CN113186321A - 一种芽囊原虫绝对荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法，属于分子生物学技术领域，该芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法包括下列步骤：芽囊原虫病原基因组DNA的提取；引物的设计与合成；绝对荧光定量PCR方法的建立；标准曲线的绘制；绝对荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性试验。本发明建立了快速，灵敏的芽囊原虫分子检测方法，针对芽囊原虫SSU rDNA位点设计引物，在荧光定量PCR仪中约1 h即可高效扩增出结果。与传统的PCR检测方法相比，具有省时、高效、灵敏、定量的特点。

Description

一种芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法。

背景技术

芽囊原虫(Blastocystis spp. )属于芽囊原虫目，芽囊原虫科，芽囊原虫属，是一类寄生于宿主肠道的具有多态性的厌氧单细胞原生生物，芽囊原虫具有广泛的遗传多样性，迄今为止，根据SSU rDNA序列的多态性进行基因亚型分类，已在人类和动物中发现了22种不同亚型（Subtypes，STs），包括ST1～ST17、ST21和ST23～ST26，其中10个芽囊原虫亚型（ST1～ST9和ST12）具有***共患性，其余亚型目前只在动物体内被检测到。此外也有未知基因亚型的相关报道。

目前，芽囊原虫的主要检测方法有病原学诊断法、血清学诊断法、分子生物学诊断法和体外培养诊断法。

病原学诊断主要有粪便涂片检查和体外培养试验。粪便涂片检查是芽囊原虫检查最为经典的方法，其要求采集人或动物的新鲜粪便做涂片，或辅以卢戈氏碘液染色法染色，染色后在400倍镜下观察结果。该法虽然简单可靠，但在感染

强度小时很难在显微镜下检查出病原，而且操练的熟练程度将直接影响诊断结果的准确性。体外培养试验是在感染强度很小时，将粪便样本置于培养基中，以使芽囊原虫得到增殖，进而提高检测效率与灵敏性，但此方法耗时长且繁琐。因此体外培养法不适于田间流行病学调查，而较适于病原的实验室分离（王沛, 张富强, 何波, 等. 人芽囊原虫体外培养研究进展[J]. 中国热带医学, 2020, 20(12): 1207-1211.）。

血清学诊断主要有间接免疫荧光抗体试验(indirect fluorescent antibody ,IFA)及酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）。苏水莲等人采用硝酸纤维素膜作为同相载体，用人芽囊原虫可溶性抗原作包被抗原，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(HRP-IgG)作酶标抗体，初步建立检

测人芽囊原虫血清抗体的Dot -ELISA诊断方法，用该方法分别对体外培养法阳性者和阴性者血清进行检测，敏感度为92.13%，特异度为97.92%，表明Dot -ELISA用于检测人芽囊原虫血清抗体较敏感、特异。（苏水莲, 严宜明, 廖华, 等. Dot-ELISA检测人芽囊原虫血清抗体的研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2007(03): 256-258.）。Lanuza MD等人采样间接免疫荧光法测定61株芽囊原虫分离株，结果显示除1, 2组存在差异，其余分离株血清学检测结果均一致，这也表明血清学分析方法也可作为B.h分型的佐证（Lanuza MD, Carbajal J A, Villar J, et al. Soluble-protein and antigenic heterogeneityin axenic Blastocystis hominis isolates: pathogenic implications[J].Parasitol Res, 1999, 85: 93-7.）。

分子生物学诊断方法主要为聚合酶链式反应，主要有常规PCR，巢式PCR。常规PCR采用1对引物对芽囊原虫SSU rDNA位点进行扩增鉴定（Scicluna SM, Tawari B, ClarkCG. DNA barcoding of blastocystis[J]. Protist, 2006, 157: 77-85.）。巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用2对引物扩增完整的片段。第1对引物扩增片段和普通PCR相似。第2对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的优点在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异（Clark CG. Extensivegenetic diversity in Blastocystis hominis[J]. Mol Biochem Parasitol. 1997, 87(1): 79-83；Wong KH, Ng GC, Lin RT, et al. Predominance of subtype 3 amongBlastocystis isolates from a major hospital in Singapore[J]. ParasitologyResearch, 2007, 102(4):663-670.）。

与传统PCR方法相比，荧光定量方法的优势为灵敏度高，耗时短，且能对感染强度进行定量。目前，荧光定量方法已用于多种寄生虫等病原体的检测。陈甫等根据微小隐孢子虫18s rRNA基因序列设计1对荧光定量引物，建立检测微小隐孢子虫的基于SYBR Green的Real-time PCR方法。（陈甫, 黄克和. 基于SYBR Green检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR方法的建立及应用[J]. 中国病原生物学杂志, 2009, 4(03): 191-195.）。张萍等针对犬源贾第虫16S rRNA基因片段设计一对引物，建立了贾第虫DNA的SYBR GreenⅠreal-timePCR检测方法。（张萍, 刘远佳, 李结, 等. 犬源A型贾第虫real-time PCR检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报, 2011, 33(12): 961-964.）。杨峰等设计扩增CSFV E2基因的特异性引物,建立Eva Green染料的RT-qPCR检测方法（杨峰, 陈立强, 许信刚, 等. 猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 动物医学进展, 2021, 42(01): 1-5.）。目前，国内尚没有采用荧光定量技术检测芽囊原虫并测定感染强度的方法，本发明以芽囊原虫SSU rDNA为靶基因位点设计引物，建立针对芽囊原虫的荧光定量检测及感染强度测定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法，用于提供一种省时高效、高效、灵敏度高的芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法，该芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法包括下列步骤：

①、芽囊原虫病原基因组DNA的提取：采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便样品总DNA；

②、引物的设计与合成：根据芽囊原虫SSU rDNA基因的高度保守区，科学合成扩增片段大小为280bp的上下游引物，在引物使用前，使用超纯水溶解为10 umol/L，－(25～20)℃保存备用；

③、绝对荧光定量PCR方法的建立：使用SYBR^® Green Realtime PCR Master Mix试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立，反应体系为20μL：模板2μL，双蒸水5.6μL，10μL，上下游引物各1.2μL；加样时先将除模板外各组分均匀混合并分装到反应管，后加模板，上机前离心处理；反应程序如下：1个循环的95℃ 30s；40个循环的95℃ 5s，56℃ 10s，72℃15s；

④、标准曲线的绘制：

⑤、绝对荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性试验：通过标准曲线的绘制显示可检测到仅含有几个芽囊原虫细胞DNA拷贝数，体现出绝对荧光定量PCR方法的灵敏度；将实验室已有的病原提取相应核酸，按照扩增体系扩增；同时设芽囊原虫阳性对照及去离子水的阴性对照，检测结果体现出绝对荧光定量PCR方法的特异性。

⑥、芽囊原虫病原数目的定量：在使用本方法检测样品后，可将检测结果Ct值带入所绘制的标准曲线，进而获得相对应的基因拷贝数。根据参考文献资料中每个芽囊原虫细胞含约100 copies SSU rDNA基因，可计算获得样品中芽囊原虫细胞数约为：基因拷贝数/100。

优选的，所述引物序列如下：上游引物为830F: 5′-TCATACGCTCGTCTCAAA-3′;下游引物为830R: 5′-TGATAGGGCAGAAACTTGA-3′。

优选的，所述步骤④包括下列绘制步骤：

a、制备含目的基因的质粒作为阳性标准品；

b、将阳性标准品质粒换算拷贝数后，进行连续的10倍倍比稀释，从1:10到1:10⁹共设置9个浓度梯度，每个梯度设置3个重复，于型荧光定量PCR仪中进行扩增，同时设置去离子水为阴性对照；

c、扩增结束后收集数据，根据扩增曲线、CT值，得出最佳的检测区间，并绘制标准曲线。

本发明的有益效果是：设计特异扩增芽囊原虫SSU rDNA基因片段的引物，然后通过SYBR^® Green Realtime PCR Master Mix试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立。根据芽囊原虫SSU rDNA基因的高度保守区，设计并合成扩增片段大小为280bp的上下游引物，可用于对低含量芽囊原虫病原的检测；此外，可通过定量检测芽囊原虫病原含量情况，从而了解芽囊原虫在体内体外的变化规律，为探究宿主的临床症状、病理变化与机体荷虫量之间的关系和体外培养及药物防治研究奠定基础；同时本发明建立了快速，灵敏的芽囊原虫分子检测方法，针对芽囊原虫SSU rDNA设计引物，在荧光定量仪中约1 h即可高效扩增出结果。与传统的PCR检测方法相比，具有省时高效、高效、灵敏度高的特点。并且此方法此方法不开盖检测，避免了开盖电泳检测时造成的污染。荧光定量方法作为一种分子生物学的快速检测方法，将会有更广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明所构建重组质粒的扩增曲线图。

图2为本发明所构建重组质粒的标准曲线。

图3为本发明所构建重组质粒的熔解曲线。

图4为常规PCR检测感染芽囊原虫的SD大鼠粪便样品。

泳道M: DL 2000 Marker。

泳道1～28: SD大鼠感染芽囊原虫后1～28 d粪便样品。

泳道P: 阳性对照。

泳道N: 阴性对照。

表1为绝对荧光定量PCR检测感染芽囊原虫的SD大鼠粪便样品。

图5为芽囊原虫常规PCR敏感性试验结果。

表2为芽囊原虫绝对荧光定量PCR敏感性试验结果。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。

请同时参考图1至图5，下面将结合附图对本发明实施例的芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法作详细说明。

该芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法包括下列步骤：

①、芽囊原虫基因组DNA的提取：使用粪便基因组DNA提取试剂盒（E.Z.N.A StoolDNA kit，OMEGA，America）进行粪便样品DNA的提取，按照操作说明，分别提取粪便样品总DNA，最后溶于200 uL洗脱缓冲液中，保存于－20℃冰箱内。

②、PCR检测感染芽囊原虫的SD大鼠粪便样品：引物为实验室已合成的针对芽囊原虫SSU rDNA基因的一对引物，扩增片段大小为600bp，引物序列如下：上游引物RD5：ATCTGGTTGATCCTGCCAGT；下游引物BhRDr：GAGCTTTTTAACTGCAACAACG；反应体系为25μL：10×Buffer2.5μL，dNTPs2μL，灭菌双蒸水17μL，上游引物和下游引物各0.5μL，r TaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板2μL。反应程序为：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min35个循环；72℃ 10min，4℃终止反应。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像仪观察。

③、绝对荧光定量PCR检测感染芽囊原虫的SD大鼠粪便样品：通过使用TOYOBO公司的SYBR^® Green Realtime PCR Master Mix试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的扩增，反应体系为20μL：模板2μL，双蒸水5.6μL，SYBR^® Green Realtime PCR Master Mix 10μL，上下游引物各1.2μL；加样时先将除模板外各组分均匀混合并分装到反应管，后加模板，上机前离心处理；反应程序如下：1个循环的95℃ 30s；40个循环的95℃ 5s，56℃ 10s，72℃ 15s。

④、PCR检测和绝对荧光定量PCR检测芽囊原虫方法比较：通过对比PCR检测感染芽囊原虫的粪便样品(见图4)与绝对荧光定量PCR检测感染芽囊原虫的粪便样品(见表1)，可以看出常规PCR检测出一定含量的芽囊原虫及仅能通过条带亮度强弱大致反应病原含量多少，而绝对荧光定量PCR不仅可以检测到更少含量的芽囊原虫(38个拷贝数，见表2)，还可以对病原含量有更精确的测定(样品中芽囊原虫细胞数约为：基因拷贝数/100)。

⑤、PCR检测和绝对荧光定量PCR检测芽囊原虫方法敏感性比较：通过对比PCR检测芽囊原虫样品(见图5)与绝对荧光定量PCR检测芽囊原虫样品(见表2)，可以看出，普通PCR可以检测到2 000 cells/200mg粪便（10 cells/μL），同样的样品使用绝对荧光定量方法可以检测到20 cells/200 mg粪便（0.1 cells/μL）。绝对荧光定量方法的敏感性比普通PCR方法高2个数量级（100倍）。

表1.对荧光定量PCR检测感染芽囊原虫的SD大鼠粪便样品

dpi/d	试验鼠A（copies/μL）
		1	37.8
2	0
		3	797.2
4	2 401.4
		5	11 523.6
6	622.5
		7	0
8	50 512.4
		9	4 859.7
10	0
		11	62 316.5
12	20 233.8
		13	1 787.2
14	18 950.8
		15	547.3
16	800.3
		17	55.8
18	0
		19	14.7
20	11.7
		21	0
22	0
		23	0
24	20.2
		25	0
26	0
		27	9.1
28	0

表2.芽囊原虫绝对荧光定量PCR敏感性试验结果

质粒浓度（copies/μL）	Ct平均值(n=3)	细胞浓度（cells/μL）	Ct平均值(n=3)
				3.8×10<sup>8</sup>	10.59	-	-
3.8×10<sup>7</sup>	13.21	-	-
				3.8×10<sup>6</sup>	16.61	1 000	15.83
3.8×10<sup>5</sup>	19.88	100	19.2
				3.8×10<sup>4</sup>	23.51	10	23.37
3.8×10<sup>3</sup>	27.62	1	26.74
				3.8×10<sup>2</sup>	31.14	0.1	30.98
38	33.26	0.01	33.37

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法包括下列步骤：

芽囊原虫病原基因组DNA的提取：采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便样品总DNA；

引物的设计与合成：根据芽囊原虫SSU rDNA基因的高度保守区，合成扩增片段大小为280bp的上下游引物，在引物使用前，使用超纯水溶解为10 µmol/L，－(25～20)℃保存备用；

绝对荧光定量PCR方法的建立：使用SYBR^® Green Realtime PCR Master Mix试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立，反应体系为20μL：模板2μL，双蒸水5.6μL，10μL，上下游引物各1.2μL；加样时先将除模板外各组分均匀混合并分装到反应管，后加模板，上机前离心处理；反应程序如下：1个循环的95℃ 30s；40个循环的95℃ 5s，56℃ 10s，72℃ 15s；

标准曲线的绘制：

绝对荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性试验：通过标准曲线的绘制显示可检测到仅含有几个芽囊原虫细胞DNA拷贝数，体现出绝对荧光定量PCR方法的灵敏度；将实验室已有的病原提取相应核酸，按照扩增体系扩增；同时设芽囊原虫阳性对照及去离子水的阴性对照，检测结果体现出绝对荧光定量PCR方法的特异性;

芽囊原虫病原数目的定量：在使用本方法检测样品后，可将检测结果Ct值带入所绘制的标准曲线，进而获得相对应的基因拷贝数;根据参考文献资料中每个芽囊原虫细胞含约100 copies SSU rDNA基因，可计算获得样品中芽囊原虫细胞数约为：基因拷贝数/100。

2.根据权利要求1所述的一种芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述引物序列如下：上游引物为830F: 5′-TCATACGCTCGTCTCAAA-3′;下游引物为830R: 5′-TGATAGGGCAGAAACTTGA-3′。

3.根据权利要求1所述的一种芽囊原虫绝对荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤④包括下列绘制步骤：

a、制备含目的基因的质粒作为阳性标准品；

b、将阳性标准品质粒换算拷贝数后，进行连续的10倍倍比稀释，从1:10到1:10⁹共设置9个浓度梯度，每个梯度设置3个重复，于荧光定量PCR仪中进行扩增，同时设置去离子水为阴性对照；

c、扩增结束后收集数据，根据扩增曲线、CT值，得出最佳的检测区间，并绘制标准曲线。

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