CN114231496A - 马流产沙门氏菌竞争elisa抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种马流产沙门氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒及其应用。所述的试剂盒中含有由保藏编号为CGMCCNo.21990的杂交瘤细胞株分泌产生的抗马流产沙门氏菌FljB蛋白的单克隆抗体。此外，本发明还建立了马流产沙门氏菌竞争ELISA抗体检测方法，与TAT方法相比，本发明建立的竞争ELISA方法的敏感性更高：对标准阳性血清能检测到的最大稀释度为32倍稀释，TAT检测最大稀释度为原倍。竞争ELISA方法的特异性更好：与常见的马传贫、马流感、马鼻肺炎、马动脉炎等病毒病以及马腺疫、鼠伤寒沙门氏菌感染、都柏林沙门氏菌感染等细菌病的血清抗体均不反应，仅与马流产沙门氏菌特异性抗体反应。因此，本发明的提出为马流产沙门氏菌抗体的检测提供了一种新的技术手段。

Description

马流产沙门氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种马流产沙门氏菌抗体检测试剂盒及其应用。特别涉及一种马流产沙门氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒及其应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术
马流产沙门氏菌病(Equine abortus Salmonellosis)是由马流产沙门氏菌引起的一种以孕马流产为主要特征的马属动物传染病，又名为马副伤寒(Equi parathphoid)或马沙门氏菌性流产。该病易感染初产母畜，多数母畜在发生流产前，一般无明显临床症状，突发流产，绝大多数为死胎，有少数存活的胎儿，在出生几天后，也会发生死亡。妊娠母马流产时，病菌随流产胎儿、胎衣、羊水及***分泌物排出体外,病公马(驴)能随***排菌。
近年来，该病在我国华东、华北和西北等地区爆发流行，主要引起马、驴的流产，流产率为20-100％。前期实验室研究，将流产马驹胎儿脏器组织进行细菌的分离鉴定，结果均为马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi,S.abortus.equi)。但该病在国内、外的研究较少，缺乏特异性的检测技术，我国《马流产沙门氏菌病诊断技术(NY/T 570-2002)》行业标准(行标)中提及该病的血清学检测方法为试管凝集试验(TAT)，该方法可用于检测马流产沙门氏菌抗体，但在个别情况下，也可能检出沙门氏菌的其他血清型抗体，比如鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium,S.typi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,S.enteritidis)、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin，S.dublin)等沙门氏菌的抗体，特异性不强；采用试管进行操作、样品需要多个稀释度，无法满足大规模样品检测的需要。
所以，为了应对疫情的连年爆发，亟需建立一种特异性强、敏感性高和高通量的检测方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种分泌抗马流产沙门氏菌 (Salmonella abortusequi,S.abortus.equi)FljB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及由该杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体；
本发明的目的之二在于提供以上所述的单克隆抗体在检测马流产沙门氏菌抗体试剂中的用途。
本发明的目的之三在于提供一种马流产沙门氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒及其检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明通过体外融合表达FljB蛋白，得到了多株抗FljB蛋白的单克隆抗体，通过筛选竞争性单克隆抗体、优化反应条件和反应策略，最终建立了竞争ELISA (C-ELISA)抗体检测方法。该方法的反应原理为：以单克隆抗体进行包被，待检血清与HRP标记的FljB蛋白同时加入到ELISA板的反应孔内，37℃作用30分钟后，读取OD450的吸光值，通过计算抑制率进行检测结果的判定。
其中，本发明筛选得到的一株分泌抗马流产沙门氏菌(Salmonella abortusequi, S.abortus.equi)FljB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为S-FljB-1A10，分类命名为杂交瘤细胞株(Hybridoma cellula linea)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.21990，保藏日期为2021年4月1日。
由所述的杂交瘤细胞株分泌产生的抗马流产沙门氏菌FljB蛋白的单克隆抗体也在本发明的保护范围之内。
进一步的，本发明还提出了所述的单克隆抗体在制备检测马流产沙门氏菌抗体试剂中的用途。优选的，所述的试剂为竞争ELISA抗体检测试剂。
更进一步的，本发明还提出了一种马流产沙门氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明所述的单克隆抗体。
其中，优选的，所述的单克隆抗体作为包被抗体。
其中，优选的，所述的试剂盒中还含有5％w/v的NCS封闭液、HRP标记的 FljB蛋白、洗涤液、双组份TMB显色液以及终止液。
其中，优选的，所述的试剂盒用于检测马流产沙门氏菌抗体时，按照以下步骤进行：
(1)使用2μg/mL的所述的单克隆抗体包被酶标板4℃过夜后，用洗涤液洗涤， 37℃下用5％w/v的NCS封闭2h，洗板；
(2)将HRP标记的FljB蛋白与对照或待测血清样品按照体积比1:1混合后加入板中，37℃孵育30min，洗板；
(3)加入双组份TMB显色液，37℃显色10min，最后加终止液终止反应，测定OD450nm值，计算抑制率，当抑制率>41.5％时，判定为阳性。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
与TAT方法相比，本发明建立的竞争ELISA方法的敏感性更高：对标准阳性血清能检测到的最大稀释度为32倍稀释，TAT检测最大稀释度为原倍。竞争 ELISA方法的特异性更好，对常见的马传贫、马流感、马鼻肺炎、马动脉炎等病毒病以及马腺疫、鼠伤寒沙门氏菌感染、都柏林沙门氏菌感染等细菌病的血清抗体均不反应，仅与马流产沙门氏菌特异性抗体反应。而TAT法与其他沙门氏菌有非特异***叉反应。
目前国内外没有针对该病不同病原的特异性抗体检测的方法，即鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和马流产沙门氏菌等病原产生的抗体，均有可能检测为TAT阳性。为了更加科学的、客观的评价我们建立的竞争ELISA 方法，我们将TAT检测的阳性和阴性血清，进行了进一步的验证，即采用马流产沙门氏菌特异性的蛋白进行Westernblot(WB)试验，将TAT和WB均为阳性的血清定为马流产沙门氏菌阳性血清，将TAT和WB均为阴性的血清定为马流产沙门氏菌阴性血清。马流产沙门氏菌阳性血清和阴性血清各20份。利用竞争ELISA 检测这20份血清，结果显示阳性和阴性的符合率均为100％。选择1份TAT检测最大稀释度为原倍的阳性血清样品作为标准阳性血清，利用竞争ELISA方法检测该血清的敏感性为32倍稀释，由此说明，竞争ELISA方法的敏感性更高。利用竞争ELISA方法检测临床血清样品860份，阳性检出率为37.7％。
附图说明
图1为不同株单克隆抗体亲和力的测定；
图2为不同抗体在相同浓度下与酶标抗原的结合力分析；
图3为最佳包被单克隆抗体的筛选；
图4为1A10单克隆抗体SDS-PAGE电泳结果；
其中：M：蛋白Marker；1：抗体洗脱第1管；2：抗体洗脱第2管；3：抗体洗脱第3管；4：抗体洗脱第4管；5：抗体洗脱第5管；6：抗体洗脱第6管； 7：抗体洗脱第7管；
图5为马流产沙门氏菌1A10单克隆抗体的特异性检测结果；
其中：1.马流感病毒；2.马疱疹I型病毒；3.马疱疹VI型病毒；4.马动脉炎病毒；5.马传染性贫血病毒；6.鼠伤寒沙门氏菌；7.肠炎沙门氏菌；8.都柏林沙门氏菌；9.马流产沙门氏菌；
图6为竞争ELISA法的反应策略；
图7为竞争ELISA法一步法反应条件优化；
图8为竞争ELISA法二步法反应条件优化；
图9为竞争ELISA法底物的优化；
图10为血清与酶标抗原作用时间的确定；
图11为竞争ELISA法特异性鉴定；
图12为竞争ELISA法(C-ELISA)和间接ELISA(iELISA)法检测马流产沙门氏菌阳性血清的敏感性结果；
图13为竞争ELISA法检测驴副伤寒阳性血清的敏感性结果；
图14为竞争ELISA(C-ELISA)与间接ELISA(iELISA)反应原理示意图以及非特异性反应对其检测结果的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1马流产沙门氏菌重组FljB蛋白的表达、纯化
按照公开号为“CN111458501A”，发明名称为“用于检测马流产沙门氏菌抗体的间接ELISA试剂盒及其制备方法和应用”的专利申请中所记载的方法进行重组FljB蛋白的表达与纯化，该文以全文引用的方式并入本发明说明书中。
实施例2单克隆抗体的制备
1材料
1.1免疫原纯化的马流产沙门氏菌FljB蛋白(稀释含量1mg/ml)，由实施例1制备。
1.2细胞骨髓瘤细胞SP2/0，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。
1.3试验动物6～8周龄雌性Balb/c小鼠，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。
1.4细胞培养液含20％胎牛血清、青链霉素各100U(μg)/ml的1640培养基，置2～8℃保存。1640培养基，购自Sigma公司；胎牛血清，购自Ausbian 公司。
1.5细胞冻存液取10ml二甲基亚砜(DMSO)，溶于90ml胎牛血清中，混合均匀后，置2～8℃备用。
1.6试剂盒
1.6.1BCA试剂盒，购自Novagen公司。
1.6.2SBA ClonotypingTMSystem/HRP，购自SouthernBiotech公司。
1.7其他试剂PEG4000、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和HRP标记的羊抗鼠IgG，均购自Sigma公司；TMB显色液，购自Thermo公司。
2方法
2.1杂交瘤细胞的构建
2.1.1动物免疫
2.1.1.1一次免疫将纯化后的马流产沙门氏菌FljB蛋白与等体积的弗氏完全佐剂进行乳化作为免疫原，经背部皮下注射4-6周龄Balb/c小鼠，200μl(含 FljB蛋白100μg)/只。
2.1.1.2二次免疫首次免疫后3周，将纯化后的马流产沙门氏菌FljB蛋白与等体积的弗式不完全佐剂混合乳化作为免疫原，按照一次免疫的免疫方式和剂量采取腹腔注射进行二次免疫。
2.1.1.3三次免疫二免后3周，将纯化后的马流产沙门氏菌FljB蛋白与等体积的弗式不完全佐剂混合乳化作为免疫原，按照二次免疫的免疫方式和剂量进行三次免疫。
2.1.1.4第四次免疫细胞融合前3天，将纯化后的马流产沙门氏菌FljB蛋白为免疫原经腹腔注射接种小鼠，200μl(含FljB蛋白100μg)/只。
2.1.2骨髓瘤细胞的准备融合前1～2天，扩大培养骨髓瘤细胞，使其处于对数生长期，且生长状态良好。融合当天，弃去培养液，并用无血清1640轻轻冲洗两次，用15ml 1640基础培养液将细胞从瓶壁上轻轻吹下。取少量骨瘤细胞悬液，用细胞计数板计数，准备融合。
2.1.3免疫脾细胞的准备
2.1.3.1融合前，将加强免疫的小鼠眼球采血处死，制备阳性血清。浸泡于 75％酒精5分钟后放于超净工作台。
2.1.3.2将小鼠固定于鼠架上，无菌打开腹腔，分离***取出脾脏，将脾脏放入盛有15ml 1640基础培养液的平皿中，用无菌注射器吸取培养液轻轻吹出脾细胞，反复操作3～4次。
2.1.3.3将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加1640基础培养液约至30ml，混匀。对细胞悬液用细胞计数板计数，备用。
2.1.4脾细胞与骨髓瘤细胞融合
2.1.4.1HAT培养液，1640培养液及1ml PEG4000水浴中预热，另备42℃预热的灭菌水500ml。
2.1.4.2上述准备的对数生长期SP2/0细胞与免疫小鼠脾细胞按1∶8入50ml 离心管中，轻轻颠倒混匀。800r/min离心10分钟，吸尽上清以免影响融合效率，轻轻弹击离心管底部使细胞尽量均匀的铺满离心管底。
2.1.4.3融合过程在盛有42℃水的融合杯中进行，将1ml 37℃预热的 PEG4000溶液逐滴加入到50ml离心管中，边加边缓慢转动离心管，并于90秒内加完，37℃静置1～2分钟。
2.1.4.4先慢后快地加入1640基础培养液终止反应，第1分钟滴加1ml 1640，第2分钟滴加1ml 1640，第3分钟滴加3ml 1640，第4分钟滴加10ml 1640，第 5分钟滴加10ml1640。静置2分钟，轻轻颠倒2次，静置7分钟，以800r/min 离心10分钟，弃去上清。用110mlHAT培养液轻轻重悬细胞，200μl/孔接种于已培养有饲养细胞的96孔培养板中，置37℃、5％的CO2培养箱中培养。
2.1.4.5 3天后半量换液，6天后半量换液，待细胞长至孔底面积1/4～1/3时取上清进行筛选检测并更换为HT培养液。
2.1.5阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆应用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清，并通过2～3次连续的有限稀释克隆法筛选阳性克隆，对细胞株进行扩大培养和冻存。间接ELISA方法如下：
2.1.5.1包被用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH值9.6)将马流产沙门氏菌 FljB蛋白至1μg/ml，分别加入96孔酶联反应板，100μl/孔，置2～8℃过夜。
2.1.5.2洗涤弃去孔内液体，用PBST(0.01mol/L，pH值7.4)洗板3次， 250μl/孔，每次洗涤均将板倒扣于干燥滤纸上将液体拍干。
2.1.5.3封闭加入含5％脱脂乳的PBS(0.01mol/L，pH值7.4)，200μl/ 孔，置37℃封闭2小时。
2.1.5.4洗涤方法同2.1.5.2项。
2.1.5.5加样加入待检样品，100μl/孔，37℃作用1小时。
2.1.5.6洗涤方法同2.1.5.2项
2.1.5.7加入二抗加入1：10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，100μl/ 孔，37℃作用30min。
2.1.5.8洗涤方法同2.1.5.2项
2.1.5.9显色加入TMB显色液，100μl/孔，置室温(15～25℃)显色(避光孵育)5分钟。
2.1.5.10终止加入终止液50μl/孔，轻微振荡混匀后，在波长450nm下用酶标仪读其OD450nm值(应在加入终止液后5分钟内完成读数)，并记录结果。
2.1.5.11判定
试验成立的条件当待检样品OD450nm值＞1.0且P/N值(P/N＝被测样品 OD450nm值/阴性对照OD450nm值)＞2.1，判定为阳性，其所对应的最大稀释度为其效价。
2.1.5.12筛选
(1)将不同株抗体从2.5μg/ml依次进行2倍梯度稀释。稀释后的抗体加入分别包被1μg和0.1μg FljB蛋白的ELISA板中作用1h，然后加入1：4000倍稀释的HRP标记的抗鼠二抗作用30min，显色5min。对不同株单克隆抗体进行亲和力进行计算。
(2)将不同单克隆抗体稀释相同浓度包被(2μg/ml)，封闭后加入相同浓度的酶标抗原直接作用30min，评估不同抗体在相同浓度下与酶标抗原的结合情况。
(3)包被抗体的筛选将阴性血清与HRP-FljB蛋白(1:3000)混合后加入包被不同浓度MAb(4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml)的ELISA板中作用30min 或者1h，筛选最佳的包被单克隆抗体。由于阴性血清中没有马流产沙门氏菌特异性抗体不与酶标抗原反应，酶标抗原直接与包被的MAb反应，在相同阴性血清及相同MAb包被浓度下OD450nm值越高，MAb效果越佳。
(4)包被抗体的筛选标准选取亲和力强，捕获抗原能力强的阳性杂交瘤细胞进行后续试验。
2.1.6阳性杂交瘤细胞株的亚克隆用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的亚克隆，克隆3次，至克隆孔内的抗体阳性率达到100％，将获得的阳性杂交瘤细胞扩大培养后置液氮中冻存。
2.2单克隆抗体的制备和纯化
2.2.1腹水的制备取6～8周龄Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂，接种7～10天后，每只小鼠腹腔注射1～2.5×106个/0.5ml个生长良好的杂交瘤细胞。待小鼠腹部明显膨大后抽取收集腹水。将收获腹水置4℃，以 10000r/min离心10分钟，取上清保存备用。
2.2.2单克隆抗体的纯化
2.2.2.1样品准备将制备的腹水室温溶解后，与4～5倍体积的结合/洗涤缓冲液(20mmol/L磷酸纳，pH值7.0)混合后，经0.45μm滤器过滤。
2.2.2.2装柱平衡将HiTrap protein G填料(约2ml柱床体积)装入合适的层析柱，用10倍柱体积的结合/洗涤缓冲液(20mmol/L磷酸纳，pH值7.0)平衡，流速为1ml/min。
2.2.2.3上样将样品加到平衡好的层析柱中，流速为0.2～1ml/min，收集流出液，反复使样品流经柱子3～5次。
2.2.2.4洗涤用10～15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液(20mmol/L磷酸纳，pH 值7.0)清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白。
2.2.2.5洗脱用洗脱缓冲液(0.1mol/L甘氨酸，pH值2.7)进行洗脱5～6 次，每次洗脱体积1ml，收集流出液。洗脱后应立即用中和缓冲液(1mol/L Tris-HCl， pH值9.0)进行中和，每1ml洗脱流出液中加入约120μl中和缓冲液(1mol/L Tris-HCl，pH值9.0)。
2.3单克隆抗体的鉴定
2.3.1单克隆抗体亚类鉴定将筛选的1A10株用SBA ClonotypingTM
System/HRP试剂盒按照说明书对筛选出的单克隆抗体亚类进行鉴定。
2.3.2效价测定取杂交瘤细胞1A10株细胞纯化后的腹水用PBS(0.01mol/L， pH值7.4)进行10倍梯度稀释，用间接ELISA的方法进行检测，方法同 2.1.5.1～2.1.5.11项。
2.3.3蛋白浓度的测定按照BCA试剂盒说明书中检测方法，对纯化后单克隆抗体蛋白浓度进行测定。
2.3.4SDS-PAGE电泳
2.3.4.1样品处理将2.5μl的5×SDS-PAGE上样缓冲液加入10μl收获的纯化的单克隆抗体中，100℃煮沸10分钟，轻微离心，备用。
2.3.4.2SDS-PAGE分析取处理后的样品10μl及蛋白分子量Marker按照 Bio-Rad产品说明书进行SDS-PAGE电泳实验，用软件BandScan5.0对凝胶图像进行分析，测定单克隆抗体的纯度。
2.3.5亲和度测定采用间接ELISA法测定单抗的亲和度常数。将96孔板以每孔0.1μg/ml和1.0μg/ml的浓度包被纯化FljB蛋白。纯化的单克隆抗体从 2.5μg/ml 2倍稀释至0.001221μg/ml。将单抗加入2种抗原浓度的包被孔中，在37℃下孵育1小时。用PBST洗涤3次后，以HRP偶联的山羊抗小鼠IgG(1：10000) 作为二抗，在37℃下孵育30min。加入TMB底物，进行显色反应。终止后，读取OD450nm下的吸光度，并根据使用的单抗的浓度绘制曲线。然后利用公式，使用最高OD值(ODmax)的50％对应的单抗浓度来计算单克隆抗体的亲和常数。 K＝(n-1)/2(nAb’-Ab)Ab和Ab’分别表示包被抗原浓度为0.1和1.0μg/ml时最高 OD值一半时对应的抗体浓度，n:包被浓度相差的倍数。
2.3.6 1A10单克隆抗体的特异性检测
将马流感病毒、马疱疹I型病毒、马疱疹VI型病毒、马动脉炎病毒、马传染性贫血病毒、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、都柏林沙门氏菌以及马流产沙门氏菌蛋白进行SDS-PAGE电泳，以1A10作为一抗，以抗鼠二抗进行Western blot 试验，以观察1A10单克隆抗体的特异性。
3结果
3.1杂交瘤细胞的筛选
(1)亲和力计算结果如图1，表明：1A10单克隆抗体的亲和力常数最高，为1.19x109，1C5F10次之，亲和力常数为9.22x108，1H9B4最低为1.05x108。
(2)不同抗体在相同浓度下与酶标抗原的结合力分析如图2，表明：不同株单克隆抗体以相同浓度包被时，酶标抗原与1A10单抗作用后获得的OD值最大，说明在单克隆抗体相同浓度包被条件下，1A10单克隆抗体捕获酶标抗原的能力最强。
(3)最佳包被单克隆抗体的筛选结果如图3，结果表明：酶标抗原与阴性血清在Mab预包被的ELISA板子中作用30min或1h，包被1A10MAb的反应孔 OD450值最高，因此1A10为最佳包被MAb。
综合分析不同株单克隆抗体特性，1A10抗体与其他7株单克隆抗体相比具有亲和力强，捕获抗原能力强等优点，用于进行后续试验。
将分泌单克隆抗体1A10的杂交瘤细胞株命名为S-FljB-1A10，分类命名为杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No. 21990，保藏日期为2021年4月1日。
3.2单克隆抗体1A10的鉴定
3.2.1单克隆抗体1A10亚类鉴定按照SBA ClonotypingTMSystem/HRP试剂盒说明书对筛选出的单克隆抗体亚类进行鉴定，结果表明1A10单克隆抗体亚类为IgG1，轻链为κ型。
表1单克隆抗体1A10亚类鉴定结果
Figure RE-GDA0003476605480000101
3.2.2效价测定用间接ELISA的方法测定杂交瘤细胞1A10株纯化后腹水的效价为1∶6.6×106，详见表2。
表2 1A10株单抗效价测定结果
Figure RE-GDA0003476605480000102
Figure RE-GDA0003476605480000111
3.2.3单克隆抗体1A10浓度的测定测定纯化后单克隆抗体的浓度为7 mg/ml。
3.2.4SDS-PAGE电泳将洗脱下来的7管单克隆抗体1A10，进行 SDS-PAGE分析。结果表明，纯化的单克隆抗体经SDS-PAGE电泳，出现两条特异性条带，其中重链约50kDa，轻链约25kDa，纯度约为98％，纯化的单抗主要集中在第3、4、5管中，详见图4。
3.3 1A10特异性实验结果
特异性试验结果如图5所示，该结果表明，1A10仅与马流产沙门氏菌蛋白反应，与其他病原菌不存在交叉反应，说明特异性良好。
实施例3马流产沙门氏菌竞争ELISA抗体检测方法的建立
1、最佳反应策略的设计
根据竞争ELISA原理，设计四种不同的反应条件和策略(图6)，分别是一步法：待检血清与HRP标记的FljB蛋白(酶标抗原)直接加入到ELISA板内作用30分钟或1小时；两步法：待检血清与HRP标记的FljB蛋白先作用30分钟或1小时后再将二者的混合物转移到ELISA板内作用30分钟。
2、最佳包被单克隆抗体与酶标抗原工作浓度的筛选
采用一步法(图6)、二步法(图6)的反应策略分别对包被抗体浓度、酶标抗原浓度进行反应条件优化和筛选，确定每个反应策略的最佳反应条件，并利用最佳反应条件对同一份阳性血清进行检测，进而比较不同反应策略的敏感性差异。
采用不同的包被抗体浓度和酶标抗原浓度条件下，一步法与两步法分别作用30min和1h的优化结果如图7(一步法)和图8(两步法)所示，筛选获得的最佳反应条件如表3所示。在最佳反应条件下，检测同一份阳性血清的最大稀释度结果如表3所示，如果以抑制率大于41.5％作为阳性结果判定标准，结果表明不同的反应策略下，获得的检测敏感性均为16倍稀释，说明各反应策略的检测效果相当，所以，以单抗包被浓度少、阴性血清OD450nm值在1.0～2.0之间、操作简便为筛选原则的情况下，选择一步法作用30min和1h分别进行后续的实验。
筛选的2个最佳反应条件分别为：1)单抗包被浓度确定为2μg/ml，HRP标记的FljB蛋白浓度确定为3000倍稀释(3000x)，直接作用30min；2)单抗包被浓度确定为2μg/ml，HRP标记的FljB蛋白浓度确定为6000倍稀释(6000x)。直接作用1h。
表3四种反应策略的最佳反应条件及比较
Figure RE-GDA0003476605480000121
3、底物显色液的筛选
由于优化的4种反应条件阴性血清OD值均在1.5～1.8之间，为了提高阴性血清检测的OD值，提高检测敏感性，对显色液进行筛选：将底物由单组份(底物A和底物B两种组份的预混显色液)更换为双组份(底物A和底物B两种组份单独分开的显色液)的显色液。结果如图9所示，采用双组份的显色液，直接作用30min和1h的反应条件下，阴性血清OD值均升高到了2.0～3.0之间，而阳性血清变化非常小，因此，筛选的底物显色液为双组份显色液。
4、血清与酶标抗原作用时间的筛选
应用上述实验优化筛选的反应条件和双组份显色液，通过对同一份阳性血清进行敏感性检测分析，筛选出血清与酶标抗原作用的最佳时间。
结果如图10所示，直接作用30分钟和1小时的抑制率检测结果比较接近，如果以抑制率大于41.5％作为阳性结果判定标准，两种反应条件下检测的阳性血清最大稀释倍数分别为32倍和16倍，这表明采用双组份显色液，血清与酶标抗原直接作用30分钟，对比表3采用单组份显色液的实验结果(即检测最大稀释倍数为16倍)，可以将检测的敏感性提高2倍。因此，血清与酶标抗原作用时间确定为30分钟。
5、竞争ELISA临界值的确定
应用优化的竞争ELISA方法对413份阴性血清进行检测，获得全部抑制率的平均值(X值)为2.79％，标准差(SD值)为0.1498，通过生物学统计分析方法计算出临床血清检测时阳性和阴性血清判定的临界值(X+3SD)为41.5％，因此，当待检血清样品的抑制率值大于或等于临界值(Cutoff)时判为阳性，低于临界值时则判为阴性。
6、马流产沙门氏菌竞争ELISA抗体检测方法的试验步骤
通过对竞争ELISA方法反应条件的优化，确定最佳的反应条件如下：2μg/mL 的1A10MAb在4℃包被过夜，5％w/v的N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)，在37℃封闭2h，血清与1:3000倍稀释的HRP-FljB混合后加到ELISA板上，37℃作用 30min，TMB显色10min(37℃)。
具体操作步骤如下：
(1)2μg/mL的1A10MAb包被酶标板4℃过夜后(>12h)用洗涤液洗涤，37℃下用封闭液5％w/v的NCS封闭2h，洗板；
(2)将HRP标记的FljB蛋白与对照或待测血清样品混合后(1:1)加入板中， 37℃孵育30min，洗板；
(3)加入双组份TMB显色液，37℃显色10min，最后加终止液终止反应，测定OD450nm值，计算抑制率([阴性对照OD450值-样品OD450值]/[阴性对照OD450值-阳性对照OD450值]×100％)，当抑制率≥41.5％时，判定为阳性，抑制率＜ 41.5％时，判定为阴性。
7、竞争ELISA特异性试验
利用优化出的最佳反应条件，对马流产沙门氏菌(S.abortus equi)、马传染性贫血病病毒(EIAV)、马动脉炎病毒(EAV)、马疱疹病毒(EHV)、马流感病毒(EIV)、马泰勒虫(T.equi)、马巴贝斯虫(B.caballi)、马腺疫链球菌(S.equi)、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等阳性血清进行检测，评估马流产沙门氏菌竞争ELISA抗体检测方法的特异性，结果显示，只有马流产沙门氏菌血清检测结果为阳性，而其他病原阳性血清检测结果均为阴性(如图11)。因此证明该方法具有良好的特异性。
8、竞争ELISA与试管凝集试验、间接ELISA(iELISA)检测马血清样品敏感性的对比
对2份马流产阳性血清(血清1和血清2)，试管凝集(TAT)效价均为1:1600 (按照“NYT-570-2002-马流产沙门氏菌病诊断技术”行业标准的规定，试管凝集效价≥1:1600时判定为阳性)，将待检血清做2倍稀释再进行TAT试验，检测结果为阴性，所以血清1和血清2做TAT试验可检测的最大稀释度为原倍(1×)。
分别采用竞争ELISA和间接ELISA方法进行检测，其中间接ELISA方法按照公开号为“CN111458501A”，发明名称为“用于检测马流产沙门氏菌抗体的间接ELISA试剂盒及其制备方法和应用”的专利申请中所记载的方法进行。
结果如图12所示，竞争ELISA检测这2份阳性样品的最大稀释度均为32 倍稀释(32×)，对比试管凝集试验的结果：即原倍血清结果为阳性，2倍稀释的血清结果为阴性，TAT检测的最大稀释度为原倍。所以，竞争ELISA检测的敏感性是试管凝集试验的32倍。
间接ELISA对上述2份样品检测的最大稀释度也为32×，这表明竞争ELISA 与间接ELISA的检测敏感性相当。
9、竞争ELISA与试管凝集试验(TAT)检测驴血清样品敏感性的对比
对2份(血清3和血清4)TAT检测最大稀释度为原倍的驴副伤寒阳性血清样品进行竞争ELISA的检测，如图13所示，竞争ELISA检测这2份阳性样品的最大稀释度均为32倍稀释(32×)，敏感性高于试管凝集试验。
10、竞争ELISA检测的血清样品受动物种类的影响小于间接ELISA
从实验原理来看，竞争ELISA是通过单克隆抗体与酶标抗原的结果情况进行结果的判定，不同动物来源(马或驴)的动物血清不影响结果的判定；而间接 ELISA方法中采用抗马二抗进行检测，如果检测驴血清，应采用抗驴二抗重新建立检测方法，否则获得的数据并不科学。
11、竞争ELISA的特异性好于间接ELISA
在间接ELISA检测中，马血清如果与ELISA板、包被抗原等发生非特异性的结合之后，还会与酶标抗马二抗反应，产生非特异性的检测结果；在竞争ELISA 方法中，如果与ELISA板或者包被的抗原结合后，不会影响酶标抗原与包被的单克隆抗体之间的结合，对结果的判定影响不大。示意图如图14所示。
12、临床样品的检测
12.1竞争ELISA检测标准血清
应用本发明建立的竞争ELISA方法对试管凝集试验(TAT)阳性和阴性样品各20份进行检测，结果如表4所示。竞争ELISA和TAT的阳性和阴性符合率均为 100％。
表4临床样品的检测结果
Figure RE-GDA0003476605480000151
注：“+”代表阳性结果，“-”代表阴性结果
12.2竞争ELISA检测临床样品
利用竞争ELISA对临床860份血清进行检测，其中380份为阳性，检出率为 37.7％。

Claims (8)

1.一种分泌抗马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi,S.abortus.equi)FljB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株命名为S-FljB-1A10，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.21990，保藏日期为2021年4月1日。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生的抗马流产沙门氏菌FljB蛋白的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测马流产沙门氏菌抗体试剂中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的试剂为竞争ELISA抗体检测试剂。
5.一种马流产沙门氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求2所述的单克隆抗体。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的单克隆抗体作为包被抗体。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有5％w/v的NCS封闭液、HRP标记的FljB蛋白、洗涤液、双组份TMB显色液以及终止液。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于检测马流产沙门氏菌抗体时，按照以下步骤进行：
(1)使用2μg/mL的权利要求2所述的单克隆抗体包被酶标板4℃过夜后，用洗涤液洗涤，37℃下用5％w/v的NCS封闭2h，洗板；
(2)将HRP标记的FljB蛋白与对照或待测血清样品按照体积比1:1混合后加入板中，37℃孵育30min，洗板；
(3)加入双组份TMB显色液，37℃显色10min，最后加终止液终止反应，测定OD450nm值，计算抑制率，当抑制率>41.5％时，判定为阳性。
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