CN1198647C - 抗人cd40抗体 - Google Patents
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Abstract
本申请人发现新颖的嵌合和人源化抗CD40抗体，所述的抗体阻断gp39和CD40之间的相互作用。本发明的抗CD40抗体有效地调节抗T细胞依赖的抗原，胶原诱导的关节炎和皮肤移植中的体液免疫应答，并且它们的抗炎症特性也是有用的。
Description
发明背景
免疫/炎症应答是由一系列复杂的相互作用所介导的。已经表明在这些过程中一种重要的受体/配体对是CD40/gp39。gp39/CD40的相互作用介导免疫***的活化T细胞和其他效应细胞之间许多重要的信号传导事件，从而导致免疫应答的放大。通过CD40信号传导的应答包括在体液免疫应答过程中辅助B细胞的T细胞，单核细胞诱导细胞因子的过程以及由内皮细胞引起的粘附分子的表达。
CD40是一种I型细胞表面受体并且是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超基因家族成员之一。尽管原来被鉴定为一种B细胞抗原，现在认为CD40是由包括树突细胞、角质细胞和单核细胞的所有抗原呈递细胞(APC)所表达的。CD40也由在某些条件下能起APC作用的细胞类型所表达，如血管内皮细胞，或者是涉及与T细胞或T前体细胞直接相互作用的细胞，如胸腺上皮细胞。最近，也有报道CD40能由成纤维细胞、嗜酸性细胞和活化的T细胞表达。CD40的表达也在癌细胞中观察到。有关这方面的证据，最初来源于一些鉴定为CD40+T细胞的来自癌和黑色素瘤的细胞系(Clark和Ledbetter，美国国家科学院院报(1986)83：4494-98；Schriever等，实验医学杂志(1989)169：2043-58；Caux.等，实验医学杂志(1994)180：1263-72；Alderson等，实验医学杂志(1993)178：669-74；Young等，国际癌症杂志1989)43：786-94；Paulie等，癌症免疫学和免疫治疗(1985)20：23-28；Denfeld等，欧洲免疫学杂志1996)26：2329-34；Gaspari等，欧洲免疫学杂志(1996)26：1371-77；Peguet-Navarro等，免疫学杂志(1997)158：144-52；Hollenbaugh等，实验医学杂志(1995)182：33-40；Galy和Spits等，免疫学杂志(1992)149：775-82)。Gp39也被称为CD40L、TRAP、T-BAM，而现在根据白细胞工作组的规定有了官方的名称CD145。在体外测试中，gp39在T细胞活化后大约2-4小时在T细胞上出现，并且其水平在6-8小时达到高峰。然后，该蛋白水平快速下降并在刺激后24小时检测不到。Gp39的表达也在嗜酸性细胞和肥大细胞中检测到(Noelle等，美国国家科学院院报(1992)89：6550-54；Hollenbaugh等，EMBO J(1992)11：4313-21；Spriggs等，实验医学杂志(1992)176：1543-50；Graf等，欧洲免疫学杂志(1992)22：3191-94；Covey等，分子免疫学(1994)31：471-84；Castle，免疫学杂志(1993)151：1777-88；Roy等，免疫学杂志(1993)151：2497-2510；Gauchat等，自然(1993)365：340-43；Gauchat等，欧洲免疫学杂志(1995)25：863-65；Koshy等，临床研究杂志(1996)98：826-37；Desai-Mehta，临床研究杂志(1996)97：2063-73)。
CD40是一种强有力的信号传导受体，提供一种针对活化的T细胞的机制，以调节广泛范围的免疫和炎症应答。在用gp39配体的重组型和抗CD40单抗的体外和体内研究中表明，通过该受体的信号传导导致在所有已知的CD40+细胞的细胞应答，该结果不仅依细胞类型而变化，而且也受其他受体同时出现的信号传导事件调节。例如，在B细胞中，与IL-4受体信号传导相连的CD40信号传导导致B细胞增殖和产生IgE同型抗体，而与来自IL-10受体的信号相连的CD40信号传导导致B细胞增殖和产生IgG同型抗体(Gordon等，欧洲免疫学杂志(1987)17：1535-38；Rousset等，实验医学杂志(1991)173：705-710；Jabara等，实验医学杂志(1990)172：1861-64；Gascan等，免疫学杂志(1991)147：8-13)。Gp39介导的CD40信号传导可能在细胞免疫中通过诱导CD80和CD86而起作用，CD80和CD86是结合CD28和CTLA4的重要的T细胞共刺激分子(Goldstein等，分子免疫学(1996)33：541-52)。
CD40/gp39受体/配体***是涉及免疫***活化的T细胞和其他细胞之间产生相互作用的许多***之一。然而，许多研究发现表明这种相互作用是独特的，并且在人类中调节体液免疫应答起中心作用。尤其是，已经表明gp39的表达或结构缺陷是熟知的X连锁高IgM(X-HIM)综合症的人免疫缺陷症的原因。这种免疫缺陷症的特征是受累个体不能产生不是IgM同型的抗体，表明gp39和CD40之间产生的相互作用对有效的体液免疫应答是必须的(Allen等，美国国家科学院院报(1993)259：990-93；Aruffo等，细胞(1993)72：291-300；Di Santo等，自然(1993)361：541-43；Fuleihan等，美国国家科学院院报(1993)90(6)：2170-73；Korthauer等，自然(1993)361：539-541；Nortarangelo等，免疫防御综述(1992)3：101-22)。同样地，最近资料表明人类中非X连锁的HIM综合症是由CD40分子中的缺陷引起的。用基因敲除技术，产生了缺乏CD40或gp39的小鼠。这些小鼠出现的表现型与HIM综合症相同的特征，这表明这些小鼠是一种合适的模型，可用于测定阻断CD40和gp39之间相互作用的抗CD40或抗gp39单抗体内治疗的效果(Kawabe等，免疫(1994)1：167-78；Xu等，免疫(1994)1：423-431；Renshaw等，实验医学杂志(1994)180：1889-1900；Castigli等，美国国家科学院院报(1994)91：12135-39)。
用仓鼠抗小鼠gp39单抗(MR1)，广泛地研究了在正常小鼠和小鼠的疾病模型中CD40/gp39相互作用的体内抑制的影响。该抗体的免疫抑制能力表现在其对T细胞依赖抗原的完全抑制体液免疫应答的能力(Foy等，实验医学杂志(1993)178：1567-75)。也已表明用该抗体治疗抑制了几种小鼠模型的免疫疾病，包括那些由细胞免疫应答介导的疾病。显示为用抗gp39治疗抑制的疾病模型包括胶原诱导的关节炎、实验性***脑脊髓炎、狼疮肾炎、转移排斥以及移植物抗宿主反应(Durie等，科学(1993)261：1328-30；Berry等，未发表的资料；Gerritse等，美国国家科学院院报(1995)93：2499-504；Mohan等，免疫学杂志(1995)154：1470-1480；Larsen等，移植(1996)61：4-9；Hancock等，美国国家科学院院报(1996)93：13967-72；Parker等，美国国家科学院院报(1995)92：9560-64；Durie等，临床研究杂志(1994)94：1333-38；Wallace等，未发表的资料)。在细胞免疫应答的放大中，CD40/gp39的作用可能直接刺激能表达CD40的活化T细胞亚类，或非直接诱导细胞因子和重要的共刺激细胞表面分子如CD28和CD86的表达，这些分子与T细胞受体CD28和CTAL-4结合。该抑制剂的抗炎效应用研究氧诱导的肺损伤小鼠模型阐明。体外结果说明对位于血管内皮细胞上和单核细胞上的CD40的刺激，导致细胞粘附分子、一氧化氮(NO)、基质金属蛋白酶和前炎症细胞因子的表达，这些结果暗示对体内的炎症有影响(Kiener等，免疫学杂志(1995)155：4917-25；Malik等，免疫学杂志(1995)156：3952-60；Hollenbaugh等，实验医学杂志(1995)182：33-40)。
用抗人的gp39单抗在猴子中的研究显示，在体内抑制gp39和CD40之间相互作用的生物制品是灵长类的有效免疫抑制剂。已经表明：抗gp39单抗在抑制对T细胞依赖的抗原的抗体应答中是有效的，并保护同种异体移植排斥也有效，出现了在啮齿类所观察到的相似结果。
综合以上的研究表明，干扰gp39和CD40之间相互作用的药剂将是十分有效的免疫抑制剂和抗炎剂。因此，本领域存在对阻断CD40/gp39相互作用的有效方法的需求，以提供免疫抑制或抗炎效应。本发明的一个目的是提供一种能阻断gp39和CD40之间相互作用的抗体。
本发明的另一个目的是提供一种有效地阻断gp39和CD40之间相互作用的嵌合抗体。
本发明的另一个目的是提供一种有效地阻断gp39和CD40之间相互作用的人源化抗体。
本发明的进一步的目的是提供一种施用本发明的抗体、嵌合抗体或人源化抗体而调节免疫应答的方法。该方法用于治疗任何自身免疫病以及皮肤或其他器官移植。
发明概述
本发明包含一种新颖的抗体，更优选的是一种抗人的嵌合CD40单克隆抗体(单抗)，它阻断gp39和CD40之间相互作用。在本发明的一个实施方案中，特别优选的抗人嵌合CD40单抗被称为“χ220”。χ220是一种包含鼠可变区和人κ和γ1恒定区的嵌合抗体。象其亲本小鼠单抗一样，χ220与CD40结合，结果以剂量依赖方式有效地阻断对T细胞依赖的抗原的体液免疫应答。
本发明还包括阻断gp39和CD40之间相互作用的人源化抗CD40抗体。在本发明的一个实施方案中，一种人源化抗体被称为F4；而在另一个实施方案中，所述的人源化抗体被称为L3.17。本发明的优选人源化抗体包含其中移植有鼠CDR的人可变重链区和可变轻链区。
本发明的抗CD40的抗体，优选的是在此披露的嵌合抗体和人源化抗体，在调节抗T细胞依赖的抗原、诱导关节炎的胶原和移植排斥的体液免疫应答中有效。本发明的抗CD40的抗体，优选的是在此披露的嵌合抗体和人源化抗体，也具有用于抗炎的特性(与用抗gp-39所观察到的结果相似)。
本发明的抗体，尤其是抗CD40的嵌合抗体χ220和抗CD40的人源化抗体F4和L3.17，具有广泛的治疗用途，包括用于自身免疫病、炎症和移植。由于在几种组织类型的恶性细胞中观察到CD40表达，显然易见，本发明的抗CD40抗体，尤其是嵌合抗体和人源化抗体，具有潜在的肿瘤学方面的用途。
下列缩写用于整个本申请中，这些缩写在本领域的技术人员中公知： APC(抗原呈递细胞)；CDR(互补决定区)；CHO(中国仓鼠卵巢)；CIA(抗原诱导的关节炎)：Cmax(最大血清浓度)：COS(非洲绿猴成纤维细胞系)：DMARD(疾病修饰的抗风湿药物)；ELISA(酶联吸附免疫测定)；EPT(终点滴度)；EU(内毒素单位)；Fab(抗原结合片段)； FITC(异硫氰酸荧光素)：Hu(人源化)；h106-2(人源化抗gp39-单抗)；HAMA(人抗小鼠抗体)：im(肌肉内)；KLH(匙孔血蓝蛋白)：mAb(单克隆抗体，单抗)；MTX(氨甲碟呤)：OVA(卵白蛋白)：PBS(磷酸盐缓冲液)；PCR(聚合酶链式反应)；PE(藻红蛋白)：sc(皮下)；SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)；SEC(大小排阻层析)；SRBC(绵羊红血细胞)；STR(搅拌罐反应器)；TNF(肿瘤坏死因子)；VL(抗体轻链可变区)；VH(抗体重链可变区)。
一种编码本发明嵌合抗体(嵌合抗体2.220)的优选轻链的核苷酸被保藏在美国典型培养物保藏中心，给定的保藏号为ATCC＿＿。一种编码本发明嵌合抗体(2.220)的优选重链的核苷酸被保藏在美国典型培养物保藏中心，给定的保藏号为ATCC＿＿。
一种编码本发明人源化抗体(人源化抗体F4)的优选轻链的核苷酸被保藏在美国典型培养物保藏中心，给定的保藏号为ATCC＿。一种编码本发明人源化抗体(人源化抗体L3.17)的另一条优选轻链的核苷酸被保藏在美国典型培养物保藏中心，给定的保藏号为ATCC＿。一种编码本发明人源化抗体(人源化抗体F4和L3.17)的优选重链的核苷酸被保藏在美国典型培养物保藏中心，给定的保藏号为ATCC＿＿。
本发明所指的保藏物，根据用于专利程序的微生物保藏国际确认规则的布达佩斯条约所要求的条件，维持贮存。这些保藏物仅为本领域的技术人员提供方便，而不是U.S.C.§112规则对保藏物所要求的默许使用。在保藏材料中含有的该聚核苷酸的序列以及由此所编码的多肽的氨基酸序列，在此引入仅供参考，并作为本发明任何序列描述有冲突时的对照。制取、使用或销售所述的保藏材料可能需要许可证，因此上述的许可是不许批准的。
在本申请中无论是前面或后面所引用的所有参考文献，作为整体在此引入仅供参考。
附图简述
图1显示由抗人CD40单抗对sgp39与Raji细胞结合的抑制作用。
图2是一个概要图示的灵长类研究方案。治疗天数用菱形表示。用SRBC和KLH免疫分别用长方形和三角形表示。不研究超过I期用2.36治疗的动物，以及不研究超过II期用1.106治疗的动物。
图3显示在灵长类中抗SRBC抗体的应答。图3a显示IgM抗SRBC抗体的分析结果。图3b显示IgG抗SRBC抗体的分析结果。
图4a显示χ220的轻链可变区的序列，用粗线表示(SEQ ID NO：1)，图4b显示χ220的重链可变区的序列，用粗线表示(SEQ ID NO：2)。在图4a和4b中下划线的序列是人抗体具有最紧密同源性的***信号序列，它被用作人源化的模板。
图5显示体外测定本发明的嵌合和人源化抗体的结果。图5a显示用基于ELISA的测定法反映220和h220v3与hCD40-mG2b的结合。图5b显示用抗人的CD40单抗s对sgp39介导的人B细胞共刺激的抑制作用。
图6显示IgM抗SRBC抗体的应答。图6a显示来自接受10、40或100mg/kg的χ220的猴子的结果。图6b显示来自接受0.1或1mg/kg的χ220的猴子的结果。
图7显示IgG抗SRBC抗体的应答。图7a显示来自接受10、40或100mg/kg的χ220的猴子的结果。图7b显示来自接受0.1或1mg/kg的χ220的猴子的结果。
图8显示在灵长类中抗OVA抗体的应答。图8a显示IgM抗OVA抗体的分析结果。图8b显示IgG抗OVA抗体的分析结果。
图9显示在灵长类中抗KLH抗体的应答。图9a显示IgM抗KLH抗体的分析结果。图8b显示IgG抗KLH抗体的分析结果。
图10显示抗体7E1-G1和7E1-G2b抑制对SRBC的IgG抗体应答的比较结果。
图11显示用7E1-G2b对SRBC抗体应答的抑制作用的剂量反应曲线。
图12显示负责本发明嵌合抗体的轻链和重链区的表达载体图谱。
图13提供一条负责一种表达载体的核酸序列，该表达载体能表达一条本发明嵌合抗体的重链。起始ATG(核苷酸1000-1002)，编码人抗体的***信号序列的起始Met，用粗线表示。下划线的1057-1422的核苷酸(SEQ ID NO：5)提供一种编码本发明抗体的一条可变重链的优选核酸序列。
图14提供一条负责一种表达载体的核酸序列，该表达载体能表达一条本发明嵌合抗体的轻链。起始ATG(核苷酸1005-1007)，编码人体的***信号序列的起始Met，用粗线表示。下划线的1065-1388的核苷酸(SEQ ID N：6)提供一种编码本发明抗体的一条可变轻链的优选核酸序列。
图15显示鼠抗CD40可变区和人模板序列的对比排列。鼠抗CD40H和L链可变区的氨基酸被用于鉴定同源人种系的序列。根据Kabat等的方法(Kabat，E.A.等，(1991)，目的免疫蛋白的序列(第5版)华盛顿DC：美国人类健康服务部；Kabat，E.A.等，(1977)，生物化学杂志252：6609-6616)。序列中的差异由垂直线表示，而在组合表达文库中具有特征的构架区位置用星号表示。
图16显示人源化抗CD40变体作用固化抗原的滴度的结果。特征描述细菌表达的嵌合CD40 Fab和选自每种文库的变体的特点。嵌合(实心圆)、Hu I-19C11(空心圆)、Hu II-CW43(空心方形)、HuITI-2B8(实心三角形)和无关的(实心方形)Fab从15ml的细菌培养液的周质腔中释放，然后系列稀释物与固定在微滴定板上的CD40-Ig的抗原温育。抗体结合按照下列描述的方法定量。
图17表示抗体的亲和力如何与可溶性的gp39和CD40-Ig结合的抑制作用相关。CD40受体的配体，gp39，在微滴定板中捕获。接着，各种数量的纯化嵌合(实心圆)、Hu II-CW43(空心方形)、Hu III-2B8(实心三角形)、Hu II/III-2B12(空心圆)和无关的(实心方形)Fab，在微滴定板上与2μg/ml的CD40-Ig共温育。CD40-Ig与gp39的结合按照下列描述的方法定量。
图18显示在活性位点中的鼠构架区残基的定量关系。对来自构架区最适文库Hu I(A)和构架区/HCDR3最适文库Hu II(B)的最高活性的抗CD40变体的可变区测序，以鉴定构架区文库位置上的氨基酸。根据在8个构架区文库位置保留的鼠残基的总数，将每种独特的变体分类。来自Hu I文库的34个克隆和来自Hu II文库的14个克隆被测序，结果分别鉴定出24和10个独特的变体。实线表示预期来自随机选择变体的相同数目的序列分布。
本发明详述
本发明者开发了具有免疫抑制特性的嵌合和人源化抗CD40的抗体。上述抗CD40抗体拥有作为治疗剂的明显用途。本发明者也开发了一种接近匹配的抗小鼠CD40单抗(与抗人CD40单抗接近匹配)，该抗体用于研究在许多免疫和炎症疾病的小鼠模型中抗CD40单抗治疗的效应。由于CD40是一种强有力的信号传导分子，开发抗CD40的抗体比较复杂。根据刺激CD40信号传导的能力以及阻断CD40/gp39相互作用的能力，可将结合该抗原的抗体分类。
申请人的抗人CD40单抗能阻断CD40/gp39的相互作用，是从多组的抗CD40单抗选出来的。标记为2.220的该抗体，是嵌合和人源化的。“嵌合”抗体包含一条轻链和一条重链：所述的轻链包含一个轻链可变区和一个轻链恒定区；所述的重链包含一个重链可变区和一个重链恒定区。嵌合抗体包含来自一个物种的可变区和来自另一个物种的恒定区(例如，小鼠可变区与人恒定区连接)。(如见，美国专利4,816,397和4,816,567)。每种轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由称为“互补决定区”或“CDRs”的三个超变区间断的“构架区”组成。“人源化”抗体包含具有人构架区并与来自供体小鼠和大鼠免疫球蛋白的CDRs组合在一起的抗体。(如见，美国专利5,530,101)。包括在本发明范围之中的人源化抗体，也包含在此披露的来自鼠可变链的CDRs。
人源化抗体的最直接途径包括将来自供体单抗的CDRs移到人构架区上(Jones，P.T.等，(1986)自然321：522-525)。然而，某些构架区的残基支持CDR的结构，并且移植鼠CDRs的抗原与人构架区模板接触可能减弱得到的人源化单抗的结合能力(Foote，J.等，(1992)分子生物学杂志224：487-499)。评价特异的构架区残基对抗体亲和力的潜在贡献引起了两个问题。首先，对具体的单抗来说，预测那一个构架区残基在维持亲和力和特异性中起关键的作用是困难的。其次，对亲本单抗和人模板之间有差异的构架区残基来说，预测来源于鼠亲本或人模板的氨基酸是否会产生更高活性的单抗是困难的。因此，绝对依赖结构预测的人源化抗体的方法不总是成功的。
以前的技术描述一般抗体构建策略时，提出了免疫后维持抗体结合能力的难点(Rosok，M.J.等，(1996)生物化学杂志271：22611-22618)。通过合成和表达一种组合抗体文库的单一步骤，确定潜在的在亲本单抗和人模板之间有差异的构架区残基的特点，所述的抗体文库含有所研究的在构架区位置亲本和人模板氨基酸的全部可能的组合。表现为最佳构架区结构的变体通过筛选法鉴别，然后，最佳的构架区结构由DNA测序法确定。一般来说，测定多个活性克隆的序列表明，关键的构架区位置需要特异的氨基酸表达。反之，在活性克隆中，文库构架区位置的鼠或人的氨基酸以相等的频率表达，与对具体的构架区位置起更少的重要功能相一致。所以，根据功能结合法，可快速地鉴定保留亲本单抗结合活性的抗体的人源化版本。
抗体人源化和亲和力的成熟的过程经常按照周详的步骤进行(Rosok(1996)，同上；Yelton，D.E.等，(1995)免疫学杂志155：1994-2004；Wu，H等，(1998)美国国家科学院院报95：6037-6042；Baca，M等，(1997)生物化学杂志272：10678-10684；Marks，J.D.等，(1992)生物化学杂志267：16007-16010)。用一种下面描述的修改策略，产生了所表现的亲和力比嵌合Fab等价或更好的多种鼠单抗2.220的人源化版本。
本发明申请的抗CD40的嵌合抗体在此指的是“χ220”。本发明申请的接近匹配的抗小鼠CD40单抗在此指的是“7E1”。本发明申请的抗CD40的人源化抗体在此指的是“F4”和“L3.17”。
产生了两种不同的7E1同型抗体。在用抗CD40单抗治疗的免疫和炎症疾病的前临床模型中，这两种7E1的变体可用于检测该分子的Fc部分的作用。在本发明中也披露了抗小鼠CD40单抗的产生方法，用于挑选与χ220的特性匹配的抗体的标准，单抗同型变体的产生方法以及这些抗体在小鼠免疫疾病模型中的体内活性。用χ220和其鼠亲本单抗2.220在猴子中的研究以及用7E1在小鼠中的研究显示，这些抗CD40单抗是强有力的免疫抑制剂，并将在下面更详细的讨论。在此所述的这些研究，用本领域的技术人员熟知的标准技术进行。
总之，已经表明本申请的抗体能在猴子中抑制体液免疫应答。同样地，两种接近匹配的抗小鼠CD40单抗、7E1的同型变体，在许多人疾病的前临床模型中表现为免疫抑制活性。综合以上结果，这些发现表明χ220、F4和L3.17具有在治疗自身免疫病和移植方面的临床用途。
下列实施例仅为了说明的目的，并不是限制本发明的申请范围，这些申请范围仅由权利要求所限制。
实施例1
鼠抗人CD40抗体的选择
A.分离和体外特征描述特性
使用标准的杂交瘤技术，用CD40融合蛋白作为免疫原，产生了一系列的抗人CD40的单克隆抗体。用CD40+细胞系和融合蛋白，筛选与CD40结合的抗体。用gp39与CD40结合的测定法和通过CD40刺激的功能测定法，确定所克隆的抗体。然后，用灵长类细胞确定所选择的抗体的交叉反应性，以评估这些抗体用于灵长类前临床模型的适用性。
1.免疫接种和融合
进行两种融合以产生抗人CD40单抗的杂交瘤。产生免疫淋巴细胞的免疫接种在6-8周龄的雌性BALB/c的小鼠中进行，用一种重组的融合蛋白作为免疫原，该融合蛋白由融合有铰链区、鼠IgG2b抗体的CH2和CH3结构域的人CD40的细胞外结构域组成(hCD40-mG2b)。
对40-1的融合来说，用在完全弗氏佐剂中的30ug hCD40-mG2b的乳剂(总共200ul)，在小鼠皮下的3-4个位点进行初始免疫。相似地，在第21天，用在不完全弗氏佐剂中的hCD40-mG2b给所述的动物促进，然后在第37天通过溶在PBS中的30ug hCD40-mG2b的静脉注射进行最后一次免疫。除了用RiBi佐剂(R-730)替代弗氏佐剂外，也相似地进行对40-2融合的免疫接种。促进免疫在第21天和第42天进行，在第58天进行最后的前融合促进。
最后促进注射3天后，从脾和***中获取淋巴细胞，然后，用标准的方法(Kearney等，免疫学杂志(1979)123：1548-50；Lane，免疫学杂志(1985)81：223-28)，将淋巴细胞与小鼠X63-Ag8.653骨髓细胞以3∶1的比例融合。来自每种融合的细胞悬液接种到10块96孔的细胞培养板中，植板密度大约共为每孔170,000个细胞(融合前)。
2.筛选和克隆
用两种测定方式鉴别对人原始CD40具有特异性的单抗。用基于ELISA的方式，初步筛选来自所有孔的细胞培养上清液与CD40阳性的EBV转化的人B细胞系(1A2-2C)的结合能力。然后，用基于ELISA的方式，测定每种上清液与一种纯化重组的融合蛋白hCD40-Ig(由融合有人IgGl的铰链区、CH2和CH3的人CD40细胞外结构域组成)和一种相似构建的无关人Ig融合蛋白Leu8-hIg的反应性(Hollenbaugh，EMBO J(1992)11：4313-4321)。综合细胞结合的资料，与前者融合蛋白而不与后者融合蛋白有反应性，可确定在大约200个主孔中存在对原始CD40具有特异性的抗体。
一个所需的抗CD40单抗的关键功能特性是完全阻断CD40和其配体gp39的相互作用。因此，抗体选择的下一步是，用基于ELISA的方式，评价所有CD40特异的主孔上清液抑制sgp39与固化的hCD40-Ig的结合能力，sgp39是可溶的，重组鼠CD8-人gp39的融合蛋白。对完全抑制该相互作用的的那些抗体，接着用相同的方式进行滴定，以确立哪一孔含有最高滴度的抑制性抗体。根据这种分析，挑选出10个最明显抑制活性的主孔进行克隆。
合适地分泌抗体的细胞克隆，用二步法完成。首先，将来自每个主孔的细胞，以10个细胞/孔的接种密度进行“微克隆”，之后，用有限稀释法正式对最高滴度的CD40特异的“微克隆”孔进行克隆。
3.进一步的特性
六种测定方式用于进一步确定所述的抗体的特性。这些方式是sgp39与人B细胞结合的抑制作用、由附加抗IgM的sgp39诱导的对B细胞增殖的抑制作用、由活化的T细胞诱导的B细胞体外合成抗体的抑制作用、与抗IgM直接共刺激B细胞、在交叉连接的抗κ轻链抗体的存在下与抗IgM共刺激B细胞以及在第二抗CD40单抗，G28-5，的存在下与抗IgM共刺激B细胞。已知该单抗拥有强烈的共刺激活性并且不完全阻断CD40/gp39的相互作用。为便于比较它被包括在许多这些测定中。
该分析结果选出了4种单抗：1.66(IgG2b)、2.36(IgG2a)、2.174(IgG1)、2.220(IgG2a)。进行测定确定所述的单抗特性。在一实验中，来自人B细胞系Raji的细胞与2或20μg/ml的各种抗CD40单抗温育，然后与含有mCD8-gp39融合蛋白(sgp39)的未稀释COS细胞上清液进行第二次温育。通过与FITC标记的抗mCD8单抗进一步温育，然后在FACScan上分析这些细胞检测出结合的sgp39。与抗体温育过的样品的平均荧光强度除以第一次不与抗体温育的样品的平均荧光强度，计算出抑制百分率(图1)。
如图1所示，这四种单抗的每一种能完全抑制sgp39融合蛋白与高水平表达CD40的人B细胞系的结合，尽管在2.174的情况下，完全阻断需要相对高的抗体浓度。相似的数据也用人扁桃体B细胞得到。由二次功能测定的数据是平行的。首先，已显示每种单抗能完全阻断sgp39介导的对人扁桃体B细胞的共刺激作用。其次，在一体外T细胞依赖的B细胞抗体合成测定中，每一种明显地抑制IgG和IgM的产生。
四种抗体有三种表现为在抗IgM的存在下，有限的共刺激B细胞增殖的能力。在诱导弱共刺激活性的能力方面，单抗2.220更为一致。添加抗κ轻链抗体用于与抗CD40单抗s交联时，2.36得到明显的共刺激活性，而其他三种抗体的活性不受影响。当与四种新的抗CD40单抗的每一种配对组合时，G28-5的共刺激能力表现为分别调节。单抗1.66以及尤其是2.174增强G28-5的共刺激，而2.220和2.36抑制共刺激。
根据在人类中体外***评价选择后，进一步在非人的灵长类研究中检查该四种抗CD40单抗体内评价的适用性。分析的二个关键点是每种与灵长类B细胞结合的相对潜力和对体外的T细胞依赖的B细胞抗体合成的抑制能力。发现所有的四种单抗对cynomolgusmacaqe(Macaca fascicularis)B细胞有交叉反应性。2.36和2.220比2.174和1.66更高的亲合力结合。单抗2.174和1.66的较低表观结合不是由于它们的具体同型，因为其他同型匹配的抗CD40单抗表现为可与2.36和2.220相仿的结合水平(例如，G28-5和2.118)。这些结果与人B细胞观察到的结果相反，在B细胞中，每种单抗表现为可仿的结合。发现四种单抗抑制猴B细胞引起的抗体合成的能力，与其结合能力相平行。
B.体内特点
在非人的灵长类中用抗CD40单抗进行二种研究，以评价抗CD40单抗作为免疫抑制剂的适用性，然后选出合适的抗体作进一步的开发。首先，比较了所选择的四种抗CD40单抗的体内清除率和急性毒性。用这些结果选出了二种抗体2.36和2.220，然后在第二次研究中测定，设计该研究是评价对T依赖抗原的抗体应答的抑制效能以及急性毒性。
用2.36和2.220进行灵长类的功效研究
根据以前的发现，给cynomolgus猴静脉注射施用后，评价单抗2.36和2.220抑制T依赖的抗体应答的能力。这种研究分为三期进行(图2)。在I期中，由1只或2只雄性和2只雌性的cynomolgus猴组成的4组，在第1天，每组用绵羊红血球细胞(SRBCs)静脉内免疫，然后在第1、3和5天，用20mg/kg的单抗2.36、2.220、1.106(鼠抗人gp39的IgG1，阳性对照)、或L6(鼠抗人肿瘤抗原的IgG2a，阴性对照)。测定对SRBC免疫原的IgM和IgG的滴度，试验项和对照项的血清水平，存在抗试验项和对照项的抗体，血清免疫球蛋白的水平，外周血白细胞计数，以及外周血淋巴细胞各种亚群的频率。在II期中，清除试验项和对照项后，所述的动物用SRBCs和第二种抗原匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫，以评价诱导的免疫耐受和观察到的免疫抑制的可逆转性。在III期中，重新免疫选择的动物，以确定初次抑制的抗SRBC的抗体应答是否用SRBCs另外激发后重新获得，并评价对KLH的再次抗体应答。
进行的一个实验显示单抗2.220明显地抑制对SRBCs的初次抗体应答(图3)。在第I期的第1、3和5天，用20mg/kg的单抗1.106、L6、2.36或2.220治疗猴子。在第I、II和III期的第1天，猴子用SRBC免疫。图3a显示针对IgM抗SRBC的抗体的血清样品的分析结果；图3b显示针对IgG抗SRBC的抗体的血清样品的分析结果。数据以相应于每组抗SRBC的滴度的几何平均数表示(n＝3或4)。
高峰初次应答，对IgM和IgG来说分别被抑制85％和98％。清除血清中单抗2.220低于检测水平后，对SRBCs的高峰再次应答，与I期中阴性对照的应答相比，对IgM和IgG的抑制分别为79％和56％。这与阳性对照单抗1.106正好相反，其中观察到对SRBCs的强烈的再次抗体应答。对SRBCs的第三次应答不被抑制，这表明单抗2.220诱导较长时间的免疫抑制，但不诱导免疫耐受。用KLH免疫的所有动物具有初次和再次抗KLH的应答，表明该免疫抑制是可以逆转的。用2.36治疗的动物不包括在II期中，因为在I期的研究中没有观察到明显的抑制作用。
在最后一次剂量后立即发生的平均高峰血清浓度，对单抗2.220和2.36分别为744和405μg/ml。当到第15天从血清中清除的单抗2.36低于检测水平后，一直到第29天单抗2.220才被清除。单抗s2.36和2.220两者均具有免疫原性。
在任一只动物中，没有观察到药物相关的临床症状，体重或食物消耗量的变化，或者血液学或血清Ig水平的改变。唯一观察到的药物相关的发现是，用单抗2.36和2.220分别使外周B细胞的百分率短暂下降70％和43％。B细胞恢复到正常水平在治疗后2-3周出现。
总之，单抗2.220明显地抑制对SRBCs的抗体应答，而2.36不能。尽管单抗2.220诱导较长时间的抗原特异的免疫抑制，但它是可逆转的。根据这些发现，选择单抗2.220做进一步开发。
实施例2
嵌合抗体χ220的产生
为了说明鼠抗人单抗2.220的免疫原性，产生了重组型并体外比较其效能，在重组型中，可变区与人恒定区融合。使用两种方法产生嵌合抗体，含有未改变的鼠可变区和人源化型，在人源化型中，鼠超变区(CDRs)被移植到人构架区序列的可变区之内。嵌合抗体保留亲本抗体的抗原结合特性，但可能具有更大的免疫原性。人源化抗体更少出现免疫原性，但在导入人源化中的突变能影响抗原的结合。
A.嵌合和人源化抗体的构建和体外的特性
通过PCR得到来自抗CD40单抗2.220的VL和VH区。为分别获得VH或VL区，从表达2.220单抗的杂交瘤中分离RNA，用IgG1特异的或Cκ特异的反义引物产生cDNA。把聚G尾巴加到这些单链的cDNAs上。然后，用一种正义引物(一种含有聚C序列，与聚G尾巴互补的寡核苷酸)和一套巢式反义引物，用PCR扩增可变区。然后，得到的PCR产物被***到所用的限制性位点包括在引物中的细菌载体中。通过双脱氧核苷酸测序法测定多种克隆的序列。进行了两次独立的实验，在RNA阶段开始然后获得的序列是相同的。
为产生抗体的嵌合型，用引物通过PCR扩增可变区，所述的引物导入一段人抗体信号肽序列的序列，该序列如在图4所示，发现与2.220序列最接近匹配。轻链可变区序列(图4a)和重链可变区序列(图4b)的下划线部分表示***的与鼠2.220最接近同源性的人抗体信号序列。PCR产物被***到一种含有编码人κ或人γ1的恒定区序列的载体中，以分别产生完整的轻或重链。所述的载体也含有合适的抗药性基因，以产生和扩增表达该蛋白的稳定细胞系。通过来自COS细胞的瞬时表达，然后蛋白A纯化，产生初始特性的蛋白。
作为一个实施例，用负责嵌合抗体的重和轻链的不同表达载体共转染CHO DG44细胞，产生表达嵌合抗体的细胞系，用高拷贝的电穿孔法，以促进共整合。(见美国专利4,956,288)。χ220重和轻链分别被克隆到pD17和pD16的表达载体中。两种载体均来自InVitrogen质粒pcDNA3，并且含有如下的特征(图12)：(1)用无增强子SV40启动子控制下的鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，取代来自pcDNA3的新霉素抗性基因(也称为“弱DHFR”；注意仅启动子被弱化，而不是DHFR酶被弱化-无增强子的启动子仍含有SV40的复制起点，所以这些载体能用于瞬时COS转染)；(2)目的基因从CMV启动子表达，而聚腺苷化信号来自牛生长激素基因；(3)转录终止序列在目的基因的表达盒两侧(即，相对于启动子的5′和相对于聚A位点的3′)；(4)所述的载体含有两个不同的限制性位点的多接头，相对于启动子3′的一个用于克隆目的基因，而相对于启动子5′的一个用于转染前线性化载体；以及(5)便于质粒在大肠杆菌中增殖的氨苄青霉素抗性基因和Co1E1起点。
所用的重和轻链基因是基因组构建体，具有下列修饰：(1)负责重链信号肽的编码序列，可变区和CH1结构域是邻接的(即，不含有内含子)；以及(2)负责轻链信号肽的编码序列和可变区邻接的。
本领域的技术人员熟知的并能表达本发明嵌合抗体的其他表达载体，也可考虑用于本发明。一种用于在表达载体中能表达本发明嵌合抗体的重链的核酸序列在图13显示；一种用于在表达载体中能表达本发明嵌合抗体的轻链的核酸序列在图14显示。
嵌合抗体(“χ220”)的重和轻链的完整氨基酸序列，包括其可变区和恒定区，见如下(粗体的氨基酸表示可变的重链和可变的轻链)：
重链的序列(SEQ ID NO：3)
QIQLVQSGPE LKKPGETVRI SCKASGYAFT TTGMQWVQEM PGKGLKWIGW 50
INTHSGVPKY VEDFKGRFAF SLETSANTAY LQISNLKNED TATYFCVRSG 100
NGNYDLAYFA YWGQGTLVTV SAASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL 150
VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 200
QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP 250
KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVE NAKTKPREEQ 300
YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE 350
PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 400
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 450
GK 452
轻链的序列(SEQ ID NO：4)
DIVLTQSPAT LSVTPGDRVS LSCRASQSIS DYLHWYQQKS HESPRLLIKY 50
ASHSISGIPS RFSGSGSGSD FTLSINSVEP EDVGIYYCQH GHSFPWTFGG 100
GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200
LSSPVTKSFN RGEC 214
产生了几种220的人源化型。该过程涉及鉴别与VH和VL结构域最接近的同源性的鼠和人的种系序列。用鼠的种系序列鉴别在亲和力成熟的过程中可能出现的体细胞突变的位置。然后用人的序列作为模板，在负责VH和VL的人序列中取代已知或疑有对结合特异性重要的序列区。然后对这些序列的结构建立模型，用作最接近同源性的模板蛋白，因为该蛋白的晶体结构已经解析。用PGR定点诱变产生编码人源化型的质粒，并通过COS细胞的瞬时表达用于产生抗体。用本发明的嵌合和人源化抗体进行体外测定，结果在图5表示。图5a显示用基于ELISA的测定法，测定χ220和h220v3与hCD40-mG2b的结合测定结果。Immulon-2板的孔用在PBS中的浓度为10ng/ml的hCD40-mG2b包被2hrs。用样品稀释液(遗传***公司)阻断这些孔，按所示的浓度加入抗体。温育1hr后，洗涤这些孔，用过氧化酶偶联的山羊抗人IgG抗体检测存在的所述抗体。H220v3是一种单抗2.220的人源化型。数值是重复孔的平均数而误差线表示标准偏差。
图5b显示用抗人的CD40单抗测定抑制sgp39介导的人B细胞共刺激的测定结果。在96孔板中，用sgp39融合蛋白、20μg/ml的兔抗人IgM包被的免疫珠和所示浓度的抗CD40单抗或仅作对照的培养基，温育贴壁的人扁桃体B细胞(每孔50,000)。起始培养后72hrs，所有孔用1μCi/孔的[3H]胸腺嘧啶脉冲标记，然后细胞继续培养18hrs。然后收集细胞，在液闪计数仪中测定掺入的[3H]胸腺嘧啶。
根据体外测定的结果(图5a和图5b，显示嵌合和人源化抗体均有效地结合CD40并且抑制B细胞的刺激)，选择嵌合抗体作进一步的研究。
实施例3
χ220的功效
A.嵌合单抗2.220：在非人的灵长类中单剂量的功效研究
在cynomolgus猴子中，评价χ220抑制对T细胞依赖的抗原的初次和再次体液免疫应答的能力。在一项研究中，四只猴子为一组，用绵羊红细胞(SRBCs)免疫，在接受单剂量大药丸的10、40或100mg/kg的χ220或作为对照的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)静脉内注射之前，立即给予卵白蛋白(OVA)进行再次免疫。在所有的三个剂量水平，观察到基本上抑制对SRBCs的初次体液免疫应答，这表明χ220在灵长类中的功效。在所有χ220处理的猴子中，观察到剂量依赖的外周血B细胞暂时缺乏，细胞数随时间的恢复也是剂量依赖的。在二个最高剂量组，观察到外周血T细胞的绝对平均数短暂轻微降低。观察到血清IgM水平的短暂轻微降低，但IgG或IgA的血清水平没有药物相关的变化。
为了评价免疫耐受的诱导作用和免疫抑制活性的可逆转性，在第49天时，所有的猴子用OVA、SRBCs和一种新抗原匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫。在100mg/kg组当χ220的血清水平低于据信是免疫抑制水平(～10μg/ml)时，外周血B细胞的数目回复到所用的剂量前的水平。一般来说，最低剂量水平的抗SRBC的抗体应答可与在对照组猴子中初次的抗SRBC的抗体应答相仿。然而，在二种较高剂量水平处理的猴子中，对SRBCs的抗体应答仍然部分或基本上被抑制。
为进一步探索免疫抑制和B细胞缺乏的剂量依赖的关系，进行了第二次研究，其中，增加的猴子(四只/组)用SRBCs免疫，然后给以单一剂量的0.1或1.0mg/kg的χ220或PBS。在二个剂量水平观察到对SRBCs的抗体应答亚适度的免疫抑制。在第28天接受1.0mg/kgχ220的猴子中，明显地中度缺乏外周血B细胞，到第二天恢复到原来的水平。在0.1mg/kg时，观察外周血B细胞的平均数和百分率下降，但其值未超出B细胞百分率的正常历史范围。对外周血B细胞的绝对数来说，还未确立历史界限。在接受1mg/kg的χ220的猴子中，观察到外周血T细胞数的暂时轻微下降和离体T细胞增殖的微弱下降。最后，没有证据显示，在IL-6或TNFα的血清水平中完全活化或药物相关的变化，并且在接受10、40或100mg/kg的χ220处理过的猴子中，未检测到离体T细胞活化、补体活化和血清细胞因子的水平的变化。
在二项研究中，施用χ220后检测血清样品，以确定试测项的循环水平和评价针对试验项的抗体形成。药理动力学分析表明：χ220的平均高峰血清浓度(Cmax)没有随剂量增加的方式成比例地增加，并且当施用的剂量增加时，χ220的半衰期延长。当以0.1、1或10mg/kg施用时，发现χ220是免疫原。循环浓度超过10μg/ml时，似乎χ220抑制直接针对它的抗体应答。
1.实验原始记录
在以上提到的初始研究中，把cynomolgus猴分成四组，每组由二只雄性和二只雌性组成。在χ220或对照项施用前，所有猴子用OVA(5mg/kg，im和10mg/kg，sc)免疫28天。在第1天，所有猴子用SRBCs(1.7ml/kg，10％的悬浮液，iv)免疫，并在接受单剂量大药丸的10、40或100mg/kg的χ220或作为对照的PBS静脉注射之前，立即给予OVA(5mg/kg，im和10mg/kg，sc)进行再次免疫。在第149天，χ220的血清水平降低到假定的免疫抑制水平(~10μg/ml)以下，以及所有组中外周血B细胞的水平恢复到所用的剂量前的水平后，所述的猴子用OVA、SRBCs和KLH(10mg/只动物，im)免疫。用KLH免疫的目的是显示，用χ220处理后所述的猴子能发生对一种新抗原的免疫应答。
为了说明涉及免疫抑制和外周血B细胞缺乏的更好的剂量应答，在第二次研究中另外组的猴子(二只/性别/组)用SRBCs免疫，然后在第1天给予单剂量的0.1或1.0mg/kg的χ220或作为对照的PBS。在二项研究中选择的时间点，检测血液学参数和外周血淋巴细胞亚群。在接受10、40或100mg/kg的χ220的猴子中检测血清化学参数，但未检测0.1和1mg/kg剂量水平的参数，因为在更高的剂量下未观察到药物相关的结果。此外，测量IgM、IgG、IgA和χ220的血清水平。为评价功效，对恰好免疫原施用前和施用后每周获得的合适血清样品，测定抗SRBC和OVA免疫原的特异IgM和IgG抗体形成。在第1天试验项施用前和施用后每周，对接受χ220的猴子，测定抗试验项的特异IgM和IgG抗体形成。当比较各组之间抗体应答时，用几何平均滴度。此外，在施用χ220后选择的时间点，对接受0.1或1mg/kg的χ220的猴子，测量了补体溶血活性(CH50)和C4d片段水平以及测定TNF-α和IL-6。在第17和31天，对接受0.1和1mg/kg的χ220的猴子，也评价用伴刀豆凝集素A刺激后离体的外周血T细胞的活化，以估计χ220对T细胞针对丝裂原应答的影响。最后，对所有的猴子每天观察临床毒性症状，每周记录体重以及每天监测食物消耗量。
在第1天接受载体或10、40或100mg/kg的χ220(图6a)，或0.1或1mg/kg的χ220(图6b)之前，猴子用SRBC免疫。用ELISA分析血清样品中IgH抗SRBC的抗体。数据以每组抗SRBC抗体的终点滴度(EPT)的几何平均值表示(n＝2[超过第15天的100mg/kg组]或4)，其中，EPT与具有比平均板背景值2倍更大的吸光值的最大血清稀释度的倒数等值。
2.结果
a.抗SRBC的抗体应答
当给猴子施用10、40或100mg/kg时，χ220基本上有效地抑制抗SRBCs的初次抗体应答。在对照初次IgM抗SRBC的抗体应答的高峰天数(第8天)，与对照组相比(图6a)，在用10、40或100mg/kg的χ220处理的猴子中，初次IgM抗SRBC的抗体应答的平均值被抑制92-94％。直到第85天，在10、40或100mg/kg的剂量水平，IgM抗SRBC的抗体应答的组平均值没有出现阳性。在对照初次IgG抗SRBC的抗体应答的高峰天数(第15天)，与对照组相比(图7a)，在接受10、40或100mg/kg的猴子中，初次IgG抗SRBC的抗体应答的平均值分别被抑制98％、99％和85％。在100mg/kg组中，更高的全部前剂量抗SRBC的抗体滴度可能由于明显缺乏剂量依赖的免疫抑制。不过，用40mg/kg χ220处理的2只猴子延迟了初次IgG抗SRBCs的抗体应答(其强度可与对照组应答相仿)，该应答到第36天出现阳性，到第51天达到面峰。
在第149天，χ220的血清水平降低到假定的免疫抑制水平(~10μg/ml)以下，以及所有组中外周血B细胞的水平恢复到所用的剂量前的水平后，所述的猴子用SRBCs进行第二次免疫。如预期的那样，对照组的猴子发生了强烈的IgG抗SRBCs的再次抗体应答。用10mg/kgχ220处理的猴子发生了初次IgM和IgG抗SRBCs的抗体应答，一般来说，该应答可与对照组猴子的初次抗体应答相仿。不过，在40mg/kg的剂量水平，抗SRBCs的抗体应答仍然部分被抑制，而在100mg/kg的剂量水平，基本上被抑制。尽管用40mg/kg χ220处理的2只猴子，先前发生微弱的初次抗SRBCs的抗体应答，出现了特征为再次抗体应答的IgM和IgG抗SRBCs的抗体滴度，在该组其他的2只猴子和剩余的用100mg/kg χ220处理的猴子中，与对照组猴子的初次抗SRBC的抗体应答平均值相比较，抗SRBC的抗体应答大约仍被抑制90％。
施用0.1或1mg/kg的χ220后，观察到抗SRBCs的抗体应答的亚适度免疫抑制(图6b和7b)。当所有的χ220处理的猴子发生对SRBC抗原的阳性IgM抗体应答时，与对照组应答的平均高峰值相比，在用1mg/kg χ220处理的猴子中，IgM抗SRBC的抗体应答的所有平均高峰值被抑制大约56％。在用0.1mg/kg χ220处理的猴子中，未观察到抑制IgM抗SRBC的抗体应答。对照组的猴子到第15天和接受0.1或1mg/kg的χ220的猴子到第8天，平均IgM抗SRBC的抗体应答达到高峰。总的来说，用0.1和1mg/kg的χ220处理的猴子中，平均IgG抗SRBC的抗体应答分别抑制56％和42％。对照组的猴子到第15天和接受1mg/kg的χ220的猴子到第8天，以及接受0.1mg/kg的χ220的猴子到第8天，平均IgG抗SRBC的抗体应答达到高峰。
b.抗OVA的抗体应答
在第1天，猴子经静脉内施用剂量为10、40或100mg/kg的χ220。此外，在第28、1和149天，所有猴子用OVA免疫。分析血清样品中IgM(图8a)或IgG(图8b)抗OVA的抗体。数据以每组抗OVA抗体的终点滴度(EPT)的几何平均值表示(n＝2[超过第15天的100mg/kg组]或4)，其中，EPTs与具有比平均板背景值2倍更高的吸光值的最大血清稀释度的倒数等值。
在研究中，每周对接受10、40或100mg/kg的χ220的猴子，每周检测抗OVA的特异IgM和IgG的抗体形成。在所有的猴子中，初次和再次抗OVA的抗体应答高度可变，并且一般来说是微弱的(图8)。在第1天计划接受χ220的猴子，比对照组的猴子具有更高的抗OVA的抗体滴度。
在第149天，所述的猴子接受第3次OVA免疫。激发后7天之内，所有的猴子发生对OVA的阳性IgG抗体应答。对照组猴子和用10mg/kg的χ220处理的猴子含有的抗体滴度，其特征为第3次抗体应答，而用40或100mg/kg的χ220处理的猴子出现的抗体滴度，其特征更象是再次抗体应答。
c.抗KLH的抗体应答
在第1天，猴子经静脉内施用剂量为10、40或100mg/kg的χ220。此外，在第149天，所有猴子用KLH免疫。分析血清样品中IgM(图9a)或IgG(图9b)抗KLH的抗体。数据以每组抗KLH抗体的终点滴度(EPT)的几何平均值表示(n＝2[超过第15天的100mg/kg组]或4)，其中，EPTs与具有比平均板背景值2倍更高的吸光值的最大血清稀释度的倒数等值。
在第149天，χ220的血清水平降低到假定的免疫抑制水平(~10μg/ml)以下，以及所有组中外周血B细胞的水平恢复到所用的剂量前的水平后，所述的猴子用KLH(10mg/只动物，im)免疫。所有的猴子发生对KLH的阳性IgM和IgG的抗体应答，这说明对一种新抗原应答的能力没有被损害(图9)。
d.试验项和抗试验项抗体应答的血清水平
施用χ220后检测血清样品，以测定试验项的循环水平和评价抗试验项的抗体形成。施用10或40mg/kg剂量后3分钟和施用100mg/kg剂量后6小时，出现χ220的平均高峰血清浓度(Cmax)。在用10、40或100mg/kg的χ220处理的猴子中，χ220的Cmax值分别为329、2429和2343μg/ml。不过，在40和100mg/kg组的猴子个体中，Cmax值有较大的变化。在用10、40或100mg/kg的χ220处理的猴子中，估计χ220的血清平均半衰期分别是114、173和315小时。
施用χ220后3分钟出现的平均Cmax值，相对于0.1和1mg/kg的剂量，分别为1.77和33μg/ml。在每个剂量水平中，未观察到χ220的血清水平的性别相关的差异。相对于0.1和1mg/kg的剂量，平均AUCinf值分别为15.5和847μg.h/ml。总之，这些研究表明，随着施用的剂量增加，χ220的半衰期延长。而且，似乎χ220的Cmax值增加的方式不与剂量的增加成比例。
尽管在接受10、40或100mg/kg的χ220的猴子中，IgM抗试验项的应答微弱或缺乏，但是在接受10mg/kg的χ220的猴子中，观察到明显的IgG抗试验项的抗体应答。在接受10mg/kg的χ220的猴子中，到第29天，即χ220的平均组血清浓度低于10μg/ml后大约1周，平均IgG抗试验项的抗体应答出现阳性，到第36和43天达到高峰，其几何平均滴度为12,627。在用10mg/kg的χ220处理的猴子中出现的IgG抗试验项的抗体，也和B细胞缺乏后首次检测到增加的事件同时出现。到测量的最后一天(第149天)，接受40或100mg/kg的χ220的猴子仍没有发生抗χ220的阳性抗体应答，尽管χ220的组平均血清水平到第57天(40mg/kg)或第92天(100mg/kg)低于10μg/ml。
当以0.1或1mg/kg施用时，χ220为免疫原。在研究过程中到第15天，接受0.1或1mg/kg χ220的4只猴子的3只，具有微弱的阳性IgM抗试验项的抗体应答。到第22天，用1mg/kg χ220处理的4只猴子的3只，具有明显的阳性IgG抗试验项的抗体应答，达到高峰时其几何平均终点滴度为16,618。总而言之，在接受0.1mg/kg的χ220猴子中，IgG抗试验项的抗体应答的几何平均值没有阳性，仅1只接受0.1mg/kg的χ220猴子，具有IgG抗试验项的抗体应答的微弱阳性，到第22天达到高峰时其终点滴度为2430。综合以上结果，这些资料表明在血清水平高于大约10μg/ml时，χ220能免疫抑制抗自身的抗体应答。
实施例4
人源化抗CD40的抗体F4和L3.17的产生
已经用本领域熟知的各种方法，进行单抗的人源化。基于结构的方法证明是有效的，但是来源于大量的潜在涉及结合活性的构架区的复杂性降低了成功率。不用基于模型预测合适构架区的方法，用基于筛选大量组合的方法，以下披露的抗体文库法可以鉴定构架区活性构象。结合选择方法的诱变方法允许分析多种变体并且模拟体内的成熟过程(综述见Marks，J.D.等，(1992)生物化学杂志267：16007-16010)。基于密码子的诱变方法允许构建特征为对特异残基有贡献的文库，因此比随机诱变方法更有效。例如，不能用错配PCR合成下列披露的组合构架区文库。再者，随机诱变创造了更大量多样的文库，不幸的是，大部分突变不能增强单抗的结合活性。结果，必须筛选大量的克隆以鉴定活性变体。
一种称为“指导性选择”的策略，被用于从噬菌体展示文库中分离人单抗，该方法用一种啮齿类单抗作为模板，为二步法的过程(Jespers，L.S.等，(1994)生物技术12：899-903)。最近，披露了一种用噬菌体展示技术的指导性选择的修改方法，在该方法中，用嵌合的Fd片段从文库中选择一条L链，该文库含有携带移植鼠CDR3的人L链(Rader，C.等，(1988)美国国家科学院院报95：8910-8915)。然后，用最好活性的L链，从含有鼠HCDR3的人H链文库中选择H链。通过这些方法分离的单抗为完全人的(Jespers，同上)，或大部分是人的(Rader，同上)，但是，该过程的每一步导入的大量抗体多样性需要应用亲和富集方法。
用下列材料和方法，产生本发明的人源化抗CD40抗体F4和L3.17。
1.嵌合抗CD40的构建
根据抗CD40的鼠单抗2.220的序列，合成和纯化编码VH和VL的重叠寡核苷酸(长度为69-75碱基)。分别合成可变的H和L的结构域，合成方法是把25pmol的每一种重叠的寡核苷酸在50μl PCR反应液中和Pfu DNA聚合酶(Stratagene)混合，进行以下的5个循环：94℃变性20sec，50℃退火30sec，72℃蔓延1min，72℃维持30sec。接着，把退火温度增加到55℃，继续25个循环。使用相同的程序，用反向引物和生物素化的正向引物，在100μl PCR反应液中扩增1μ1的融合产物。所述的产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱，被T4聚核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)磷酸化，然后，在5mM Tris-Cl，pH7.5，0.5mM EDTA，1M NaCl，0.05％吐温20中，25℃下和链亲和素磁珠(Boehringer Mannheim)温育15min。洗涤所述的磁珠，然后用0.15M NaOH在25℃下温育10min洗脱非生物素化的负链DNA。用称为M13I104CS的修饰M13IX104载体(Kristensson，K.等，(1995)疫苗95，39-43页，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)，通过杂交诱变法(Rosok，M.J.等，(1996)生物化学杂志271：22611-22618；Kunkel，T.A.(1985)美国国家科学院院报82：488-492)，在3倍过量的尿苷化的载体模板中，用VH和VL寡核苷酸，合成嵌合抗CD40 Fab。在κ链的末端和γ1恒定区，用丝氨酸取代半胱氨酸残基，修饰M13IX104。把该反应物电穿孔到DH10B细胞中，并滴到XL-1蓝色生长面上。
2.组合构架区和构架区/CDR3文库的构建
通过用于构建嵌合抗CD40相同的方法，略作修改，合成组合构架区文库(Hu I)。合成了重叠的寡核苷酸，该寡核苷酸编码人模板和鼠抗CD40 CDRs的H和L可变结构域的构架区，这些序列由Kabat等确定(kabat，E.A.等，(1991)免疫目的蛋白的序列(第5版)，华盛顿DC：美国健康和人类服务部；kabat，E.A.等，(1977)生物化学杂志252：6609-6616)。合成了简并寡核苷酸，该寡核苷酸编码在7个VH和1个VK构架区位置的鼠和人的氨基酸(图15，残基用星号标记)。
通过与组合构架区文库相同的方法，略作修改，合成构架区/HCDR3文库(Hu II)和构架区/HCDR3/LCDR3文库(Hu III)。选作诱变的CDR残基是：HCDR3中的Ser95-Tyr102和LCDR3中的Gln89-Thr97(图15，下划线)。设计编码HCDR3和LCDR3的寡核苷酸以突变单一的CDR残基，按照本领域披露的方法(Glaser，S.M.等，(1992)免疫学杂志149：3903-3913)，在每个位置导入NN(G/T)而合成寡核苷酸。编码构架区文库和非文库的鼠CDRs的重叠寡核苷酸，与25pmol的编码突变的HCDR3的寡核苷酸或与25pmol每种编码突变的HCDR3和LCDR3的寡核苷酸组合在一起。
3.噬菌体表达文库的筛选
首先，通过本领域熟知的一种修饰的噬菌斑挖出法，称为捕挖法(Capture lift)(Watkins，J.D.等，(1998)分析生物化学256：169-177)，筛选Hu II和Hu III的文库。简言之，硝酸纤维素膜(82mm)用山羊抗人κ抗体包被，用1％BSA封闭，然后放到含有感染噬菌体的细菌生长面的琼脂板上。在初次筛选中，将噬菌体以105个噬菌体/100-mm平板铺板。捕捉表达抗CD40变体Fabs的噬菌体后，该滤膜用在PBS中含有1％BSA的5ng/ml CD40-Ig，在25℃下温育3h。用含有0.1％吐温20的PBS洗涤该滤膜4次，然后，用3000倍的含1％BSA的PBS稀释的山羊抗小鼠IgG2b碱性磷酸酶偶联物(南方生物技术公司)，在25℃下温育1h。用含有0.1％吐温20的PBS洗涤该滤膜4次，按所述的方法(Warkins(1998)同上)显色。为了分离单个的克隆，挑取来自初次筛选的阳性噬菌斑，用更低的密度(＜103噬菌体/100-mm平板)重新铺板，然后用同样的方法筛选。
首先，用ELISA筛选Hu I组合文库，以允许快速评价各种变体的相对亲和力(Watkins，J.D.等，(1997)分析生物化学253：37-45)。此外，用ELISA确定通过捕挖筛选法所鉴别的克隆的特点。简言之，微滴定板用5μg/ml的山羊抗人κ抗体(南方生物技术公司)包被，用在PBS中的3％BSA封闭。接着，用50μl来自大肠杆菌培养物的上清液或来自细胞裂解液的Fab，与平板在25℃下温育1h，平板用含有0.1％吐温20的PBS洗涤3次，然后用在PBS中含有1％BSA的0.1μg/ml CD40-Ig，在25℃下温育2h。平板用含有0.1％吐温20的PBS洗涤3次，然后，用3000倍的含1％BSA的PBS稀释的山羊抗小鼠IgG2b碱性磷酸酶偶联物，在25℃下温育1h。用含有0.1％吐温20的PBS洗涤平板3次，按本领域所述的方法(Warkins(1997)同上)显色。
4.DNA测序
分离单链DNA，通过荧光双脱氧核苷酸终止法(Perkin-Elmer，Foster City，CA)，测定本发明人源化抗体的H和L链可变区的基因。
人源化抗体F4的轻链可变区的核酸(SEQ ID NO：7)和氨基酸(SEQID NO：8)序列如下：
GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT 42
E I V L T Q S P A T L S L S 14
CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT 84
P G E R A T L S C R A S Q S 28
ATT AGC GAT TAC TTA CAT TGG TAC CAA CAG AAA CCT GGC CAG 126
I S D Y L H W Y Q Q K P G Q 42
GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT TAC GCA TCC CAC TCC ATC TCT 168
A P R L L I Y Y A S H S I S 56
GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 210
G I P A R F S G S G S G T D 70
TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCA 252
F T L T I S S L E P E D F A 84
GTT TAT TAC TGT CAG CAT GGC CAC TCT TTT CCT TGG ACC TTC 294
V Y Y C Q H G H S F P W T F 98
GGA GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATT AAA 321
G G G T K V E I K 107
人源化抗体F4和L3.17的重链可变区的核酸(SEQ ID NO：9)
和氨基酸(SEQ ID NO：10)序列如下：
CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT 42
Q V Q L V Q S G S E L K K P 14
GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC GCC 84
G A S V K V S C K A S G Y A 28
TTC ACT ACC ACT GGC ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA 126
F T T T G M Q W V R Q A P G 42
CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA TGG ATC AAC ACC CAC AGC GGG 168
Q G L E W M G W I N T H S G 56
GTC CCA AAG TAT GTC GAG GAC TTC AAA GGA CGG TTT GTC TTC 210
V P K Y V E D F K G R F V F 70
TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTG CAG ATC AGC 252
S L D T S V S T A Y L Q I S 84
AGC CTA AAG GCT GAG GAC ACT GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGA 294
S L K A E D T A V Y Y C A R 98
TCT GGC AAT GGG AAC TAT GAC CTG GCA TAC TTT AAG TAT TGG 336
S G N G N Y D L A Y F K Y W 112
GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 366
G Q G T L V T V S S 122
人源化抗体L3.17的轻链可变区的核酸(SEQ ID NO：11)和氨基酸(SEQ ID NO：12)序列如下：
GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT 42
E I V L T Q S P A T L S L S 14
CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT 84
P G E R A T L S C R A S Q S 28
ATT AGC GAT TAC TTA CAT TGG TAC CAA CAG AAA CCT GGC CAG 126
I S D Y L H W Y Q Q K P G Q 42
GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT TAC GCA TCC CAC TCC ATC TCT 168
A P R L L I Y Y A S H S I S 56
GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 210
G I P A R F S G S G S G T D 70
TTC ACT CTC ACC ACT AGC AGC CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCA 252
F T L T I S S L E P E D F A 84
GTT TAT TAC TGT CAG CAT GGC CAC TCT TAT CCT TGG ACC TTC 294
V Y Y C Q H G H S Y P W T F 98
GGA GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATT AAA 321
G G G T K V E I K 107
5.Fab的表达和纯化
一些Fabs被克隆到一种在***糖调节的BAD启动子控制下的表达载体中。此外，一种六个组氨酸的标签被融合到H链的羧基末端，以便用镍鳌合的树脂纯化。纯化的Fab按所述的方法(Warkins(1997)同上)定量。
6特性测定
Immulon II微滴定板用在PBS中的0.1μg/ml CD40-Ig，在4℃下温育16h，用在PBS中的3％BSA封闭。所述的平板用含有0.1％吐温20的PBS洗涤3次，用含有1％BSA的PBS以3倍系列稀释来自周质间隙释放的Fab，与平板在25℃下温育2h。接着，平板用含有0.1％吐温20的PBS洗涤4次，检测抗体的结合，用2000倍的含1％BSA的PBS稀释的山羊抗人κ碱性磷酸酶偶联物，在25℃下温育1h进行。用含有0.1％吐温20的PBS洗涤平板4次，按所述的方法(Warkins(1997)同上)比色法显色。
为了检测变体对配体结合的抑制作用，Immulon II微滴定板用2μg/ml的抗鼠CD8包被，以捕捉表达CD8结构域的sgp39融合蛋白。所述的平板用含有0.05％吐温20的PBS洗涤1次，然后用在PBS中的3％BSA封闭。所述的平板用含有0.05％吐温20的PBS洗涤1次，然后与含有sgp39饱和水平的细胞培养基，在25℃下温育2h。吸取未结合的sgp39，所述的平板用含有0.05％吐温20的PBS洗涤2次。接着，加入用PBS 3倍系列稀释的25μl的纯化的变体Fabs，然后加入25μl在PBS中的4μg/ml人CD40-Ig。平板在25℃下温育2h，用含有0.05％吐温20的PBS洗涤3次。用PBS 10,000稀释的连接有辣根过氧化酶的山羊F(ab′)2抗人IgG Fcγ特异抗体的偶联物(Jackson)，检测结合的CD40-Ig。所述的平板用含有0.05％吐温20的PBS洗涤4次，用显色法定量结合程度，该方法是与在50mM柠檬酸，100mMNa2HPO4，pH5中的1mg/ml邻苯二胺二盐酸和0.003％的过氧化氢温育进行。加入H2SO4到终浓度0.36M，终止反应，在490nm测定吸光值。
7.BIAcore分析
通过表面等离子共振法(BIAcore)，测定CD40和抗CD40变体之间相互作用的动力学常数。通过注射8μl在10mM乙酸钠，pH4中的10μg/ml CD40-Ig，把CD40-Ig固定到(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]-碳二亚胺盐酸)和N-羧基琥珀酰胺活化的传感芯片CM5上。在低密度下(~150RU)固定CD40-Ig，以防止解离相过程中Fabs的重新结合。为了得到缔合率常数(kon)，以20μl/min的流率，从在PBS中25-600nM范围的6个不同的Fab浓度，测定结合率。解离率常数(koff)是由分析解离相得到的6个测量的平均值。用BIAevalution 3.0程序分析传感图。根据Kd＝koff/kon计算出Kd。每次测定后通过延长解离，移去剩余的Fab。
与嵌合Fab相比较，人源化抗体F4和3.17的动力学分析结果在下面的表1显示：
表1
| 克隆ID# | kon | koff | Kd | 评价 |
| 嵌合Fab | 8.43E+5 | 2.65E-3 | 3.14nM | 木瓜蛋白酶水解嵌合的2.220IgG制备 |
| F4 | 2.00E+6 | 4.77E-4 | 0.24nM | 人源化 |
| L3.17 | 3.17E+6 | 3.28E-4 | 0.10nM | 人源化 |
8.人源化的结果
如上面所讨论的那样，用鼠抗CD40单抗的可变构架区序列鉴定最大程度同源的人种系序列。H链构架区残基与人种系VH7(7-4.1)和JH4序列为74％的一致性，而L链与人种系VKIII(L6)和JK4序列为75％的一致性。H和L链可变区序列的对比排列在图15显示。由Kabat等确定的CDR残基(kabat，E.A.等，(1991)免疫目的蛋白的序列(第5版)，华盛顿DC：美国健康和人类服务部；kabat，E.A.等，(1977)生物化学杂志252：6609-6616)用下划线标示，并被排除在同源性分析之外。逐个评定鼠单抗和人模板之间有差异的构架区残基。
根据结构和序列分析，除了HCDR3外的抗体CDRs展示有限数目的主链构象，称为规范结构(Chothia，C.等，(1987)分子生物学杂志196：901-917；Chothia，C.等，(1989)自然342：877-883)。而且，已经鉴定了一些对确定CDR环的主链构象起关键作用的残基(Chothia(1987)，同上；Chothia(1989)，同上)。因此，鉴定了鼠抗CD40的规范构架区残基，并且确定：在人模板的H和L链构架区中，所有关键规范位置的氨基酸与相应的鼠残基是一致的。
一般在人抗体中未找到的暴露于表面的鼠氨基酸，可能对人源化单抗的免疫原性有作用(Padlan，E.A.等，(1991)分子免疫学28：489-498)。因此，分析了鼠抗CD40和人模板之间有差异的构架区残基，根据溶剂暴露预测这些残基是埋藏或位于抗体的表面(Padlan(1991)，同上)。可以预测，远离CDRs暴露于溶剂的构架区残基对抗原结合没有明显的作用，因此，除了2个H链的残基外，所有的残基都改变为相应的人的氨基酸，以降低潜在的免疫原性。预计在28和46位的H链残基是溶剂暴露的。不过，如Chothia等(同上)定义的那样，H28位于HCDR1区中并潜在地与所述的抗原能相互作用。此外，在鼠单抗中的H46位的赖氨酸有点不正常，明显地不同于人模板的谷氨酸。因此，在H28和H46位的鼠和人的残基，在组合文库中标出(图15，星号)。
所有预测大部分埋藏在所述抗体中的剩余的不同构架区残基，针对下列特征进行评价：(1)与CDRs的接近性；(2)潜在地与VK-VH界面中的相反结构域接触；(3)不同氨基酸的相关性；以及(4)在调节CDR活性中的预期重要性，这些特征由Studnicka等定义(Studnicka，G.M.等，(1994)蛋白质工程7：805-814)。埋藏的残基中，大多数的L链构架区的差异性，是认为不可能直接涉及CDR构象的位置的相关氨基酸。然而，位于LCDR2邻近并潜在地与VH结构域接触的L49，与人的残基无关，有可能涉及确定LCDR2的构象。针对以上的原因，在L49位的鼠和人的氨基酸，两者均在在组合构架区文库中标出(图15，星号)。
对鼠H链序列和人模板的分析更为复杂。在鼠单抗中H9的残基是脯氨酸，而人模板中含有一个无关的丝氨酸残基。H9位置也在调节CDR的构象中起作用，因此被选作组合文库的位点(图15，星号)。在鼠抗CD40和H链模板之间有差异的剩余埋藏的构架区残基，位于构架区38、39、48和91位。鼠抗CD40单抗在H38和H39位分别含有谷氨酰胺和谷氨酸，而人模板含精氨酸和谷氨酰胺。H38的残基与HCDR1接近，谷氨酰胺→精氨酸的变化是非保守的，并且在鼠单抗中该位点的谷氨酰胺表达有点异常。相似地，谷氨酸→谷氨酰胺对埋藏的氨基酸来说是一种非保守的差异，H39是一种潜在的VK接触残基，而且在鼠单抗中，谷氨酸有点异常。H48的残基非常接近于HCDR2，预计H91是一个潜在地与VK结构域接触的高风险位点(Studnika(1994)同上；Harris，L.等，(1995)Prot.Sci 4：306-310)。因此，鼠和人的两者的残基在H38、39、48和91标出(图15，星号)。
总之，构架区文库由移植入模板中的鼠CDRs组成。另外，认为在L链的1个构架区残基和在H链的7个构架区残基，对维持单抗的活性有潜在的重要性。所有这些位点的特点通过合成一个组合文库体现，该文库表达在这些残基中找到的鼠和人氨基酸的所有可能组合。称为Hu I的这种文库的总多样性是28或256种变体(见下面表2)。
表2表达抗CD40抗体的噬菌体文库的汇总表
文库 文库位置 大小* 筛选数+
Hu I 构架区 256 2.4×103
Hu II 构架区，HCDR3 1.1×105 2.0×106
Hu III 构架区，HCDR3， LCDR33.1×107 5.5×105
*根据DNA序列的独特克隆的数目。所用的32个密码子在每个CDR位置编码所有的20个氨基酸。
+通过ELISA用表达的抗体，在小规模的细菌培养物中筛选Hu I文库(Watkins(1997)，同上)。Hu II和Hu III文库以每100-mm平皿105个噬菌斑植板在XL-1蓝色/琼脂平面上，用捕挖法筛选(Watkins(1998)，同上)。
在小规模(＜1ml)的细菌培养物中表达Hu I文库，从周质间隙释放的均一数量的Fab在微滴定板中被捕获，所述抗体的结合活性直接通过ELISA比较(Watkins(1997)，同上)。尽管鉴定的与靶抗原结合的亲和力可与嵌合抗体相仿，或更好，但所筛选的大多数Hu I的克隆比嵌合抗CD40 Fab更低的活性。大约6％的随机筛选的Hu I变体，展示的结合活性可与嵌合Fab相仿(资料未显示)。鉴定出可与嵌合CD40的活性相仿的多种Hu I变体，与大多数关键的构架区残基被包括在组合文库中的解释是一致的。
对固定抗原的滴定进一步确定活性克隆的特点，证实对具有增强亲和力的多个变体的鉴定结果。例如，克隆19C11与CD40受体的结合比嵌合Fab具有更高的亲和力，该结果由滴定谱中的迁移率说明(图16，相对实心圆的空心圆)。对最大活性的34个克隆的DNA测序，结果鉴定出24个独特的构架区组合，每个组合含有2-6个构架区残基(资料未显示)。
LCDR3和HCDR3直接与抗原接触，和其他的CDRs相互作用，并且经常明显地影响抗体的亲和力和特异性(Wilson，I.A.等，(1993)结构生物学流行观点 3：113-118；Padlan，E.A.等，(1994)分子免疫学31：169-217)。另外，LCDR3和HCDR3的构象，部分通过一些构架区残基确定。为了鉴定活性最高的抗体，应用基于密码子的诱变法(Glaser，S.M.，(1992)免疫学杂志149：3903-3913)，以一次1条的方式，合成在HCDR3中每个位置导入突变的寡核苷酸，结果在每个CDR残基表达所有的20种氨基酸。每条寡核苷酸编码不多于单个的氨基酸改变。编码HCDR3文库的寡核苷酸库和编码组合构架区的重叠寡核苷酸以及其他的CDRs混合，产生一个构架区/HCDR3文库。称为Hu II的该文库的多样性为1.1×105(表2，见上)。用相似的方法合成一个针对LCDR3的文库。用编码LCDR3、HCDR3和组合构架区的寡核苷酸，制造一个称为Hu III的构架区/HCDR3/LCDR3文库。大量的构架区/CDR3的组合导致文库的复杂性为3.1×107(表2，见上)。
把LCDR3和/或HCDR3中的突变与组合文库结合，增加了人源化抗CD40变体的潜在多样性，从256-107或更大。为了更有效地筛选这些较大的文库，采用了一种称为捕挖法的修饰噬菌斑挖出法(Watkins(1998)，同上)。简言之，感染噬菌体的细菌被铺板在固体琼脂表面，接着，用包被有一种Fab特异试剂的硝酸纤维素膜覆盖。捕获几乎均一数量的噬菌体表达的Fab后，用5ng/ml的CD40 Ig融合蛋白探测该滤膜。由于探测滤膜所用的抗原的浓度基本上低于Fab的Kd，仅展示增强亲和力的变体可以检测出来。用82mm的滤膜(每张膜含有≈105种变体)，从Hu II筛选＞106种变体以及从Hu III中筛选＞105种变体后，鉴定出多种展示更高亲和力的克隆(表2)。
因为滤膜上的噬菌体密度高，选出阳性的噬菌斑，以较低的密度重新铺板，然后重新筛选。接着，用捕挖法产生最强比色信号的变体，进一步通过ELISA确定特性。如预期的那样，用捕挖法筛选鉴定的大多数克隆，结合CD40比嵌合Fab更好。把变体滴定到固定的CD40-Ig上鉴定出多个克隆，这些克隆展示的亲和力比嵌合和人源化的Fab更大(图16，空心方框与实心三角形和空心以及实心圆圈比较)。
赋予增强亲和力的构架区/CDR的突变，通过DNA测序法鉴定。在10/13 Hu II的变体和3/4 Hu III变体中，鉴别出独特的可变区序列。Hu II变体和Hu III变体含有1-5个鼠构架区残基和0-2个CDR3突变，这些结果总结在下列表3中。
表3同时优化构架区和CDR残基鉴别更高亲和力的变体
文库 克隆 鼠构架区残基* CDR突变
嵌合 (43) 0
Hu I 19C11 (2)H28，48 0
Hu II CW43 (3)H9，28，91 HCDR3，101A→R
2B12 (5)H9，28，38，46，48 HCDR3，101A→K
Hu III 2B12 (5)H9，28，38，46，48 HCDR3，101A→K
2B8 (1)H28 HCDR3，101A→K
LCDR3，96R→Y
*根据Kabat等(同上)对CDRs的定义，与最大同源的人种系序列不同的鼠构架区残基的数目。与人模板不同的鼠构架区残基的数目用括号表示。在鼠单抗和人源化版本之间的全部构架区差异定位在H链(H)上，采用Kabat等的计数***标出其位置。
细菌表达的嵌合Fab和从每个文库中选出的变体的亲和力，用表面等离子共振测量法更彻底地确定特性，以确定纯化的Fab与固定的CD40-Ig的缔合率和解离率。嵌合抗CD40具有的解离常数Kd＝3.14nM，与筛选的结果相一致，许多变体展示为更高的亲和力。2个最好的克隆，F4和L3.17，具有的Kd分别是0.24nM和0.10nM(表1)。抗CD40变体改善的亲和力显然是解离率较慢的结果，因为对所有的变体来说，缔合率非常相似(0.9-3.2×106M-1s-1的范围)。
最后，测定展示增强亲和力的变体阻断gp39配体与CD40受体结合的能力。所有的变体，以与Fabs的亲和力相关的剂量依赖方式，抑制可溶的CD40-Ig融合蛋白与固定的gp39抗原的结合(图17)。例如，与CD40-Ig融合蛋白的配体结合最强的抑制剂是2B8变体，它也是对CD40最高亲和力的变体(图17)。2B8变体比嵌合Fab对CD40展示更高的亲和力，大约高17倍，并更有效地抑制与配体结合，大约为7倍。
实施例5
小鼠模型***
申请人也开发和体内测定了一种命名为7E1-G2b的大鼠抗小鼠的CD40单抗和其前体7E1-G1。制取该抗体是为了探索在自身免疫病、炎症和移植的鼠模型中，抗CD40治疗的潜力。小鼠模型***的初始目的是产生一种抗鼠的复本，模拟2.220的完全和强烈的阻断gp39/CD40的相互作用，同时拥有弱共刺激活性，并用标准的实验疾病模型体内测定其作用。
A.抗鼠CD40单克隆抗体7E1-G1和7E1-G2b的分离和定性
1.免疫、融合和定性
用一种重组鼠CD40免疫融合球蛋白经足垫接种免疫一只8周龄的Lewis大鼠，所述的融合蛋白由小鼠CD40的细胞外区与小鼠IgG2a抗体(mCD40-mIg)的铰链区、CH2和CH3融合组成。最后一次免疫后3天，来自引流***的白细胞与小鼠X63-Ag8.653骨髓细胞融合，以产生大鼠与小鼠的杂交瘤。通过ELISA，根据用原始mCD40-mIg抗原出现的反应性，以及用CD40阳性小鼠B细胞淋巴瘤细胞系(WEHI-231，ATCCCRL-1702)出现的反应性，鉴定含有对天然小鼠CD40特异的抗体的培养孔。然后测定上清液抑制mCD40-mIg与mgp39结合的能力，mgp39是可溶性重组的mCD8小鼠gp39融合蛋白，为sgp39的鼠等价体。通过有限稀释法克隆了大约12个最强抑制活性的主孔。
克隆后，用培养上清液和纯化的抗体进行功能分析，以便更准确地评价抗CD40单抗抑制鼠gp39与CD40的相互作用的能力，并确定它们的刺激特性。用本领域熟知的标准方法，测量抑制mgp39与WEHI-231结合的能力，确定抑制特性。用本领域熟知的标准方法，在所述的抗体和抗IgM的存在下，测量诱导WEHI-321细胞紧密同型黏附和脾B细胞增殖，确定刺激特性。根据这些结果，确定了3种单抗(5A3、7E1-G1和8E1)，在GP39/CD40阻断和共刺激水平方面，它们最象抗人CD40单抗2.220。
2.选择7E1作为抗鼠CD40的先导单抗
在小鼠中，体内研究的目的是鉴别哪一个阻断/非刺激的抗CD40单抗最强烈地抑制对依赖T抗原的特异抗体应答。在小鼠中研究用抗鼠CD40单抗抑制对SRBCs的IgG抗体应答。用1×108 SRBCs免疫5只为一组的BALB/c小鼠4次，同时用1mg的CD40单抗5A3、7E1-G1或8E1 ip处理。作为对照，相似方法免疫的各组小鼠用MR1(仓鼠抗鼠gp39，阳性对照，250μg)、6E9(大鼠抗人gp39，阴性对照，1mg)或PBS处理。在第7、14、21和35天，通过ELISA评价小鼠的IgG抗SRBC的滴度。结果显示：当在用SRBCs抗原激发的时间点作为单剂量抗体施用时，与单抗5A3或8E1相比较，单抗7E1-G1表现为更有效的IgG抗SRBC的应答，因此，被选作进行鼠研究的抗CD40的先导单抗。
3.单抗7E1-G1的同型转换变体
7E1-G1不拥有其特征可与嵌合2.220抗人CD40单抗相仿的效应功能(即，在补体固定和Fc受体相互作用方面，大鼠IgG1没有人IgG1那样有效)，而且7E1体内特异抗体抑制特征没有用2.220单抗在灵长类中观察到的那样完整。因此，寻找一种具有7E1特异性但在其效应能力方面更象人IgG1的大鼠同型抗体。为达到本目的，通过同胞选择技术(Hale等，免疫方法杂志(1987)103(1)：59-67)，产生一种从IgG1变为IgG2b的天然7E1的同型转换变体。简言之，用原始7E1杂交瘤以1000个细胞/孔接种的96孔板的上清液中，通过ELISA鉴定抗CD40单抗的IgG2b同型。用有限稀释法，经200个细胞接种密度的数轮植板和鉴定IgG2b阳性孔，然后以20个细胞/孔二轮克隆，结果分离一个克隆的7E1的IgG2b转换变体，7E1-G2b。
通过三套数据表明，7E1-G2b是一种IgG1的嫡系转换变体。首先，重链N末端的测序表明，两种变体在起始的35个氨基酸残基是一致的。其次，用对7E1-G1可变重链CDRs特异的引物的PCR分析，从7E1-G1或7E1-G2b获得的cDNA中，产生一条合适大小的泳带，表明这不是二个无关的其他抗体。最后，用抗κ的痕量试剂的ELISA法，评价纯化数批的二种变体与固定的mCD40-hIg的结合活性，产生了基本一致的滴定曲线。
B.体内研究
1.在抗体应答模型中体内比较7E1-G1与7E1-G2b
用SRBC`s作为T细胞依赖抗原，体内比较7E1-G1与7E1-G2b的功效。用SRBC iv免疫3~5只一组的动物，同时在第0天，以1、0.25或0.1mg化合物用7E1-G1或7E1-G2b ip处理，结果在图10显示。抗鼠gp39单抗MR1用作免疫抑制效应的阳性对照。单抗6E9和PBS分别用作无关的单抗和无单抗的对照。在第7、14和21天，用ELISA估测小鼠抗SRBC的滴度。效价表示，在ELISA法中产生一个OD值＝0.3的血清稀释计算值。如图10所示，所用剂量的7E1-G2b抑制对SRBCs的IgG应答，而7E1-G1不能。
2.在依赖T抗原的小鼠模型中7E1-G2b的剂量应答
用SRBC作为抗原，在T细胞依赖的初次免疫应答模型中，检测7E1-G2b。在各种剂量下，测定7E1-G2b，以确定最低的有效剂量。用1×108SRBCs注射BALB/c小鼠(n＝5)4次，在第0天相同的时间，按照所示的剂量，单次注射7E1-G2b或MR1(抗鼠gp39)或PBS作为抗原施用。在图11显示的结果是第7、16和28天的IgG抗SRBC的应答。报告的数值是血清稀释度1/50的ELISA吸光值。误差线表示标准偏差。
如图11所示，用7E1-G2b单次处理，在第16天25μg/小鼠(1.25mg/kg)的剂量抑制IgG的免疫应答达87％，在第16天，50或100μg的剂量完全抑制免疫应答达。在第28天，50μg/小鼠的剂量抑制IgG的应答达89％，而100μg/小鼠的剂量完全抑制免疫应答。注意用作阳性对照的MR1，起免疫抑制的亚适剂量为100μg/小鼠。
3.在预防性的胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠模型中7E1-G2b的作用
用一种实验性风湿关节炎鼠模型，胶原诱导的关节炎模型(CIA)，确定7E1-G2b对预防关节炎的影响。在第0天，用在完全弗氏佐剂中的200μg的鸡II型胶原(CII)，皮内注射DBA/1J雄性小鼠(6-8周)。从第7天开始，每4天IP施用250μg/剂量的7E1-G2b治疗。对照组按照相同的剂量程序，用PBS治疗。在第21天，全部小鼠用在不完全弗氏佐剂中的C II促进。每天观察小鼠脚爪肿胀的情况，并客观地按0-3级记分，3分等值于最大肿胀和红斑。用测径器每天测量脚爪。所报告的临床评分来***死小鼠时每爪的分值除以每组动物的总数。所报告的观测值是各组的平均值。
在小鼠中，关节炎的发展，接着是关节炎症，用7E1-G2b治疗被完全抑制，结果见下面的表4所示。直到第90天，用7E1-G2b治疗的小鼠完全免除了该疾病。
表4.治疗胶原诱导的关节炎的结果
Tx组 关节炎发生率 中位值(范围) 中位值(范围) 中位值(范围)
发作的日期 临床分值 测量的脚爪值
7E1-G1 0/5 0 0 0.075
7E1-G2b 0/5 0 0 0.075
PBS对照 4/430 (27-32) 3.5(3-4) 0.114(0.110-0.117)
如上所述，本发明的抗体是十分有效的免疫调节剂，可用作治疗剂抗各种疾病。
如上所述，本发明包含的嵌合抗体和人源化抗体具有附加的保守性氨基酸替换，这些替换基本上不影响CD40的结合。一般来说，保守性替换包括一个氨基酸被另一个相似特性的氨基酸替换，例如，在下列各组中的替换：缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
在一方面，通过表达重组DNA片段，本发明产生了如上所述的嵌合和/或人源化抗体，所述的重组DNA片段是编码人恒定区的DNA片段连接编码鼠可变区轻链和可变区重链的DNA片段(或其部分)而成。按照本发明设计的，编码含有全部或部分轻链可变区的多肽链的实例性DNA序列，如在SEQ ID NO：1或其贮藏的ATCC克隆所示，和/或全部或部分的重链可变区，如在SEQ ID NO：2或其贮藏的ATCC克隆所示。
也包含在本发明之中的是披露的轻链可变区和其活性或功能部分。蛋白或其部分的免疫活性或功能形式在此也称为“轻/重链可变区或其生物学活性部分”。在本发明的情况中，所述的生物学活性部分包含所述的轻或重链的一部分，当结合到抗体中时，该部分仍然允许抗体结合到CD40上。
具体而言，本发明包含的核酸序列编码本发明抗体的可变区重链和可变区轻链。例如，图13的1057-1422位的核苷酸(SEQ ID NO：5)提供一种优选的核酸序列，该序列编码一种本发明抗体的可变区重链；图14的1065-1388位的核苷酸(SEQ ID NO：6)提供一种优选的核酸序列，该序列编码一种本发明抗体的可变区轻链。SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11显示优选的核酸序列，这些序列编码一种本发明人源化抗体的可变区轻链SEQ ID NO：9显示一种优选的核酸序列，该序列编码一种本发明人源化抗体的可变区重链。包括在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11中显示的多核苷酸的质粒，被保藏在ATCC中。
本发明也设计包括与人CD40结合的嵌合和/或人源化抗体，含有基本上与在此披露的可变区轻和重链序列同源的多肽的嵌合和/或人源化抗体，和显示与在此披露的可变区轻和重链序列基本上一致的序列的嵌合和/或人源化抗体。例如，包括在本发明范围之中的是下列特点的嵌合抗体，该嵌合抗体包含的轻链区与SEQ ID NO：4中显示的轻链区表现出至少85％的序列一致性，更优选的是至少大约90％的序列一致性，甚至更优选的是至少大约95％的序列一致性，而最优选的是至少大约98％的序列一致性。更具体而言，包括在本发明范围之中的是下列特点的嵌合抗体，该嵌合抗体包含的可变轻链区与SEQ ID NO：1中显示的可变轻链区表现出至少85％的序列一致性，更优选的是至少大约90％的序列一致性，甚至更优选的是至少大约95％的序列一致性，而最优选的是至少大约98％的序列一致性。也包括在本发明范围之中的是下列特点的人源化抗体，该人源化抗体包含的轻链区与SEQ IDNO：8和/或SEQ ID NO：12中显示的轻链区表现出至少85％的序列一致性，更优选的是至少大约90％的序列一致性，甚至更优选的是至少大约95％的序列一致性，而最优选的是至少大约98％的序列一致性。
此外，包括在本发明范围之中的是下列特点的嵌合抗体，该嵌合抗体包含的重链区与SEQ ID NO：3中显示的重链区表现出至少85％的序列一致性，更优选的是至少大约90％的序列一致性，甚至更优选的是至少大约95％的序列一致性，而最优选的是至少大约98％的序列一致性。更具体而言，包括在本发明范围之中的是下列特点的嵌合抗体，该嵌合抗体包含的可变重链区与SEQ ID NO：2中显示的可变重链区表现出至少85％的序列一致性，更优选的是至少大约90％的序列一致性，甚至更优选的是至少大约95％的序列一致性，而最优选的是至少大约98％的序列一致性。此外，也包括在本发明范围之中的是下列特点的人源化抗体，该人源化抗体包含的可变重链区与SEQ ID NO：10中显示的可变重链区表现出至少85％的序列一致性，更优选的是至少大约90％的序列一致性，甚至更优选的是至少大约95％的序列一致性，而最优选的是至少大约98％的序列一致性。一般来说，所述的DNA片段进一步包含一种与嵌合或人源化抗体的编码序列操作性连接的表达控制DNA序列，包括天然连接或异源的启动子区。优选地，表达控制序列是在能转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子***，但也可以用针对原核宿主的控制序列。一旦该载体被结合到合适的宿主中，所述的宿主可在适合于高水平表达核苷酸序列的条件下维持培养，并且按需要，可以进行收集和纯化可变轻链、重链、轻/重链二聚体或完整的抗体、结合片段或其他形式的免疫球蛋白。(见，Beychok，S.，“合成免疫球蛋白的细胞”，学术出版社，纽约(1979))。把本发明披露的编码VL和VH区的核酸序列与编码多肽接头的DNA连接，也可以产生单链抗体。
原核宿主如大肠杆菌，和其他微生物如酵母，可用于表达本发明的抗体，除了微生物外，也可用哺乳动物的组织细胞培养物表达和生产本发明的抗体。真核细胞可能是优选的，因为本领域已经开发了许多合适的能分泌完整免疫球蛋白的细胞系，这些细胞包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系和杂交瘤细胞。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如启动子或增强子，以及必须的信息加工位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷化位点和转录终止序列，所有这些序列在本领域公知。
通过众所周知的方法，可把含有目的DNA片段(例如，重和/或轻链编码序列和表达控制序列)的载体，转移到宿主细胞中，所用的方法依宿主细胞的类型而异。例如，氯化钙转染法通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔法也可用于其他宿主细胞(如见，Maniatis，等，“分子克隆：实验室手册”，冷泉港出版社(1982))。
一旦表达了本发明的整个抗体、它们的二聚体，单条轻链和重链或其他形式的免疫球蛋白，可按照本领域的标准方法纯化，这些方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱法、柱层析法、凝胶电泳等。对于药学应用来说，基本上纯的至少90-95％均一性的免疫球蛋白是优选的，而98-99％或更高的均一性是最优选的。
一般来说，可找到本发明的抗体在治疗抗体介导和/或T细胞介导的失调方面的用途。适于治疗的典型疾病状态包括相对于宿主疾病的移植和移植排斥，以及自身免疫病，如I型糖尿病、牛皮癣、多发性硬化、风湿性关节炎、***性红斑狼疮和重症肌无力(myestheniagravis)。
本发明的抗体和药物组合物尤其适用于肠道外施用，即皮下、肌肉内或静脉内施用。肠道外施用的药物组合物，通常包含溶解在可接受载体中的抗体溶液，优选的是水相载体。所用的各种水相载体全部在本领域中众所周知，例如，水、缓冲液、盐水、甘氨酸、等等。这些溶液是无菌的，一般无颗粒物质。这些药物组合物可以通过众所周知的常规灭菌技术灭菌。所述的组合物可含有大体生理条件所要求的药学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如以下的物质：乙酸钠、氯化纳、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、人白蛋白等。
含有本发明抗体的组合物，可作预防和/或治疗用途施用。在治疗应用中，给已经患疾病的病人施用所述的组合物，所用的剂量足以治愈或至少部分抑制该疾病和其并发症。适合于达到本目的的剂量被定义为“治疗有效剂量”。所用的有效剂量将依据于该疾病状态的严重程度和病人自身免疫***的一般状态，可通过本领域的技术人员确定。
在预防用途中，把含有本发明抗体的组合物给不处于疾病状态需增强抵抗力(抑制免疫应答)的病人施用。上述的剂量被定义为“预防有效剂量”。在该用途中，准确的剂量再次依据于病人的健康状态和一般免疫水平。一个优选的预防用途是预防移植排斥，例如，肾移植排斥。
尽管为了清晰和便于理解的目的，通过说明和实施例的方式，较为详细地披露了本发明，但是，显然易见，在所附的权利要求范围之内，可以实施一些改变和修饰的方法。
Claims (8)
1.一种与人CD40结合的嵌合抗体，该嵌合抗体包含一条轻链和一条重链，所述轻链包括SEQ ID NO：1的轻链可变区，所述重链包括SEQ IDNO：2的重链可变区。
2.一种与人CD40结合的嵌合抗体，该嵌合抗体包含一条轻链和一条重链，所述的轻链包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，而所述的重链包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
3.一种核酸分子，该分子包含编码SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQID NO：2的重链可变区的核苷酸序列。
4.一种表达载体，该载体包含编码SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQID NO：2的重链可变区的核苷酸序列。
5.一种人源化抗体，该抗体包含编码SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区的核苷酸序列。
6.一种药物组合物，包含权利要求1的嵌合抗体。
7.一种药物组合物，包含权利要求2的嵌合抗体。
8.一种核酸分子，该分子包含如SEQ ID NO：5和6所示的核苷酸序列。
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