模板进行反应，获得序列如SEQ ID NO.3的VP1片段；

通过连接酶连接VP1片段与质粒载体A，获得质粒pXMJ19-VP1，序列如SEQ ID NO.4所示；

将pXMJ19-VP1质粒转入大肠杆菌感受态中，培养、涂布、筛选并挑取单菌落继续培养后进行质粒提取，纯化后测序。

作为本发明所述猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的构建方法的一种优选方案，其中：所述双酶切的酶切位点为HindⅢ和EcorⅠ。

作为本发明所述猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的构建方法的一种优选方案，其中：所述连接酶为T4DNA连接酶，其中，VP1片段与质粒载体的比例为0.3pmol:0.03pmol。

作为本发明所述猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的构建方法的一种优选方案，其中：所述VP1模板为VP1通过linker连接得到的4×VP1；其中，所述VP1的序列如SEQ ID NO.8所示，所述linker的序列如SEQ ID NO.9所示。

作为本发明所述猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的构建方法的一种优选方案，其中：所述pXMJ19-H36-VP1的构建方法包括，

设计上下游引物p3、p4，引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，通过引物将pXMJ19-VP1的启动子Ptac更换为H36启动子，使用Pri mestarMAX聚合酶通过PCR对其进行反应，回收PCR反应后的产物进行重组，即得到序列如SEQ ID NO.7所示的质粒pXMJ19-H36-VP1；

将pXMJ19-H36-VP1质粒转入大肠杆菌感受态中，培养、涂布、筛选并挑取单菌落继续培养后进行质粒提取，纯化后测序。

作为本发明所述猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的构建方法的一种优选方案，其中：所述重组通过Assembly Mix重组酶与回收产物重组，其中，Assembly Mix重组酶和柱回收产物质量比为1：1。

本发明的再一目的是，克服现有技术中的不足，提供一种猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，将所述载体转入谷氨酸棒状杆菌感受态中，能够实现分泌表达。

作为本发明所述猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的应用的一种优选方案，其中：所述载体在谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中能够实现VP1表达量的显著提升。

本发明有益效果：

本发明构建得到了一种猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体，该载体在以谷氨酸棒状杆菌作为底盘菌株时能够分泌表达，与现有技术相比，实现了在除大肠杆菌以外的底盘菌株中表达VP1，提高其表达量以及活性；同时本发明还通过更换合成型启动子来构建表达载体，实现VP1表达量的进一步提升，为开发猪O型***亚单位疫苗提供了一种新的更安全的方案。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明实施例1构建的pXMJ19-VP1质粒图谱。

图2为本发明实施例2构建的pXMJ19-H36-VP1质粒图谱。

图3为本发明pXMJ19-VP1在谷氨酸棒状杆菌中表达的凝胶成像图。

图4为本发明pXMJ19-H36-VP1在谷氨酸棒状杆菌中表达的凝胶成像图。

图5为本发明实施例4间接法ELISA测定活性的结果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明中进行Western-blot蛋白检测分析时用到的溶液包括：

转模缓冲液(Western杂交用)：Glycine 2.9g/L；Tris 5.8g/L；SDS 0.37g/L；甲醇200ml/L；

TBST Buffer(Western杂交膜清洗液)：Nacl 8.8g/L；1M Tris-HCl(PH8.0)20ml/L；Tween 200.5ml/L；

PBS Buffer:Nacl 8g/L；KCl 0.2g/L；Na₂HPO₄ 1.42g/L；KH2PO40.27g/L；(PH值调至7.4)

本发明中通过镍亲和层析纯化pXMJ19-H36-VP1发酵生产的VP1用到的溶液包括：

A液：Tris 20m mol/L，Nacl 500m mol/L，咪唑10m mol/L,甘油5％。

B液：Tris 20m mol/L，Nacl 500m mol/L，咪唑500m mol/L,甘油5％。

实施例1

本实施例构建了pXMJ19-VP1质粒载体，具体为：

1)获得质粒载体：应用序列如SEQ ID NO.10所示的pXMJ19组成型空载质粒通过快切酶双酶切将载体切开，酶切位点为HindⅢ和EcorⅠ，两种快切酶各5ul,载体质量控制在4500-5000ng之间，green buffer 10ul，最终加无核酸酶灭菌水至100ul。

2)获得VP1片段：设计上下游引物p1、p2，引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，通过引物***酶切位点；使用estaq聚合酶通过PCR对VP1模板进行反应，得到VP1片段，序列如SEQ ID NO.3所示；

再应用Takara Bio宝日医生物公司快切酶，酶切位点为HindⅢ和EcorⅠ，两种快切酶各3.5-4ul,片段质量在3500-4000ng之间，green buffer 10ul,最终加无核酸酶灭菌水至100ul，得到酶切后的VP1片段产物，使用产物进行柱回收；

其中，PCR反应条件为：94℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共35个循环，72℃保温2min；

VP1模板为VP1通过linker连接得到的4×VP1，其中，所述VP1的序列如SEQ IDNO.8所示，所述linker的序列如SEQ ID NO.9所示。

3)连接：用Takara Bio宝日医生物公司的T4DNA连接酶将VP1片段产物和质粒载体连接成pXMJ19-VP1质粒，其中，VP1片段产物：载体＝0.3pmol:0.03pmol，buffer 2ul，T4DNA连接酶为1ul，最终加无核酸酶灭菌水至20ul，在16℃的条件下连接一小时，获得pXMJ19-VP1质粒图谱如图1所示，序列如SEQ ID NO.4所示。

4)培养：将pXMJ19-VP1质粒转化入由翊圣生物公司提供的DH5α大肠杆菌感受态中，冰浴25min后，42℃水浴热激45s-1min，热激后再冰浴2-3min，转入37℃摇床进行45-60min的恢复培养；

恢复培养后，涂布氯霉素抗性的LBB培养基平板(LBB培养基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，脑心浸出液10g/L，琼脂粉20g/L)。，平板培养12-16h，蓝光仪下进行单菌落的初筛选，对有荧光的单菌落进行液体培养基的培养，(液体培养基LBB：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，脑心浸出液10g/L)培养12-16h，提取2ml菌液进行质粒提取，提取纯化后的质粒通过金唯智公司进行质粒序列测序。

实施例2

本实施例构建了pXMJ19-H36-VP1质粒载体，具体为：

1)构建质粒：pXMJ19-H36-VP1质粒构建采用环状PCR后重组的方法，设计上下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示，通过引物将原启动子Ptac更换为H36启动子；使用Primestar MAX聚合酶通过PCR得到线性质粒序列，PCR完成后，将产物进行柱回收，回收后得到的产物进行重组(Assembly Mix重组酶和柱回收产物各10ul；50℃，1h)；

其中，PCR反应条件为：98℃预变性3min，98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共35个循环，72℃保温2min。

2)培养：将pXMJ19-H36-VP1质粒转化入由翊圣生物公司提供的DH5α大肠杆菌感受态中，冰浴25min后，42℃水浴热激45s-1min，热激后再冰浴2-3min，转入37℃摇床进行45-60min的恢复培养；

3)恢复培养后，涂布氯霉素抗性的LBB培养基平板(LBB培养基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，脑心浸出液10g/L，琼脂粉20g/L)。平板培养12-16h，蓝光仪下进行单菌落的初筛选，对有荧光的单菌落进行液体培养基的培养。(液体培养基LBB：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，脑心浸出液10g/L)培养12-16h，提取2ml菌液进行质粒提取，提取纯化后的质粒通过金唯智公司进行质粒序列测序，pXMJ19-H36-VP1质粒图谱如图2所示,序列如SEQ ID NO.7所示。

实施例3

分别取pXMJ19-VP1质粒，pXMJ19-H36-VP1质粒各5ul，谷氨酸棒状杆菌(BZH001)感受态80～100ul，分别将质粒打入BZH001感受态中，冰浴10-15mim，1800v电击两次，将质粒与BZH001感受态的混合液打入LBHIS培养基中，46℃水浴6min，30℃摇床恢复培养1.5～2.5h，涂布LBHIS+氯霉素抗性的固体培养基平板，30℃培养箱培养24h。

其中，LBHIS培养基：酵母膏2.5g/L，蛋白胨5g/L，Nacl 5g/L，脑心浸出液18.5g/L，山梨醇91g/L。

Western-blot蛋白检测分析：

培养24h后的平板菌，挑单菌落在LBB+氯霉素抗性的液体培养基中培养12h，作为菌落的活化阶段；

12h后，将活化的菌液转入新的LBB+氯霉素抗性液体培养基发酵24h；

取菌液并定量到10OD，对定量后的菌液进行细胞破碎的操作：

首先将菌液离心，弃上清，用PBS缓冲液清洗；再次离心，弃上清，用PBS缓冲液清洗；利用超声破碎仪进行细胞破碎，破碎周期为3分钟，采用破碎1S,静止2S的破碎方式；

破碎好的蛋白样品按照样品量：buffer＝4:1的比例混合；混合后水浴煮沸5min；

利用预制胶进行SDS-PAGE的蛋白凝胶电泳实验检测，(120V电压，运行1.5h)；之后进行Western-blot实验检测(300mA电压，运行1.5h)。

将转模后的模纸用5％的脱脂牛奶孵育1h；再用带有万分之二的his抗体的5％的脱脂牛奶孵育1h,随后用TBST缓冲液清洗3次，可用凝胶成像***进行成像，如图3、4所示。

图3中M为Marker,L1为阴性对照，L2～L4为pXMJ19-VP1三组平行样，图4中M为Marker,L1为阴性对照，L2为pXMJ19-VP1质粒表达结果，L3～L5为pXMJ19-H36-VP1三组平行样，由图可以看出，本发明构建的质粒表达载体能够成功实现在谷氨酸棒状杆菌中的表达，同时，图4中L3-L5泳道的条带深度明显强于L2泳道，说明通过替换启动子还能够实现蛋白表达量的增加。

实施例4

通过镍亲和层析纯化发酵pXMJ19-H36-VP1质粒生产的VP1：

发酵结束后收集300mL发酵液，7500r/min离心20min，150ml的Buffer A洗涤3次后重悬，进行高压匀浆破碎，将破碎完成后的破碎液离心，取上清进行纯化；

将进样泵A2、B1放入已超声的无菌水中，进行泵洗(流速：10mL/min，压力：1.5Mpa)，完成后冲洗管路约10个柱体积，流速调为1mL/min，清洗上样杯，将压力调为0.35Mpa，接镍柱，并冲洗5个柱体积，将A2泵放入A液，B1泵放入B液，泵洗并冲洗5个柱体积进行平衡；

UV调零，蛋白样品通过进样杯，上样于预先平衡好的纯化柱，上样完成后，使用A液冲洗柱子10个柱体积，10％的B液清洗镍柱上的杂蛋白，收集1ml流川液，使用40％的B液将目标蛋白洗脱，并连续收集12管1ml的洗脱液，用100％B液冲洗镍柱，收集1ml洗脱液，收集完备后，换20％乙醇洗至基线平，得到纯化的结构蛋白VP1。

间接法ELISA测定活性

将纯化后的40％B液洗脱收集的蛋白样品和100％B液洗脱后收集的蛋白样品稀释10倍，每孔100μL上样，每个样品对应一个复孔，有两个孔只加100μL洗涤液，另留两个完全空白孔；

上样结束后将酶标板置于37℃恒温恒湿箱中过夜包被，将过夜包被的酶标板用ELISA洗涤液洗板三次，洗涤后加入一抗孵育液，每孔100μL，盖上盖板置于37℃恒温恒湿箱中孵育40min；

孵育结束后用ELISA洗涤液洗板五次，洗板结束后加入二抗孵育液，每孔100μL，随后将酶标板置于37℃培养箱中孵育30min，二抗孵育结束后用ELISA洗涤液洗板十次，洗板结束后每孔加入100μL显色液，盖上盖板，用锡箔纸将酶标板包住，放至37℃培养箱避光显色10min，显色结束后立即向酶标板中加入ELISA终止液终止显色，每孔50μL，结果如图5所示。

如图5，从左到右依次为：洗脱液空白对照组(两个孔)，40％B液洗脱后收集的蛋白样品(两个孔)，100％B液洗脱后收集的蛋白样品(两个孔)，完全空白对照组(两个孔)，从图中的颜色变化中可以看到，本研究中的VP1能够与阳性血清发生特异结合，具有免疫活性。

对比例1

本对比例在构建pXMJ19-VP1质粒载体的过程中直接以序列如SEQ ID NO.8所示的VP1作为VP1模板，其余步骤均与实施例1相同，得到pXMJ19-VP1-0质粒。

按照实施例3的方法将本对比例构建得到的载体质粒打入谷氨酸棒状杆菌感受态中，再打入LBHIS培养基中培养，并按上述方法进行Western-blot蛋白检测分析，通过凝胶成像***进行成像，结果发现本对比例构建的质粒载体在谷氨酸棒状杆菌中无法实现表达，且免疫活性也无法确认。由此可见，本发明的质粒构建过程中，若其中某一引物或模板序列发生改变，得到的载体都可能无法在谷氨酸棒状杆菌中实现表达。

综上，本发明构建得到了一种猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体，实现在以谷氨酸棒状杆菌作为底盘菌株时的分泌表达，且能够只表达猪O型***病毒结构蛋白；与现有技术相比本发明实现了在除大肠杆菌以外的底盘菌株中表达VP1，提高其表达量以及活性；同时本发明还通过更换合成型启动子来构建表达载体，实现VP1表达量的进一步提升，为开发猪O型***亚单位疫苗提供了一种新的更安全的方案。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的构建方法，其特征在于：所述表达载体包括pXMJ19-VP1和pXMJ19-H36-VP1，序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7所示；

所述表达载体pXMJ19-VP1的构建方法包括，

通过快切酶双酶切将序列如SEQ ID NO.10所示的pXMJ19组成型空载质粒切开，获得质粒载体A；

设计上下游引物p1、p2，引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，通过引物***酶切位点，使用estaq聚合酶通过PCR对VP1模板进行反应，获得序列如SEQ ID NO.3的VP1片段；

通过连接酶连接VP1片段与质粒载体A，获得质粒pXMJ19-VP1，序列如SEQ ID NO.4所示；

将pXMJ19-VP1质粒转入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态中，培养、涂布、筛选并挑取单菌落继续培养后进行质粒提取，纯化后测序；

所述VP1模板为VP1通过linker连接得到的4×VP1；其中，所述VP1的序列如SEQ IDNO.8所示，所述linker的序列如SEQ ID NO.9所示；

所述表达载体pXMJ19-H36-VP1的构建方法包括，

设计上下游引物p3、p4，引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，通过引物将pXMJ19-VP1的启动子Ptac更换为H36启动子，使用PrimestarMAX聚合酶通过PCR对其进行反应，回收PCR反应后的产物进行重组，即得到序列如SEQ ID NO.7所示的质粒pXMJ19-H36-VP1；

将pXMJ19-H36-VP1质粒转入大肠杆菌感受态中，培养、涂布、筛选并挑取单菌落继续培养后进行质粒提取，纯化后测序；

将所述表达载体转入谷氨酸棒状杆菌（C. glutamicum）感受态中，能够实现分泌表达。

2.如权利要求1所述的猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的构建方法，其特征在于：所述双酶切的酶切位点为HindⅢ和EcorⅠ。

3.如权利要求1所述的猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的构建方法，其特征在于：所述连接酶为T4DNA连接酶，其中，VP1片段与质粒载体的比例为0.3pmol:0.03pmol。

4.如权利要求1所述的猪O型***病毒结构蛋白VP1的表达载体的构建方法，其特征在于：所述重组通过Assembly Mix重组酶与回收产物重组，其中，Assembly Mix重组酶和柱回收产物质量比为1：1。