CN118067981A - 一种用于微生物检测的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于微生物检测的试剂盒及其应用，属于免疫检测技术领域。所述用于微生物检测的试剂盒包括包被捕获抗体的酶标板、HRP标记抗体、抗原标准品、洗涤液、显色液以及终止液；所述捕获抗体和HRP标记抗体均为特异性结合人芽囊原虫抗原的抗体。本发明提供的用于微生物检测的试剂盒可检测粪便中人芽囊原虫的含量，准确、灵敏、简单易用，克服了镜检筛查人芽囊原虫需要专业人员及设备、易漏检等缺陷，普通实验室即可完成本操作，具有良好的推广性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种用于微生物检测的试剂盒及其应用。
背景技术
芽囊原虫是一种常见的机会致病性肠道寄生原虫，属于单细胞原生生物，广泛分布于世界各地，主要寄生于人类、以及其他灵长类、狗、猪、猫、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、蛙、蛇等动物的大肠。其中，人芽囊原虫（Blastocystis hominis）是芽囊原虫中人源性的种类。人芽囊原虫形态多样，主要有空泡型、颗粒型、阿米巴型、复***型、包囊型等，大小变化较大，直径范围在2-200μm之间。
人芽囊原虫通过粪便中排出的包囊进行传播，传播途径为粪口传播。凡粪便中排出人芽囊原虫的病人、带虫者或保虫宿主都可成为传染源。粪便管理不当，使人芽囊原虫通过水源、食物及用具而传播。大部分感染者无临床特异性表现，芽囊原虫有机体只是生活在人的消化道中，而不会造成伤害。但当人体免疫力下降时，机会致病性病原体如人芽囊原虫趁虚而入，逐渐成为优势致病病原体，引起腹痛、腹泻、腹胀、厌食、恶心、呕吐等症状，个别重症患者可导致严重腹泻、低蛋白血症、全身水肿等，甚至危及生命。结合当今社会人口老龄化，以及肿瘤、艾滋病、结核等疾病的增多，免疫抑制剂等药物的广泛应用，导致免疫力低下的人群不断增多。因此，对于人芽囊原虫的检测和诊断方法的研究与应用显得尤为重要。
人芽囊原虫的实验室诊断主要通过病原学检查，从标本中检获虫体即可确诊。然而，由于人芽囊原虫形态多样且体积差异较大，对氧气敏感，且病原学检测方法极易受粪便中其他成分的干扰，因此辨识和诊断的难度较大，容易造成一定比例的漏检与误诊。除了传统的病原学检查，目前分子生物学诊断是人芽囊原虫病的常规诊断方法之一。其中，PCR技术具有高度敏感性和特异性，尤其在种间鉴别诊断方面具有独特优势。然而，PCR需要专门的设备和技术人员，通常在专门的检测中心完成，限制了其现场应用的广泛性。
人芽囊原虫作为一种机会致病性肠道寄生原虫，在诊断与防控方面面临诸多挑战。为了更加快速简便、准确度高地检测人芽囊原虫，需要不断探索新的诊断方法和技术，以满足临床的需求。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于微生物检测的试剂盒，利用该检测试剂盒可以进行人芽囊原虫检测，样本易得、操作简便且应用广泛。
本发明的目的之二在于提供所述用于微生物检测的试剂盒的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种用于微生物检测的试剂盒，包括包被捕获抗体的酶标板、HRP标记抗体、抗原标准品、洗涤液、显色液以及终止液。
进一步地，所述捕获抗体和HRP标记抗体均为特异性结合人芽囊原虫抗原的抗体。
进一步地，所述捕获抗体为单克隆抗体4G5，所述单克隆抗体4G5的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述HRP标记抗体由单克隆抗体2E11制备得到，所述单克隆抗体2E11的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述抗原标准品为人芽囊原虫抗原标准品；所述洗涤液为PBST；所述显色液为TMB；所述终止液为2M硫酸。
进一步地，所述特异性结合人芽囊原虫抗原的抗体通过如下方法制备：
（1）粪便中分离人芽囊原虫，反复冻融、超声破碎后离心，制备人芽囊原虫抗原；
（2）取步骤（1）的人芽囊原虫抗原免疫小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；
（3）ELISA筛选分泌人芽囊原虫单克隆抗体的瘤细胞，得到单克隆抗体4G5和单克隆抗体2E11。
进一步地，所述捕获抗体包被酶标板的步骤为：将单克隆抗体4G5用抗体包被液稀释后加到酶标板的微孔中，用封板膜封板，置于4℃包被过夜，加入封闭液室温封闭一段时间，弃去酶标板板孔中的液体，烘干密封，4℃保存。
进一步地，所述HRP标记抗体的制备方法：将单克隆抗体2E11加入被NaIO4氧化的HRP溶液，室温避光反应，加入NaBH4置于4℃继续反应一段时间，PBS透析过夜。
进一步地，NaIO4氧化HRP的步骤为：取0.2M的NaIO4溶液与40mg/mL的HRP溶液混匀，于10 mM的NaAc缓冲液中4℃透析过夜。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
所述用于微生物检测的试剂盒检测粪便中人芽囊原虫的含量的应用。
进一步地，检测步骤为：
（1）取待检测样本预处理后，反复冻融、超声破碎后离心取上清；
（2）取出捕获抗体包被的酶标板，恢复至室温，使用PBST洗涤缓冲液洗板并甩干；加入步骤（1）处理过的样本，室温孵箱孵育后洗板；
（3）将HRP标记抗体加入到步骤（2）的体系中，室温孵育一段时间，PBST洗板并甩干；
（4）向步骤（3）反应过后的体系中加入显色液，室温避光显色一段时间，加入终止液终止反应；
（5）使用酶标仪进行双波长检测，用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值，通过标准曲线计算结果。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供的用于微生物检测的试剂盒可检测粪便中人芽囊原虫的含量，准确、灵敏、简单易用，克服了镜检筛查人芽囊原虫需要专业人员及设备、易漏检等缺陷，普通实验室即可完成本操作，具有良好的推广性。
附图说明
图1为本发明用于微生物检测的试剂盒的原理；其中①为捕获抗体包被的酶标板；②为加入待测样本；③为洗涤液洗板后，酶标板内只剩下结合了捕获抗体的人芽囊原虫抗原；④为HRP标记抗体结合到抗原上；
图2为本发明用于微生物检测的试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
人芽囊原虫单克隆抗体制备：
取腹泻患者的粪样1g，加入10 mL的生理盐水稀释，振荡器振荡混匀，在室温下1000 rpm离心5 min，弃上清，沉淀加入10 mL生理盐水，振荡器上振荡混匀，再次1000 rpm离心5 min弃上清，沉淀加入10 mL生理盐水混匀。将粪便溶液取0.5mL接种至LES双相培养基中，连续传代2周。再将上述培养的原虫接种至软琼脂IMDM固相培养基（含15%新生牛血清、0.3%琼脂、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL链霉素和2.5 µg/mL两性霉素）上，培养4周待团状原虫群落出现时，以接种环挑取单一团状原虫群落接种至IMDM液相培养基（含15%新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和2.5 µg/mL两性霉素）中，继续培养3周。吸取400μL上述培养混合物进行测序，测序引物为：
上游引物：5'TCATACGCTCGTCTCAAA/>3'（SEQ ID NO.1）；
下游引物：5'TGATAGGGCAGAAACTTGA/>3'（SEQ ID NO.2）；
将测序结果与NCBI网站Blastocystis hominis基因组数据进行序列比对，鉴定分离得到的人芽囊原虫是否正确。
将分离到的人芽囊原虫采用液相IMDM培养基在37°C培养箱中厌氧培养7天。用无菌PBS重悬的人芽囊原虫，反复冻融3次后，冰浴超声破碎20 min，10000 rpm离心10 min后取上清，即为人芽囊原虫抗原。二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，将人芽囊原虫抗原的浓度调整为5 μg/mL，加蛋白酶抑制剂，于-80℃保存备用。
采用腹部皮下多点注射方式免疫Balb/c雌性小鼠，免疫三次。间接ELISA法测定小鼠血浆的抗体效价，选择效价最高的小鼠进行杂交瘤细胞融合。脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0的细胞数目比为10:1，融合时间为2min，使用50％聚乙二醇作为融合试剂。经过10天左右的HAT筛选培养基筛选培养后，取上清进行ELISA检测，筛选出性能较优的阳性细胞株，通过有限稀释法对阳性细胞进行亚克隆。将1×107个筛选后的亚克隆细胞腹腔注射Balb/c小鼠，第13天取小鼠腹水，用0.2μm滤器过滤。将腹水采用离子交换色谱纯化，后加入浓缩柱中，以5000rpm的转速离心15min，加入PBS置换获得浓缩后的单抗。调整抗体的浓度为10mg/mL备用。
将活性最高的两个单克隆抗体命名为2E11与4G5，测定其可变区序列。单克隆抗体2E11和单克隆抗体4G5分别包括轻链和重链；其中，单克隆抗体2E11的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；单克隆抗体4G5的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.3
EVKLDQSGADLVKPGGTAKLSMVVSGFGESSFNTREWARSTPDRRLETAAGRTDVSYYNDNEGGKGRFSVTRETVKTTAYLNCSSSRSEENLAYYCVIGDAIMYVQWGQGTAVTVSA；
SEQ ID NO.4
QTVVNTPMALLGSLASQLSANSDLADREWFRQHMATVLKSLAYFASDFDGACDHSSGSTNATNGTLIASILNAEDDGDYYCCKSNLTSISQDTNSSNWFATGTRLEI；
SEQ ID NO.5
QVQLNQSGMELLHPGVNVRISNKGSGYRFTSYCADLAKTSKLHSLDNIGGNPDSGNMQKKKNDYRYKATPNAEQSSSNGFMEAARLTSDENGIYYCSRLAGNYGDYWGQGTGLLVSS；
SEQ ID NO.6
QAVGIQDTALTQTCGETVNVQCHTSVVQWVNDKPERLFNGLIAATYGAFMDGVPARFSGSIAADKAGVTINAGQTEDDVIYFCGLLYLVGSRNPWSMVFGAGTHLTVK。
实施例2
用于微生物检测的试剂盒及其应用：
HRP标记抗体的制备：将实施例1制备的单克隆抗体2E11在50mM碳酸盐缓冲液中透析24h，其间换液2次，透析后将其浓度调整为2mg/mL。称取2mg HRP干粉溶于100μL ddH2O中。称取21mg NaIO4，溶于1 mL ddH2O中，配制成0.2 M的NaIO4溶液。取0.4mL NaIO4溶液与2mL HRP溶液混匀，室温避光40min，浸入10 mM的NaAc缓冲液中4℃透析过夜。HRP溶液与单克隆抗体2E11等体积混匀，室温避光轻轻搅拌3小时。称取0.4mg的NaBH4，溶解于20µL的ddH2O，全部加入上步反应液中，混匀，置于4℃反应2小时，后于PBS中4℃过夜透析。
捕获抗体包被的酶标板的制备：选择实施例2制备的单克隆抗体4G5作为捕获抗体。使用酶标96孔板作为固相载体，将捕获抗体用抗体包被液稀释至2 μg/mL，100 μL/孔加到酶标板的微孔中，用封板膜封板后置于4℃包被过夜。弃去孔中液体，用ELISA洗涤液洗板3次，250 μL/孔加入封闭液，置于室温封闭2h。弃去板孔中的液体，烘干16h，密封，4℃保存。
试剂盒的使用：双抗夹心ELISA方法检测微生物的试剂盒原理如图1所示。其中①为捕获抗体包被的酶标板；②为加入待测样本；③为洗涤液洗板后，酶标板内只剩下结合了捕获抗体的人芽囊原虫抗原；④为HRP标记抗体结合到抗原上，可通过HRP标记抗体偶联的HRP酶检测待测样本中人芽囊原虫的含量。
标准曲线绘制：实验前40 min取出捕获抗体包被好的酶标板，恢复至室温，使用PBST洗涤缓冲液洗板3次并甩干。加入100μL不同稀释度的人芽囊原虫抗原（80ng/mL、60ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL）并设空白对照，于室温孵箱孵育2h，洗板3次并甩干。加入100μL HRP标记抗体工作液至反应孔中，于室温孵箱孵育40 min，洗板3次并甩干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，于室温避光显色10min，加入70 μL 2M硫酸终止反应。使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以标准品浓度为横坐标（ng/mL），OD 450 - OD 630为纵坐标绘制标准曲线。结果如图2所示，本申请用于微生物检测的试剂盒的检测范围为2.5-60 ng/mL，R2= 0.9993。
试验例1
双抗夹心ELISA试剂盒特异性：
取粪便中常见的肠道微生物①乳酸菌（Lactobacillus）、②葡萄球菌（Staphylococcus）、③链球菌（Streptococcus）、④普雷沃氏菌（Prevotella）、⑤脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、⑥梭状芽孢杆菌（Clostridium）、⑦艰难梭菌（Clostridiumdifficile）、⑧双歧杆菌（Bifidobacterium catenulatum）、⑨棒状杆菌（Corynebacterium）、⑩丙酸杆菌（Propionibacterium）培养后离心收集菌体，分别加入无菌PBS重悬，反复冻融3次后，进行冰浴超声破碎20min，10000 rpm离心10 min后取上清，即为肠道微生物的抗原。BCA法测定浓度，将其浓度调整为20 ng/mL，加蛋白酶抑制剂，于-80℃保存。
实验前30 min，取出捕获抗体包被好的酶标板，恢复至室温，使用PBST洗涤缓冲液洗板3次并甩干。加入100μL 20ng/mL的人芽囊原虫抗原或肠道微生物抗原（称为菌①-⑩）各4份，于室温孵箱孵育2h，洗板3次并甩干。加入100μL HRP标记抗体工作液至反应孔中，于室温孵箱孵育40 min，洗板3次并甩干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，于室温避光显色10 min，加入70 μL 2M硫酸终止反应。使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，通过标准曲线计算结果。结果显示，该抗体对不与其他类似蛋白反应（表1）。
表1
试验例2
双抗夹心ELISA试剂盒稳定性：
将捕获抗体包被好的酶标板、HRP标记抗体、人芽囊原虫抗原标准品放于37℃测试其稳定性，放置20天，每5天做一次人芽囊原虫抗原检测。将捕获抗体包被好的酶标板、HRP标记抗体、人芽囊原虫抗原标准品放入4℃冰箱储存，存放时间为2年，每12个月取出做一次人芽囊原虫抗原检测。
检测方法为：取捕获抗体包被好的酶标板，使用PBST洗涤缓冲液洗板3次并甩干。加入100μL不同稀释度的人芽囊原虫抗原（60ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL）并设空白对照，于室温孵箱孵育2h，洗板3次并甩干。加入100μL HRP标记抗体工作液至反应孔中，于室温孵箱孵育40 min，洗板3次并甩干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，于室温避光显色10 min，加入70 μL 2M硫酸终止反应。使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以标准品浓度为横坐标（ng/mL），OD 450 - OD 630为纵坐标绘制标准曲线。结果如表2所示，试剂盒在37℃暴露15天、低温储存2年内，标准曲线的OD值梯度良好，表明试剂盒稳定性良好。
表2
试验例3
人芽囊原虫检测：
取来自20位一周内有腹泻经历的志愿者的粪样各1g，加入10 mL的生理盐水稀释，振荡器振荡混匀，在室温下1000 g离心5 min，弃上清，沉淀加入10 mL生理盐水，振荡器上振荡混匀，再次1000 g离心5 min弃上清，沉淀加入10 mL生理盐水混匀。反复冻融3次后，冰浴超声破碎20 min，10000 rpm离心10 min后取上清。样品记为粪样1-20。取自来水为阴性对照，10ng/mL的人芽囊原虫抗原为阳性对照。
实验前30 min，取出捕获抗体包被好的酶标板，恢复至室温，使用PBST洗涤缓冲液洗板3次并甩干。加入100μL待测样品（每个样品做三次重复），于室温孵箱孵育2h，洗板3次并甩干。加入100μL HRP标记抗体工作液至反应孔中，于室温孵箱孵育40 min，洗板3次并甩干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，于室温避光显色10 min，加入70 μL 2M硫酸终止反应。使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值，通过标准曲线计算结果。如表3所示，8名志愿者粪便样本检测结果人芽囊原虫抗原阳性，检出浓度均在本发明试剂盒的线性范围以内，说明本发明所建立的检测方法可以用粪便作为样本完成人芽囊原虫感染检测。
表3
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种用于微生物检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被捕获抗体的酶标板、HRP标记抗体、抗原标准品、洗涤液、显色液以及终止液；
所述捕获抗体和HRP标记抗体均为特异性结合人芽囊原虫抗原的抗体；
所述捕获抗体为单克隆抗体4G5，所述单克隆抗体4G5的重链氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述HRP标记抗体由单克隆抗体2E11制备得到，所述单克隆抗体2E11的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的用于微生物检测的试剂盒，其特征在于，所述抗原标准品为人芽囊原虫抗原标准品；所述洗涤液为PBST；所述显色液为TMB；所述终止液为2M硫酸。
3.根据权利要求1或2所述的用于微生物检测的试剂盒，其特征在于，所述特异性结合人芽囊原虫抗原的抗体通过如下方法制备：
（1）粪便中分离人芽囊原虫，反复冻融、超声破碎后离心，制备人芽囊原虫抗原；
（2）取步骤（1）的人芽囊原虫抗原免疫小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；
（3）ELISA筛选分泌人芽囊原虫单克隆抗体的瘤细胞，得到单克隆抗体4G5和单克隆抗体2E11。
4.根据权利要求1所述的用于微生物检测的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体包被酶标板的步骤为：将单克隆抗体4G5用抗体包被液稀释后加到酶标板的微孔中，用封板膜封板，置于4℃包被过夜，加入封闭液室温封闭一段时间，弃去酶标板板孔中的液体，烘干密封，4℃保存。
5.根据权利要求1所述的用于微生物检测的试剂盒，其特征在于，所述HRP标记抗体的制备方法：将单克隆抗体2E11加入被NaIO4氧化的HRP溶液，室温避光反应，加入NaBH4置于4℃继续反应一段时间，PBS透析过夜。
6.根据权利要求5所述的用于微生物检测的试剂盒，其特征在于，NaIO4氧化HRP的步骤为：取0.2M的NaIO4溶液与40mg/mL的HRP溶液混匀，于10 mM的NaAc缓冲液中4℃透析过夜。
7.如权利要求1所述用于微生物检测的试剂盒的应用，其特征在于，将所述试剂盒用于检测粪便中人芽囊原虫的含量。
8.根据权利要求7所述用于微生物检测的试剂盒的应用，其特征在于，检测步骤为：
（1）取待检测样本预处理后，反复冻融、超声破碎后离心取上清；
（2）取出捕获抗体包被的酶标板，恢复至室温，使用PBST洗涤缓冲液洗板并甩干，加入步骤（1）处理过的样本，室温孵箱孵育后洗板；
（3）将HRP标记抗体加入到步骤（2）的体系中，室温孵育一段时间，PBST洗板并甩干；
（4）向步骤（3）反应过后的体系中加入显色液，室温避光显色一段时间，加入终止液终止反应；
（5）使用酶标仪进行双波长检测，用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值，通过标准曲线计算结果。
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