CN117821474A - 一种调控陆地棉早熟性状的基因及其应用 - Google Patents
一种调控陆地棉早熟性状的基因及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117821474A CN117821474A CN202410184373.2A CN202410184373A CN117821474A CN 117821474 A CN117821474 A CN 117821474A CN 202410184373 A CN202410184373 A CN 202410184373A CN 117821474 A CN117821474 A CN 117821474A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- upland cotton
- ghgaa
- cotton
- early ripening
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 title claims abstract description 63
- 235000009429 Gossypium barbadense Nutrition 0.000 title claims abstract description 52
- 235000018322 upland cotton Nutrition 0.000 title claims abstract description 52
- 230000005070 ripening Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 title abstract description 8
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims abstract description 36
- 101150082072 14 gene Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 101150106774 9 gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 claims description 20
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 14
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 20
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 abstract description 14
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 abstract description 11
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 abstract description 11
- 230000028604 virus induced gene silencing Effects 0.000 abstract description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 7
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008827 biological function Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- -1 bud emergence Species 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 235000009438 Gossypium Nutrition 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012247 phenotypical assay Methods 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229930002348 tetracyclic diterpenoid Natural products 0.000 description 1
- 150000004197 tetracyclic diterpenoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
- C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种调控陆地棉早熟性状的基因及其应用，属于基因工程技术领域。所述基因包括GhGASA9基因和GhGASA14基因中的至少一个；所述GhGASA9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述GhGASA14基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明通过构建目的基因的VIGS沉默载体，研究其调控早熟的生物学功能，证实了GhGASA9和GhGASA14基因正向调控陆地棉早熟响应赤霉素，改善陆地棉的开花、现蕾和株高等表型生长发育性状，为陆地棉早熟育种提供重要基因资源。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种调控陆地棉早熟性状的基因及其应用。
背景技术
棉花(Gossypium spp)是一种能提供天然纤维、油料和植物蛋白的经济作物，在国民经济发展中起着非常重要的作用。西北内陆是目前中国棉花种植区最占主导地位的地区，又因其春季气温回升慢、终霜结束晚，秋季气温下降快、初霜开始早，导致积温不够，因此更适合种植早熟棉品种。早熟性状是棉花的最重要育种目标性状之一，它不仅决定了棉花能否在收获期正常成熟，而且还决定了该品种是否适宜于机械采收。在早熟相关性状中，开花时间是评价棉花早熟的重要特征之一。
赤霉素(GA3)是一类四环双萜类植物生长因子，影响花的诱导以及花器官发育。而GASA(GA-Stimulated inArabidopsis)是一个位于DELLA下游的赤霉素调节家族，广泛存在于单子叶和双子叶植物物种中，已在一些植物物种中进行了广泛研究，因此探明GASAs响应赤霉素调节开花的过程具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控陆地棉早熟性状的基因及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明证实GhGASA9和GhGASA14基因正向调控陆地棉早熟响应赤霉素，改善陆地棉的开花、现蕾和株高等表型生长发育性状，为陆地棉早熟育种提供重要基因资源。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种调控陆地棉早熟性状的基因，所述基因包括GhGASA9基因和GhGASA14基因中的至少一个；所述GhGASA9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述GhGASA14基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种沉默所述基因的生物材料。
进一步地，所述生物材料包括沉默所述基因的重组表达载体和包含所述重组表达载体的重组菌。
本发明还提供一种所述的基因或所述的生物材料在调控陆地棉早熟性状中的应用，通过沉默所述基因推迟陆地棉早熟。
进一步地，所述推迟陆地棉早熟包括推迟陆地棉的现蕾时间和开花时间。
本发明还提供一种所述的基因或所述的生物材料在降低陆地棉株高性状中的应用。
本发明还提供一种推迟陆地棉现蕾时间的方法，包括将所述的生物材料转化至陆地棉中，构建得到沉默所述基因的转基因陆地棉植株的步骤。
本发明还提供一种推迟陆地棉开花时间的方法，包括将所述的生物材料转化至陆地棉中，构建得到沉默所述基因的转基因陆地棉植株的步骤。
本发明还提供一种降低陆地棉株高性状的方法，包括将所述的生物材料转化至陆地棉中，构建得到沉默所述基因的转基因陆地棉植株的步骤。
本发明公开了以下技术效果：
本发明为了进一步明确GhGASA9和GhGASA14基因调控开花的分子机理，将目的基因进行克隆，构建目的基因的VIGS沉默载体，研究其调控早熟的生物学功能，结果发现，GhGASA9和GhGASA14基因沉默导致陆地棉的现蕾和开花时间延迟，影响陆地棉的生长发育。外源喷施赤霉素后，引起株高显著变化，提高了现蕾的集中性并促进了开花，以此证实GhGASA9和GhGASA14基因正向调控陆地棉早熟响应赤霉素，改善陆地棉的开花、现蕾和株高等表型生长发育性状，为陆地棉早熟育种提供重要基因资源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pEASY-T5 Zero载体和TRV载体的图谱；
图2为目的基因扩增的结果；
图3为目的基因菌液的PCR检测结果；
图4为双酶切验证结果；
图5为基因GhGASA9和GhGASA14的克隆产物的测序结果；
图6为目的基因的沉默及沉默效率的检测；其中A为TRV:GhCLA1阳性对照表型；B为目的基因沉默效率检测；
图7为GhGASA9和GhGASA14沉默植株的表型检测结果；其中，A为苗高；B为株高；C为赤霉素处理组(GA3)和对照组(MOCK)下的株高；
图8基因沉默的开花表型对比图；其中，A为开花统计结果；B为现蕾到开花周期统计；C为赤霉素处理组(GA3)和对照组(MOCK)下开花表型对照。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例
1.材料与试剂
1.1试验材料
本实施例所用材料为陆地棉中棉113(ZM113)，种子由中国农业科学院棉花研究所提供。
1.2试验试剂
本实施例所用试剂见表1：
表1实验所用试剂
1.3菌株与载体
GV3101农杆菌感受态细胞和pEASY-T5 Zero克隆载体(CT501-01，含DH5α大肠杆菌感受态细胞)分别购买自上海唯地生物技术有限公司和全式金生物科技有限公司，用于基因沉默的VIGS载体***(TRV:00(PYL156)、PYL192和TRV:GhCLA1)由中国农业科学院棉花研究所转基因课题组馈赠，pEASY-T5 Zero载体图谱如图1所示。
1.4溶液配制
a.培养基的配方见表2：
表2培养基配方
注：培养基需在121℃灭菌20min
b.100mL 50×TAE缓冲液：24.2g Tris+3.72g Na2EDTA·2H2O+5.71mL冰乙酸；
c.50mg/mL利福平(Rif)和20mg/mL乙酰丁香酮(AS)：将5g Rif粉末和2g乙酰丁香酮粉末分别溶于100mLDMSO溶液中，分别用0.22的滤膜过滤除菌，封装，-20℃保存；
d.0.5M MES：将10.65g MES粉末溶于50mL ddH2O中，用NaOH将pH值调至5.6，之后定容至100mL，用0.22的滤膜过滤除菌，封装，4℃保存；
e.1M MgCl2：用100mL ddH2O溶解9.521g MgCl2粉末(放大量热)，0.22滤膜过滤除菌，4℃保存；
f.500mL重悬液：10mL 0.5M MES+1mL 20mg/mLAS+5mL 1M MgCl2，无菌ddH2O补足至500mL。
1.5使用仪器
主要仪器：可见分光光度计、高速冷冻离心机、水浴锅、电泳仪、人工气候箱、切胶仪、超低温冰箱、荧光定量仪、梯度PCR仪、灭菌锅、电子天平、微波炉、台式恒温摇床、制冰机、超净工作台、生化培养箱、超微量分光光度计、超纯水仪器和迷你漩涡混匀仪。
2试验方法
2.1引物设计
利用NCBIPrimer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计GhGASA9和GhGASA14基因的克隆引物、qRT-PCR引物、VIGS沉默引物(VIGS沉默引物产物片段大小为300～500bp)，引物序列如表3所示：
表3本发明所用的引物列表
2.2RNA的提取
2.2.1RNA提取和反转录
根据多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书提取RNA。
反转录(cDNA第一链的合成)：
a.将分装的RNA按照自己的需求从-80℃冰箱取出并在冰上融化，在-20℃冰箱中取出5×FastKing-RT SuperMix试剂和RNase-Free ddH2O在冰上融化，轻摇混匀；
b.反应体系见表4：
表4反转录反应体系
c.反应程序见表5：
表5反应程序
d.反应完成后，检测cDNA的纯度及浓度，分装，-20℃保存。
2.3目的片段的扩增与克隆载体的连接和转化
2.3.1目的片段的扩增
以中棉113(ZM113)的cDNA为模板，利用Taq 2×PCR Mix with Dye V2预混液(含染料)试剂盒进行目的基因的扩增，扩增体系如表6：
表6扩增体系
根据上述体系加完反应液后，轻摇混匀，短暂离心，按照表7反应程序进行反应：
表7扩增反应程序
反应结束后，用1.8％的琼脂糖凝胶电泳检测其目的基因的大小是否合适。
克隆获得陆地棉GhGASA9的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
克隆获得的GhGASA9基因序列中沉默的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1：
ATGGCCATCTTTAAGGCTTTCATTGCTTCACTTCTCATCTCTCTTCTCCTTCTCCAACTTGTTGCTGC TGATCAACTGGTGACAAGTGCCAGCAAGAACAAGGGAACTGCTCCCCCTAAGAAAATTGACTGCGGCGGGGCTTGT GCGGCGAGGTGCCGATTATCATCGAGGCCACACCTATGCAAGAGGGCATGCGGGACATGTTGTGCACGCTGCAACT GTGTTCCACCGGGGACAGCCGGTAACCAAGAAATGTGTCCTTGCTATGCTAGCTTGACCACCCACGGTGGCCGACG CAAGTGCCCTTGA其中，下划线部分为沉默片段。
SEQ ID NO.2：
GCCATCTTTAAGGCTTTCATTGCTTCACTTCTCATCTCTCTTCTCCTTCTCCAACTTGTTGCTGCTGATCAACTGGTGACAAGTGCCAGCAAGAACAAGGGAACTGCTCCCCCTAAGAAAATTGACTGCGGCGGGGCTTGTGCGGCGAGGTGCCGATTATCATCGAGGCCACACCTATGCAAGAGGGCATGCGGGACATGTTGTGCACGCTGCAACTGTGTTCCACCGGGGACAGCCGGTAACCAAGAAATGTGTCCTTGCTATGCTAGCTTGACCACCCACGGTGGCCGACGCAAGTGCCCTT。
克隆陆地棉GhGASA14基因的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
克隆获得的GhGASA14基因序列中沉默的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.3：
ATGGCTAAACTTGTTGCTACTTTCTTCTTGGCTCTCATTGCCATCTCCATGGTTCAAACTTTGGTTAT GGCATCACATGGACATGGTGGTCATCATTATGATAACAAACGTTATGGACCTGGAAGTCTCAAGCCTTACCAATGT CCATAACTCAGTGCACAAGGAGGTGTAGCCAGACACAGTACCATAAACCATGCATGTTCTTCTGTCAGAAATGTTG CAGGACATGCCTTTGTGTTCCTCCAGGGTATTATGGGAACAAACAAGTTTGCCCTTGCTACAACAACTGGAAAACC AAGGAAGGAGGCCCCAAATGCCCTTAA其中，下划线部分为沉默片段。
SEQ ID NO.4：
TGCTACTTTCTTCTTGGCTCTCATTGCCATCTCCATGGTTCAAACTTTGGTTATGGCATCACATGGACATGGTGGTCATCATTATGATAACAAACGTTATGGACCTGGAAGTCTCAAGCCTTACCAATGTCCATAACTCAGTGCACAAGGAGGTGTAGCCAGACACAGTACCATAAACCATGCATGTTCTTCTGTCAGAAATGTTGCAGGACATGCCTTTGTGTTCCTCCAGGGTATTATGGGAACAAACAAGTTTGCCCTTGCTACAACAACTGGAAAACCAAGGAAGGAGGCCCCAAATG。
2.3.3目的基因与克隆载体pEASY-T5 Zero的连接
a.从-80℃冰箱中取出pEASY-T5 Zero载体后，在冰上融化。
b.计算所加目的片段的体积(载体与目的片段的摩尔比＝1:5)，向无菌的1.5mL离心管中加入表8所示的反应体系(整个操作在冰上完成)：
表8连接体系
c.将其轻摇混匀，短暂离心后，25℃连接5min。
2.3.4转化DH5α大肠杆菌感受态细胞
采用热激法将连接有目的基因的载体转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，以目的基因序列引物进行菌液PCR验证并测序(由上海生工生物工程有限公司完成)。
2.4沉默载体的构建
以2.3.4测序成功的阳性质粒为模板，通过添加了限制性酶EcoRⅠ和Kpn I的酶切位点和保护碱基的沉默引物进行沉默片段的扩增，并通过双酶切的方法将GhGASA9和GhGASA14的沉默片段***到沉默载体中，构建TRV:GhGASA9和TRV:GhGASA14沉默载体，具体酶切体系如表9：
表9酶切体系
按上述体系37℃反应15min后胶回收目的基因片段PCR产物，载体回收酶切大片段，将目的片段与沉默载体连接，将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，进行菌液PCR和双酶切鉴定，完成后将阳性质粒测序(上海生工)，并转入农杆菌GV3101感受态中。
转化农杆菌GV3101的步骤如下：
a.将GV3101感受态细胞从-80℃超低温冰箱取出，在冰上解冻，分装成两管，吸取2μL测序成功的质粒，加入离心管中，进行转化。
b.完成上述步骤后，加入350μL的LB液体培养基(未加抗生素)，振荡培2h(28℃，200rpm)，将菌液均匀的涂布在固体培养基中(添加Kan+和Rif抗生素)，在黑暗，28℃条件下，培养2d。
c.培养完成后，将单菌落挑至5mL LB液体培养基中(添加Kan+和Rif抗生素)，按照步骤b中振荡培养的条件进行培养16h；
d.培养完成后，用50％甘油保存菌液(菌液:甘油＝1:1，V:V)，-80℃保存备用；做菌液PCR确认载体阳性。
2.5陆地棉VIGS沉默目的基因
对中棉113幼苗进行VIGS沉默，具体方法如下：
a.种植中棉113种子，待其生长至第七天，子叶完全展开时，将其浸水，直至花盆内的营养土将水吸收至表面后，停止浸水，放置备用。
b.向LB液体培养基中加入Kan+和Rif备用，其中Kan+和Rif的终浓度分别为50μg/mL和25μg/mL。将从-80℃取出的VIGS载体***和目的基因菌液在冰上融化，28℃，200rpm活化16h(菌液:LB液体培养基＝1:10，V:V)。活化完成后，按同样比例进行扩繁。
c.菌液扩繁完成后，以5000rpm的转速，离心10min，倒掉上清液，保留菌体，并利用分光光度计用重悬液使菌体悬浮，调整OD600为1.8。
d.重悬完成后，黑暗放置3h，使菌体复苏后，将PYL192分别与含TRV:00(为空白对照组)、TRV:GhCLA1(为阳性对照)、TRV:GhGASA9，TRV:GhGASA14(为实验组)的菌体重悬液1:1混合，并将其充分混匀。
e.在陆地棉幼苗生长的第7天，将其按照步骤a的方法浸水。在陆地棉幼苗生长的第八天对其进行VIGS注射，具体操作为：将子叶背面使用1mL注射器针头划口(注意伤口不过大，针尖般大小即可)，将步骤d的混合菌液注射到陆地棉子叶中，尽可能使菌液充满整个子叶。
f.注射完成后，为了达到更好的侵染效果，使用塑料袋将其包裹，25℃黑暗放置24h后，在正常生长条件下培养。
2.6沉默植株的鉴定
待阳性对照陆地棉幼苗出现白化后，采取实验组及空白组的陆地棉幼叶进行荧光定量实验，检测其沉默效率，并适时进行表型观察。
3结果与分析
3.1沉默载体的构建与沉默株系的阳性鉴定
3.1.1目的基因片段的扩增与沉默载体的构建
用NCBI的blast-primer设计引物，以中棉113的cDNA为模板，使用艾伯泰科的Taq2XPCRMix with Dye V2酶进行目的片段的扩增，使用通用型DNA纯化回收试剂盒(天根)回收目的片段。将回收的目的片段与pEASY-T5 Zero载体连接进行筛选，提质粒。通过双酶切的方法将目的片段(图2)与TRV:00载体连接并培养，通过菌液PCR(图3)、双酶切和测序(图4和图5)方法得到阳性质粒。根据测序可得连接到该载体上的目的片段并未发生碱基的缺失和替换，因此测序成功。将阳性质粒用冻融法转化到农杆菌进行培养。
3.1.2目的基因的沉默效率检测及表型分析
基于基因家族数据分析，筛选出陆地棉生长发育的候选基因。因此利用VIGS技术研究目的基因在陆地棉开花调控中的作用。本发明选择GhGASA9基因和GhGASA14基因进行VIGS试验。通过在子叶下表皮注射的方法，沉默陆地棉中棉113中的目的基因，发现在感染后的第7天，阳性对照(TRV:GhCLA1)植株开始白化，沉默后的第9天，阳性对照白化明显，说明农杆菌感染陆地棉成功。对目的基因的沉默效率检测发现，与对照组相比，TRV:GhGASA9和TRV:GhGASA14植株中GhGASA9基因和GhGASA14基因的表达明显受到抑制。通过VIGS沉默植株和对照植株的表达量分析，说明目的基因已被沉默(图6)。
3.1.3沉默植株的表型影响
挑选4周龄的TRV:GhCLA1、TRV:00、TRV:GhGASA9和TRV:GhGASA14植株置于25℃环境下培养。之后观察其株高、现蕾和开花时间，发现将GhGASA9基因或GhGASA14基因沉默之后，其株高无显著差异，但外施赤霉素后，TRV:00株高显著增加(图7)。将GhGASA9基因或GhGASA14基因沉默之后，陆地棉的现蕾和开花时间延迟，影响陆地棉生长发育(图8)。将GhGASA9基因和GhGASA14基因沉默之后，陆地棉TRV:GhGASA9和TRV:GhGASA14植株平均现蕾时间分别延迟了4.8天和6.0天，开花时间分别延迟了4.23天和5.0天，均达到显著水平。喷施赤霉素后现蕾到开花时间集中了10-12天，与TRV:00开花时间无显著差异，上述结果表明GhGASA9基因和GhGASA14基因可以调控陆地棉开花时间并响应赤霉素。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种调控陆地棉早熟性状的基因，其特征在于，所述基因包括GhGASA9基因和GhGASA14基因中的至少一个；所述GhGASA9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述GhGASA14基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种沉默权利要求1所述基因的生物材料。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括沉默权利要求1所述基因的重组表达载体和包含所述重组表达载体的重组菌。
4.一种如权利要求1所述的基因或权利要求2或3所述的生物材料在调控陆地棉早熟性状中的应用，其特征在于，通过沉默所述基因推迟陆地棉早熟。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述推迟陆地棉早熟包括推迟陆地棉的现蕾时间和开花时间。
6.一种如权利要求1所述的基因或权利要求2或3所述的生物材料在降低陆地棉株高性状中的应用。
7.一种推迟陆地棉现蕾时间的方法，其特征在于，包括将权利要求2或3所述的生物材料转化至陆地棉中，构建得到沉默所述基因的转基因陆地棉植株的步骤。
8.一种推迟陆地棉开花时间的方法，其特征在于，包括将权利要求2或3所述的生物材料转化至陆地棉中，构建得到沉默所述基因的转基因陆地棉植株的步骤。
9.一种降低陆地棉株高性状的方法，其特征在于，包括将权利要求2或3所述的生物材料转化至陆地棉中，构建得到沉默所述基因的转基因陆地棉植株的步骤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410184373.2A CN117821474A (zh) | 2024-02-19 | 2024-02-19 | 一种调控陆地棉早熟性状的基因及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410184373.2A CN117821474A (zh) | 2024-02-19 | 2024-02-19 | 一种调控陆地棉早熟性状的基因及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117821474A true CN117821474A (zh) | 2024-04-05 |
Family
ID=90511777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410184373.2A Pending CN117821474A (zh) | 2024-02-19 | 2024-02-19 | 一种调控陆地棉早熟性状的基因及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117821474A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210032648A1 (en) * | 2017-01-25 | 2021-02-04 | China Agricultural University | Method for improving sensitivity of plant to gibberellin inhibitor and use thereof |
| CN115960190A (zh) * | 2022-11-29 | 2023-04-14 | 西南大学 | 枇杷EjGASA6基因及其编码的蛋白与应用 |
-
2024
- 2024-02-19 CN CN202410184373.2A patent/CN117821474A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210032648A1 (en) * | 2017-01-25 | 2021-02-04 | China Agricultural University | Method for improving sensitivity of plant to gibberellin inhibitor and use thereof |
| CN115960190A (zh) * | 2022-11-29 | 2023-04-14 | 西南大学 | 枇杷EjGASA6基因及其编码的蛋白与应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LIU，Z.H.等: "Accession：KC147715.1", 《GENBANK》, 16 July 2013 (2013-07-16) * |
| QIAO K.等: "Accession：MW450747.1", 《GENBANK》, 14 May 2022 (2022-05-14) * |
| 风兰: "高、矮秆蓖麻转录组分析及RcBKI1和RcGASA9基因的功能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, no. 02, 15 February 2021 (2021-02-15), pages 1 - 92 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN115725615B (zh) | 陆地棉GhABC1K14-A09基因及其在陆地棉抗旱和耐盐性中的应用 | |
| CN110117320A (zh) | 棉花GhCAL-D07基因在促进植物开花中的应用 | |
| CN117904181A (zh) | 陆地棉GhANN4基因在陆地棉抗旱和耐盐性中的应用 | |
| CN101503691A (zh) | 植物表皮毛特异表达启动子fif1及其应用 | |
| CN116676320B (zh) | 一个调控棉花生长发育的基因GhBEL1 | |
| CN116179564B (zh) | 陆地棉GhABC1K12-A07基因及其应用 | |
| CN115851823B (zh) | 一种春兰CgARF18基因及其应用 | |
| CN101875932B (zh) | 一种棉花生长点特异性启动子及其克隆和应用 | |
| CN108795944B (zh) | 棉花长链非编码RNA-lnc973及其在植物耐盐性中的应用 | |
| KR20070115325A (ko) | 뿌리 특이적 발현 프로모터 | |
| CN106191075A (zh) | 一种美洲黑杨伸展蛋白基因及其编码蛋白与应用 | |
| CN102776202A (zh) | 一种培育雄性不育植物的方法 | |
| CN117821474A (zh) | 一种调控陆地棉早熟性状的基因及其应用 | |
| CN118028310B (zh) | 一种陆地棉基因GhKMT3；2a及其在调控早熟性状中的应用 | |
| CN105063062A (zh) | 小麦耐盐、抗旱基因TaDHN3，表达载体及其应用 | |
| CN101624595B (zh) | 棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子及其应用 | |
| CN104357449A (zh) | 一种获取植物雄蕊表达启动子sta3的方法及相应启动子 | |
| CN117904179B (zh) | GhANN11基因在调控陆地棉耐寒性和耐热性中的应用 | |
| CN117904178B (zh) | GhBRXL4.3基因在调控陆地棉耐盐性和/或耐低温性中的应用 | |
| CN118028311A (zh) | 一种调控陆地棉早熟性状的基因GhKMT3;1a及其应用 | |
| CN116716316B (zh) | 一个响应环境温度调控陆地棉开花的关键基因GhPIF7 | |
| CN104450749A (zh) | 黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体及其应用 | |
| CN104928293B (zh) | 小麦根特异表达膨胀素基因的启动子及其应用 | |
| CN108070598A (zh) | 一种棉花根尖特异性启动子及其应用 | |
| CN113025621B (zh) | Cipk14基因在提高木豆抗旱中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |