CN110054664B - 含d型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用 - Google Patents

含d型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用 Download PDF

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Abstract

本发明设计合成了含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物，其是以线性两亲性α‑螺旋天然抗菌肽Anoplin为模板，将D型氨基酸替换增强酶解稳定性和对替换后D型氨基酸侧链进行脂肪酸修饰增强抗耐药菌活性的策略相结合，得到的一类全新结构的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物Ano‑D4,7‑4Cn和Ano‑D4,7‑7Cn，n＝4‑16。体外抑菌实验、PI染色法流式细胞术实验和酶解稳定性实验均表明，本发明含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物具有强抗耐药菌活性和高酶解稳定性；相比于传统抗生素，本发明得到的新型抗菌肽类似物在临床抗菌药物的开发方面具有很好的应用前景。

Description

含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和 应用
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，涉及一类全新结构的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用，特别涉及一类具有强抗耐药菌活性和高酶解稳定性的含D型氨基酸侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用。
背景技术
近年来，由于传统抗生素在临床用药中的滥用，导致耐药菌株，即“超级细菌”的不断出现，该“超级细菌”对大多数或所有可用的抗生素均表现出耐受性(HealthEcon.1996May-Jun；5(3):217-26)。多粘菌素B和多粘菌素E(又称粘菌素)作为阳离子肽类抗菌药，在20世纪60年代得到广泛应用，但由于严重的毒性问题，在20世纪70年代其临床应用大大减少。虽然随着20世纪70年代流行的具有多药耐药性的革兰氏阴性细菌的出现，这两种抗菌药物的使用又出现了复苏，成为了最后的抗生素，但不幸的是，多粘菌素耐药的“超级细菌”也相继出现(Expert Rev Anti Infect Ther.2012Aug；10(8):917-34；BiomedRes Int.2015；2015:679109)。毋庸置疑，一类新抗生素的开发已经变得至关重要(LancetInfect Dis.2013Dec；13(12):1057-98)。作为一种具有较大潜力的新型抗生素，抗菌肽(AMPs)，特别是阳离子抗菌肽，由于其具有广谱抗菌活性，且能够快速杀菌，受到了极大关注(Chembiochem.2015Jan 19；16(2):242-53)。AMPs通常由多样的生物有机体产生，包括细菌、真菌、植物、昆虫、两栖动物、甲壳类动物、鱼类和哺乳动物(Clin MicrobiolRev.2006Jul；19(3):491-511)。最为重要的，相较于传统抗生素，细菌不易对没有特定作用靶点的抗菌肽产生耐药性。抗菌肽的作用方式通常涉及与细菌胞质膜的非特异性相互作用，使得到达细菌膜中的抗菌肽发生积累，使膜的渗透性增加和屏障功能丧失，最终导致细菌内容物的泄露而死亡(Eur.J.Biochem.2001,268,5589-5600；Nat RevMicrobiol.2005Mar；3(3):238-50)。
然而，尽管与传统抗生素相比，AMPs能够有望战胜“超级细菌”，但作为理想的抗菌药物，抗菌活性不佳、宿主细胞的毒性、生理条件的不耐受性、酶降解的敏感性，以及由于复杂的设计而导致的高制造成本，限制了AMPs的临床应用。大量研究表明，D型氨基酸的引入，能够有效的避免蛋白酶的降解，提高抗菌肽的酶解稳定性(Sci Rep.2017Jul 31；7(1):6953；Chem Biol Drug Des.2006Feb；67(2):162-73)，但D型氨基酸的引入通常会导致其抗菌活性降低。而脂肪酸作为生物细胞膜磷脂的重要组成部分，具有较高的疏水性，将其引入抗菌肽中，有利于通过增加抗菌肽的疏水性而增强其对细菌细胞膜的亲和力，从而增强其抗菌活性，并且脂肪酸还可以减少蛋白酶的降解，增强抗菌肽的酶解稳定性，延长抗菌肽体内作用时间(Biochem J，2005，385(Pt 1)：135-43；Biophys Chem，2015，199：25-33)。
发明内容
本发明的目的之一：提供一类全新结构的具有强抗耐药菌活性和高酶解稳定性的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物。
本发明的目的之二：提供上述抗菌肽类似物在临床抗菌药物开发中的应用。
本发明的目的之三：提供上述抗菌肽类似物的合成方法。
(一)含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物
本发明含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物，是在母肽Anoplin的部分D型氨基酸替换类似物Ano-D4,7的4位或者7位引入带有侧链保护基Mtt的D型特殊非天然氨基酸Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH，然后脱去侧链保护基，对该D型特殊非天然氨基酸的侧链进行不同长度的脂肪酸(Cn，n＝4-16)修饰，得到新型结构的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn，Ano-D4,7-7Cn，n＝4-16。
结构式分别如下所示：
Gly-Leu-Leu-D-Lys(Cn)-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2
其中n＝4-16，命名为Ano-D4,7-4Cn；
Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys(Cn)-Thr-Leu-Leu-NH2
其中n＝4-16，命名为Ano-D4,7-7Cn；
本发明含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，包括以下工艺步骤：
1、Ano-D4,7-4Cn的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys(Mtt)-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即为Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin；
将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin，用含有体积分数为1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，得到Ano-D4,7-4(NH2)-resin；分别将脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA于DMF中溶解混匀，并与Ano-D4,7-4(NH2)-resin进行缩合反应，得到Ano-D4,7-4Cn-resin；将Ano-D4,7-4Cn-resin切割、纯化得到抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn，n＝4-16。
2、Ano-D4,7-7Cn的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys(Mtt)-Thr-Leu-Leu-resin，即为Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)resin；
将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin，用含有体积分数为1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，得到Ano-D4,7-7(NH2)-resin；分别将脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA于DMF中溶解混匀，并与Ano-D4,7-7(NH2)-resin进行缩合反应，得到Ano-D4,7-7Cn-resin；将Ano-D4,7-7Cn-resin切割、纯化得到抗菌肽类似物Ano-D4,7-7Cn，n＝4-16。
以上所述各氨基酸、脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为20-100mg/mL，20-100mg/mL，10-40mg/mL，20-100mg/mL，20-60mg/mL；各氨基酸、脂肪酸、HOBT、HBTU与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比均为6:1-3:1，DIEA与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为6:1-12:1。
所述切割试剂为TFA、三异丙基硅烷和水以体积比9.5:0.25:0.25形成的混合溶液。
所述纯化过程为，粗肽先冷冻干燥得到冻干粉，然后进行RP-HPLC分离；RP-HPLC纯化条件为，流动相A：0.05％TFA的水溶液，流动相B：0.05％TFA的乙腈溶液；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
经质谱鉴定，本发明方法成功合成了新型结构的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn和Ano-D4,7-7Cn，n＝4-16。
(二)含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物体外活性研究
1、抑菌实验
采用经典的二倍稀释法测定上述抗菌肽类似物的最低抑菌浓度，即MIC值。所选用的实验菌株包括标准正常菌株：E.coli ATCC 25922，P.aeruginos ATCC 27853，K.pneumoniae ATCC 700603，S.aureus ATCC 25923，B.subtilis ATCC 23857，S.epidermidis ATCC 12228和临床分离的多重耐药菌株：A.baumannii 9828，A.baumannii9840，P.aeruginosa 1240，P.aeruginosa 1190,E.coli 8500，E.coli 8040，S.aureus4800，S.aureus 5200。具体实验方法如下：经MH培养基过夜培养至生长对数期的实验细菌稀释成1×106CFU/mL的细菌悬浮液；将抗菌肽类似物溶解于无菌水中，经二倍稀释法配成1-128μmol/L的一系列不同浓度的肽溶液，与上述细菌悬浮液等体积混合，于96孔培养板中37℃孵育18-24h，观察，肉眼可见无明显细菌生长的最小浓度即为最低抑菌浓度MIC；抗生素Erythromycin，Kanamycin，Penicillin作阳性对照药；平行重复三次上述实验，结果如表1和表2。
表1对抗标准正常菌株的最低抑菌浓度
Figure BDA0002034362060000041
/>
Figure BDA0002034362060000051
表2对抗多重耐药菌株的最低抑菌浓度
Figure BDA0002034362060000052
表1结果表明，含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn和Ano-D4,7-7Cn对标准正常细菌菌株具有良好的抗菌活性，其抗菌活性相比于母肽Anoplin有明显提高，且部分优于传统抗生素；表2结果表明，含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn和Ano-D4,7-7Cn对临床分离的多重耐药菌菌株具有较强的抗菌活性，其抗菌活性相比于母肽Anoplin有明显提高，并且优于传统抗生素；随着脂肪酸链长度的增加，抗菌肽类似物对标准菌株和多重耐药菌的抗菌活性均显著增强，但当脂肪酸链长度增加到一定程度时，抗菌活性不再增加。
2、流式细胞术实验
采用大肠杆菌(ATCC 25922)标准菌株进行PI染色流式细胞术检测抗菌肽类似物对细菌膜破坏作用。具体实验方法如下：将培养至对数期的大肠杆菌稀释至10×108CFU/mL，PBS(10mM，pH 7.4)洗涤后并半体积重悬，得到细菌悬浮液；将抗菌肽类似物溶解于PBS，浓度为8×MIC，与上述细菌悬浮液等体积混合，于37℃共孵育2h，经碘化吡啶(PI)避光染色15min后，PBS洗去多余染料，经流式细胞仪检测PI荧光的摄取能力，结果如图9。
图9结果表明，含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn和Ano-D4,7-7Cn，均具有较好的细菌细胞膜破坏能力；随着侧链脂肪酸长度增加，抗菌肽类似物对细菌细胞膜的破坏能力明显增强，可以为上述抗菌活性的显著增强做出解释。
3、酶解稳定性实验
将肽溶液与不同浓度的胰蛋白酶溶液(1mg/mL，0.5mg/mL，0.2mg/mL，0.1mg/mL)37℃共孵育1h和6h；60℃灭活15min后，与上述最低抑菌浓度测定方法相同，测定在不同胰蛋白酶溶液中对E.coli ATCC 25922的最低抑菌浓度MIC，结果如表3所示。
表3不同浓度胰蛋白酶条件下对E.coli ATCC 25922的最低抑菌浓度
Figure BDA0002034362060000061
Control：无胰蛋白酶存在下对E.coli ATCC 25922的最低抑菌浓度
表3结果表明，母肽Anoplin在不同浓度的胰蛋白酶环境下均丧失抗菌活性，表现出低稳定性；但含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn和Ano-D4,7-7Cn在不同浓度胰蛋白酶环境中均未丧失抗菌活性，最低抑菌浓度MIC只是发生轻微改变，仍然表现出较好的抗菌活性，说明含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物在胰蛋白酶环境下具有较高稳定性，其稳定性明显优于母肽。
综上，本发明是以线性两亲性α-螺旋天然抗菌肽Anoplin为模板，将D型氨基酸替换增强酶解稳定性和对替换后D型氨基酸侧链进行脂肪酸修饰增强抗耐药菌活性的策略相结合，得到一类全新结构的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物。体外生物活性研究结果显示，该含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物具有强抗耐药菌抗菌活性和高酶解稳定性，在临床抗菌药物开发中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明抗菌肽类似物Ano-D4,7-4C4的质谱图；
图2为本发明抗菌肽类似物Ano-D4,7-4C8的质谱图；
图3为本发明抗菌肽类似物Ano-D4,7-4C12的质谱图；
图4为本发明抗菌肽类似物Ano-D4,7-4C16的质谱图；
图5为本发明抗菌肽类似物Ano-D4,7-7C4的质谱图；
图6为本发明抗菌肽类似物Ano-D4,7-7C8的质谱图；
图7为本发明抗菌肽类似物Ano-D4,7-7C12的质谱图；
图8为本发明抗菌肽类似物Ano-D4,7-7C16的质谱图；
图9为本发明抗菌肽类似物的PI染色流式细胞术实验结果图；图中以从左到右、从上到下的顺序依次为对照组，Anoplin组，Ano-D4,7-4C8组，Ano-D4,7-4C12组，Ano-D4,7-7C8组和Ano-D4,7-7C12组。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法作进一步说明。
实施例1：Ano-D4,7-4C4的合成
(1)树脂的活化及预处理
准确称取0.47g的MBHA树脂(0.43mmol/g)置于多肽固相合成仪中，DCM溶液溶胀30min后，经茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明树脂正常。
(2)Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去；将Fmoc-Leu-OH(212mg)、HOBT(81mg)、HBTU(228mg)、DIEA(0.2mL)于5-10mL DMF中溶解混匀，加入合成仪中与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-Leu-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Leu-OH(212mg)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(239mg)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(281mg)、Fmoc-Ile-OH(212mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(390mg)、Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH(376mg)、Fmoc-Leu-OH(212mg)、Fmoc-Leu-OH(212mg)、Fmoc-Gly-OH(238mg)，HOBT、HBTU和DIEA用量同上，其中Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH缩合反应时间为1.5h，其余均为1h，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys(Mtt)-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin；
(3)Ano-D4,7-4C4-resin的合成
将上述Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-4(NH2)-resin；分别将丁酸酐(Cn，n＝4；0.87mL)、HOBT(81mg)、HBTU(228mg)、DIEA(0.2mL)于5-10mLDMF中溶解混匀，加入合成仪中与上述脱去侧链Mtt保护基的Ano-D4,7-4(NH2)-resin混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明缩合反应完全，得到Ano-D4,7-4C4-resin；用含有体积分数20％哌啶的DMF溶液，脱去N末端Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-4C4-resin。
(4)多肽切割
将Ano-D4,7-4C4-resin以TFA、三异丙基硅烷和水体积比9.5:0.25:0.25的混合溶液为切割试剂进行切割，经冰***和水萃取后，冷冻干燥，得到粗肽冻干粉；
(5)多肽纯化
将上述冷冻干燥得到的粗肽冻干粉经RP-HPLC分离纯化，收集流出液，再冷冻干燥，经质谱鉴定得Ano-D4,7-4C4，分子量为1223Da，质谱图见图1；其中，RP-HPLC纯化条件：流动相A:0.05％TFA/水；流动相B:0.05％TFA/乙腈；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
实施例2：Ano-D4,7-4C8的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin的合成
同实施例1。
(3)Ano-D4,7-4C8-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin，用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-4(NH2)-resin；分别将辛酸酐(Cn，n＝8；1.53mL)、HOBT(81mg)、HBTU(228mg)、DIEA(0.2mL)于5-10mL DMF中溶解混匀，加入合成仪中与上述脱去侧链Mtt保护基的Ano-D4,7-4(NH2)-resin混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明缩合反应完全，得到Ano-D4,7-4C8-resin；用含有体积分数20％哌啶的DMF溶液，脱去N末端Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-4C8-resin。
(4)多肽切割
同实施例1。
(5)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得到Ano-D4,7-4C8，分子量为1279Da，质谱图见图2。
实施例3：Ano-D4,7-4C12的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-Ano-D4,7-resin的合成
同实施例1。
(3)Ano-D4,7-4C12-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin，用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-4(NH2)-resin；分别将十二烷酸(Cn，n＝12；240mg)、HOBT(81mg)、HBTU(228mg)、DIEA(0.2mL)于5-10mL DMF中溶解混匀，加入合成仪中与上述脱去侧链Mtt保护基的Ano-D4,7-4(NH2)-resin混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明缩合反应完全，得到Ano-D4,7-4C12-resin；用含有体积分数20％哌啶的DMF溶液，脱去N末端Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-4C12-resin。
(4)多肽切割
同实施例1。
(5)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得Ano-D4,7-4C12，分子量为1335Da，质谱图见图3。
实施例4：Ano-D4,7-4C16的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-Ano-D4,7-resin的合成
同实施例1。
(3)Ano-D4,7-4C16-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin，用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-4(NH2)-resin；分别将十六烷酸(Cn，n＝16；307mg)、HOBT(81mg)、HBTU(228mg)、DIEA(0.2mL)于5-10mL DMF中溶解混匀，加入合成仪中与上述脱去侧链Mtt保护基的Ano-D4,7-4(NH2)-resin混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明缩合反应完全，得到Ano-D4,7-4C16-resin；用含有体积分数20％哌啶的DMF溶液，脱去N末端Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-4C16-resin。
(4)多肽切割
同实施例1。
(5)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得Ano-D4,7-4C16，分子量为1391Da，质谱图见图4。
实施例5：Ano-D4,7-7C4的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去；将Fmoc-Leu-OH(212mg)、HOBT(81mg)、HBTU(228mg)、DIEA(0.2mL)于5-10mL DMF中溶解混匀，加入合成仪中与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-Leu-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Leu-OH(212mg)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(239mg)、Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH(376mg)、Fmoc-Ile-OH(212mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(390mg)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(281mg)、Fmoc-Leu-OH(212mg)、Fmoc-Leu-OH(212mg)、Fmoc-Gly-OH(238mg)，HOBT、HBTU和DIEA用量同上，其中Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH缩合反应时间为1.5h，其余均为1h，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys(Mtt)-Thr-Leu-Leu-resin，即Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin；
(3)Ano-D4,7-7C4-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin，用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-7(NH2)-resin；分别将丁酸酐(Cn，n＝4；0.87mL)、HOBT(81mg)、HBTU(228mg)、DIEA(0.2mL)于5-10mL DMF中溶解混匀，加入合成仪中与上述脱去侧链Mtt保护基的Ano-D4,7-7(NH2)-resin混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明缩合反应完全，得到Ano-D4,7-7C4-resin；用含有体积分数20％哌啶的DMF溶液，脱去N末端Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-7C4-resin。
(4)多肽切割
同实施例1。
(5)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得Ano-D4,7-7C4，分子量为1223Da，质谱图见图5。
实施例6：Ano-D4,7-7C8的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin的合成
同实施例5。
(3)Ano-D4,7-7C8-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin，用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-7(NH2)-resin；分别将辛酸酐(Cn，n＝8；1.53mL)、HOBT(81mg)、HBTU(228mg)、DIEA(0.2mL)于5-10mL DMF中溶解混匀，加入合成仪中与上述脱去侧链Mtt保护基的Ano-D4,7-7(NH2)-resin混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明缩合反应完全，得到Ano-D4,7-7C8-resin；用含有体积分数20％哌啶的DMF溶液，脱去N末端Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-7C8-resin。
(4)多肽切割
同实施例1。
(5)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得Ano-D4,7-7C8，分子量为1279Da，质谱图见图6。
实施例7：Ano-D4,7-7C12的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin的合成
同实施例5。
(3)Ano-D4,7-7C12-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin，用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-7(NH2)-resin；分别将十二烷酸(Cn，n＝12；240mg)、HOBT(81mg)、HBTU(228mg)、DIEA(0.2mL)于5-10mL DMF中溶解混匀，加入合成仪中与上述脱去侧链Mtt保护基的Ano-D4,7-7(NH2)-resin混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明缩合反应完全，得到Ano-D4,7-7C12-resin；用含有体积分数20％哌啶的DMF溶液，脱去N末端Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-7C12-resin。
(4)多肽切割
同实施例1。
(5)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得Ano-D4,7-7C12，分子量为1335Da，质谱图见图7。
实施例8：Ano-D4,7-7C16的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin的合成
同实施例5。
(3)Ano-D4,7-7C16-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin，用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-7(NH2)-resin；分别将十六烷酸(Cn，n＝16；307mg)、HOBT(81mg)、HBTU(228mg)、DIEA(0.2mL)于5-10mL DMF中溶解混匀，加入合成仪中与上述脱去侧链Mtt保护基的Ano-D4,7-7(NH2)-resin混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明缩合反应完全，得到Ano-D4,7-7C16-resin；用含有体积分数20％哌啶的DMF溶液，脱去N末端Fmoc保护基，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明保护基已脱去，得到Ano-D4,7-7C16-resin。
(4)多肽切割
同实施例1。
(5)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得Ano-D4,7-7C16，分子量为1335Da，质谱图见图8。

Claims (9)

1.一类含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物，其特征是，该抗菌肽类似物的结构式为：
Gly-Leu-Leu-D-Lys(Cn)-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2
Ano-D4,7-4Cn，Cn为辛酸、十二烷酸或十六烷酸；
或
Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys(Cn)-Thr-Leu-Leu-NH2
Ano-D4,7-7Cn，Cn为辛酸、十二烷酸或十六烷酸。
2.如权利要求1所述的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物中的应用。
3.如权利要求1所述的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是：
采用经典固相合成方法，将带有侧链保护基Mtt的D型特殊非天然氨基酸Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH引入Anoplin的部分D型氨基酸替换类似物Ano-D4,7序列的4位或7位，合成Ano-D4,7-4(Mtt)-resin或Ano-D4,7-7(Mtt)-resin；然后脱去侧链保护基，对所述D型特殊非天然氨基酸的侧链进行不同长度的脂肪酸修饰；最后经切割、纯化后得到含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn或Ano-D4,7-7Cn，其中，Cn为辛酸、十二烷酸或十六烷酸。
4.如权利要求3所述的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述抗菌肽类似物的合成方法具体为：
(1)Ano-D4,7-4Cn的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys(Mtt)-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即为Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin；
将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-4(Mtt)-resin，用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，得到Fmoc-Ano-D4,7-4(NH2)-resin；分别将脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA于DMF中溶解混匀，并与Fmoc-Ano-D4,7-4(NH2)-resin进行缩合反应，得到Fmoc-Ano-D4,7-4Cn-resin；将Fmoc-Ano-D4,7-4Cn-resin脱去Fmoc-保护基后切割、纯化，得到抗菌肽类似物Ano-D4,7-4Cn，Cn为辛酸、十二烷酸或十六烷酸；
(2)Ano-D4,7-7Cn的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys(Mtt)-Thr-Leu-Leu-resin，即为Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin；
将上述得到的Fmoc-Ano-D4,7-7(Mtt)-resin，用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，得到Fmoc-Ano-D4,7-7(NH2)-resin；分别将脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA于DMF中溶解混匀，并与Fmoc-Ano-D4,7-7(NH2)-resin进行缩合反应，得到Fmoc-Ano-D4,7-7Cn-resin；将Fmoc-Ano-D4,7-7Cn-resin脱去Fmoc-保护基后切割、纯化，得到抗菌肽类似物Ano-D4,7-7Cn，Cn为辛酸、十二烷酸或十六烷酸。
5.如权利要求4所述的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述各氨基酸、各脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为20-100mg/mL，20-100mg/mL，10-40mg/mL，20-100mg/mL，20-60mg/mL。
6.如权利要求4或5所述的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述各氨基酸、各脂肪酸、HOBT、HBTU与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比均为6:1-3:1，DIEA与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为6:1-12:1。
7.如权利要求3-5任一项所述的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述切割试剂为TFA、三异丙基硅烷和水以体积比9.5:0.25:0.25形成的混合溶液。
8.如权利要求3-5任一项所述的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述纯化过程为，经冷冻干燥后，进行RP-HPLC分离纯化；RP-HPLC纯化条件为，流动相A：0.05％TFA的水溶液，流动相B：0.05％TFA的乙腈溶液；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
9.如权利要求6所述的含D型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述纯化过程为，得到的粗肽经冷冻干燥后，进行RP-HPLC分离纯化；RP-HPLC纯化条件为，流动相A：0.05％TFA的水溶液，流动相B：0.05％TFA的乙腈溶液；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Àngel Oliveras et al.Antimicrobial activity of linear lipopeptides derived from BP100 towards plant pathogens.《PLOS ONE》.2018, *
Synthesis and biological activity of lipophilic analogs of the cationic antimicrobial active peptide anoplin;Kostas Chionis et al;《Journal of peptide science》;20161231;摘要，第3页右栏第1段-第4页左栏第1段，第4页右栏第2段-第5页左栏最后1段，表2，图4 *

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