CN118028310B

CN118028310B - 一种陆地棉基因GhKMT3；2a及其在调控早熟性状中的应用

Info

Publication number: CN118028310B
Application number: CN202410285860.8A
Authority: CN
Inventors: 宿俊吉; 王彩香; 巨吉生; 袁文敏; 张雪利; 李丹丹; 杨琦文
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2024-03-13
Filing date: 2024-03-13
Publication date: 2024-07-09
Anticipated expiration: 2044-03-13
Also published as: CN118028310A

Abstract

本发明公开了一种陆地棉基因GhKMT3；2a及其在调控早熟性状中的应用，涉及基因工程技术领域。该GhKMT3；2a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明研究发现GhKMT3；2a基因在盛花期和花器官中显著表达，通过将目的基因进行克隆，构建目的基因的VIGS沉默载体，研究其调控早熟的生物学功能，结果发现，GhKMT3；2a基因沉默导致陆地棉的株高变矮、现蕾和开花时间延迟，影响陆地棉的生长发育。以此证实GhKMT3；2a基因正向调控陆地棉早熟，改善陆地棉的开花、现蕾和株高等表型生长发育性状，为陆地棉早熟育种提供重要基因资源。

Description

一种陆地棉基因GhKMT3；2a及其在调控早熟性状中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种陆地棉基因GhKMT3；2a及其在调控早熟性状中的应用。

背景技术

陆地棉是一种广泛种植的棉花，是世界上天然纤维的主要来源。早熟是陆地棉的重要优良性状，可有效避免低温影响，从而有利于扩大陆地棉种植，实现大规模机械化种植和采收。

陆地棉早熟是一个复杂性状，主要包括全生育期、苗期、蕾期、花铃期、第一果枝位、第一果枝位高度和霜前花率等性状，这些性状都是数量性状，受多个数量性状基因位点控制，遗传机理复杂且易受环境因素影响，因此，传统育种方法进展缓慢，效率低。

发明人前期的研究表明，组蛋白甲基化通过调节关键的开花基因FLC进而调控开花。然而陆地棉缺乏FLC基因，因此通过组蛋白甲基化研究调控陆地陆地棉开花时间的基因的难度增大。

挖掘控制陆地棉早熟性状的基因，对于培育具有早熟性状的陆地棉品种有着非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种陆地棉基因GhKMT3；2a及其在调控早熟性状中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现GhKMT3；2a基因正向调控陆地棉早熟，改善陆地棉的开花、现蕾和株高等表型生长发育性状，为陆地棉早熟育种提供重要基因资源。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种调控陆地棉早熟性状的GhKMT3；2a基因，所述GhKMT3；2a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供上述的GhKMT3；2a基因在调控陆地棉早熟性状中的应用，所述GhKMT3；2a基因正向调控陆地棉早熟性状。

进一步地，所述早熟性状包括现蕾时间和开花时间。

本发明还提供一种过表达上述的GhKMT3；2a基因的生物材料在改善陆地棉早熟性状中的应用。

进一步地，所述生物材料为以下(1)或(2)所述的物质：

(1)过表达GhKMT3；2a基因的重组表达载体；

(2)包含所述重组表达载体的重组微生物菌株。

进一步地，所述早熟性状包括现蕾时间和开花时间。

本发明还提供一种改善陆地棉早熟性状的方法，将过表达上述的GhKMT3；2a基因的生物材料转化入陆地棉中，构建得到过表达所述GhKMT3；2a基因的转基因陆地棉植株的步骤。

本发明还提供一种沉默GhKMT3；2a基因的生物材料在降低陆地棉株高中的应用。

进一步地，所述生物材料为以下(a)或(b)所述的物质：

(a)沉默GhKMT3；2a基因的沉默载体；

(b)包含所述沉默载体的重组微生物菌株。

本发明还提供一种降低陆地棉株高的方法，将沉默GhKMT3；2a基因的生物材料转化入陆地棉中，构建得到沉默所述GhKMT3；2a基因的转基因陆地棉植株的步骤。

本发明公开了以下技术效果：

本发明采用基因家族分析挖掘与生殖发育相关的候选基因，发现GhKMT3；2a基因在盛花期和花器官中显著表达。为了进一步明确GhKMT3；2a基因调控开花的分子机理，将目的基因进行克隆，构建目的基因的VIGS沉默载体，研究其调控早熟的生物学功能，结果发现，GhKMT3；2a基因沉默导致陆地棉的株高变矮、现蕾和开花时间延迟，影响陆地棉的生长发育。以此证实GhKMT3；2a基因正向调控陆地棉早熟，改善陆地棉的开花、现蕾和株高等表型生长发育性状，为陆地棉早熟育种提供重要基因资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为pEASY-T5 Zero载体的图谱；

图2为TRV载体的图谱；

图3为目的基因菌液的PCR检测结果；

图4为双酶切验证结果；

图5为GhKMT3；2a的克隆产物的测序结果；

图6为基因沉默的表型对比图；

图7为GhKMT3；2a基因的表达量检测结果；

图8为GhKMT3；2a沉默植株的表型检测结果；其中，A为现蕾时间；B为开花时间；C为株高。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1试验材料与试剂

1.1试验材料

本试验所用材料为陆地棉中棉113(ZM113)，种子是由中国农业科学院棉花研究所提供。

1.2试验试剂

本研究所用试剂见表1：

表1实验所用试剂

1.3菌株与载体

GV3101农杆菌感受态细胞和pEASY-T5 Zero克隆载体(CT501-01，含DH5α大肠杆菌感受态细胞)分别购买自上海唯地生物技术有限公司和全式金生物科技有限公司，用于基因沉默的VIGS载体***(TRV156、TRV192和TRV-GhPDS)由中国农业科学院棉花研究所转基因课题组馈赠，pEASY-T5 Zero载体图谱如图1所示。

1.4溶液配制

a.培养基的配方见表2：

表2培养基配方

注：培养基需在121℃灭菌20min

b.100mL 50×TAE缓冲液：24.2g Tris+3.72g Na₂EDTA·2H₂O+5.71mL冰乙酸；

c.50mg/mL利福平(Rif)和20mg/mL乙酰丁香酮(AS)：将5g Rif粉末和2g乙酰丁香酮粉末分别溶于100mLDMSO溶液中，分别用0.22的滤膜过滤除菌，封装，-20℃保存；

d.0.5M MES：将10.65g MES粉末溶于50mL ddH₂O中，用NaOH将pH值调至5.6，之后定容至100mL，用0.22的滤膜过滤除菌，封装，4℃保存；

e.1M MgCl₂：用100mL ddH₂O溶解9.521g MgCl₂粉末(放大量热)，0.22滤膜过滤除菌，4℃保存；

f.500mL重悬液：10mL 0.5M MES+1mL 20mg/mLAS+5mL 1M MgCl₂，无菌ddH₂O补足至500mL。

1.5使用仪器

主要仪器：可见分光光度计、高速冷冻离心机、水浴锅、电泳仪、人工气候箱、切胶仪、超低温冰箱、荧光定量仪、梯度PCR仪、灭菌锅、电子天平、微波炉、台式恒温摇床、制冰机、超净工作台、生化培养箱、超微量分光光度计、超纯水仪器和迷你漩涡混匀仪。

2试验方法

2.1引物设计

利用NCBIPrimer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计GhKMT3；2a基因的克隆引物、qRT-PCR引物、VIGS沉默引物(VIGS沉默引物产物片段大小为300～500bp)，引物序列如表3所示：

表3本发明所用的引物列表

2.2RNA的提取

2.2.1RNA提取和反转录

根据多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书提取RNA。

反转录(cDNA第一链的合成)：

a.将分装的RNA按照自己的需求从-80℃冰箱取出并在冰上融化，在-20℃冰箱中取出5×FastKing-RT SuperMix试剂和RNase-Free ddH₂O在冰上融化，轻摇混匀；

b.反应体系见表4：

表4反转录反应体系

c.反应程序见表5：

表5反应程序

d.反应完成后，检测cDNA的纯度及浓度，分装，-20℃保存。

2.3目的片段的扩增与克隆载体的连接和转化

2.3.1目的片段的扩增

以中棉113(ZM113)的cDNA为模板，利用Taq 2×PCR Mix with Dye V2预混液(含染料)试剂盒进行目的基因的扩增，扩增体系如表6：

表6扩增体系

根据上述体系加完反应液后，轻摇混匀，短暂离心，按照表7反应程序进行反应：

表7扩增反应程序

反应结束后，用1.8％的琼脂糖凝胶电泳检测其目的基因的大小是否合适。

陆地棉GhKMT3；2a基因全长，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

克隆获得GhKMT3；2a的基因序列沉默片段(SEQ ID NO.2)。

SEQ ID NO.1：

ATGGATCCTGAGAATGAAGACCTTCCTCAATATGAACACATTTTTCAAAACGAATTCTCATATCGAAAACATAAAAAGCAAAAAGAGGAAGATATTGCTATATGCGAGTGCAAATTTGACTTTAGTGATCCTGATAGTACATGTGGAGAGAGGTGCTTGAATGTACTAACAAGCACAGAATGTACACCCGGTTATTGTCCTTGCGGTGTTTACTGCAAGAATCAGAAATTT CAGAAATGCCAATATGCTAGAGTTACGTTGTTTAAAACAGAGGGTCGTGGTTGGGGTCTGCTTGCTGCTGAATATATAAAGACTGGACAATTTATTGTTGAGTACTGTGGAGAAGTAATATCTTGGAAAGAAGCAAAGCGAAGATCTCAAGCTTATGAAAATCAAGGTCTTAAGGATGCATTTATTATTTCTCTGAATGGCTCTGAATCCATTGATGCCACCAAAAAGGGAAACCTTGCTAGATTCATCAACCACTCATGCCAACCGAACTGTGAGACTAGGAAGTGGACTGTTTTGGGAGAAATACGAGTTGGAATATTTGCAAAAGAAGATATTCCAATTGGAACTGAGCTTGCATATGATTATAACTTTGAATGGTATGGTGGTGCAAAAGTTCGCTGCCTCTGTGGTGCACTCAACTGTTCAGGATTTCTTGGAGCAAAG TCTCGTGGCTTTCAGGAGGATACCTATTTATGGGAAGATGATGATGAACGGTATTCAGTTGAAAAAATCCCGTTGT ATGATTCTGCAGAAGATGAGCCTGCCACAAAGCTCCTGAAAGCTATAAATTTGAATTCTGAGAATGATGTTAATAC TAAAAGTGAACAGTCCATAACAATGGATGTTAATCTGAAATCTAAGCACCAGTTGGAGTCTACTATTGATACAGTT CCCATGGAAGGGGTAGATGTGAATACACTGAAAATTGAATCACCTAAAGATATAAACTTGTATTCTCAAGATGCTC AGCAGGCTTTTTCACAAAAGAATGCTATGATATCTCGCATCCGAAGTAACAGTGCATGCCGGAATTATCACATTAGATCAGGGCCAATGCTTAAGAAAAAGTCGCAGCATTATTCAAATGGAAAGTTGAAACATCTTTCAAAGAAGCAAATTGATTTAAAACATCTTGCTAAGCTCTTAGCATCAAAAGAAGCACAAGAGGAAGTCTTCAGATATGAGGAAATGAAGAATGAAGCAGCTTCCCAACTAGCTTCTTTGTACAATGATATACGCCCTGCAATTGAAGAACATGAGAGGGATAACCAAGACAGTGTATCGACCAGTGTTGCTGAGAAGTGGATCGAAGCGTCCTGCTCCAAACTGAAGATAGAATTTGATTTTCATTCTTCAATTCTCAGAAATATTGTCTGCACTCCGCAAAAGGCATGTGAACAAGTGAAGCCTTGTGAACCGGAAGGACACGGAGGCAATAATGATACTGAAGTAAAGTTGGAATTTTGA；其中，下划线部分为沉默片段。

SEQ ID NO.2：

GTCTCGTGGCTTTCAGGAGGATACCTATTTATGGGAAGATGATGATGAACGGTATTCAGTTGAAAAAATCCCGTTGTATGATTCTGCAGAAGATGAGCCTGCCACAAAGCTCCTGAAAGCTATAAATTTGAATTCTGAGAATGATGTTAATACTAAAAGTGAACAGTCCATAACAATGGATGTTAATCTGAAATCTAAGCACCAGTTGGAGTCTACTATTGATACAGTTCCCATGGAAGGGGTAGATGTGAATACACTGAAAATTGAATCACCTAAAGATATAAACTTGTATTCTCAAGATGCTCAGCAGGCTTTTTCACAAAAGAATGCTATGATATCTCGCATCCGAAGTAACAGTGCATGCCG。

2.3.3目的基因与克隆载体pEASY-T5 Zero的连接

a.从-80℃冰箱中取出pEASY-T5 Zero载体后，在冰上融化。

b.计算所加目的片段的体积(载体与目的片段的摩尔比＝1:5)，向无菌的1.5mL离心管中加入以下成分(整个操作在冰上完成)：

表8连接体系

c.将其轻摇混匀，短暂离心后，25℃连接5分钟。

2.3.4转化DH5α大肠杆菌感受态细胞

采用热激法转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，以目的基因序列引物进行菌液PCR验证并测序(由上海生工生物工程有限公司完成)。

2.4沉默载体的构建

将2.3.4测序成功的阳性质粒为模板，通过添加了限制性酶Xba I和Kpn I酶切位点和保护碱基的引物进行沉默片段扩增，并通过双酶切的方法将GhKMT3；2a的片段***到TRV2沉默载体中，构建TRV2:GhKMT3；2a沉默载体，具体酶切体系如下：37℃，3h后加10×Loading Buffer停止反应，胶回收目的基因片段PCR产物，载体回收酶切大片段，将目的片段与沉默载体连接，将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，进行菌液PCR和双酶切鉴定，完成后将阳性质粒测序(上海生工)，并转入农杆菌GV3101感受态中。

a.将GV3101感受态细胞从-80℃超低温冰箱取出，在冰上解冻，分装成两管，吸取2μL测序成功的质粒，加入离心管中，进行转化。

b.完成上述步骤后，加入350μL的LB液体培养基(未加抗生素)，振荡培2h(28℃，200rpm)，将菌液均匀的涂布在固体培养基中(添加Kan⁺和Rif抗生素)，在黑暗，28℃条件下，培养2天。

c.培养完成后，将单菌落挑至5mL LB液体培养基中(添加Kan⁺和Rif抗生素)，按照步骤b中振荡培养的条件进行培养16h；

d.培养完成后，用50％甘油保存菌液(菌液:甘油＝1:1)，-80℃保存备用；做菌液PCR确认载体阳性。

2.5陆地棉VIGS沉默目的基因

对中棉113幼苗进行VIGS沉默，具体方法如下：

a.种植中棉113种子，待其生长至第七天，子叶完全展开时，将其浸水，直至花盆内的营养土将水吸收至表面后，停止浸水，放置备用。

b.向LB液体培养基中加入Kan⁺和Rif备用，其中Kan⁺和Rif的终浓度分别为50μg/mL和25μg/mL。将从-80℃取出的VIGS载体***和目的基因菌液在冰上融化，28℃，200rpm活化16h(菌液:LB液体培养基＝1:10)。活化完成后，按同样比例进行扩繁。

c.菌液扩繁完成后，以5000rpm的转速，离心10min，倒掉上清液，保留菌体，并利用分光光度计用重悬液使菌体悬浮，调整OD₆₀₀为0.8。

d.重悬完成后，黑暗放置3h，使菌体复苏后，将TRV1分别与含TRV:00(为空白对照组)、TRV2:GhCAL(为阳性对照)、TRV2:GhKMT3；2a(为实验组)的菌体重悬液1:1混合，并将其充分混匀。

e.在陆地棉幼苗生长的第七天，将其按照步骤a的方法浸水。在陆地棉幼苗生长的第八天对其进行VIGS注射，具体操作为：将子叶背面使用1mL注射器针头划口(注意伤口不过大，针尖般大小即可)，将步骤d的混合菌液注射到陆地棉子叶中，尽可能使菌液充满整个子叶。

f.注射完成后，为了达到更好的侵染效果，使用塑料袋将其包裹，25℃黑暗放置24h后，在正常生长条件下培养。

2.6沉默植株的鉴定

待阳性对照陆地棉幼苗出现白化后，采取实验组及空白组的陆地棉幼叶进行荧光定量实验，检测其沉默效率。

3结果与分析

3.1沉默载体的构建与沉默株系的阳性鉴定

3.1.1目的基因片段的扩增与沉默载体的构建

用NCBI的blast-primer设计引物，以中棉113的cDNA为模板，使用艾伯泰科的Taq2X PCRMix with Dye V2酶进行目的片段的扩增，使用通用型DNA纯化回收试剂盒(天根)回收目的片段。将回收的目的片段与pEASY-T5 Zero载体连接进行筛选，提质粒。通过双酶切的方法将目的片段与TRV156载体连接(图2)并培养，通过菌液PCR(图3)、双酶切和测序(图4和图5)方法得到阳性质粒。根据测序可得连接到该载体上的目的片段并未发生碱基的缺失和替换，因此测序成功。将阳性质粒用冻融法转化到农杆菌进行培养。

3.1.2目的基因的沉默效率检测及表型分析

基于基因家族数据分析，筛选出陆地棉生长发育的候选基因。因此利用VIGS技术研究目的基因在陆地棉开花调控中的作用。本发明选择基因GhKMT3；2a进行VIGS试验。通过在子叶下表皮注射的方法，沉默陆地棉中棉113中的目的基因，发现在感染后的第8天，阳性对照(TRV:GhCAL)植株开始白化，沉默后的第12天，阳性对照白化明显，说明农杆菌感染陆地棉成功(图6)。对目的基因的沉默效率检测发现，与对照组相比，TRV:GhKMT3；2a植株中GhKMT3；2a的表达明显受到抑制(图7)。通过VIGS沉默植株和对照植株的表达量分析，说明目的基因已被沉默。

3.1.3沉默植株的表型影响

挑选四周龄的TRV:GhPDS、TRV:00、TRV:GhKMT3；2a植株置于25℃环境下培养。之后观察其株高、现蕾和开花时间，发现将GhKMT3；2a基因沉默之后，陆地棉的株高变矮、现蕾和开花时间延迟，影响陆地棉生长发育(图8)。发现将该基因沉默之后，陆地棉GhKMT3；2a沉默植株的株高降低了5.8cm、平均现蕾和开花时间分别延迟了5.8天和7.03天，均达到显著水平。上述结果表明GhKMT3；2a基因可以调控陆地棉开花时间。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种GhKMT3；2a基因的生物材料在延迟陆地棉现蕾时间和开花时间中的应用，其特征在于，所述GhKMT3；2a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物材料为以下(1)或(2)所述的物质：

(1)沉默所述GhKMT3；2a基因的沉默载体；

(2)包含所述沉默载体的重组微生物菌株。

3.一种延迟陆地棉现蕾时间和开花时间的方法，其特征在于，将沉默GhKMT3；2a基因的生物材料转化入陆地棉中，构建得到沉默所述GhKMT3；2a基因的转基因陆地棉植株的步骤；

所述GhKMT3；2a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种沉默GhKMT3；2a基因的生物材料在降低陆地棉株高中的应用，其特征在于，所述GhKMT3；2a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物材料为以下(a)或(b)所述的物质：

(a)沉默权利要求1所述的GhKMT3；2a基因的沉默载体；

(b)包含所述沉默载体的重组微生物菌株。

6.一种降低陆地棉株高的方法，其特征在于，将沉默GhKMT3；2a基因的生物材料转化入陆地棉中，构建得到沉默所述GhKMT3；2a基因的转基因陆地棉植株的步骤；

所述GhKMT3；2a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。