CN117904181A - 陆地棉GhANN4基因在陆地棉抗旱和耐盐性中的应用 - Google Patents

陆地棉GhANN4基因在陆地棉抗旱和耐盐性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了陆地棉GhANN4基因在陆地棉抗旱和耐盐性中的应用，属于基因工程技术领域。GhANN4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了GhANN4基因在提高陆地棉抗旱性和耐盐性中的应用。本发明发现GhANN4基因在盐和干旱胁迫中显著表达，在陆地棉中沉默GhANN4基因，经干旱和盐胁迫处理后，发现GhANN4基因沉默引起陆地棉叶片萎蔫、抗氧化酶活性降低、MDA含量增加和逆境胁迫相关基因表达下降，即沉默GhANN4基因减弱棉花的抗旱性和耐盐性，证明GhANN4基因正向调控陆地棉响应干旱和盐胁迫。本发明为陆地棉应对非生物胁迫提供重要基因资源。

Description

陆地棉GhANN4基因在陆地棉抗旱和耐盐性中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及陆地棉GhANN4基因在陆地棉抗旱和耐盐性中的应用。
背景技术
棉花(Gossypium spp.)是世界上最重要的商业作物之一，也是纺织业天然纤维的重要来源。其中陆地棉(Gossypium hirsutum L.)作为棉花作物的栽培种之一，占全球棉花年产量的95％，具有广泛的应用前景。棉花种植和生产主要在干旱和半干旱地区进行，与水稻、小麦和玉米相比，棉花表现出更高的耐旱性。但是，水分和盐碱限制仍然会对棉花纤维产量和皮棉质量产生很大影响，是世界范围内影响棉花生产的主要非生物因素。尽管多年来，棉花育种者的主要目标一直是提高生产率和纤维质量，但气候因素的变化和极端天气频率事件，如干旱和盐碱对棉花生产构成了重大威胁。
Annexin基因家族属于多基因蛋白家族，其成员普遍存在于植物中，在植物生长发育和响应逆境胁迫中发挥重要作用，然而至今未见关于棉花Annexin家族成员中抗旱、耐盐基因资源的挖掘及筛选利用。
发明内容
本发明的目的是提供陆地棉GhANN4基因在陆地棉抗旱和耐盐性中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，陆地棉GhANN4基因正向调控棉花响应干旱和盐胁迫，在陆地棉中上调表达GhANN4基因可提高其抗旱性和耐盐性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种陆地棉GhANN4基因在调控陆地棉抗旱和/或耐盐性中的应用，所述陆地棉GhANN4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种陆地棉GhANN4基因编码的蛋白在调控陆地棉抗旱和/或耐盐性中的应用，所述陆地棉GhANN4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种重组载体在调控陆地棉抗旱和/或耐盐性中的应用，所述重组载体包括上述的陆地棉GhANN4基因。
本发明还提供了一种重组菌在调控陆地棉抗旱和/或耐盐性中的应用，所述重组菌包括上述的重组载体。
进一步地，通过在陆地棉中上调所述陆地棉GhANN4基因的表达水平，以提高所述陆地棉抗旱和/或耐盐性。
本发明还提供一种提高陆地棉抗旱和/或耐盐性的方法，包括在陆地棉中上调所述陆地棉GhANN4基因的表达水平的步骤。
进一步地，所述在陆地棉中上调所述陆地棉GhANN4基因的表达水平包括以下步骤：将上述的陆地棉基因或上述的重组载体或上述的重组菌导入陆地棉植株中。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用基因家族分析挖掘与生长发育相关的候选基因，发现GhANN4基因在棉花非生物胁迫中发挥重要作用。为了进一步明确GhANN4基因在非生物胁迫中的调控机制，将目的基因进行克隆，构建目的基因的VIGS沉默载体，研究其非生物学功能，结果发现，干旱或盐胁迫处理后，GhANN4基因沉默导致陆地棉的叶片萎蔫更明显，叶片内抗氧化酶(CAT、POD和SOD)活性降低，MDA含量增加，还导致沉默植株逆境胁迫相关基因的表达水平降低。说明沉默GhANN4基因削弱陆地棉的抗旱性和耐盐性，以此证实GhANN4基因正向调控陆地棉响应干旱和盐胁迫，为陆地棉应对非生物胁迫提供重要基因资源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pEASY-T5Zero载体的图谱和TRV载体的图谱；
图2为目的基因PCR扩增、沉默载体构建体菌液PCR和双酶切结果；A:目的基因PCR扩增结果；B:目的基因VIGS片段与沉默载体构建体菌液PCR扩增结果；C:目的基因与沉默载体构建体双酶切为目的基因菌液的PCR检测结果；其中，Marker：DNA分子量标准Marker2000(bp)；1-4：GhANN4-1,2,3,4；1-3：GhANN4-1,2,3；
图3为TRV:GhCLA阳性对照表型；
图4为TRV:GhANN4植株中目的基因沉默效率检测结果；
图5为TRV:00和TRV:GhANN4干旱和盐胁迫下陆地棉植株的表型分析；其中，CK：无胁迫对照组；PEG胁迫：干旱胁迫；NaCl胁迫：盐胁迫；
图6为目的基因沉默植株抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性和MDA含量检测；A：干旱胁迫下指标；B：盐胁迫下指标；
图7为沉默植株中逆境胁迫相关基因表达情况；A：干旱胁迫相关基因表达；B：盐胁迫相关基因表达；
图8为陆地棉GhANN4克隆产物测序图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1陆地棉GhANN4基因在陆地棉抗旱和耐盐性中的应用
1.实验材料与试剂
1.1实验材料
本发明所用材料为陆地棉品种新石K18，种子由石河子农业科学研究院提供。
1.2实验试剂
本发明所用试剂见表1：
表1实验所用试剂
1.3菌株与载体
GV3101农杆菌感受态细胞和pEASY-T5Zero克隆载体(CT501-01，含DH5α大肠杆菌感受态细胞)分别购买自上海唯地生物技术有限公司和全式金生物科技有限公司，用于基因沉默的VIGS载体***(包括TRV1、TRV2和TRV-GhCLA)由中国农业科学院棉花研究所转基因课题组馈赠，pEASY-T5 Zero载体图谱如图1所示。
1.4培养基和溶液配制
a.培养基的配方见表2：
表2培养基配方
注：培养基需在121℃灭菌20min
b.100mL 50×TAE缓冲液：24.2g Tris+3.72gNa2EDTA·2H2O+5.71mL冰乙酸；
c.50mg/mL利福平(Rif)和20mg/mL乙酰丁香酮(AS)：将5g Rif粉末和2gAS粉末分别溶于100mLDMSO溶液中，分别用0.22μm的滤膜过滤除菌，封装，-20℃保存；
d.0.5M吗啉乙磺酸(MES)：将10.65g MES粉末溶于50mL ddH2O中，用NaOH将pH值调至5.6，之后定容至100mL，用0.22μm的滤膜过滤除菌，封装，4℃保存；
e.1M MgCl2：用100mL ddH2O溶解9.521g MgCl2粉末(放大量热)，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存；
f.500mL重悬液：10mL 0.5M MES+1mL 20mg/mLAS+5mL 1M MgCl2，无菌ddH2O补足至500mL。
1.5主要仪器
可见分光光度计、高速冷冻离心机、水浴锅、电泳仪、人工气候箱、切胶仪、超低温冰箱、荧光定量仪、梯度PCR仪、灭菌锅、电子天平、微波炉、台式恒温摇床、制冰机、超净工作台、生化培养箱、超微量分光光度计、超纯水仪器和迷你漩涡混匀仪。
2.试验方法
2.1引物设计
利用NCBIPrimer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计GhANN4基因(SEQ ID NO.1)的克隆引物、qRT-PCR引物、VIGS沉默引物(VIGS沉默引物产物片段大小为300～500bp)，引物序列如表3所示：
表3本发明所用的引物列表
注：表中下划线所示碱基片段为酶切位点。
2.2RNA的提取和反转录
2.2.1RNA提取
根据多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441，天根)说明书提取RNA。
2.2.2反转录
a.将分装的RNA从-80℃冰箱取出并在冰上融化，在-20℃冰箱中取出5×FastKing-RT SuperMix试剂和RNase-Free ddH2O在冰上融化，轻摇混匀；
b.反应体系见表4：
表4反转录反应体系
c.反应程序见表5：
表5反应程序
d.反应完成后，检测cDNA的纯度及浓度，分装，-20℃保存。
2.3目的片段的扩增与克隆载体的连接和转化
2.3.1目的片段的扩增
以新石K18的cDNA为模板，利用Taq 2×PCRMix with Dye V2预混液(含染料)试剂盒进行目的基因的扩增，扩增体系如表6：
表6扩增体系
根据上述体系加完反应液后，轻摇混匀，短暂离心，按照表7反应程序进行反应：
表7扩增反应程序
反应结束后，用1.8％的琼脂糖凝胶电泳检测其目的基因的大小是否与预期的一致。结果显示扩增产物的序列(SEQ ID NO.2)与预期大小一致。
陆地棉GhANN4基因全长，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
ATGGCCACTCTTACAGTGCCCACGACAGTTCCTTCAGTGTCTGAAGATTGTGAACAACTAAGAAAAGCCTTTTCAGGATGGGGAACTAATGAGGGCTTAATCATAGATATATTGGGTCACAGAAATGCGGAGCAACGAAACTTGATTCGAAAAACCTACGCTGAAACCTATGGAGAGGATCTCCTCAAGGCACTAGACAAGGAACTCTCGAATGACTTTGAGAGGCTGGTTCTGCTTTGGGCTCTTGATCCTGCTGAACGTGATGCCCTTTTGGCTAATGAAGCCACCAAAAGGTGGACTTCAAGCAATCAAGTCCTTATGGAAATAGCCTGCACAAGGTCTGCCAACCAACTGCTTCACGCAAGGCAGGCTTATCATGCTCGTTATAAGAAGTCGCTTGAAGAGGACGTTGCTCATCACACGACTGGGGACTTCCATAAGCTCCTCCTACCTCTAGTGAGTTCATACAGATATGAGGGAGAGGAGGTGAACATGACTCTGGCAAAAACAGAGGCGAAGTTGCTTCATGAGAAAATTTCAAACAAAGCTTACAGTGATGACGATGTCATAAGGGTTTTGGCTACAAGAAGCAAGGCACAGATCAATGCAACTCTGAATCACTACAAAAATGAATATGGAAATGACATAAACAAGGACTTGAAGGCTGACCCTAAGGATGAGTTCCTTGCACTACTAAGGTCCACAGTGAAGTGCTTGGTCTATCCGGAAAAGTATTTTGAGAAGGTTCTTCGCCTAGCAATCAATAGACGAGGAACGGATGAAGGAGCTCTTACAAGAGTTGTTTGCACTAGGGCTGAGGTGGATCTAAAGATCATAGCAGATGAGTATCAGCGAAGGAACAGTGTCCCACTGACTCGTGCCATTGTCAAGGACACTCATGGAGACTATGAAAAATTGCTGCTGGTACTTGCAGGACATGTGGAGAATTGA；
克隆获得GhANN4的基因序列沉默片段(SEQ ID NO.2)。
SEQ ID NO.2：
CGGAATTCCACAGAAATGCGGAGCAACGAAACTTGATTCGAAAAACCTACGCTGAAACCTATGGAGAGGATCTCCTCAAGGCACTAGACAAGGAACTCTCGAATGACTTTGAGAGGCTGGTTCTGCTTTGGGCTCTTGATCCTGCTGAACGTGATGCCCTTTTGGCTAATGAAGCCACCAAAAGGTGGACTTCAAGCAATCAAGTCCTTATGGAAATAGCCTGCACAAGGTCTGCCAACCAACTGCTTCACGCAAGGCAGGCTTATCATGCTCGTTATAAGAAGTCGCTTGAAGAGGACGTTGCTCATCACACGACTGGGGGTACCCC。
2.3.2目的基因与克隆载体pEASY-T5Zero的连接
a.从-80℃冰箱中取出pEASY-T5Zero载体后，在冰上融化。
b.计算所加目的片段的体积(载体与目的片段的摩尔比＝1:5)，向无菌的1.5mL离心管中加入以下成分(整个操作在冰上完成)：
表8连接体系
c.将其轻摇混匀，短暂离心后，25℃连接5分钟。
2.3.3转化DH5α大肠杆菌感受态细胞
采用热激法转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，以目的基因序列引物进行菌液PCR验证并测序(由上海生工生物工程有限公司完成)。
2.4沉默载体的构建
将“2.3.3转化DH5α大肠杆菌感受态细胞”中测序成功的阳性质粒为模板，通过添加了限制性酶EcoR I和Kpn I酶切位点和保护碱基的引物进行沉默片段扩增，并通过双酶切的方法将GhANN4的片段***到TRV2沉默载体中，构建TRV2:GhANN4沉默载体，具体酶切体系如下：37℃，3h后加10×Loading Buffer停止反应，胶回收目的基因片段PCR产物，载体回收酶切大片段，将目的片段与沉默载体连接，将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，进行菌液PCR和双酶切鉴定，完成后将阳性质粒测序(上海生工)，将其转入农杆菌GV3101感受态中，操作步骤如下：
a.将GV3101感受态细胞从-80℃超低温冰箱取出，在冰上解冻，分装成两管，吸取2μL测序成功的质粒，加入离心管中，进行转化。
b.完成上述步骤后，加入350μL的LB液体培养基(未加抗生素)，振荡培养2h(28℃，200rpm)，将菌液均匀的涂布在固体培养基中(添加Kan+和Rif抗生素)，在黑暗，28℃条件下，培养2天。
c.培养完成后，将单菌落挑至5mL LB液体培养基中(添加Kan+和Rif抗生素)，按照步骤b中振荡培养的条件进行培养16h；
d.培养完成后，用50％甘油保存菌液(菌液:甘油＝1:1)，-80℃保存备用；进行菌液PCR确认载体阳性。
2.5陆地棉VIGS沉默目的基因
对新石K18幼苗进行VIGS沉默，具体方法如下：
a.种植新石K18种子，待其生长至第七天，子叶完全展开时，将其浸水，直至花盆内的营养土将水吸收至表面后，停止浸水，放置备用。
b.向LB液体培养基中加入Kan+和Rif备用，其中Kan+和Rif的终浓度分别为50μg/mL和25μg/mL。将从-80℃取出的VIGS载体***和目的基因菌液在冰上融化，28℃，200rpm活化16h(菌液:LB液体培养基＝1:10)。活化完成后，按同样比例进行扩繁。
c.菌液扩繁完成后，以5000rpm的转速，离心10min，倒掉上清液，保留菌体，并利用分光光度计用重悬液使菌体悬浮，调整OD600为0.8。
d.重悬完成后，黑暗放置3h，使菌体复苏后，将TRV1分别与含TRV2:00(空白对照组)、TRV2:GhCLA(阳性对照)、TRV2:GhANN4(实验组)的菌体重悬液1:1混合，并将其充分混匀。
e.在陆地棉幼苗生长的第七天，将其按照步骤a的方法浸水。在陆地棉幼苗生长的第八天对其进行VIGS注射，具体操作为：将子叶背面使用1mL注射器针头划口(注意伤口不过大，针尖般大小即可)，将步骤d的混合菌液注射到陆地棉子叶中，尽可能使菌液充满整个子叶。
f.注射完成后，为了达到更好的侵染效果，使用塑料袋将其包裹，25℃黑暗放置24h后，在正常生长条件下培养。
2.6沉默植株的鉴定
待阳性对照陆地棉幼苗出现白化后，采取实验组及空白组的陆地棉幼叶进行荧光定量实验，检测其沉默效率。
2.7目的基因沉默棉花植株的干旱和盐胁迫处理
待注射过的阳性棉花幼苗出现白化后，将空白对照和实验组生长至四周龄的棉花幼苗分别用400mmol/LNaCl和15％PEG进行盐和干旱胁迫处理，进行表型观察。
2.8目的基因沉默棉花叶片生理指标测定
按照常规方法分别检测空白对照组和实验组棉花叶片的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性、MDA含量，以分析目的基因沉默植株对干旱和盐胁迫的反应。
2.9目的基因沉默棉花植株中逆境胁迫相关基因的荧光定量检测
在胁迫处理前后，采摘基因沉默株系的幼叶，通过根据RNAprep pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(货号DP441，购自天根生化科技有限公司)提取RNA，并通过FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂盒(货号KR118，购自天根生化科技有限公司)进行反转录，最后通过SuperReal荧光定量预混试剂增强版试剂盒(货号FP205，购自天根生化科技有限公司)进行胁迫相关基因的表达水平检测，具体方法参照说明书。
其中干旱胁迫处理中，TRV:GhANN4沉默植株检测的胁迫相关基因为GhCBL3、GhDREB2A、GhDREB2C、GhPP2C、GhRD20-2和GhRD29A。
盐胁迫处理中，TRV:GhANN4沉默植株检测的胁迫相关基因为GhCIPK6、GhNHX1、GhRD20-1、GhSOS1、GhSOS2和GhSNRK2.6。
3.结果与分析
3.1目的基因片段的扩增与沉默载体的构建
用NCBI的blast-primer设计引物，以新石K18的cDNA为模板，使用艾伯泰科的Taq2XPCRMix with Dye V2酶进行目的片段的扩增，使用通用型DNA纯化回收试剂盒(天根)回收目的片段。将回收的目的片段与pEASY-T5 Zero载体(如图1所示)连接进行筛选，提质粒。通过双酶切的方法将目的片段(图2中A)与TRV156载体连接并培养，通过菌液PCR(图2中B)、双酶切(图2中C)和测序(图8)方法得到阳性质粒。根据测序可得连接到该载体上的目的片段并未发生碱基的缺失和替换，因此测序成功。将阳性质粒用冻融法转化到农杆菌进行培养。
3.2目的基因的沉默效率检测及表型分析
基于基因家族数据分析，筛选出陆地棉生长发育的候选基因。因此利用VIGS技术研究目的基因在陆地棉抗干旱和盐胁迫调控中的作用。本发明选择基因GhANN4进行VIGS试验。通过在子叶下表皮注射的方法，沉默陆地棉新石K18中的目的基因，发现在感染后的第8天，阳性对照(TRV:GhCLA)植株开始白化，沉默后的第12天，阳性对照白化明显，说明农杆菌感染陆地棉成功(如图3所示)。对目的基因的沉默效率检测发现，与对照组相比，TRV:GhANN4植株中GhANN4的表达明显受到抑制(如图4所示)。通过VIGS沉默植株和对照植株的表达量分析，说明目的基因已被沉默。
3.3干旱和盐胁迫对目的基因沉默植株的表型分析
挑选四周龄的VIGS沉默株系，包括目标基因沉默TRV:GhANN4和对照组TRV:00植株进行干旱和盐胁迫处理。结果如图5所示，15％PEG和400mmol/LNaCl处理35天后，处理组植株子叶已完全脱落，真叶出现萎蔫和黄化，并发现TRV:GhANN4沉默植株相比TRV:00株系真叶严重失水，黄化和萎蔫也更严重，说明GhANN4基因参与陆地棉抗旱耐盐反应。
3.4干旱和盐胁迫对目的基因沉默棉花叶片抗氧化酶活性的影响
对沉默植株的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性进行检测，如图6所示，在干旱胁迫30天后，GhANN4沉默植株的CAT、SOD和POD活性较未处理时均表现出不同程度的下降。在盐胁迫30天后，GhANN4沉默植株的SOD和POD活性较未处理时均表现出不同程度的下降。
3.5干旱和盐胁迫对目的基因沉默棉花叶片MDA含量的影响
对胁迫后的GhANN4基因沉默植株和空载体植株进行MDA含量检测分析发现(如图6所示)，干旱胁迫下的GhANN4沉默植株较未处理时的MDA含量显著升高，说明GhANN4基因的沉默造成棉花抗性降低。
3.6干旱和盐胁迫对目的基因沉默棉花逆境胁迫相关基因表达的影响
与对照植株相比，在干旱胁迫处理前后TRV:GhANN4植株的胁迫相关基因的表达均发生了显著变化。
如图7中A所示，与TRV:00相比，在处理前和处理后，沉默植株TRV:GhANN4中GhCBL3、GhDREB2A、GhDREB2C、GhPP2C表达量均显著低于对照植株。处理前，沉默植株TRV:GhANN4中GhRD20-2的表达量高于对照植株，但是干旱胁迫处理后，GhRD20-2的表达量显著低于对照植株。在处理前和处理后，沉默植株TRV:GhANN4中GhRD29A表达量均高于对照植株。
与对照植株相比，在盐胁迫处理前后TRV:GhANN4植株的胁迫相关基因的表达均发生了显著变化。
如图7中B所示，与TRV:00相比，在处理前和处理后，沉默植株TRV:GhANN4中GhCIPK6、GhRD20-1表达量均显著低于对照植株。处理前，沉默植株TRV:GhANN4中GhSOS1的表达量高于对照植株，但是盐胁迫处理后，GhSOS1的表达量显著低于对照植株。GhNHX1、GhSOS2和GhSNRK2.6的表达在对照植株中显著上调，而在盐胁迫处理后的沉默植株中则显著下调。
结果表明，GhANN4可能对棉花应对干旱和盐胁迫有正向调节作用。
综上所述，通过VIGS沉默GhANN4的陆地棉相比于对照组对干旱和盐胁迫更为敏感，说明棉花抗旱性和耐盐性降低，因此证明GhANN4基因正向调控棉花响应干旱和盐胁迫，在陆地棉中过表达GhANN4基因可以增强陆地棉的抗旱性和耐盐性。本发明为陆地棉对非生物胁迫的高抗逆性育种提供重要基因资源。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种陆地棉GhANN4基因在调控陆地棉抗旱和/或耐盐性中的应用，其特征在于，所述陆地棉GhANN4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种陆地棉GhANN4基因编码的蛋白在调控陆地棉抗旱和/或耐盐性中的应用，其特征在于，所述陆地棉GhANN4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.一种重组载体在调控陆地棉抗旱和/或耐盐性中的应用，其特征在于，所述重组载体包括权利要求1中所述的陆地棉GhANN4基因。
4.一种重组菌在调控陆地棉抗旱和/或耐盐性中的应用，其特征在于，所述重组菌包括权利要求3中所述的重组载体。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，通过在陆地棉中上调所述陆地棉GhANN4基因的表达水平，以提高所述陆地棉抗旱和/或耐盐性。
6.一种提高陆地棉抗旱和/或耐盐性的方法，其特征在于，包括在陆地棉中上调所述陆地棉GhANN4基因的表达水平的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述在陆地棉中上调所述陆地棉GhANN4基因的表达水平的方法，包括以下步骤：将权利要求1中所述的陆地棉基因或权利要求3中所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌导入陆地棉植株中。
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