CN101067120A - 粪肠球菌cms－h001及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CMS－H001，其保藏号为CCTCC No.M 206108。本发明的粪肠球菌CMS－H001能有效治疗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)感染。

Description

粪肠球菌CMS-H001及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及粪肠球菌的新的菌株以及该菌株的应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)感染是人类最常见的感染之一，感染率在全球人口中达50％以上。1982年Warren和Marshall从人胃黏膜标本中成功培养出幽门螺杆菌，并确定HP为胃炎和消化性溃疡的致病菌以来，改变了慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关性淋巴瘤(MALT)的治疗和胃癌的预防格局，已将上述四种疾病定为HP相关性疾病。大量研究表明，HP感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃癌及胃黏膜相关性淋巴瘤(MALT)的关系非常密切，并于1996年被世界卫生组织确认为一级致癌原。根除HP治疗可以降低胃疾病的发生率。目前国内外治疗Hp感染的标准方案根除HP感染是以质子泵抑制剂(PPI)和(或)铋剂加上两种抗生素的“三联”或“四联”疗法(MalfertHeiner P，MegraudF，O’Morain C et al.Current concepts in the management of Helicobacterpylori infection-tHe Maastricht 2-2000 Consensus Report.AlimentaryPharmacology and Therapeutics 2002；16：167-180)。用抗生素抑杀HP取得了满意的疗效并缩短了治疗时间。

尽管目前用抗生素抑杀HP非常有效，但费用较昂贵，且人们必须承受抗生素带来的危害也相当大。随着抗生素的联合广泛使用，HP耐药菌株增多，抗生素使用的种类、时间和量将随之增加，这将引起如下危害：1、大量长时间和联合多种抗生素，对人体的毒副作用将增大；2、菌株变异和耐药菌株增多，变异的菌株将不仅只限于HP；3、其他腔部和皮肤的微生态破坏，导致各腔道自净功能降低，使其他粘膜萎缩相关性疾病甚至肿瘤的发生率增加。抗生素联合大量应用，会产生抗生素相关性腹泻、肠道菌群失调、甚至产生伪膜性肠炎等一系列问题，使疗效下降，患者依从性降低，停药后易复发和再感染等缺陷，及耐药菌株的迅速增加更使根除率下降。因此寻找非抗生素治疗HP势在必行。

Adamasson等(Nomura A，Stemmermann GN，Chyou PH，Kato I，Perez-Perez GI.Blaser MJ.Helicobacter pylori infection and gastric carcinomaamong Japanese Americans in Hawaii.N Engl J Med 1991；325：1132-1136.)报道了几例使用抗生素治疗Hp导致的菌群失调：口腔内出现抗药性链球菌和葡萄球菌；胃粘膜中细菌数增加，且出现抗药性共生菌；肠道内微生态环境的改变最明显，抗药性肠道球菌、肠杆菌、类杆菌在治疗后都有所增加。故寻求一种毒副作用少，病人容易接受的治疗方法成为目前医学研究中的热点。

发明内容

本发明的目的就是为了解决以上问题，提供一种能有效治疗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)感染的新的粪肠球菌菌株及其在制备药物等方面的应用。

本发明的再一目的是提供含有上述菌株的幽门螺杆菌抑制剂、药物组合物、食品、保健品及食品添加剂。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，其保藏号为CCTCC No.M 206108。

本发明还公开了幽门螺杆菌抑制剂，所述抑制剂含有保藏号为CCTCCNo.M 206108的粪肠球菌CMS-H001。

本发明还公开了所述的粪肠球菌CMS-H001在制备用于治疗幽门螺杆菌感染导致的疾病的药物中的应用。

具体的，所述疾病为胃病。

或者具体的，所述疾病为慢性胃炎。

或者具体的，所述疾病为消化性溃疡。

或者具体的，所述疾病为胃黏膜相关性淋巴瘤。

或者具体的，所述疾病为胃癌。

本发明进一步公开了一种药物组合物，所述药物组合物含有药学有效剂量的上述的粪肠球菌CMS-H001。

本发明还公开了一种食品，所述食品含有上述的粪肠球菌CMS-H001。

优选的，所述食品为饮料。

本发明进一步公开了一种保健品，所述保健品包含上述的粪肠球菌CMS-H001。

本发明进一步公开了一种食品添加剂，所述食品添加剂包含上述的粪肠球菌CMS-H001。

本发明的粪肠球菌CMS-H001，是一种分离的全新的菌株，该菌株在体内、体外均能够有效拮抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)；且对酸和胆汁都有良好的耐受性；能减轻HP感染引起的黏膜慢性炎症损伤，减少淋巴细胞、浆细胞的浸染，对HP的根除率达到75％-87.5％，与现阶段常规的PPI三联疗法比较差异无显著性。本发明的新的菌株可用于治疗HP感染与HP相关性疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关性淋巴瘤和胃癌。

保藏信息：

菌株名称：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001

保藏日期：2006年10年23日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

保藏编号：CCTCC No.M 206108

附图说明

图1为本发明粪肠球菌CMS-H001在光镜下的形态图。

图2为本发明粪肠球菌CMS-H001的5000×倍扫描电镜图像。

图3为本发明粪肠球菌CMS-H001的20000×倍扫描电镜图像

图4为本发明粪肠球菌CMS-H001的6000×倍透射电镜图。

图5为本发明粪肠球菌CMS-H001的12000×倍透射电镜图。

图6为实施例2中的胃体、胃窦损伤积分直方图，A代表胃体损伤积分直方图，B代表胃窦损伤积分直方图。

图7为实施例2中Giemsa染色细菌记数积分的直方图，A代表胃体Hp积分直方图，B代表胃窦Hp积分直方图。

图8为实施例2中各治疗组胃粘膜改良Giemsa染色图，空白对照组(A)胃小凹内未见明显杆菌，模型组(B)可见大量杆菌黏附；而粪肠球菌CMS-H001治疗组(C)和PPI治疗组(D)则仅可见少量杆菌黏附(Giemsa染色，×1000)。

图9为实施例2中模型组胃组织匀浆染色结果图，A、B分别为模型组胃组织匀浆涂片和匀浆组织细菌培养的HE染色光镜下形态，均可见Gram’s染色阴性细菌，呈弯曲杆菌或弧形(Gram’s染色，油镜)。

具体实施方式

微生态学研究正常微生物群与其宿主的相互关系，微生态疗法应用可拮抗病原菌活性的活菌制剂来治疗细菌感染，作用特异、直接、长久，无明显毒副作用。微生态调节剂——益生菌通过提高某些有利于健康的细菌的数量和活性，重建菌群平衡而对宿主起有益作用。常见的益生菌主要包括乳杆菌、乳酸链球菌、双歧杆菌等，这些细菌是健康人胃肠道的正常菌群，其代谢产物中含有乙酸、乳酸、过氧化氢等，对病原菌有一定的拮抗作用。另外，这些细菌能够产生多种细菌素，有高度特异的抑菌或杀菌作用。因此益生菌通过多种途径拮抗病原菌，减少了耐药性的发生，为治疗细菌感染性疾病提供了新的途径。

本发明的新的菌株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，是一种益生菌，能够有效拮抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)，可用于治疗HP感染与HP相关性疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关性淋巴瘤和胃癌。

本发明的新的菌株：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，已经于2006年10年23日在位于中国武汉市的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了保藏，保藏号为CCTCC No.M 206108。

本发明的粪肠球菌CMS-H001菌株在EC培养基上为酱紫色扁平菌落，直径1～2毫米，边缘齐，表面光滑，光镜下表现为革兰氏染色阳性球菌；扫描电镜和透射电镜下呈球状或串珠状，无芽孢球菌，胞壁结构完整，无芽生现象，胞质均匀。菌株代谢终产物中，VFA主要为乙酸，NVFA主要为乳酸，以及少量琥铂酸。

在粪肠球菌CMS-H001菌株的体外拮抗Hp试验中发现，高压灭菌的和过滤除菌的粪肠球菌CMS-H001上清液无抑制Hp作用，而粪肠球菌CMS-H001培养上清液则有明显的拮抗Hp作用，说明粪肠球菌CMS-H001抗Hp作用效力的发挥依赖于活菌状态或代谢终产物的有效成分。

进一步的体外模拟胃十二指肠环境抗性研究发现，粪肠球菌CMS-H001接种到pH为2.0的酸性环境中活菌计数与接种到pH6.8的近中性环境中的无显著差异，表明粪肠球菌CMS-H001菌株对pH2.0的MRS液体培养基耐受良好；同时，粪肠球菌CMS-H001菌株在含0.3％胆汁盐的MRS液体培养基活菌计数较接种于不含胆盐的MRS无显著性差异。表明本发明的粪肠球菌CMS-H001菌株对酸和胆汁都有良好的耐受性。

以上研究表明，从人胃窦和十二指肠分离的厌养菌株中筛选出的粪肠球菌CMS-H001菌株，对模拟胃酸和十二指肠胆汁环境抗性良好，体外可明显抑制Hp临床株，而且这种作用依赖活菌的直接参与。这些研究表明本发明的粪肠球菌CMS-H001菌株已经具备成为药用菌的必备条件，可用于开发成应用微生态疗法防治Hp感染的新药、保健品以及食品添加剂等。

本发明进一步用粪肠球菌CMS-H001菌株对HP诱导的胃炎模型鼠进行体内治疗研究，并与现阶段常规的治疗方法“PPI三联疗法”进行比较。研究发现本发明的益生菌粪肠球菌CMS-H001能减轻HP感染引起的黏膜慢性炎症损伤，减少淋巴细胞、浆细胞的浸染，与模型组比较有显著性差异，与PPI治疗组比较无明显差异，并有抑制HP的作用，治疗后HP细菌检测明显减少，对HP的根除率达到75％-87.5％，与PPI三联疗法比较差异无显著性。

本发明的研究结果说明正常人胃内存在对Hp有拮抗作用的共生菌，并且存在菌株特异性。本发明从健康人胃窦分离的厌养菌株中筛选出的粪肠球菌CMS-H001，在体内有明显抑制Hp临床株的作用，其对HP的根除率与PPI加抗菌素的三联疗法比较无显著性差异。此结果对Hp感染的治疗提供了新的方法，为微生态在治疗HP相关性疾病方面提供了理论基础。

利用本发明的粪肠球菌CMS-H001可以制备成药物组合物。该药物组合物含有药学有效剂量的粪肠球菌CMS-H001的活菌形式。此外，所述药物组合物还可以含有合适的药物载体。本发明的药物组合物可以为胶囊、溶液或可饮用悬浮液、袋装粉剂等形式，每一单一剂量一般含有粪肠球菌CMS-H001菌株约为10⁶～10¹⁰细胞。本发明的药物组合物可用于防治HP相关性疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关性淋巴瘤和胃癌等。

利用本发明的粪肠球菌CMS-H001还可以制备成食品、保健品或食品添加剂的形式，这些食品、保健品或食品添加剂可用于防治HP相关性疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关性淋巴瘤和胃癌等，提高使用者的健康水平。本发明的食品可以是含有本发明粪肠球菌CMS-H001活菌的饮料的形式，也可以是含有该活菌的乳制品、发酵乳、酸豆奶等形式。

下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例1

粪肠球菌CMS-H001的分离鉴定及其生物学特性

1、培养基处方及配置

MRS液体培养基：取蛋白胨5g，牛肉粉5g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖10g，K₂HPO₄ 2.5g，柠檬酸铵1g，NaCl 2.5g，MgSO₄ 0.25g，MnSO₄ 0.1g，Tween-80 0.5g加蒸馏水500ml溶解后121℃高压蒸气灭菌，置4℃冰箱备用。

MRS固体培养基：蛋白胨5g，牛肉粉5g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖10g，K₂HPO₄ 2.5g，柠檬酸铵1g，NaCl 2.5g，MgSO₄ 0.25g，MnSO₄ 0.1g，Tween-800.5g加蒸馏水500ml溶解，加入琼脂粉10g，121℃高压蒸气灭菌，浇注无菌培养皿，置4℃冰箱备用。

2、胃镜取材和标本转送

胃镜下抽吸健康成人十二指肠降段液体0.5ml入2mlMRS液体培养基，按上法共取三个标本，厌氧盒30分钟内转送至实验室。

3、粪肠球菌CMS-H001种子菌的分离培养

粪肠球菌CMS-H001种子菌分离自一健康成人十二指肠降段液体，标本在厌氧盒内于37℃恒温培养4h后取出，按10^-1系列稀释至10^-7，原液和各级稀释液各取100ul滴加到MRS平板，L型玻棒涂布均匀，37℃厌氧培养48h后取出观察菌落形态，挑单克隆行革兰氏染色镜检，将不同形态和染色性的菌落单克隆挑入MRS液体培养基中，37℃厌氧环境培养24h后取出染色镜检，观察镜下形态，并划线接种于MRS固体培养基，再次37℃厌氧培养48h观察菌落形态，挑单克隆染色镜检，反复四次传代纯化，直至固体平板上所长菌落形态一致，革兰氏染色镜检形态一致确定已分纯。分纯的各株细菌可添加防冻剂后于-70℃冰箱低温保存备用。

3、菌落特征：

粪肠球菌CMS-H001在EC培养基上为酱紫色扁平菌落，直径1～2毫米，边缘齐，表面光滑。光镜下为革兰氏染色阳性球菌，球形或串珠状，无芽孢。见图1。

4、扫描电镜观察

取1g菌泥生理盐水洗3次，取600ul菌悬液2500rpm/min离心5min，加入600ul 2.5％戊二醛，打散沉淀，固定24h；0.1M PBS清洗，3次×5min；1％的OSO₄固定1h；50％、70％、90％、100％的丙酮梯度脱水，每级10min×2次；50％、70％、90％、100％醋酸异戊酯，每级置换5min×2次；临界点干燥仪干燥；离子溅射仪，喷铂金镀膜；JSM5600-LV型扫描电镜观察、照相。结果如图2、3所示，粪肠球菌CMS-H001株细菌表面光滑、完整，形态均一，呈球状或串珠状，无芽孢，图2、图3分别代表5000×和20000×倍。

5、透射电镜观察：

取1g菌泥生理盐水洗3次，取600ul菌悬液2500rpm/min离心5min，沿管壁加入2.5％戊二醛固定24h，2％的锇酸固定2h，50％、70％、90％、100％的丙酮梯度脱水，环氧树脂混合液∶纯丙酮＝1∶1，37℃，浸泡24h，Epon812(Epoxiaquivalentgewicht145-160)、DDSA(DodecenylsuccinicAnhydride)、MNA(Methyl Nadic Anhydride)、DMP30(Tris-(dimethylaminomethgl)-phenc)，60℃，包埋成块；修块、定位；半薄切片；瑞典LKB-III型超薄切片机切片，厚约500A；醋酸铀、硝酸铅双重染色，日立H-600型透射电镜观察、照相。结果如4、5所示，图像显示在透射电镜下细菌形态规整，胞壁结构完整，无肿胀及芽生现象，胞质均匀，未发现异常颗粒，所有切片中未见病毒、支原体等外源因子，图4、图5分别代表6000×和12000×倍。

6、粪肠球菌CMS-H001代谢终产物测定

(1)仪器：日本岛津GC2010型气相色谱检测仪(GC)，氢焰离子检测器(FID)，DB-5MS色谱柱；日本岛津UV-2501PC；

(2)标准液的制备：

醇和挥发性脂肪酸(VFA)标准液的制备：将甲酸37μl、乙酸57μl、丙酸74μl、异丁酸93μl、丁酸92μl、异戊酸109μl、戊酸108μl、己酸125μl、乙醇100μl、丙醇5μl、异丁醇5μl、丁醇10μl、异戊醇0.5μl、戊醇0.5μl加蒸馏水定容至100ml，即为10mmol/L的标准液。

非挥发性脂肪酸(NVFA)标准液的配制：将乳酸84μl、苯乙酸60mg、琥珀酸60mg加蒸馏水至100ml，即为10mmol/L的标准液。

(3)VFA制备：选用偏磷酸法

取标准液或培养物1ml加偏磷酸0.5ml，调整pH值在2.0以下，37℃匀化2h，10000转/分，4℃离心2min，取上清1μl用于进样分析。

(4)NVFA制备：选用甲醇硫酸法

取标准液或培养物2ml加50％硫酸0.2ml，调整PH值在2.0以下，取硫酸酸性培养物1ml，加入甲醇溶液1ml和50％硫酸0.1ml，将样品煮沸5分钟或室温下过夜，加入氯仿0.5ml，混匀后静置片刻，1000转/分，4℃离心2min，取氯仿层1μl用于进样分析。

(5)标本及标准品中各物质的分析：

分别取提取后的样品和标准品1μl进样分析，由日本岛津GC2010型气相色谱检测仪(GC)检测各物质的保留时间并以标准品作为样本中该物质的定量标准。

结果显示：粪肠球菌CMS-H001菌株VFA主要为乙酸，乙酸出峰时间为7.970min，NVFA主要为乳酸，并有少量琥铂酸，乳酸出峰时间为7.300min，琥铂酸出峰时间为9.775min。

7、粪肠球菌CMS-H001的生化鉴定

API-20 STREP(法国酶里埃)是一个结合各方面的20个生化试验的标准化方法。该***能够坚定医学细菌中绝大多数链球菌的种或群。

API-20 STREP试验条由含能进行酶测定和糖发酵的干燥底物的20个小管所组成，可测定酶活或糖发酵。酶活测定是以浓、纯菌悬液接种于干燥的酶底物。在培养期间，所产生的最终代谢产物通过自然变色或加入试剂而变色而显示。发酵试验是以接种于由糖底物组成的培养基。发酵的碳水化合物是以PH指示剂来显示。

取镜检Gram′s染色阳性球菌菌株行API-20 STREP生化鉴定，鉴定方法参见API-20 STREP鉴定试剂盒中厂商配备的说明书。结果见表1。

表1  粪肠球菌CMS-H001菌株API-20 STREP生化反应结果

测定	底物	反应/酶	反应结果结果评分
				VP	丙酮酸	3-羟基丁酮	+1
HIP	马尿酸盐	水解作用	+2
				ESC	七叶灵柠檬酸铁	β-葡萄糖甙	+4
PYRA	吡咯烷酮-2-奈胺	吡咯烷酮芳胺酶	+1
				αGAL	6-2-萘a-半乳糖呲喃甙	a-半乳糖甙酶	-0
βGUR	萘酚AS-B1β-D-葡萄糖醛酸酶	β-葡萄糖醛酸酶	-0
				βGAL	2-萘-β-D-半乳糖呲喃甙	β-半乳糖甙酶	-0
PAL	2-萘-磷酸盐	碱性磷酸酶	-0

LAP	L-亮氨酸-萘胺	亮氨酸芳胺酶	+4
				ADH	精氨酸	精氨酸双水解酶	+1
RIB	核糖	产酸	+2
				ARA	L-***糖	产酸	-4
MAN	D-甘露醇	产酸	+1
				SOR	山梨醇	+2
LAC	乳糖		+4
				TRE	海藻糖	1
INU	菊糖		-0
				RAF	棉子糖	-0
AMD	淀粉		+1
				GLYG	糖原	-0
CAT			过氧化氢酶				-
		SPOR			芽孢	-
GRAM			革兰氏染色				+
		COCC			形态
API-20 STREP编码			7143711
				符合率(％)			99％

实施例2

粪肠球菌CMS-H001对幽门螺杆菌(Hp)的体外抑制试验

(1)粪肠球菌CMS-H001菌株上清液制备：菌株按1％体积比接种于MRS液体培养基，37℃厌氧培养24h后取出，4℃5000rpm/min离心10min，留取上清，弃去沉淀。

粪肠球菌CMS-H001菌株灭菌上清液制备：按上法得到上清液后121℃高压蒸气灭菌20min。

粪肠球菌CMS-H001菌株上清液滤过液制备：上清液用0.22微米孔径的滤器过滤除菌，得到不含细菌的上清液。

(2)Hp菌液制备：无菌接种环收集心脑浸液血平板上Hp，接种于0.2ml含50％胎牛血清的心脑浸液，比浊法判断菌液浓度为10¹¹CFU/ml。

(3)抑菌试验：吸100μl幽门螺杆菌菌悬液滴加到直径为9cm的心脑浸液血平板，无菌L形玻棒涂布均匀。待菌液完全渗透血平板，用无菌200μlTip头在平板上打孔，孔径7mm，孔深5mm，每板4个孔，孔底用0.8％琼脂液封底后，向孔内分别加入粪肠球菌CMS-H001菌株上清液、灭菌上清液、滤过的上清液，加MRS液体培养基作为对照孔，液面尽量接近血平板表面，不得溢出，每孔加液120μl，一式三份，置于厌养箱中微需氧环境37℃恒温培养72h。

72h后取出打孔平板测量抑菌圈直径，高压灭菌上清液、过滤除菌的上清液以及MRS液体培养基的对应孔内壁和孔周无细菌生长，抑菌圈直径为0；粪肠球菌CMS-H001菌株培养上清液各孔内壁均有相应细菌生长，三个平板的抑菌圈直径分别为18mm，18mm，11mm，平均为15.7mm。

实施例3

粪肠球菌CMS-H001体外耐酸、耐胆汁试验

(1)耐酸试验：从-70℃冰箱中取出冻存的粪肠球菌CMS-H001菌株，接种于MRS液体培养基中，37℃厌养培养24h后，离心(4300×g，10min，4℃)，弃去上清，收集菌体沉淀，用无菌生理盐水洗涤3次。然后以1％体积比接种到pH值为2.0(用盐酸滴定)的MRS液体培养基中。同时接种到pH值为6.8的MRS液体培养基作为对照。

分别在接种后0min和120min取100μl菌液按10^-1序列稀释，各稀释梯度取100μl接种到pH6.8的MRS平板，厌氧培养48h后行活菌计数。重复三次。

结果如表2所示，粪肠球菌CMS-H001菌株接种到pH为2.0的酸性环境中120min时，活菌计数与接种到pH6.8的近中性环境中的无显著差异(P＞0.05)，均较接种前的细菌计数稍有增多趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。表明粪肠球菌CMS-H001菌株对pH2.0的MRS液体培养基耐受良好。

表2.粪肠球菌CMS-H001接种前和接种于pH为6.8和2.0的MRS液体培养基后120min的活菌计数对数值

菌株	接种前x±s	接种后120min(x±s)
					对照组(pH6.8)	实验组(pH2.0)	P
		CMS-H00 1	8.65±0.47	8.89±0.27				8.87±0.28	0.926

^*P＜0.05 vs.对照组

(2)耐胆汁试验：从-70℃冰箱中取出粪肠球菌CMS-H001菌株接种于MRS液体培养基中，37℃厌养培养24h后，离心(4300×g，10min，4℃)，弃去上清，收集菌体沉淀，用无菌生理盐水洗涤3次。然后以1％体积比接种到含0.3％胆汁盐的MRS液体培养基中。同时接种到不含胆汁盐的MRS液体培养基作为对照。

分别在接种后0min和120min取100μl菌液按10^-1序列稀释，各稀释梯度取100μl接种到pH6.8不含胆汁盐的MRS平板，厌养培养48h后行活菌计数。重复三次。

结果如表3所示，粪肠球菌CMS-H001菌株在含0.3％胆汁盐的MRS液体培养基120min时，活菌计数与接种于不含胆汁盐的MRS液体培养基相比无显著性差异(P＞0.05)。

表3.粪肠球菌CMS-H001接种前和接种于含胆汁盐和不含胆盐的MRS后120min活菌计数对数值

菌株	接种前x±s	接种后120min(x±s)
					不含胆盐	0.3％胆盐	P
		CMS-H001	8.58±0.35	9.30±0.24				8.92±0.17	0.090

●P＜0.05 vs.对照组。

实施例4

粪肠球菌CMS-H001治疗HP感染性胃炎的体内有效性研究

用抗生素破坏清洁级BalB/C小鼠胃内微生态环境，使胃内细菌含量明显减少的情况下，再感染HP成功地形成了HP感染性胃炎模型。经模拟胃内环境的耐酸耐胆汁试验研究，证明粪肠球菌CMS-H001对酸和胆汁具有一定的抗性。该菌株胃内定植发现其可在胃内稳定定植。证明粪肠球菌CMS-H001具有体内治疗HP的条件。以下对粪肠球菌CMS-H001体内治疗HP诱导的胃炎模型鼠进行有效性研究。

一、材料和方法

1、HP临床株分离和纯化所需的材料

1.1常用试剂和溶液的配制

厌氧发生剂：    成分        质量(g)

                碳酸氢钠    0.8

              硼氢化钾          1.1

              柠檬酸            1.08

革兰氏染液

结晶紫染液：  结晶紫            1g

              95％乙醇         20ml

              1％草酸铵水溶液    80ml

将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

卢戈氏碘染液：      碘        1g

                    碘化钾    2g

                    蒸馏水    300ml

95％酒精：95ml乙醇，加5ml蒸馏水

稀石炭酸复红染液：称取碱性复红10g，研细，加95％乙醇100ml，放置过夜，滤纸过滤。取该液10ml，加5％石炭酸水溶液90ml混合，即为石炭酸复红液。再取此液10ml，加水90ml，即为稀石炭酸复红液。

防冻液：DMSO与甘油按1∶2的体积比混合。

2、HP鉴定材料

2.1、快速尿素酶试剂盒(福建三强生物化工有限公司)；

2.2、胃黏膜的病理组织学检查：由有经验的医师进行石蜡切片、HE染色、双盲阅片。

2.3、Giemsa染色和双盲阅片评分。

2.4、HP细菌培养：由本实验室用心脑浸液制备培养基备用。

3、碾磨的组织液行Gram’s染色涂片

4、动物实验材料

建立清洁级动物饲养房，实验动物和笼具、饲料购自湖南农业大学动物实验中心由专人负责动物的饲养和管理；

实验动物：已经造模成功为慢性胃炎的普通级BALB/c小鼠24只，加上空白对照组8只，共32只，雌雄各半，体重±2g。

5、菌悬液、药液的配制：

无菌接种环收集MRS培养平板上的粪肠球菌CMS-H001菌株，用无菌生理盐水配成悬液，比浊法调整菌悬液终浓度为1×10⁹CFU/ml。

药物：

质子泵抑制剂：泮立苏针剂(40mg/支)(杭州中美华东制药有限公司，批号040805)；

抗生素：克拉霉素片剂(250mg/片)(江西汇仁药业有限公司，批号0510019)，氨苄青霉素针剂(0.5g/支)(华北制药股份有限公司，批号0404307)，庆大霉素(天津药业焦作有限公司，批号05052802)，均购自中南大学湘雅二院药剂科。

小鼠的药物的剂量按人与各种动物之间的用药剂量换算：已知A种动物每kg体重用药量，欲计算B种动物每kg体重用药剂量时，可查表(参见孙敬方著《动物实验方法学》，北京，人民卫生出版社2001年，116至125页)，找出折算系数(W)再按下式计算：B种动物的剂量(mg/kg)＝W×A种动物的剂量(mg/kg)。由上述公式计算得出各种药物的剂量如下：

泮立苏针剂(40mg)用100ml无菌生理盐水稀释成浓度为0.4mg/ml的溶液，每只小鼠每天每次给0.25ml灌胃。

氨苄青霉素(0.5g)用25ml无菌生理盐水稀释成浓度为20mg/ml的溶液，每只小鼠每天每次给0.25ml灌胃。

克拉霉素(0.25g)用5ml无菌生理盐水稀释成浓度为50mg/ml的溶液，每只小鼠每天每次给0.1ml灌胃。

6、实验动物分组及治疗方法：

经抗生素预处理、再给予PPI加HP灌胃，造模成功的24只Balb/c小鼠随机分成3组，每组8只。第1组为PPI加抗生素处理组，第2组为粪肠球菌CMS-H001处理组；第3组为模型对照组；另外增加8只正常Balb/c小鼠作为空白对照组(第4组)。

第1组(PPI+抗生素三联疗法治疗组)：自第3-10天，每天先禁食12h，予PPI溶液0.25ml及氨苄青霉素0.25ml加克拉霉素0.1ml灌胃，灌完胃后再禁食3-4个小时，每天一次，连用7天。于最后一次灌胃后第4周全部处死小鼠。

第2组(粪肠球菌CMS-H001治疗组)：自第1-10天，每日先禁食12h，予CMS-H001新鲜菌悬液0.5ml/只灌胃，细菌数为10⁹CFU，灌完胃后再禁食3-4个小时，每天一次，连用10天。于最后一次灌胃后底4周全部处死小鼠。

第3组(模型对照组)：自第1～10天，每天予生理盐水0.5ml/只灌胃，每天一次。连用10天，于最后一次灌胃后第4周处死全部小鼠。

第4组(空白对照组)：自第1～10天，每天予生理盐水0.5ml/只灌胃，每天一次。连用10天，于最后一次灌胃后第4周处死全部小鼠。

小鼠的处理：用断颈法处死小鼠后立即解剖，取出胃腔，去除前胃，沿大弯侧剪开，取完整的胃组织(包括十二指肠、胃窦、胃体等)；一半胃粘膜用10％的***液固定后行HE染色和Giemsa染色，另一半组织行快速尿素酶试验(观察时间5min)、涂片及细菌培养。

7.细菌检测：

7.1HP检测

1)快速尿素酶试验：造模组小鼠处死后取胃粘膜置于液体尿素酶试剂中，室温下观察5min，指示剂变红为阳性。

2)Hp培养：胃及十二指肠组织标本用含10％胎牛血清的心脑浸液500ul研磨成匀浆，用前后差量法算得标本质量，10^-1系列适当稀释，各梯度取100ul涂心脑浸液血平板，37℃微需氧培养3～7天，观察菌落形态，取可疑菌落行革兰氏染色镜检和快速尿素酶试验。

3)Giemsa染色：步骤如下：

①石蜡切片按同一方向装入染色架，60℃烤片10分钟，以上或用电吹风使切片上的石蜡溶化。

②入二甲苯中脱蜡2～5分钟，重复1次，夏天脱蜡时间短一些，冬天则相反。

③100％，100％，95％，90％，80％，70％乙醇依次各1分钟，入自来水，流水放置约3分钟，至切片清晰。

④直接入2％Giemsa染液中染色30分钟(染液可重复使用)。

⑤自来水洗去染液

⑥直接入100％乙醇中脱水。

⑦常规脱水，透明，封片。

4)Gram’s染色步骤：①结晶紫染色：1min，流水冲洗；②卢戈氏碘媒染：染色1min，流水冲洗；③酒精脱色：95％酒精脱色，15～30秒，至无紫色脱下为止，流水冲洗；④稀石炭酸复红复染，1min，流水冲洗。

集中检测方法中，细菌培养阳性即诊断为HP阳性，快速尿素酶试验、改良Giemsa染色及Gram’s染色两项阳性诊断为Hp阳性。

8.病理学

处死小鼠立即解剖后，取一半胃粘膜用10％的***液固定后行HE染色：小鼠胃组织用10％***固定，石蜡包埋，切片，HE染色(苏木素染色7分钟——自来水冲洗多余的染液——1％盐酸酒精分化5秒，使细胞核呈紫蓝色——自来水成分洗涤——1％伊红染色，3分钟左右)。病理科医生双盲阅片。

9.判断标准

9.1Hp定植的判断标准(International Agency for Research on CancerWorking Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.Schistosomes，Liver Flukes，and Helicobacter pylori.Lyon：InternationalAgency for Research on Cancer，1994：177-240.)(MalfertHeiner P，Megraud F，O’Morain C et al.Current concepts in the management of Helicobacter pyloriinfection-tHe Maastricht 2-2000 Consensus Report.Alimentary Pharmacologyand Therapeutics 2002；16：167-180.)

高倍镜下观察Giemsa染色切片10个视野，以Hp数量的多少进行计分来判断其定植情况。标准如表4：

表4.Hp定植量的评分标准

分数	评分标准
		0分1分2分3分4分	任何胃小凹内均观察不到Hp定植少量Hp定植且不是每个胃小凹内都能观察到(1-2个细菌/胃小凹)Hp定植量低但在多数胃小凹内可观察到(3-10个细菌/胃小凹)所有胃小凹内均有中量到多量的Hp(11-20个Hp/胃小凹)大量定植，所有胃小凹内均满布Hp(大于20个Hp/胃小凹)

9.2胃粘膜慢性炎症的评分标准(MalfertHeiner P，Megraud F，O’Morain C et al.Current concepts in the management of Helicobacter pyloriinfection-tHe Maastricht 2-2000 Consensus Report.Alimentary Pharmacologyand Therapeutics 2002；16：167-180.)

观察粘膜固有层慢性炎症细胞(淋巴细胞、浆细胞及嗜酸性粒细胞)和中性粒细胞，分别对固有层慢性炎症和活动性炎症程度进行计分，标准如下表5。粘膜下层的炎症评分标准同粘膜固有层。整个黏膜的炎症评分为黏膜固有层和黏膜下层的平均值。

表5  胃粘膜病理组织学损伤评分标准

分数	评分标准
		0分1分2分3分4分5分6分	未见或偶见炎症细胞轻度的多灶性分布轻度的广泛分布或中度的多灶性分布轻度广泛分布并中度多灶性分布或重度多灶性分布中度广泛分布中度广泛分布并重度多灶性分布重度广泛分布

9.3疗效判断

(1)Hp根除标准：治疗停止后一个月做细菌培养阴性或快速尿素酶试验和组织学染色检查2项均阴性为Hp根除。

(2)Hp感染好转标准：单位质量组织Hp计数减少或组织学染色细菌量减少。

(3)病理学治愈标准：大体观转为正常且病理组织学结果正常。

(4)病理学好转标准：大体观充血水肿较前减轻，糜烂溃疡灶较治疗前缩小(游标卡测量病灶直径)，或病理学未完全正常，但评分较治疗前减少。

体内有效性判断标准：

治愈标准：(1)加(3)，即Hp根除加上病理学结果正常。

好转标准：(1)加(4)，或(2)加(3)，或(2)加(4)。

有效率＝治愈率+好转率

10、统计方法

运用SPSS11.0统计软件进行数据处理，结果以均数±标准差(x±s)表示，两组间均数比较采用t检验和方差分析，P＜0.05视为显著性差异。

二、结果

1、一般情况

在实验过程中，观察各组小鼠的饮食情况、活动量及毛发、体重的情况，每周称体重，发现各组小鼠之间饮食及活动量无明显变化，体重的变化无显著性差异(P＜0.05)(见表6)。

表6：小鼠体重变化表(x±s，n＝8)

组别	治疗前	第1周	第2周	第3周	第4周
						1组2组3组4组	25.23±4.0524.87±4.5325.64±4.8625.24±4.39	25.47±3.8625.10±2.8926.16±5.2125.46±3.76	24.57±4.1424.60±3.1525.33±4.0726.56±3.25	25.71±3.5425.43±3.2625.04±4.3925.97±2.79	26.21±4.5725.97±2.8725.54±4.7926.49±4.61

2.大体观察

2.1从沿胃大弯纵行切开的胃黏膜面观察，可以看到模型组Hp感染引起的充血水肿及部分胃窦黏膜糜烂，治疗组大部分胃黏膜无明显充血水肿，治疗结束后大体观可见胃黏膜炎症与模型组比较明显好转。

2.2病理组织学损伤积分

各组损伤积分参见表7以及图6的直方图，图6的A和B分别代表胃窦、胃体的损伤积分。

总体上胃窦黏膜炎症损伤积分稍高于胃体黏膜，4组间胃窦黏膜炎症损伤积分比较有统计学差异，其中第1组(PPI+抗生素处理组)、第2组(粪肠球菌CMS-H001治疗组)、第4组(空白对照组)的胃窦黏膜炎症损伤的积分均低于第3组(模型对照组)，差异有显著性(P＜0.05)，第1组、第2组、第4组两两比较差异无显著性(P＞0.05)。

胃体炎症损伤积分4组比较有统计学差异，其中第1组、第2组、第4组的胃体黏膜炎症损伤的积分均低于第3组，差异有显著性(P＜0.05)，第1组、第2组、第4组两两比较差异无显著性(P＞0.05)。

表7：Balb/c鼠处理各处理组胃黏膜慢性炎症损伤积分(x±s，n＝8)

组别	胃窦	胃体
			第1组第2组第3组第4组	1.96±0.43*1.81±0.44*2.75±0.571.53±0.28*	1.84±0.38*1.71±0.65*2.675±0.741.47±0.34*

注：与第3组比较，^*P＜0.05

3、计算HP的根除率

3.1 Hp的定植积分

Giemsa染色可清楚地显示Hp呈S形，多定植于胃小凹上部及胃腺腔内。各组Hp的定植积分参见表8以及图7的直方图，图7的A和B分别代表胃窦、胃体的Hp定植积分。

4组间胃窦黏膜Hp定植积分比较有统计学差异，其中第1组、第2组与第3组比较差异有显著性(P＜0.05)，第1组、第2组两两比较差异无显著性(P＞0.05)。

4组间胃体黏膜Hp定植积分比较有统计学差异，其中第1组、第2组与第3组比较差异有显著性(P＜0.05)，第1组、第2组两两比较差异无显著性(P＞0.05)。

表8：各组Balb/c鼠Hp定植积分结果(x±s，n＝8)

组别	胃窦	胃体
			第1组第2组第3组第4组	1.13±0.23×1.19±0.26×1.63±0.520±0×	1.13±0.23×1.16±0.30×1.56±0.320±0×

注：各组Hp定植积分与第3组比较，^×P＜0.05

图8为各组胃粘膜改良Giemsa染色图，可见空白对照组胃小凹内未见明显杆菌，模型组可见大量杆菌黏附，而PPI治疗组和粪肠球菌CMS-H001治疗组则仅可见少量杆菌黏附。

3.2 HP的快速尿素酶试验和培养结果：

结果见表9。第1、2组胃窦和胃体部快速尿素酶试验和细菌培养与第3组比较均有显著性差异(P＜0.05)。

表9：快速尿素酶试验和细菌培养结果

组别	快速尿素酶试验		Hp培养
					胃窦	胃体	胃窦	胃体
	第1组第2组第3组第4组	12.5％(1/8)25.0％(2/8)87.5％(7/8)0(0/8)	12.5％(1/8)12.5％(1/8)75％(6/8)0(0/8)	12.5％％(1/8)12.5％(1/8)62.5％(5/8)0(0/8)					0.0％(0/8)12.5％(1/8)50％(4/8)0(0/8)

3.3各处理组不同部位HP的根除率比较：

结果见表10。

胃窦部：第1组和第2组与第3组、第4组比较差异有显著性(P＜0.05)，第1、2组之间比较差异无显著性(P＞0.05)。

胃体部：第1组、第2组与第3组、第4组比较差异有显著性(P＜0.05)。

表10  不同处理组、不同部位HP的根除率比较

组别	Hp阳性例数		Hp根除率
					胃窦	胃体	胃窦	胃体
	第1组第2组第3组第4组	1/82/87/80	1/81/82/80	87.5％75％12.5％0					87.5％87.5％25.0％0

3.4培养的HP做Gram’s染色涂片观察细菌形态

模型组胃组织匀浆涂片和匀浆组织细菌培养的HE染色光镜下形态，均可见Gram’s染色阴性细菌，呈弯曲杆菌或弧形，如图9A、B所示。

以上结果表明，本发明的粪肠球菌CMS-H001能减轻HP感染引起的黏膜慢性炎症损伤，减少淋巴细胞、浆细胞的浸染，与模型组比较有显著性差异，与PPI治疗组(常规治疗方法)比较无明显差异；并有抑制HP的作用，治疗后HP细菌检测明显减少，对HP的根除率达到75％-87.5％，与PPI三联疗法比较差异无显著性。

Claims (13)

1、一种粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，其保藏号为CCTCC No.M 206108。

2、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)抑制剂，其特征在于：所述抑制剂含有保藏号为CCTCC No.M 206108的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)CMS-H001。

3、权利要求1所述的粪肠球菌CMS-H001在制备用于治疗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)感染导致的疾病的药物中的应用。

4、根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述疾病为胃病。

5、根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述疾病为慢性胃炎。

6、根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述疾病为胃癌。

7、根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述疾病为胃黏膜相关性淋巴瘤。

8、根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述疾病为消化性溃疡。

9、一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物含有保藏号为CCTCC No.M 206108的药学有效剂量的粪肠球菌CMS-H001。

10、一种食品，其特征在于：所述食品含有保藏号为CCTCC No.M206108的粪肠球菌CMS-H001。

11、根据权利要求10所述的食品，其特征在于：所述食品为饮料。

12、一种保健品，其特征在于：所述保健品含有保藏号为CCTCC No.M 206108的粪肠球菌CMS-H001。

13、一种食品添加剂，其特征在于：所述食品添加剂含有保藏号为CCTCC No.M 206108的粪肠球菌CMS-H001。

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