CN1186855A - 一种在肠道降低人体胆固醇的菌株及制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于降低高胆固醇血症的屎链球菌和含有该菌株活菌的微生态制剂。屎链球菌(S.faecium)DM891129菌株就是由人体内正常微生物中优选出来的,在生长过程中能分泌出一种由多糖、蛋白质和核糖核酸构成的物质,这些物质可促进胆固醇分解代谢,使其转变成胆汁酸,从而降低胆固醇水平。经稳定性及各种毒性试验证明,该菌无毒副作用,且具有遗传的稳定性。

Description

一种在肠道降低人体胆固醇的菌株及制剂

本发明涉及用于降低高胆固醇血症的屎链球菌和含有该菌株活菌的微生态制剂。

近年来，随着生活水平的提高，社会上出现了一些令人担扰的问题，少儿肥胖，中老年人血脂高等症，严重影响人们的身心健康，尤其是青少年的正常生长发育。为了解决这一问题，就要降低胆固醇的含量，减少脂肪的合成与沉积。人体的胆固醇都要经过肠道，肠道中存在大量的细菌，某些菌群成员可以直接参与宿主的胆固醇代谢，并对异常的代谢进行调整，使之恢复正常。日本河谷康雄(1984)，曾从健康人肠道中分离出一株具有降低胆固醇作用的菌株(AD1001)，没有公开是什么菌。Gililand(1985)报导，自猪粪便中分离出一株乳杆菌，能明显抑制猪高胆固醇饮食而致的血胆固醇升高的作用。还未见到其它菌株及其制剂用于人体，并参与宿主的胆固醇代谢，而起到降低胆固醇及血胆固醇含量及血脂的报导。

本发明的目的是提供一种生长旺盛，遗传稳定，无毒的可降低人体高胆固醇水平的新菌株，进而提供降低高血脂的该活菌制剂。

本发明用于在人体肠道降低人体胆固醇的DM891129菌株，是从健康人体内分离出的新菌株。经中国药品生物制品检定所检定，确定为屎链球菌(S.faecium)，是经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的，保藏号为CGMCCNO.0278的屎链球菌(S.faecium)。S.faecium是streptococcus faecium的简写。

人体肠道寄生着大约10¹⁴个正常的微生物，这些微生物参与了人体的生理、生长，生物物理和药理及病理的全部生命活动进程，保藏号为CGMCC NO.0278的屎链球菌(S.faecium)DM891129菌株就是由这些生理性的正常微生物中优选出来的。DM891129菌在生长过程中能分泌出一种由多糖、蛋白质和核糖核酸构成的物质，这些物质可促进胆固醇分解代谢，使其转变成胆汁酸，从而降低胆固醇水平。经稳定性及各种毒性试验证明，该菌无毒副作用，且具有遗传的稳定性。

DM891129菌株的生物学特征为：

1、形态和染色

光镜下：G⁺球形，成对或单个呈链状排列，菌体大小为0.5—1.μm，无鞭毛，荚膜及芽胞。

电镜下该菌呈***相，电子密度均匀，胞壁清晰。

菌落形态：在Nb固体培养基上呈灰白色，园形、光滑，周边整齐，表面***，直径0.5—15mm，在EC选择性培基上，为***表面光滑菌落。

2、培养特性：DM891129菌株在EC基础固体培基及Nb培养基上，37℃需氧培养生长良好，15—45℃生长，10℃不生长，最佳温度为37℃、PH5.0—9.6，液体培基呈混浊生长，最佳PH7.4，0.5—9％ Nacl液体培基中均呈混浊生长。

在EC基础液体培养基中呈沉淀生长，无菌膜形成，在EC基础半固体培基穿刺培养无动力，沿穿刺线生长。

3、生化反应特性：见表1

表1：DM891129菌株生化反应特点(72小时培养结果)

          项    目    反    应

尿素   -    杏仁素    +    果糖    +    纤维二糖  +

卫茅醇 -    葡萄糖    +    乳糖    +    麦芽糖    +

甘露醇 +    甘露糖    +    半乳糖  +    蔗糖      +

菊糖   -    肌醇      -    水杨素  +    棉子糖    +

罩糖   +    密二糖    +    鼠李糖  -    阿伯糖    +

山梨醇 +    木糖      ±

4、抗生素敏感试验：见表2

           表2：DM891129抗生素敏感试验(49hr观察结果)

抗生素名称    抑菌圈(mm)    抗生素名称    抑菌圈(mm)

头孢霉素        26            四环素           8

白 霉 素        24            复方新诺明       -

新 霉 素        16            卡那霉素         13

氯 霉 素        22            庆大霉素         15

先锋霉素        24            链霉素           -

红 霉 素        30            庆大霉素         8

青 霉 素        --            土霉素           8

DM891129对青霉素、复方新诺明和链霉素耐药，对头孢霉素、白霉素、新霉素、氯霉素、先锋霉素、红霉素敏感(＞15mm)，对四环素、卡那霉素、庆大霉素、强力霉素、土霉素中度敏感(≤15mm)。

5、紫外线照射实验：见表3

表3：DM891129紫外线照射实验

                时           间

距离(m)    5′    20′    30′    60′

0.5        +      +-      -+      --

1.0        ++     +       +-      -+

将DM891129划线于非选择性EC基础培基，不同高度，经紫外线照射不同时间，然后将平皿置37℃，培养24-48hr，观察结果

++为全平皿均有菌生长

+ 平皿边缘有生长，中央部位很少有菌生长

+-较+平皿菌落还少

-+仅于平板边缘有零散的菌落。

以上结果可见，紫外线照射60′基本上达到灭菌，照射30′，效果欠佳。

DM891129菌株进行毒性实验：

菌株DM891129，固体培养物以生理盐水稀释制成浓的菌液，将菌液以生理盐水稀释成5个浓度，3×10¹⁰个菌/ml，3×10⁹个菌/ml，3×10⁸个菌/ml，3×10⁷个菌/ml，3×10⁶个菌/ml，以0.1ml/10g体重，对昆明种小鼠25只腹腔注射，观察2周，无一只动物死亡，因此DM891129，LD50＞3×10¹⁰个菌/10g体重，相当于成人口服量(1.0×10⁸个菌/50kg·日)的5×10⁵倍，因而DM891129菌株属无毒类。

DM891129菌株稳定性实验：

DM891129菌株在40℃的条件下，5天后大部分死亡，在60℃下，存活30分钟，80℃下，存活5秒钟，100℃5分钟内全部杀死。在常温25℃下及在2-8℃条件下留样观察，发现在2^-8℃条件下保存效果最好，在室温25℃条件下保存一年其菌体存活率仍在10％以上。

DM891129菌株发酵工艺：

将DM891129菌株接种于胰胨、酵母浸膏、葡萄糖，NaHPO₄，KH₂PO₄的混合培养液中，分别置35℃，37℃和39℃培养，35℃对DM891129菌株生长最佳，见表4。pH为7.5对DMM891129菌株生长有利，见表5。0.5％糖含量适合DM891129菌株生长，见表6，DM891129菌株对耐氧实验不敏感，在16小时，对厌氧好些，在24小时，无显著差异，见表7。

    表4  温度对DM891129生长的影响×10⁸CFU/ML

      时间(h)     8    16     24

温度℃

  35             14    11.5   9.0

  37             10    10     7.0

  39             6.5   9.0    6.5

    表5 pH对DM891129菌株生长影响×10⁸CFU/ML

      时间(h)    8     16     24

温度℃

  6.5           4.5    6.5    5.0

  7.0           5.0    7.5    5.0

  7.5           7.5    9.0    6.5

由表5知，pH为7.5对DM891129菌株生长有利

    表6  糖含量DM891129菌株生长的菌数影响×10⁸CFU/ml

      时间(h)       8    16     24

糖量％

  0.2             0.83   7.5    4.17

  0.5             1.10   12.5   9.5

  1.0             0.95   8.17   5.83

  1.5             1.05   4.17   3.67

  2.0             --     5.0    4.67

由表6知，0.5％糖含量适合DM891129菌株生长

             表7  DM891129菌株的耐氧性实验

    项号      16  小  时              24  小  时

装量     PH  活菌数×10⁸CFU/ml  PH   活菌数×10⁸CFU/ml

100ml    5.8       12.83         5.8       17.83

200ml    5.8       15.33         5.8       18.17

300ml    5.7       12            5.8       13.5

400ml    5.6       14            5.7       16.00

500ml    5.6       21.67         5.7       17.00

由表7可知DM891129菌株对氧实验不敏感，在16小时对厌氧好些，在24小时，100ml和500ml无显著差异。

菌种保藏：

DM891129可斜面，半固体深层保存或冻干保存，半固体深层保存，需将0.3—0.5％琼脂半固体穿制培养保存，以液体石蜡封闭，冻干保存时；海藻糖、脱脂奶粉、谷氨酸钠是较好的保护剂。

为适应作为药物，经培养的DM891129菌株已由最初的厌氧型转变为微需氧菌株。本发明降低胆固醇的屎链球菌制剂是含有该屎链球菌DM891129活性成分的活菌制剂。以该菌为有效成分制成的口服药物，可在人体肠道内定植过程中降解胆固醇，使其转变为类固醇，从而降低血胆固醇含量及高血脂水平，但对正常水平的血脂无降低作用，可保持正常的血脂水平。该制品安全，无毒副作用。

本发明的屎链球菌制剂是将屎链球菌接种于EC液体培养基中，培养、收集菌体与保护剂混合，冷冻干燥制成菌粉，与一定比例的赋形剂混合，制成药粉。剂型可为粉剂，片剂或囊剂。其微生物指标如表9，理化指标如表8。

                表8  DM891129制剂理化指标

项    目               指  标

规格与偏差(mg/粒)      340+25

水    份    ％         ≤7.0

颗粒度     目          ≥40

砷(以AS计)    mg/kg    ≤0.5

铅(以P_b计)   mg/kg    ≤1.0

铜(以C_u计)   mg/kg    ≤10.0

            表9  DMM891129制剂微生物指标

        项     目                       指   标

DM891129菌种检定                         阳性

DM891129活菌数  个/g                     ≥10⁷

大肠菌群  个/100g                        ≤30

霉菌      个/g                           ≤100

致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌，葡萄球菌)     不得检出

对冷冻干燥制成菌粉，与一定比例的赋形剂混合制成药粉的制剂，进行了稳定性试验，在2—8℃保存效果最好，在室温条件下保存一年其菌体存活率仍在10％以上，还属有效范围之内。室温下贮存时间与DM891129屎链球菌活菌含量测试具体结果见下列数据：贮存时间(月)    批号  含量(×10⁸CFU/g)   水份(％)  霉菌数

   0        921002       1.20             3.8        -

            921015       1.35             4.0        -

            921025       1.31             4.3        -

   3        921002       0.81             3.8        -

            921015       0.72             4.1        -

            921025       0.85             4.4        -

   6        921002       0.51             3.8        -

            921015       0.43             4.1        -

            921025       0.61             4.4        -

   12       921002       0.15             3.9        -

            921015       0.26             4.2        -

            921025       0.13             4.4        -

   18       921002       0.07             4.0        -

            921015       0.05             4.2        -

            921025       0.04             4.4        -

采用本发明的屎链球菌制剂进行了动物性试验及临床应用，证明，此制剂对正常血清胆固醇水平无影响，对高胆固醇血症者血胆固醇水平有降低作用，对单纯性肥胖小儿血脂较高者；经服用本制剂后，血脂可降至正常，体重明显减轻。

下面结合实施例进一步说明本发明。

实施例1：

将DM891129在Ec、EMB中培养，形成菌悬液，浓度为10⁹个细菌/ml，将42只沙土鼠雌雄各半，随机分为3组，第1组13只为正常组；第2组13只，在正常饮食中加5％胆固醇饮喂一周；第3组16只，在第2组饮食的基础上，每天以DM891129菌悬液(10⁹个细菌/ml)0.5ml/次，灌胃一周。3组沙土鼠以眼球采血，分别检测血清胆固醇，甘油三酯和胆酸水平及粪便中肠球菌和肠杆菌水平，结果见表10及表11。

表10：各组实验动物粪便菌群检测结果(1g/g湿便)

      正常沙土鼠      0.5％胆固醇     0.5％胆固醇饮食

                     饮食一周后      +DM891129菌液灌       ③① ③② ①②

           ①               ②        胃一周后③

肠球菌 6.36±0.69(8)  6.49±1.02(7)  7.75±1.19(12) ****  **

肠杆菌 5.44±0.45(10) 6.75±1.37(9)  6.79±1.07(11)  **       ***

注：表中扩号内数字为实验标本数

****P＜0.01    **P＜0.05    ***P＜0.02

表11：各组沙土鼠血清胆固醇、胆酸和甘油三酯水平

                     0.5％胆固醇       0.5％胆固醇饮食+

   正常沙土鼠         饮食一周后       DM891129菌液灌胃    ②①  ②③

       ①                 ②               一周   ③胆固醇  105.72±32.5(13)  220±73.9(13)     145.11±28.85(16)  ****  ****(ml/dl)胆酸    215.46±261.5(11) 520.57±400.2(13) 336.23±187.4(9)(ug/dl)甘油三酯57.57±27.66(13)  67.19+33.26(13)   72.00±23.58(16)(mg/dl)注****P＜0.001

结果表明，第3组球菌水平明显高于第1、2组(P＜0.01，P＜0.05)，2、3组肠杆菌水平明显高于第1组(P＜0.02，P＜0.05)，第2组胆固醇水平较第1组明显升高(P＜0.001)，第3组胆固醇水平较第2组明显降低(P＜0.001)。胆酸、甘油三酯水平3组之间无显著性差异。可见DM891129菌株对沙土鼠高胆固醇饮食所致的高胆固醇血症具有明显的降低作用而对血甘油三酯、胆酸水平无显著性影响。

实施例2：

选取高胆固醇血症者17人，男性11人；女性6人，年龄32-67岁；血清胆固醇水平正常者5人，均有男性，年龄52-71岁。以上病人随机分为两组。DM891129制剂胶囊，每粒含药粉0.25g(含DM891129屎链球菌0.25×10⁸个)，第1组用法为3粒，Bid.po；第2组为3粒，Tid.po：正常对照组服法同第1组。正常对照组及第1组服药4周，停药4周，再继续服药4周，共观察12周，每阶段服药前后各查一次各项指标；第2组服药4周，检查临床一般性况及副作用，包括一般感觉、食欲、每天大小便次数、睡眠、发热情况、血常规、尿检、肾功、血胆固醇、血甘油三酯及血糖水平。

一般情况所有志愿者在服药期间及服药后2周内均未见任何不良反应，血GPT，尿检，血糖水平，血常规，肾功均未见异常，无发热现象，一般临床状况均正常。正常对照组的血胆固醇及甘油三酯水平见表12。

表12：正常对照组血胆固醇、甘油三酯水平(mmol/L)检查时间      C_h               T_g

0周      4.2±0.9l(5)     2.17±1.85(5)

4周      4.12±0.81(5)    1.41±0.49(5)

         5.4±0.82        2.09±1.52(5)

12周     4.5±1.32(5)     2.02±2.11(5)

注：C_h代表血清胆固醇水平，T_g代表血清甘油三酯水平，

    0周为第一阶段服药前；4周为第一阶段服药结束；8周为第二

    阶段服药前；12周为第二阶段服药结束；表中括号为观察人数

由表12可见，第8周时血C_h水平略有上升，此为第一阶段结束，第二阶段服药前的结果，但其数值仍在正常范围之内，第二阶段服药后又略下降，与服药前水平相近。可见此制剂对正常血C_h水平及T_g水平无明显影响，各阶段相应指标比较无显著意义(P＞0.05)。

第1组各项指标检测结果如表13：

  表13：第1组血胆固醇、甘油三酯水平(mmol/L)

检查时间       C_h               T_g

  0周      6.65±0.54(11)    1.61±0.19(11)

  4周      5.56±0.72(10)    1.50±0.33(10)

  8周      5.61±0.84(11)    1.52±0.21(11)

  12周     5.0±.062(11)     1.44±0.21(11)

由表13可见，血清C_h水平于第1次服药后即呈明显下降(P＜0.01)，在间断服药期间无明显变化(P＜0.05)，第2次服药后又旦显著下降(P＜0.05)。

第一阶段服药后，血C_h水平下降超过30％者为1人(9.1％)；第二阶段服药后，血C_h水平下降率超过30％者为3人(27.3)。在整个服药期间(3个月内)，血甘油三酯水平无明显变化(P＜0.05)。

第2组各项指示检测结果如表14：

     表14：第2组血胆固醇、甘油三酯水平(mmol/L)

检查时间      C_h              T_g

  0周     7.70±1.0(6)     1.46±0.65(6)

  4周     4.54±0.89(6)    1.35±0.37(6)

注：第2组志愿者因时间限制仅观察一个月

由表14可见，服药4周后，血C_h水平明显下降(P＜0.01)，T_g水平无显著变化。在6位志愿者中，有5位(83.3％)血C_h水平下降率超过40％，另1例下降率为21.5％。与第1组志愿者同期相比，血C_h下降率差别显著(P，0.005)。提示可能与两组用药剂量差异有关。

综合以上的实验，具有体外动物模型能降血清胆固醇水平的菌株DM891129在动物性试验的基础上，由少数志愿服用，未见任何不良反应，对正常人血清胆固醇水平无影响，有降低高胆固醇血症者血胆固醇水平的作用。对血清甘油三酯水平作用不明显。实验结果提示该制剂对高胆固醇血症者血胆固醇的作用呈剂量依赖性和用药依赖性，提示该制剂作用程度与所给药量有一定关系。

实施例3：

以超过同年龄，同性别小儿平均体重20％以上者为肥胖。

本实施例选取体重超30-39％4例，超40-59％14例，超60％8例。同时选出性别年龄与治疗组完全相同，体重超重20--59％的21名肥胖而作体重观察对照组。

每人服制剂每次0.75--1g(体重＞50公斤者1g)每日二次，饭后15分钟口服。每二周随诊一次，测体重身长，全身情况查体，三个月一疗程。本组与对照组在服药开始前及疗程结束后，同时测体重一次。

治疗组小儿在开始服药前及疗程结束后各抽血一次，以酶测定法测血清甘油三酯及血清总胆固醇定量，并以放射免疫法测血清超氧化物化酶(SOD)之含量。两组体重增减情况，治疗组21例中，11例体重减轻，8例增加1-10％，仅2例增加21-30％。

血脂测定结果：血清甘油三酯测定21例中，高于正常值者6例，治疗后，5例将为正常，1例仍高于正常值。血清总胆固醇的测定，21例中高于正常值者5例(4例处于正常值高限)。治疗后2例降至正常值，1例仍高。

血清超氧化物歧化酶测定结果：21例中9例低于正常值(235mg/ml)治疗后仍有5例低于正常值。

Claims (4)

1、一种在肠道降低人体胆固醇的菌株，是从健康人体内分离出的，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.0278的屎链球菌(S.faecium)屎链球菌DM891129菌株。

2、一种降低胆固醇的活菌制剂，含有在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.0278的屎链球菌(S.faecium)DM891129活性成分的活菌制剂。

3、如权利要求1所说的活菌制剂，是将屎链球菌接种于EC液体培养基中，培养、收集菌体与保护剂混合，冷冻干燥制成菌粉，与一定比例的赋形剂混合，制成的药粉。

4、如权利要求1所说的活菌制剂，剂型为粉剂或片剂或囊剂。