JPH04503754A - モノクローナル抗体に基づくリステリア・モノシトゲネスの検出システムの開発 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体に基づ（リステリア・モノシトゲネスの検出システムの開発 リステリア・モノシトゲネスは、１９２６年に最初に報告された、胞子を形成し ないダラム陽性の運動性かん菌である。この生物は、偏在性で、牛乳および乳製 品、野菜、生肉、家禽、貝類およびその他の食品から分離されてきた。食品中に リステリア・モノシトゲネスが存在することは、特に幼児および免疫力の低下し た人において食品の安全性問題が増大することを示している。これらのグループ 内の徴候を示す感染者の死亡率は、４０％にまで達する。

汚染された食品におけるこの微生物を同定する信頼できる診断方法の必要性があ ることは明かであるが、リステリア・モノシトゲネスの検出および計算に現在使 用されている技術は、消費される前に食品の安全性を確保するのに十分な程には 迅速でない。これらの技術は、現在、食中毒らしいものの発生後に推定病因を診 断する場合にしか有用でない。現在のリステリアの検出および計数化の方法は、 ある場合、冷蔵温度での最低７日間のインキュベーションを含む選択培地での濃 厚化を含む。これは通常、リステリアとして微生物を同定する一連の生化学試験 を伴う。最終確認に要する時間は、初期の人数、食品及び共汚染微植物相の型（ リステリア種は、多数の他のグラム陽性生体に交差反応を示すことが報告されて きた。）によって数週間を越える。分析時間がこのように長男（ことによって、 調理済み食品および酪農製品のような多くの腐敗しやす（、疑わしい製品の予備 スクリーニングが妨げられる。

リステリア種と他のグラム陽性バクテリアの間に抗原交差反応があるので、これ らの微生物の存在を確認するためのものとして認められている方法はいずれも、 免疫診断方法が採られる場合、非常に特異的な抗体を要する。この目的に対して 、どのような方法も均質な（即ちモノクローナルな）抗体の使用を要するという ことが信じられている。

１９７５年のケーラーおよびミルスティンによる、免疫処置をされたマウス膵臓 細胞へのマウスの骨髄腫細胞の融合（ネーチャー、２５６巻４９５頁参照）は、 モノクローナル抗体を産生ずる連続したセルラインを得ることが可能であること を初めて提示した。

一般に、モノクローナル抗体およびそれらを作るハイブリドーマの製造において は、マウスのような実験に適した動物を、目的とする抗体の元にある抗原にさら す。一般に、いくつかの抗原を動物に注入し、動物の免疫機構がそれに反応する ようにする。この方法を、動物の免疫機構が抗原に対する抗体を産生ずるまで反 復し得るが、動物は抗原の注入に関係なく他の抗体を産生ずると推定される。動 物をその後殺し、抗体産生細胞（一般に膵臓からの）を分離する。

次に、一般に、多数のそのような膵臓細胞を同種の骨髄細胞と融合し、多数の非 腫瘍細胞にみられる自己抑制増殖の特性を示さずに再生する融合細胞コロニーを 得る。次に、融合細胞を遺伝学的に同型の抗体産生細胞のセルラインとして培養 する。しかしながら、特定のセルラインによって産生された抗体が元の抗原に対 する抗体であるかまたは抗体が抗原に対して特異的であるという確証はない。こ のようにして創られた多くのハイブリドーマ・セルラインの中から望ましい抗体 を産生ずる特定のセルラインを選択するためには、セルラインをスクリーンする ことが必要である。これは、元の抗原またはそれの精製された型に対して各セル ラインによって産生された抗体を試験することによってなされる。目的とする抗 体を産生ずることがこの方法によって発見されたセルラインは保存され、残りは 捨てられる。

融合細胞製品には予知できない性質があるので、一般に慣用の融合技法の適用の 正確な結果を予知するために１つの抗原または細胞構造からもう１つのものに外 挿することができないということは強調されるべきである。この予知不能性は、 抗原がより複雑になるにつれて、また、１つ以上の種または生物学系内の１つ以 上の型または背景中で抗原を認知することができる抗体がめられるのでますます 増大する。

従って、普遍的な技法は概念上では十分理解されているが、直面する多くの困難 と各具体例にめられる多様性がある。実際、既知のハイブリドーマを製造しよう と試みる前に、目的とするハイブリドーマが得られるか、得られたとしてそれが 抗体を産生ずるか、またはそのように産生された抗体が目的とする特異性をもつ かについて科学的確証はない。

昨年中にリステリアを検出できるモノクローナル抗体およびＤＮＡプローブの両 方が報告されている。現在、ＤＮＡプローブは、リステリアの１６８リポソーム ＲＮＡから誘導されるヌクレオチド配列およびり、モノシトゲネスから分離され た溶血素遺伝子から誘導されたヌクレオチド配列を含む。この２つは現在商品化 されており、前者はすでに市販されていた。リステリアの日常的検出のためにＤ ＮＡプローブを使用することについての１つの限界は、放射性同位元素標識の必 要性である。ＤＮＡプローブは、放射能で標識された場合のみ感受性がある。現 在手に入る非放射性ＤＮＡプローブは十分な感受性を持たない。もし食品工場で 実地できるような広く利用できるシステムに関する要求が与えられたものとすれ ば、放射能に標識されたＤＮＡプローブは一般に受け入れられない。したがって 、我々の意見である工場での検出にとっては、モノクローナル抗体に基づくシス テムが、食品中のリステリアの検出に対して最も実行可能で適切であるように思 われる。様々な研究所で、ＤＮＡプローブに対する感受性を持ち確実な非同位元 素標識システムを開発するために多大な努力が払われている。サルモネラ菌を検 出するための非同位元素に標識化されたＤＮＡプローブについてのいくつかの成 功が報告されている。

現在研究されているモノクローナル抗体は、Ｌ、モノシトゲネスの鞭毛を使った マウスの直接免疫処置によって引き起こされたものを含む（ファーバーとスベイ アーズ、１９８７年）。この抗鞭毛モノクローナル抗体は、病原性のりストリア 種に対して絶対的な特異性があるようには見えず、非病原性の変種に交差反応を 示す。

リステリアからの熱に対して安定な抗原と反応するモノクローナル抗体が確認さ れた。抗原の本質は知られていないが、商業化されており、入手できる。予備濃 厚化段階が必要であり、その後培養物を集め、抽出物を加熱によって得る。この リステリア抗原の検出は、ＥＬＩＳＡ型および２つの異なるモノクローナル抗体 を使って、先ず抗原を捕捉し、次に捕らえた抗原を検出することによって遂行さ れる。

リステリアに対する迅速な生体特異性試験の必要性は明かであるので、特異的に り、モノシトゲネス・スコツトＡおよびその血清型と反応するモノクローナル抗 体を提供するハイブリドーマ・セルラインを産生ずるための研究が行なわれた。

これらの抗体を使って、汚染された食品中のし、モノシトゲネスの存在を調べる ＥＬＩＳＡアッセイもまた、開発された。この発明の主題を含んでいるのはこれ らのハイブリドーマ・セルライン、それから産生じたモノクローナル抗体、これ らのモノクローナル抗体を使うＥＬＩＳＡアッセイである。

この発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ・セルラインはマリ− ランドのベテスダのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され 、ブダペスト条約にしたがって、そこからの特許が存続する間は公衆の入手が可 能である。モノクローナル抗体は、次の名称を持つ。

この明細書中での指定　ＡＴＣＣ ２Ｏ−１０−２ＨＢ　９９４７ ３６−６−１２　ＨＢ　９９４８ ５９−９−１６　ＨＢ　９９４９ 寄託は実施可能性のみを目的としており、この発明の範囲を制限するためのもの ではない。これらのセルラインおよびそこから誘導された他のセルラインのクロ ーンは、この発明によって予知されるとみなされている。

実施例Ｉ モノクローナル抗体の産生 メスのＢａ１ｃ／ｃマウスを、５から７週間、スピッツ他の方法［ジャーナルオ ブ・イムノロジカル・ランド　７０巻３９−４３頁頁（１９８４）］にしたがっ て、２．５Ｘ１０３の完全な中間対数増殖期のし、モノシトゲネス　スコツトＡ で、膵臓経由で免疫処置した。免疫処置の８８時間後、マウスを殺し、それらの 膵臓を取り出し、膵臓のリンパ球を、ケーラー他の方法［ヨーロピアン・ジャー ナル・オブ・イム、′ロジー　６巻２９２−２９５頁（１９７６）］にしたがっ て、ポリエチレン　グリコールを使ってマウスの形質細胞Ｎ５−１と融合し、選 択培地上に置いた。認知された直接ＥＬＩＳＡ法によって測定されたり、モノシ トゲネス反応抗体を分泌する個々のハイブリドーマを限界希釈で２回サブクロー ンした。多量のハイブリドーマの上滑および精製免疫グロブリンを、セファロー スカラムにコンジュゲートされたヤギの抗マウス免疫グロブリンを使って慣用ア フィニティクロマトグラフィーによって得た。

融合セルラインをＩＣＭまたはＰＲＭＩのような（好ましくは血清無しで）適切 な培地またはヌードマウスなどの宿主の生体内で増殖させることによって、抗体 を多量に産生ずることができる。望まれるなら、場合によって、硫安沈澱、イオ ン交換クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、電気泳動、微 量濾過、および超遠心などの慣用技法により、抗体を培地または体液から分離で きる。

モノクローナル抗体は臨床検体（食物、食品、または非食物原料からの他の検体 ）がリステリア・モノシトゲネスを含むか否かを確かめるための慣用マニュアル または自動スクリーニング試験で使うことができる。これらの試験は、選択的に 反応する抗体の能力に基づいており、チューブやプレート　ウェルなどの容器に 入れた検体を抗体とインキュベートし、反応の度合を視覚的または分光計を使っ て観察することを含む。

抗体の標識誘導体は、放射性イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、または酵素 イムノアッセイなどの多くのイムノアッセイ技法に使用され得る。抗体の標識変 形を作るのに使われる標識は、蛍光色素および、放射性標識など直接検出され得 る部分や、検出されるために反応するかまたは誘導するかされねばならない酵素 などの部分を含む。このような標識の例としては、８２ｐ、”’Ｌ　”Ｈ，＋４ ０゜フルオレスセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシ ル、ウンベリフェロン、ルシフエリア、２．３−ジヒドロフタラジンジオン、西 洋わさびベルオキシターゼ、アルカリホスファターゼ、リソチーム、およびグル コース−６−燐酸、デヒドロゲナーゼがある。抗体は既知の方法によってこのよ うな標識に付けられ得る。例えば、アルデヒド、カルボジイミド、シマレイミド 、イミデート、スクシンイミド、ビスジアゾ化ベンザジンなどのカップリング剤 を、前記の蛍光、化学発酵、および酵素標識を抗体に付けるのに使用し得る。

これらの標識を付けた誘導体を使う試験は、臨床検体と標識化された抗体をイン キュベートし、標識を媒介にして検体中の細胞上の標識免疫複合体の有無を検出 することを含む。この方法の詳細は、イムノアッセイ技法においてよく知られて いる。

実施例　ＩＩ ポリクローナル　血清 り、モノシトゲネスに対するポリクローナル抗血清を、ホルマリンで処理された し、モノシトゲネスでメスのフランダース・ジャイアント・ラビットを、３−５ 日の間隔で３週間、静脈免疫処置することにより作る。この抗血清の力価は、直 接ＥＬＩＳＡアッセイで１：２５．６００を超える。この血清を、常法にしたが ってＳ、フィーカリスへの吸着によつて部分的に精製した。

実施例ＩＩＩ 直接ＥＬ　Ｉ　ＳＡ ハイブリドーマおよび精製された抗体を抗し、モノシトゲネス反応性のために直 接細胞ＥＬＩＳＡアッセイ［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・ランド　７６ 巻６３−７１頁（１９８５）］でススクリンした。ポリ−１−リジンをイムロン Ｉプレートのウェル上に１ｕｇ／ｍ１で塗布した。次に、フィーカリス連鎖球菌 、非病原性リステリア・イヴアノヴイ、リステリア・シーリゲリ、リステリア・ イノキュアおよび病原体り、モノシトゲネスを含む試験生体を１．。

３Ｘ１．０’生体／ウェルの割合でウェルに加え、４℃で−晩インキュベートし た。次にプレートを１１０００ｒｐ、４℃で５分間、遠心分離器にかけた。プレ ートのウェルを０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、分画Ｖ）を含むＰＢＳ で３０分間ブロックし、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ−０，１％ＢＳＡで満たし た。プレートを使用するまで４℃で保存した。アッセイの場合、ハイブリドーマ 上清または精製された抗体を、室温で２時間、捕捉された菌に結合させた。プレ ートを、１％のツイーン−２０を含むＰＢＳで１回、ＰＢＳで２回洗浄し、５０ ｕ１の西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗マウス１ｇ抗体を 各ウェルに加えた。インキュベーションを２時間室温で行なった。プレートを洗 浄し、Ｏ−フェニレンジアミンをウェルに加え、発色を４０５ｎｍで読んだ。

実施例ＩＶ 間接　ＥＬＩ　ＳＡ イムロンＩプレートを０．０５％炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）中の精製された抗− Ｌ、モノシトゲネス抗体の適量の希釈液で覆った。

５％のウマ血清を含むＰＢＳでブロックした後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中の 試験生物の１０倍の希釈液５０ｕ　ｌおよび０．・０５％のツイーン−２０をウ ェルに加え、２時間、室温でインキュベートした。牛乳を使うアッセイの場合、 試験生物を初期濃度Ｉ　Ｘ　１０’生体／ｍｌで牛乳に割り、１５０ｕｌをＭａ ｂ２０−１０−２で覆われたイムニオンＩプレートのウェルに加えた。インキュ ベーションの後、ウェルを前記のように洗浄し、ラビット内で培養された５０ｕ ｌの抗り、モノシトゲネス血清の１／２０００希釈液を加えた。

インキュベーションを室温で９０分続けた。結合抗し、モノシトゲネスの量を、 ５Ｑｕｌのアルカリホスファターゼにコンジュゲートされた抗ラビット免疫グロ ブリン血清の１／２０００希釈液を加え、室温で９０分間インキュベートするこ とによって定量した。次に、プレートを洗浄し、５０ｕｌのｐ−ニトロフェニル ホスフェイト基質をウェルに加えた。発色は、４０５ｎｍで測定した。

表■は、この発明にしたがって産生され、試験生物のパネルで生成されたモノク ローナル抗体の反応性を記載している。試験された１５０のハイブリドーマのう ち、Ｍａｂ５６、Ｍａｂ７１、Ｍａｂ４５−８、Ｍａｂ７６−２２およびＭａｂ ２０−１０の５つが、試験された全てのリステリア・エスピー（Ｌ、イヴアノヴ イー、Ｌ。

シーリゲリ、Ｌ、イノキュアおよびり、モノシトゲネス）と反応した。生成され た他の抗体の全てが、Ｌ、モノシトゲネスと強く反応した。次に、Ｍａｂ２０− １０−２をり、モノシトゲネスの全ての血清型でスクリーンしたが、試験された 他のリステリア種と選択的に、より狭い範囲で反応した。これらの抗体のうち、 Ｍａｂ４９、Ｍａｂ７６、Ｍａｂ５９−９−１６、Ｍａｂ３６−６−１２、Ｍａ ｂ２０−１０−２およびＭａｂ２０−１０−３が、最も強＜Ｌ、モノシトゲネス と反応し、試験された他のリステリア種とは弱くかまたは全然反応しなかった。

記載された抗体のどれも、負の対照試験生物であるＳ、フェカリスと反応しなか った。

表Ｉ　直接結合アッセイにおける。モノクローナル抗体の特異性５９−９−１６ 　＋７−　−　今十 ｊ６−６−１２　＋／−＋＋ ２０−１０　＋＋　＋　十　ヰ＋ ２０−１０−８　＋　＋ Ｍａｂ　２０−１０−２は、Ｌ、モノシトゲネス　・スコツトＡと最も強（反応 し、Ｌ、イノキュアおよびり、イヴアノヴイー（表１）と弱く反応したが、その し、モノシトゲネス（表　ＩＩ）の他の血清型との反応性を試験した。

表Ｉ１．直接結合アッセイを使ったし、モノシトゲネス血清型に対する２０−１ ０−２の特異性 り、モノシトゲネス血清型反応性 マリ−Ｂ　十＋ ＩＡ　Ｆａｃ２．３ＡＦａｃ４　＋＋ ＩＡ　Ｆａｃ２　＋十 ４ＡＢ　Ｆａｃ６．７．　ｇ　十十 １９７１　５．４ｂ　＋＋ Ｓ、フェカリス　− これかられかるように、Ｍａｂ　２０−１０−２は、試験されたし、モノシトゲ ネスの５つの他の血清型のどれとも等しく反応した。

また、それはＳ、フェカリスとは反応しなかった。選択されたモノクローナル抗 体の特異性をさらに試験するための間接結合アッセイ即ち”サンドイッチ　ＥＬ ＩＳＡ”を開発する予備的な試みが成された。細胞を捕捉するポリクローナル抗 血清を使う初期のアッセイ型およびそれに続くモノクローナル抗体を使う検出は 、不十分であることがわかった。別の方法として、モノクローナル抗体をイムニ オンＩＩプレートに吸着し、捕捉した抗原を、吸着したポリクローナル抗血清を 使って検出した。第２吹拭体は、アルカリ　ホスファターゼにコンジュゲートさ れたヤギ　抗ラビットであった。プレートを、ｐＨ９，６の０．０５Ｍ　炭酸緩 衝液中で一晩、Ｍａｂ　２０−１０−２で覆った。試験菌の希釈液を各ウェルに 加え、２時間インキュベートした。ポリクローナルラビット抗し、モノシトゲネ ス血清（吸着されていない）を９０分間加えた。プレートを洗浄し、抗ラビット １ｇＧおよびＩｇＭ抗体をアルカリホスファターゼにコンジュゲートした。

一群のアッセイの結果の代表例が表３にある。

表３．検出のための抗原および吸着されていないラビットのポリクローナル抗リ ステリア血清を捕捉するためのＭａｂ　２０−１０−２を使った間接ＥＬＩＳＡ の結果 いくつかの矛盾がでてくるが、総じてＭａｂ　２０−１０−２は、特異的にり、 モノシトゲネスを認識すると思われる。観察される矛盾は、特発的であり、アッ セイ型の結果であり、用いられるモノクローナル抗体の結果ではないと思われる 。

同一の間接アッセイ型をＭａｂ　５９−９−１６およびＭａｂ３６−６−１２の 特異性をさらに評価するために用いた。（表４）表４．検出のために抗原および 吸着されないラビットのポリクローナル抗し、モノシトゲネス血清を捕捉するた めのＭａｂ５９−９−１６または３６−６−１２を使った間接ＥＬＩＳＡの結果 ５９−９−１６’　３６−６−１２” １−抗原を捕捉するためのプレート上の０．１　ｕ　ｇ／ｍ　１のＭａｂ２−抗 原を捕捉するためのプレート上の１０．Ｏｕｇ／ｍ１のＭａｂ　３６−６−１２ 試験生物の一団をリステリア・ウェルシメリおよびクルチア（リステリアと免疫 学的に交差反応することが知られている生物）を含むように範囲を広げる。明か に、より精巧なアッセイ型が保証される。牛乳中のし、モノシトゲネスの検出の ためのこの間接アッセイ（表５）の利用を次に研究した。

表５．腐敗した牛乳の検体中のし、モノシトゲネスを検出するためにＭａｂ　２ ０−１０−２を使う間接ＥＬＩＳＡの結果ａ＝ｏ、Ｄ、４０５ｎｍ 試験生物を、出発の濃度　１　×　１０６／ｍ１で直接牛乳に接種し、緩衝液中 の腐敗した牛乳の２回の連続希釈液をＭａｂ　２０−１０−２で覆われたプレー トに直接加えた。結果は、ここでもし。

モノシトゲネスの特異性を示した。Ｌ、モノシトゲネスのＭａｂ２０−１０−２ への吸着は、Ｌ、イヴアノヴイーまたはＳ、フェカリスでみられるそれより２か ら３倍高かった。アッセイに先だっていかなる予備濃厚化も使わなかったことは 注目されるべきである。

要約するに、リステリア属は、多くの種を含むが、Ｌ、モノシトゲネスが、食物 および食品に見られる主な（そして多分唯一の）病原性の種であることはますま す明かとなった。したがって、Ｌ、モノシトゲネスの選択的検出は、リステリア の生態がよ（解っていないが故に、また、Ｌ、モノシトゲネス以外のリステリア 種の検出が食物の安全性の指標とならないので、非常に重要である。こういう訳 で、この発明の目的は、Ｌ、モノシトゲネスを特異的に認識するモノクローナル 抗体を開発することであり、そうすることによって、Ｌ、モノシトゲネスで免疫 処置されたＢａ１ｂ／ｃマウスから分離された膵臓細胞をＮ５−１形質細胞腫細 胞に融合することによって産生されたいくつかのマウスのモノクローナルを確認 した。ハイブリドーマを直接ＥＬＩＳＡアッセイでスクリーンし、試験された１ ５０のハイブリドーマのうち、６つが最も強＜Ｌ、モノシトゲネス５ｃｏｔｔＡ と反応した。これらの抗体の１つ、Ｍａｂ２０−１０−２の特異性をさらに試験 した。Ｍａｂ　２０−１０−２は、直接結合アッセイにおいて、Ｌ、イノキュア およびり、イヴアノヴイーとある程度反応したが、Ｌ、モノシトゲネスに対する より大きな特異性が、間接ＥＬＩＳＡアッセイにおいて見られた。固体相で使わ れる抗体は、ラビットの抗マウス２吹抜体によって検出したところ、Ｌ、モノシ トゲネスを特異的に捕捉した。このアッセイ型において、他のリステリア種に対 し結合は殆ど起らなかった。反応性の相違は、完全には解っていないが、プラス チックに吸着された時およびプラスチックに結合された抗体によって吸着された 時の生物の表出の相違によって明らかにすることができた。国土の異なる抗原エ ピトープは、生物が直接プラスチックに吸着されるときに現われる。さらに、抗 体は、試験生物を捕捉するためのウェルに元来結合しているポリ−１−リジンの 不完全な遮断により、プレートのウェルに非特異的に結合されている。プラスチ ックに吸着された時に対する抗体に吸着された菌の相違もまた、直接および間接 ＥＬＩＳＡアッセイの異なる特異性を説明するものであろう。しかしながら、Ｍ ａｂ　２０−１０−２が、試験された全てのり、モノシトゲネスの血清型と反応 することは明かである。これに続く１つのモノクローナル、Ｍａｂ　２０−１０ −２のスクリーニングによって、それが全ての使えるし、モノシトゲネス血清型 （１−４）に反応することが判り、さらにそれが特異的な種であるが血清型に依 存しないことも示した。２つの他のＭａｂ　５９−９−１６および３６−６−１ ２もまたり、モノシトゲネスに対する好ましい特異性を示す。

これらのモノクローナル抗体の感受性および特異性を増すために最適化される多 くのパラメーターがあるが、これらのパラメーターは、慣用の、よ（知られた技 法を使って容易に最適化することができる。例えば、間接ＥＬＩＳＡにおいては 、検出のためのラビットの抗し、モノシトゲネス・ポリクローナル抗血清および 第２次ヤギ抗うビット抗体がある。モノクローナル抗体を使って捕捉されたし。

モノシトゲネスを検出するモノクローナル抗体のカクテルを使うことで、おそら く、より大きな特異性を得ることができるであろう。

さらに、捕捉された抗原の検出に使われるモノクローナル抗体は、好ましくは直 接リポータ−分子にコンジュゲートされるかまたはビオチンストレパヴイジン増 幅システムを利用してビオチン化される。

これらの変形に加えて、インキュベーション条件、緩衝液（イオン強度、ｐＨ） および他のアッセイ・パラメーターをアッセイを改良するために操作することが できる。この明細書中に記載されている実施態様に対する、これら全ての変形は 、この発明の範囲内にあるとみなされる。

前記の記述は、この発明の原則および実用を最良に説明し、それによって熟練し た技術書違がこの発明を多様な他の実施様態および企図される具体的な使用に適 した多様な変形に利用できるように提供された。したがって、この発明の前記の 記述は、この発明の記述および説明のためにのみ提示された。これは、余すとこ ろないものとして、またはこの発明を開示された正確な型に限定しようと意図さ れているのではな（、それの多くの修正および変形は、熟練した専門家にとって は、この明細書での教示および開示から明かとなろうし、そのような変形や修正 は、後記の主張に相当するものの全範囲内にあるように意図されている。

この発明およびそれを作り使う方法を、それに関係のある技術者が同一のものを 作り使うことができるように、完全で、明確で、簡潔で正確な言葉で記述し、こ の発明を実施する最良の方法を提示した。

国際調査報告 ＰＣＴ／Ｉ＋５９０１０１１０２ Ｅ弘零！ｉ工■ツ１匹Ｕ臣醪■Ｌコ肛ユＬ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ハイブリドーマＡＴＣＣ　９９４７（２）ハイブリドーマ　ＡＴＣＣ　９ ９４８（３）ハイブリドーマ　ＡＴＣＣ　９９４９（４）ＡＴＣＣ　ＨＢ９９４ ７、ＡＴＣＣ　ＨＢ９９４８およびＡＴＣＣ　ＨＢ９９４９からなる群から選択 されたハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体。 （５）ＡＴＣＣ　ＨＢ９９４７によって産生された請求項４記載のモノクローナ ル抗体。 （６）ＡＴＣＣ　ＨＢ９９４８によって産生された請求項４記載のモノクローナ ル抗体。 （７）ＡＴＣＣ　ＨＢ９９４９によって産生された請求項４記載のモノクローナ ル抗体。 （８）モノクローナル抗体が、骨髓腫細胞と、予めリステリア・モノシトゲネス を接種されたマウスから誘導されたリンパ球の融合によって産生されたハイプリ ドーマ セルラインから産生されるも のである、リステリア・モノシトゲネスの抗原決定基に特異性をもつモノクロー ナル抗体。 （９）臨床検体を請求項４記載のモノクローナル抗体に接触させることおよび臨 床検体とモノクローナル抗体の間の反応の有無を観察することを含む、臨床検体 におけるリステリア・モノシトゲネスの存在の測定方法。 （１０）モノクローナル抗体が蛍光性、放射性、発色団で標識化されている請求 項９記載の方法。