CN1180083C - 细胞色素c和它的基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在原核或真核寄主细胞中表达时编码至少具有细胞色素c551的部分一级结构和一个生物特性的多肽的DNA序列的DNA序列，由所述的DNA序列编码的多肽，含有这样的DNA序列的表达载体，这样的载体转化的宿主细胞，利用这样的宿主细胞生产的方法和利用这样的细胞色素c生产维生素C。

Description

细胞色素c和它的基因
本发明涉及蛋白质领域。更具体地说，本发明涉及属于具有电子受体功能的蛋白质家族的新的细胞色素c。
已知细胞色素c是为了完成伴随着将分子氧还原成水的底物的氧化在起始的脱氢酶和最终的氧化酶之间介导电子传递的基本成份之一。这一电子传递反应的基础是血红素铁的氧化还原。最近有人作出尝试，利用细胞色素c的电子传递反应作为模仿生物材料或元件的新物质，命名为生物芯片；如利用嗜热氢杆菌的细胞色素c552(Kodama等，美国专利No.5459046)。包括葡糖杆菌和醋杆菌的醋酸细菌具有高效的糖和糖醇氧化能力并且在工业上用于生产用作维生素C生产的中间物质的醋和L-山梨糖。对于氧化发酵，细胞色素c对完成氧化起了重要的作用。已经从许多生物体包括葡糖杆菌中纯化和鉴定了细胞色素c蛋白，如Matsushita等报道了从弱氧化葡糖杆菌中纯化结合CO的细胞色素c553(CO)(分子量48千道尔顿)(FEMS Microbiol.Lett.，10：267-270，1981)和后来发现细胞色素c553(CO)相同于葡糖杆菌的乙醇脱氢酶的第二个亚单位。如生物工程发酵杂志，74，209-213，1992(Y.Takeda等)公开的，在乙醇脱氢酶第二亚单位缺陷的葡糖杆菌中细胞色素c553(CO)的扩增以特定的速度(每克细胞每小时产生的克产物)稍微改进了D-山梨醇到L-山梨糖的生产。除了细胞色素c553，从葡糖杆菌中还分离了细胞色素c551(AL)(分子量55千道尔顿)和细胞色素c551(CO)(分子量72千道尔顿)(Ameyama等，农业生物化学51，2943-2950(1987))。
本发明的一个目的是提供属于具有电子受体功能的蛋白质家族的新的细胞色素c。更具体地说，本发明的新的细胞色素c可用作脱氢酶如乙醇和醛的脱氢酶的电子受体。
本发明还涉及本发明所述的多肽的功能衍生物。这些功能衍生物的定义是以本发明的氨基酸序列为基因，在所述序列中增加，***，缺失和/或替代一个或更多的氨基酸残基，采用本领域已知或本文特别叙述的检测方法测定这些衍生物仍然具有细胞色素c活性。通过本领域已知的化学肽合成方法或如本文公开的本领域中已知的方法和如Sambrook等(分子克隆，冷泉港实验室出版，纽约，美国，第二版1989)公开的基于DNA序列的重组手段可以制造这些功能衍生物。通常不改变所述分子活性的蛋白质和肽中的氨基酸的交换在本领域内是已知的，并例如由H.Neurath和R.L.Hill在“蛋白质”(学术出版社，纽约，1979，参见图6，第14页)中的描述。最普遍存在的交换是：Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Thy/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly以及这些的相反交换。
另外，本发明涉及包括如序列表中公开的编码至少具有细胞色素c551的部分一级结构和一种生物特性的在原核或真核寄主细胞中表达的多肽的DNA序列以及它们的互补链，或包括这些序列的那些DNA序列，与这些序列或其片段优选地在标准条件下杂交的DNA序列和由于基因密码的简并性，在标准条件下与这些序列不杂交但编码具有精确地相同的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
在本文中，杂交的“标准条件”意指本领域技术人员通常用于检测特异的杂交信号并在Sambrook等，“分子克隆”第二版(冷泉港实验室出版1989，纽约)中叙述的条件，或优选地称谓严谨杂交和不严谨洗涤条件，或更优选地所谓温和严谨条件或更优选地称谓严谨杂交和严谨洗涤条件，如本领域技术人员熟悉的并在Sambrook等(如上所述)中叙述的。
本发明的另一个目的是提供如上指出的进一步包括编码具有醇/醛脱氢酶活性的多肽的DNA序列的DNA序列，如实施例6中所述，可以制备这样的构建体。
本发明的另一个目的是提供具有细胞色素c活性并由上面定义的DNA序列编码的多肽，或具有细胞色素c活性、可从属于葡糖杆菌属的微生物中得到或已得到、选自分别显示下面的物理化学特性的细胞色素c551I和II的多肽：
(a)细胞色素c551I：
(a)分子量：凝胶过滤分析约为19±1千道尔顿，SDS-PAGE分析约为18.0±1.0千道尔顿；
(b)吸收光谱：其还原形式在551nm，522nm和417nm处显示最大吸收，分别作为α，β和γ峰；
(c)血红素含量：约1摩尔血红素/摩尔蛋白质；
(d)等电点：约3.95；
和
(b)细胞色素c551II：
(a)分子量：凝胶过滤测得约19±1千道尔顿，和SDS-PAGE分析约为16.8±1.0千道尔顿；
(b)吸收光谱：其还原形式在551nm，522nm和417nm处显示最大吸收，分别作为α，β和γ峰；
(c)血红素含量：约1摩尔血红素/摩尔蛋白质；
(d)等电点：约3.75。
本发明的另一个目的是提供如上定义的进一步包括编码具有醇/醛脱氢酶活性的多肽的DNA序列的DNA序列。
本发明的另一个目的是提供适于原核或真核宿主细胞中表达的含有如上定义的DNA序列的载体和已经用所述载体转化的宿主细胞，更具体地说其中已经将如上定义的DNA序列整合进基因组的所述宿主细胞，此外是真核起源并优选地是哺乳动物或植物细胞的宿主细胞或是原核起源的，特别是当选自包括细菌如大肠杆菌，恶臭假单胞菌，木醋杆菌，巴氏醋杆菌，醋化醋杆菌，汉氏醋杆菌，和弱氧化葡糖杆菌，如弱氧化葡糖杆菌DSMNo.4025组的寄主细胞中表达的载体。
另外本发明的目的是提供生产细胞色素c551的方法，该方法包括在适当的培养基中培养如上定义的宿主细胞和从培养物中回收细胞色素c551。
在体内和体外存在醇和醛脱氢酶时本发明的细胞色素c也用于提高从L-山梨糖或D-山梨醇生产2KGA和进一步从相应的底物生产醛，羧酸和酮。
化合物2KGA是在抗坏血酸(维生素C)的生产中根据已知的Reichstein方法可以转化成抗坏血酸的重要中间产物。通过发酵从L-山梨糖或从D-山梨醇生产2KGA是已知的。如农业生物化学，54(5)，1211-1218，1990(T.Hoshino等)和欧洲专利公开No.606621中公开的，借助于山梨糖和山梨醇脱氢酶催化的反应，已知葡糖杆菌菌株可生产2KGA。
所以利用本发明的细胞色素c生产维生素C也是本发明的一个目的。
在更详细地叙述本发明之前，下面给出了附图的简要说明：
图1显示了细胞色素c551I和II的吸收光谱。每个样品的蛋白质浓度各是0.4毫克/毫升。连续的和断裂的线分别是还原和氧化形式的光谱。
图2显示了从天然的细胞色素c551II分离的肽和合成的低聚核苷酸的序列。
图3显示了携带具有细胞色素c551基因的质粒的GOS2R的Western影印分析。
图4显示了用于表达醇/醛脱氢酶(AADH)-细胞色素c551共轭物的质粒的制备，它是在C末端具有类似细胞色素c的序列的醋化醋杆菌的乙醇脱氢酶(ADH)的模仿过程中构建的。*1将ADH的脱氢酶区和细胞色素区之间的序列(对应于成熟的ADH的氨基酸582到595的PALNNRGFLPVKPP)用作连接AADH区和细胞色素c551区的接头。*2导入限制性位点Nhe I和Bam HI连接这三部分(AADH，接头，和细胞色素c551)。
在更详细地说明本发明之前，在下面给出了包括可从氧化葡糖杆菌得到的纯化的细胞色素c551的异构体I和II的物理化学特性。
(1)分子量
在凝胶过滤纯化步骤中，细胞色素c551I和II显示了约19+/-1千道尔顿的表观分子量。和，SDS-PAGE分析显示了细胞色素c551I和II的分子量分别为18.0+/-1.0和16.8+/-1.0千道尔顿。所以，存在两种显示接近分子量的细胞色素c551的制剂并且细胞色素c551I和II都是单体蛋白质。
(2)吸收光谱和血红素含量
图1显示了通过添加连二硫酸钠完全还原的细胞色素c551I和II的吸收光谱。两个细胞色素c551I和II的光谱是难于互相区分的。还原的细胞色素分别在作为α，β和γ峰的551nm，522nm和417nm处显示最大吸收。并且氧化的细胞色素在作为γ峰的411nm处显示最大吸收。通过Drabkin(生物化学杂志146：605，1942)的吡啶血红素方法确定了细胞色素c551I和II的血红素含量约为1摩尔/摩尔单体血红素蛋白质。
(3)等电点
通过LKB(Stockholm，瑞典)等电点电泳***确定细胞色素c551I和II的等电点(pI)分别为3.95和3.75。
(4)细胞色素c551I和II的肽图谱比较
用V8蛋白酶或嗜热菌蛋白酶在同样的条件下消化细胞色素c551I和II，并通过反相HPLC分析比较肽片段图谱。细胞色素c551I和II的主要肽片段图谱(约30个肽片段峰)是相同的，另外分别在细胞色素c551I和II处观察到少数小肽片段峰。结果表明了在细胞色素c551I和II之间有强烈的氨基酸序列的同源性。
(5)细胞色素c551II的氨基酸序列
经过未知的修饰封闭了细胞色素c551I和II的N末端的氨基酸。所以根据肽片段确定了内部的氨基酸序列。除了V8蛋白酶和嗜热菌蛋白酶消化的肽片段，用赖氨酰-肽链内切酶消化细胞色素c551II(除去血红素和S-羧基甲基化的)制造出其它肽片段。用得到的几个肽片段测定了下列内部氨基酸序列：
No.1(序列表SEQ ID No.3)：
AlaAspThrAlaAlaThrGluGluAlaProAlaAlaAlaAlaGlyAlaAlaThrSerIleTy
rAspGlyValTyrThrAlaAlaGlnAlaGluAlaGlyGlnAlaAlaTrpMetThrSerXa
aAlaSerXaaHisGlyProThrAlaArgGlySer，
No.2(序列表SEQ ID No.4)：
GlyProArgValIleGlyProValIleAsnAsnLysTyrAlaAspLysProLeuLeuAspT
yrPheAsnTyrThrArgAspAsnMetProMetGlyAlaProHisSerLeuSerAspAsp
ThrTyrValGlu，
No.3(序列表SEQ ID No.5)：
IleLeuGlnSerHisGlyAlaGluProGlyGluThrGlu。
通过培养适当的微生物，破碎细胞和从破碎细胞的无细胞提取液，优选地从微生物的可溶部分分离和纯化来制备本发明提供的细胞色素c。
在本发明中用于分离本发明的细胞色素c的微生物优选地属于能够生产细胞色素c的葡糖杆菌属。所述微生物的功能等同物、继代培养物、突变体和变异体也可以用于本发明。优选的菌株是氧化葡糖杆菌。特定的和优选的氧化葡糖杆菌菌株已经于1987年3月17日保藏于Gottingen(德国)的德国微生物收集处(Deutsche Sammlung Von Mikroorganisen)，保藏号DSM No.4025。另外，该菌株的继代培养物也已经根据布达佩斯条约的规定保藏于日本工业科学和技术部，发酵研究院(Ageney of IndustrialScience and technology，Fementation Research Institute)，保藏号：Gluconobacter oxydans DSM No.4025 FERM BP-3812(保藏日期：1992年3月30日)。另外，欧洲专利公开0278 477公开了这一菌株的特征。
在好气条件下，在用适当的营养补充的含水培养基中可以培养该微生物。培养可以在约4.0和9.0之间，优选地约6.0和8.0之间的pH中进行。根据pH，温度和所用的营养培养基，培养期可以变化，通常2-6天产生满意的结果。进行培养的优选的温度范围是约13℃-36℃，优选地是约18℃-33℃。
通常需要培养基含有营养素如可同化的碳源、可消化的氮源和无机物质、维生素、痕量元素和其它生长促进因子。作为可同化的碳源，可以利用甘油，D-葡萄糖，D-甘露糖，D-果糖，D-***糖，L-山梨糖，D-山梨醇和诸如此类。
也可以利用各种有机或无机物质作为氮源，如酵母提取物，肉提取物，蛋白胨，酪蛋白，玉米浸出液，脲，氨基酸，硝酸盐，铵盐和诸如此类。作为无机物质，可以利用硫酸镁，磷酸钾，氯化铁和亚铁，碳酸钙和诸如此类。
在下面，叙述了在培养后从该微生物分离和纯化细胞色素c和其基因/DNA序列的克隆的实施方案。
(1)通过离心或过滤从发酵液中收获细胞。
(2)在缓冲液中悬浮细胞并通过匀浆器、超声仪或用溶菌酶处理等破碎细胞，得到细胞的裂解溶液。
(3)通过常用的蛋白质纯化方法如硫酸铵沉淀、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析从破碎的细胞的无细胞提取液，优选地从该微生物的可溶部分分离和纯化细胞色素c。
本发明提供的细胞色素c可用作属于脱氢酶的酶的电子受体，用于从乙醇和醛生产醛、羧酸和酮，特别是用于通过L-山梨糖酮从L-山梨糖或D-山梨醇生产2-KGA。
简要地说，通过下列步骤可以得到用于本发明的细胞色素c基因，DNA序列，重组表达载体和也称为转化的宿主细胞的重组生物体：
(1)从提供接受来自脱氢酶的电子的细胞色素c的微生物分离染色体DNA和在大肠杆菌中用染色体DNA构建基因文库。
(2)通过菌落、噬菌斑、或Southern杂交、PCR(聚合酶链式反应)克隆、Western-影印分析和诸如此类从染色体DNA克隆细胞色素c基因。
(3)通过常用方法确定如上得到的细胞色素c基因的核苷酸序列以便选择含有细胞色素c基因的DNA分子并构建可以有效地表达细胞色素c基因的重组表达载体。
(4)通过转化、转导、转导接合和电穿孔构建携带细胞色素c基因的重组微生物。
如下详细地举例说明了用于本发明以上方面的材料和技术：
通过本领域已知的程序可以纯化总染色体DNA。从总染色体DNA通过下列方法将编码细胞色素c的基因克隆进质粒或噬菌体载体：
(i)通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，从凝胶上分离整个蛋白质或通过肽酶处理得到的肽片段，并将它们用于蛋白质测序仪如AppliedBiosystems自动气相序列仪470A(Perkin Elmer公司，
Norwalk，Conn.，USA)从纯化的细胞色素c确定部分氨基酸序列，根据上面得到的氨基酸序列，用DNA合成仪如Applied Biosystems自动DNA测序仪381A(Perkin Elmer)合成低聚核苷酸探针，用低聚核苷酸探针通过Southern-、菌落-或噬菌斑-杂交从携带目的基因的菌株的基因文库中分离携带目的基因的克隆；(ii)通过免疫学方法，用抗细胞色素c的抗体从基因文库中筛选表达细胞色素c的克隆；或(iii)通过PCR方法用根据上面测定的氨基酸序列合成的两个低聚核苷酸从总染色体DNA中扩增该DNA并将上面得到的PCR产物作为探针，通过Southern-、菌落-、或噬菌斑-杂交从在大肠杆菌中构建的基因文库中分离携带整个细胞色素c基因的克隆。通过《酶学方法》73卷，第46页，1981中叙述的方法可以用纯化的细胞色素c蛋白或它的肽片段制备上面提到的与所述细胞色素c反应的抗体。
利用M13噬菌体通过熟知方法如双脱氧链终止法可以测定细胞色素c基因的核苷酸序列(Sanger F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467，1977)。
为了表达细胞色素c基因或通常说的有效编码细胞色素c活性的DNA序列，可以利用各种启动子，例如，存在于所述的细胞色素c基因上游的原始启动子，抗生素抗性基因如Tn5的卡那霉素抗性基因(Berg，D.E.和C.M.Berg.1983.生物/技术1：417-435)、pBR322的氨苄青霉素抗性基因的启动子，和大肠杆菌的β-半乳糖苷酶(lac)、trp-、tac-、trc-启动子，λ-噬菌体的启动子和任何在包括细菌如大肠杆菌、恶臭假单胞菌、木醋杆菌、巴氏醋杆菌、醋化醋杆菌、汉氏醋杆菌和氧化葡糖杆菌的微生物，哺乳动物细胞和植物细胞宿主中起作用的启动子。
为了上面的目的，在编码序列上导入在宿主细胞中可操作的其它的调控元件例如Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGAGG等等，包括在宿主细胞中可操作的天然和合成的序列)和转录终止子(包括在宿主细胞中可操作的天然和合成的序列的反向重复结构)并且和上面描述的启动子一起使用。
为了表达周质多肽细胞色素c蛋白，通常含有15-50个氨基酸并完全疏水的信号肽是必需的。编码信号肽的DNA可选自宿在所需的宿主细胞中可操作的任何天然和合成序列。
各种宿主/克隆载体的结合可以用于克隆双链DNA。克隆载体通常是含有复制原点、调节元件、包括多克隆位点的克隆位点和选择标记如包括氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素、壮观霉素等等的抗性基因的抗生素抗性基因的质粒或噬菌体。
在大肠杆菌中表达目的基因的优选的载体选自通常用于大肠杆菌的任何载体，如pBR322或它的衍生物包括pUC18和pBluescript II，pACYC177和pACYC184(细菌学杂志134：1141-1156，1978)和它们的衍生物，和起源于广谱宿主范围质粒的载体如RK2和RSF1010。用于在包括弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025的葡糖杆菌和恶臭假单胞菌中表达目的基因的优选的载体选自可以在葡糖杆菌和/或恶臭假单胞菌以及优选的克隆生物体如大肠杆菌中复制的任何载体。优选的载体是广谱宿主范围的载体如粘粒载体如pVK102和它的衍生物和RSF1010和它的衍生物，和含有在葡糖杆菌中起作用的复制原点和另一个大肠杆菌中有功能的原点的载体。为了稳定和有效地表达克隆基因和有效地培养携带克隆基因的寄主细胞，应该仔细考虑载体的拷贝数和稳定性。也可以将含有转座元件如Tn5的DNA序列用作载体以便将目的基因导入优选的宿主，特别是染色体上。同时可将含有任何从优选宿主中分离的DNA和目的基因的DNA序列用于将所需的DNA序列导入优选的宿主，特别是染色体上。通过转化、转导、转接或电穿孔可以将这样的DNA序列转移到优选的宿主中。
有用的寄主是原核或真核生物起源的并可以包括微生物、哺乳动物细胞和植物细胞。作为优选的微生物，可以提到细菌如大肠杆菌、恶臭假单胞菌、木醋杆菌、巴氏醋杆菌、醋化醋杆菌、汉氏醋杆菌、弱氧化葡糖杆菌、和任何革兰氏阴性细菌，它们能生产重组细胞色素c。所述的微生物的功能等价物、继代培养物、突变体和变异体也可以用于本发明。优选的菌株是大肠杆菌K12和它的衍生物、恶臭假单胞菌或氧化葡糖杆菌DSMNo.4025。
通过已知方法将编码本发明的细胞色素c的DNA序列连接进入含有在上述宿主细胞中可操作的调节区如启动子和核糖体结合位点和转录终止子的适当载体以便生产表达载体。
为了构建携带表达载体的寄主细胞，可以利用各种DNA转移方法，包括转化、转导、接合交配(普通和分子细菌学方法，第14和15章，PhilippGerhardt等编，美国微生物学协会，1994)和电穿孔。用构建转化宿主细胞的方法可以选自分子生物学领域已知的方法。通常的转化***可以用于大肠杆菌、假单胞菌和醋杆菌。转导***也可以用于大肠杆菌。接合交配***可以广泛地用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌、恶臭假单胞菌和氧化葡糖杆菌。PCT申请公开号WO89/06688的发明人公开了优选的接合交配方法。接合可以在液体培养基或在固体表面上进行。细胞色素c生产的优选受体选自大肠杆菌、恶臭假单胞菌和氧化葡糖杆菌。2KGA生产的优选受体选自大肠杆菌、恶臭假单胞菌和氧化葡糖杆菌，它们利用适当的重组表达载体可以生产活性AADH。2KGA生产的优选受体是弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025。对于接合交配的受体，通常加入选择性标记；例如通常选择抗萘定酸或利福平的抗性。
如下面举例说明的，可以将本发明的细胞色素c551用于蛋白质-蛋白质共轭物如AADH-细胞色素c551共轭物的来源，所述共轭物用编码AADH的DNA序列构建以改善总电子转移效力。
实施例1制备细胞色素c551I和II
除非特别说明，所有的操作在4℃进行。
(1)氧化葡糖杆菌DSM No.4025的培养
将含有8％的L-山梨糖(单独灭菌)，0.05％的甘油，0.25％的MgSO4.7H2O，1.75％的玉米浸出液，5.0％的面包酵母，0.5％的CaCO3和0.5％的脲(单独灭菌)，pH7.0的种子培养基分配到试管中(每个5毫升)。将一环量的在27℃，在含有5.0％D-甘露糖，
0.25％MgSO4.7H2O，1.75％玉米浸出液，5％面包酵母(东方酵母公司，日本，东京)，0.5％CaCO3，0.5％脲(单独灭菌)和2.0％琼脂，pH7.0(灭菌前)的NS2平板琼脂培养基上生长4天的氧化葡糖杆菌DSM No.4025的细胞接种到试管中的种子培养基中，并振摇，在30℃培养24小时。将得到的种子培养物转移到500毫升的Erlenmeyer烧瓶中的100毫升如上所述的同样的种子培养基中，并以280rpm旋转，在30℃培养24小时。将如上所述制备的各25毫升的种子培养物转移到于2000毫升锥形烧瓶中的500毫升含有10％L-山梨糖(单独灭菌)，0.05％甘油，1.6％脲(单独灭菌)，0.25％MgSO4.7H2O，6.25％面包酵母细胞，1.5％CaCO3(生产级，nacaraitesque，东京，日本)和3.0％玉米浸出液，pH7.5(灭菌前)的生产培养基中，并以180rpm旋转，在30℃培养35-40小时。在培养后，通过低速离心(500xg，15分钟)两次除去固体物质如面包酵母细胞和CaCO3。然后，通过10,000xg离心15分钟收获氧化葡糖杆菌DSM No.4025细胞。将细胞重悬浮于25mM Tris-HCl，0.9％NaCl，0.09％KCl，10mMCaCl2，5mM MgCl2，5％蔗糖和1mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)，pH8.0中，并在500xg离心细胞悬浮液15分钟以除去固体物质，然后在10,000xg离心15分钟收集细胞并储存于-20℃直到使用。
(2)制备可溶性组分
用60毫升25mMTris，5mMCaCl2，pH8.0悬浮从10升培养物得到的细胞(湿重40克)并通过French压器(1500kg/cm2)两次破碎。向溶液中加入DNase和MgCl2到终浓度分别为0.01毫克/毫升和1mM，通过在6,000xg离心10分钟除去细胞碎片。从如上所述制备的无细胞提取液(8,800毫克总蛋白质)中，通过在100,000xg超速离心90分钟分离含有细胞色素的可溶部分，并对25mMTris，5mMCaCl2，pH8.0透析。
(3)DEAE-Toyopearl 650M柱层析
将可溶部分用于已经用25mMTris，5mMCaCl2，pH8.0平衡过的DEAE-Toyopearl 650M柱(TOSOH公司，日本，东京，2.5ID.x45cm)。在用400毫升同样的缓冲液洗柱后，用2000毫升缓冲液中的0-0.5M NaCl的线性梯度进行洗脱。收集在0.13M NaCl浓度左右显示412nm减480nm差异吸收峰的深红带作为主要的细胞色素部分。
(4)丁基-Toyopearl 650S柱层析
用同样体积的25mM Tris，80％饱和(NH4)2SO4，pH8.0温和搅拌稀释主要的细胞色素部分，在10,000xg离心15分钟除去不溶物质并用于已经用25mM Tris，40％饱和(NH4)2SO4，pH8.0平衡过的丁基-Toyopearl650S(TOSOH；25ID.X20cm)。在用200毫升同样的缓冲液洗涤后，用1000毫升缓冲液中的40-0％的饱和(NH4)2SO4线性梯度进行洗脱。收集在20％饱和(NH4)2SO4浓度左右洗脱的细胞色素带并通过在N2气体下利用PM-10超滤浓缩到2.5毫升。
(5)Saphacryl S-100HR凝胶过滤
将细胞色素部分加到已经用25mM磷酸钠，0.2M NaCl，pH7.2平衡过的Sephacryl S-100HR柱上(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典；2.5ID.x90cm)。用同样的缓冲液在柱上展开，收集显示约19kDa分子量的细胞色素带。
(6)羟磷灰石柱层析
将主要的细胞色素部分在0.2mM磷酸钠/pH6.8中广泛地透析并用于已经用0.2mM磷酸钠(pH6.8)平衡过的羟磷灰石柱：HCA-100S(3.3×20cm；Mitsui Toatsu化学公司，日本，东京)。在用200毫升同样的缓冲液洗柱后，用2000毫升0.2-18mM磷酸钠(pH6.8)线性梯度进行洗脱。在该梯度洗脱过程中，细胞色素被分成两个红带并洗脱。所以，分别将较快和较迟的峰命名为细胞色素c551I和II。对25mM MOPS，0.2MNaCl/pH7.5透析每一种细胞色素，利用PM-10超滤器(Millipore公司，Bedford，马萨诸塞州，美国)，在N2气体中浓缩到2.0毫升并储存于-80℃。最后，从8800毫克总细胞蛋白中得到37.4毫克细胞色素c551I和42.6毫克细胞色素c551II。
(7)纯化细胞色素c551I和II
在羟磷灰石柱层析(最后纯化步骤)中，将每种细胞色素作为单一峰以恒定吸收比280/410nm洗脱。在SDS-和天然-PAGE分析中，当染色时每种细胞色素显示单一蛋白带或当不染色时显示可见的红带。通过SDS-PAGE分析确定细胞色素c551I和II的分子量分别为18.0+/-1.0和16.8+/-1.0千道尔顿。
(8)纯化的细胞色素c551I和II从氧化葡糖杆菌DSM No.4025的AADH接受电子的能力
重新构建了含有下面定义和纯化的蛋白质的2-KGA生产***。该***由12μM AADH(通过A.Asakura和T.Hoshino在欧洲专利申请号606621中叙述的方法从弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025中纯化)，14.4μM细胞色素c551I和II(1∶1混合)，250μM马心VI型细胞色素c(从Sigma，St.Louis，Mo，USA购买)，12.5单位/毫升的aa3型牛心细胞色素c氧化酶(从Sigma购买)和50mM含有50毫克/毫升L-山梨糖，5毫克/毫升牛血清白蛋白(组分V，从Sigma购买)和0.2M NaCl的MOPS缓冲液pH7.5组成。在2-KGA生产***中，马心VI型细胞色素c和aa3型牛心细胞色素c氧化酶利用氧还原催化细菌细胞色素c，细胞色素c551I和II的氧化还原。在25℃通过好气培养反应15小时后，积累了约8mM的2-KGA。但是，在缺乏细胞色素c551I和II时，2-KGA的积累少于0.2mM。这一依赖细胞色素c551I和II的2-KGA生产表明对AADH的2-KGA生产催化循环，细胞色素c551I和II是有效的电子受体。
             实施例2细胞色素c551基因的克隆
(1)用PCR方法扩增部分细胞色素c551基因
利用根据如图2显示的纯化细胞色素c551蛋白的氨基酸序列用Applied Biosystems 381A DNA合成仪(USA)合成的引物c1，c5，c6和它们的反义序列(c1R，c5R，c6R)进行PCR。利用GeneAmpTM DNA扩增试剂盒(Takara Shuzo，东京，日本)和Perkin-Elmer Cetus仪器热循环仪，根据供应商的指导进行PCR反应。反应包括30个循环的1)在94℃变性1分钟的步骤；2)在48或40℃退火2分钟的步骤；和3)在72℃合成3分钟的步骤。反应混合物(50微升)含有200μM的dNTP，6.4μM的各种引物(32简并性)，250纳克的弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025的染色体DNA，和2.5μ的在提供的缓冲液中的Taq聚合酶。当用32P标记PCR产物时，在反应混合物中加入0.74M Beq的[α-32P]dCTP和40μM的dCTP而不是200μM的dCTP。利用引物c5和c1R的PCR产生50碱基对的DNA，而用其它引物的组合进行的PCR没有产生或产生许多DNA带。
(2)对PCR扩增的50碱基对的DNA片段进行克隆和核苷酸测序
将PCR扩增的50碱基对的DNA片段克隆进pUC18的SmaI位点并通过二脱氧链终止法测序(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74：5463-5467，1977)。确定这一50碱基对的片段的核苷酸序列为5’-
ATCAACAACAAGTATGCTGACAAGCCGCTGCTGGACTACTTCAACTACAC-3’(序列表SEQ ID NO.6)。
从在第一个框架中的这一核苷酸序列推断的氨基酸序列
( IleAsnAsnLysTyrAlaAspLysProLeuLeu AspTyrPheAsnTyrThr)包括用于制备引物的氨基酸序列(IleAsnAsnLysTyrAla，AspTyrPheAsnTyrThr)。
(3)利用50个碱基的低聚核苷酸作为探针的弱氧化葡糖杆菌DSMNo.4025染色体DNA的Southern印迹分析
用根据前面提到的50碱基的序列信息用DNA合成仪合成并32P标记的50聚低聚核苷酸探测从用各种限制酶包括EcoRI消化的弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025染色体DNA制备的Southern印迹。探针只与2.5kb的EcoRI片段杂交。这一结果表明细胞色素c551只产自染色体DNA的一个基因。
(4)克隆2.5kb的含有完全的细胞色素c551基因的EcoRI片段
用EcoRI完全消化弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025的染色体DNA，将得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳。将2.5kb大小左右(2-3.5kb)的DNA片段切下并从凝胶上洗脱。用EcoRI消化的pUC18载体连接回收的DNA片段并转化大肠杆菌JM109。得到约1,000个转化体并用32P标记的50单体低聚核苷酸作为探针进行菌落杂交对它们进行筛选。结果，得到一个显示强烈信号的菌落。从菌落中提取质粒DNA并用EcoRI消化；它的2.5kb EcoRI片段显示强烈信号。将质粒命名为pGOC201。将2.5kb EcoRI片段也克隆进载体pVK100(Knauf，V.C.，等，质粒8：45-54，1982)，产生在相反方向含有2.5kb EcoRI片段的质粒pGOC101和pGOC101R。
(5)完整的细胞色素c551基因的核苷酸测序
通过二脱氧链终止法确定了细胞色素c551基因的核苷酸序列。对1.7kbEcoRI-SmaI片段测序，在片段中发现一个开放读码框架(存在于序列表SEQ ID No.1的显示的序列中的507碱基对的ORF)。这一ORF编码-168个氨基酸的蛋白(序列表SEQ ID No.2)，后者含有与起源于细胞色素c551消化产物肽片段的氨基酸序列(序列表SEQ ID No.3-5)一致的三个延伸物。该ORF也含有典型的信号序列；信号序列可能在ALA残基后被切割，产生25个残基的
MetLysAsnLysThrThrLeuGlyGlyAlaLeuAlaLeuAlaAlaLeuLeuAlaGlyThrThrGlyAlaLeuAla和143个残基的成熟序列。从该序列计算的成熟细胞色素c551的分子量为14,836。这一值小于用SDS-PAGE估价的细胞色素c551I和II的表观分子量(18,000和16,800)。在成熟蛋白的中间(残基No.15到55)发现CysAlaSerCysHis是血红素结合的保守序列，CysXaaXaaCysHis。
(6)用PCR方法亚克隆细胞色素c551基因
通过用EcoRI位点标记的引物进行的PCR扩增含有ORF(507碱基对)的117碱基对的5’-和120碱基对的3’-侧接序列的744碱基对的片段。将扩增片段克隆进载体pVK100产生在相反方向含有744碱基对片段的质粒pGOC102和pGOC102R。将744碱基对片段克隆进pMMB22产生质粒pGOC402(Bagdasarian，M.，等，基因26：273-282，1983)。
   实施例3在大肠杆菌，恶臭假单胞菌和弱氧化葡糖杆菌
          DSM No.4025中表达细胞色素c551基因
(1)在大肠杆菌中表达细胞色素c551基因
对携带pGOC402或pMMB22的大肠杆菌JM109的无细胞提取液进行Western印迹分析。在含有50微克/毫升的氨苄青霉素的LB上让大肠杆菌细胞生长过夜，然后将1％的等分试样接种到5毫升的新鲜培养基中。在培养4小时后，加入或不加入异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)到终浓度为1mM，继续培养1小时。收获细胞并悬浮于水中。在确定蛋白质浓度后，用含有62.5mM Tris-HCl(pH6.5)，10％甘油，2％SDS和5％β-巯基乙醇的Laemmli的缓冲液稀释到2毫克蛋白质/毫升的浓度并煮沸3分钟。将30μg的无细胞提取液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(15％)电泳。用半干电影印仪(Trans-blot SD，Bio-Rad，Hercules，加里福尼亚，美国)，在含有20％甲醇的2.5mM Tris-19.2mM甘氨酸缓冲液，pH8.6中，在25V操作1小时将得到的凝胶上的蛋白带影印到硝酸纤维膜上。根据供应商的推荐(KONICA公司，日本，东京)通过用抗细胞色素c551抗血清，山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶共轭物，过氧化氢，和显色剂处理可见细胞色素c551蛋白。用或不用IPTG诱导制备的携带pGOC402的细胞表达两个阳性带(在总共每30微克无细胞提取液中分别约为30纳克或10纳克细胞色素c551)，而携带pMMB22的细胞不表达它们。这些带的Rf值相同于纯化的细胞色素c551I和II，表明细胞色素c551I和H表达自一个基因并在翻译后或转录后被修饰。
(2)在恶臭假单胞菌中表达细胞色素c551
首先，通过如下进行的三亲本接合交配方法将pGOC402和pMMB22导入萘定酸抗性(Nalr)的恶臭假单胞菌ATCC21812中。在5毫升含有2.5％甘露醇，0.5％酵母提取液(Difco实验室，Detroit，Mich.)和0.3％细菌蛋白胨(Difco)的MB培养基中，在30℃培养Nalr恶臭假单胞菌ATCC21812的细胞。在37℃，在含有适当的抗生素的LB培养基中让携带pGOC402的供体菌大肠杆菌JM109(链霉素抗性：Smr)或pMMB22(Smr)和携带pRK2013的辅助菌大肠杆菌HB101(Kmr，Figurski，D.H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1648-1652，1979)生长过夜。独立地离心这些过夜培养物(每个2毫升)并将细胞沉淀独立地悬浮于2毫升的MB培养基中。混合100微升每种细胞悬浮液，并将50微升混合细胞悬浮液点在含有5％果糖，1％酵母提取液(Difco)，1％聚蛋白胨(Wako纯化学工业公司，Osaka，日本)和1.8％的琼脂的FB琼脂培养基表面的硝基纤维素滤纸上。在27℃温育平板过夜。将得到的细胞铺在含有50微克/毫升萘定酸和50微克/毫升的链霉素的MB琼脂培养基(MNS琼脂板)上。通过在MNS琼脂板上划线纯化这样得到的转接合体以便除去大肠杆菌细胞和无质粒的恶臭假单胞菌。
从在含有50微克/毫升的利福平和加入或不加入10mM IPTG的MB培养基中过夜生长的细胞中制备携带pGOC402或pMMB22的恶臭假单胞菌转接合体的无细胞提取液并如实施例3-1所述进行Western影印分析。用或不用IPTG诱导制备的携带pGOC402的细胞表达两个阳性带(在总共每20微克无细胞提取液中分别约为30和10纳克细胞色素c551)，而携带pMMB22的细胞不表达。
(3)在GOS2R和GORS6-35中表达细胞色素c551基因
通过三亲本接合交配方法，将在pVK100中以两个方向携带细胞色素c551基因的质粒(pGOC101和pGOC101R)导入弱氧化葡糖杆菌DSMNo.4025的利福平抗性衍生物，GOS2R(T.Hoshino等，欧洲专利申请No.9611500.8)。在30℃，在10毫升含有3％Trypticase Soy肉汤(BectonDickinson，Cockeysville，Md.USA)和0.3％酵母提取液(Difco实验室，Detroit，Mich.)以及100μg/毫升利福平的T培养基中培养GOS2R的细胞。在37℃，在含有适当的抗生素的LB培养基中让供体菌，即携带pGOC101(Tcr)、pGOC101R(Tcr)或pVK102(Kmr)的大肠杆菌HB101和携带pRK2013(Kmr)的大肠杆菌HB101辅助菌生长过夜。独立地离心这些过夜培养物(10毫升GOS2R培养物和2毫升大肠杆菌培养物)并将细胞沉淀独立地悬浮于2毫升T培养基中。混合各100微升的细胞悬浮液，并将50微升混合细胞悬浮液点在如实施例1-(1)所述的NS2琼脂培养基表面的硝酸纤维膜滤纸上。将平板在27℃温育过夜。将得到的细胞铺在含有100微克/毫升利福平和3微克/毫升的四环素的T琼脂培养基(TRT琼脂平板)上。通过在TRT琼脂平板上划线纯化这样得到的转接合体以便除去大肠杆菌的细胞和无质粒的GOS2R。如实施例3-(1)所述对在NS2琼脂平板上生长的转接合体的细胞进行Western影印分析。图3显示携带pGOC101或pGOC101R的GOS2R比携带pVK102的GOS2R产生更多的免疫学阳性蛋白；扩增比例似乎是约2倍。
通过如上所述的三亲本接合将质粒pGOC101和pGOC102导入弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025的利福平抗性衍生物GORS6-35(来自L-山梨糖的高2KGA生产者，T.Hoshino等，欧洲专利No.9611500.8)。质粒pGOC101以低频(每个受体＜10-8个转接合体)导入，而质粒pGOC102以更高的频率(约每个受体10-4个接合体)导入。如表1所示，一个典型的携带pGOC101的转接合体GORS6-35(pGOC101)-1显示了非常低的生长性和低的质粒稳定性(50％)，表明了细胞色素c551基因的存在或表达对寄主的生长有抑制效应，这导致了生长过程中无质粒细胞的增殖。另一个转接合体GORS6-35(pGOC101)-2在几次转移到含有30微克/毫升的四环素的NS2琼脂培养基上后，变化显示好的生长性和非常高的质粒稳定性(＞99％)。这一在生长性上的自发的变化似乎是由宿主通过过度表达细胞色素c551以适应胁迫所导致的。相反，携带pGOC102的转接合体显示好的生长性和高的质粒稳定性(88％)。
通过还原减氧化差异光谱定量地确定在含有10％L-山梨糖的生产培养基中生长的菌株中的细胞色素c551的含量。如下用Shimadzu(Kyoto，日本)UV-2200分光光度计进行细胞色素c551的定量分析。在实施例1所述的含有面包酵母细胞的生产培养基中将GORS6-35衍生物培养4天。在1,000rpm离心10分钟两次除去CaCO3和面包酵母细胞后，通过在8,000rpm离心10分钟收获细胞。用含有5mM MgCl2的50mM Tris-Hcl(pH7.5)洗涤收获的细胞并重悬浮于5毫升同样的缓冲液。将细胞悬浮液通过French压力细胞***器(1,500kg/cm2)两次并通过5,000rpm离心10分钟除去细胞碎片。在45,000rpm超速离心1小时得到的粗提取液。上清液用于通过还原减氧化差异光谱确定细胞色素c551含量。对于细胞色素的氧化，将样品用100mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)中的2mM铁***处理，而对还原，用0.1％的硼氢化钠而不是铁***处理。通过下面的方程得出上清液中的细胞色素c551(C)的浓度：
C＝E(A551-A541)还原-(A551-A541)氧化)
E(摩尔消光系数)＝19.1mM-1cm-1
表1显示了GORS6-35(pGOC101)-1，GORS6-35(pGOC101)-2，GORS6-35(pGOC102)或GORS6-35(pVK102)中细胞色素c551的表达水平。GORS6-35(pGOC101)-2和GORS6-35(pGOC102)比GORS-6-35(pVK102)表达了高1.6和1.3倍的细胞色素c551。
                           表1
       菌株            质粒稳定性     细胞色素c551含量*
                          (％)      (nmol/毫克可溶蛋白质)
GORS6-35(pVK102)           91               0.807
GORS6-35(pGOC101)-1        50               0.733
GORS6-35(pGOC101)-2        ＞99             1.297
GORS6-35(pGOC102)          88               1.070
*：含这两种细胞色素c551I和II的含量
在携带pGOC102的GORS6-35中的细胞色素c551含量的增加表明了细胞色素c551基因的原始启动子可能存在于它的结构基因上游的117碱基对之间。
       实施例4通过扩增细胞色素c551的GORS6-35
              从L-山梨糖生产2KGA
将巨大芽孢杆菌DSM No.4026(欧洲专利申请0278477)从SCM琼脂斜面(表2)上接种到150毫升SCM中。在同样的SCM种子培养基中，接种来自含有30微克/毫升的四环素的NS2培养基上的琼脂培养物的GORS6-35(pGOC101)-2或GORS6-35(pVK102)细胞或来自NS2培养基上的琼脂培养物的弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025细胞。在30℃继续种子培养直到培养液的pH变成6.5-6.0之间；这通常需要15-24小时。将种子培养液部分(7.5毫升)接种到500毫升的锥形烧瓶中的50毫升生产培养基(表3)中。在30℃，180rpm在旋转振荡器上进行这些主要的发酵过程5天。如表4所示，利用GORS6-35(pGOC101)-2的混合发酵过程比用弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025，GORS6-35和GORS6(pVK102)产生更好的2KGA产量，更快地从11％的L-山梨糖生产2KGA，和从14％的山梨糖更快地生产并得到更高的产量。重组菌株从11％L-山梨糖在3天生产105.1克/升2KGA，在分别4天和5天从14％L-山梨糖生产130.8和133.3克/升，而载体对照GORS6-35(pVK100)在3天从11％的L-山梨糖生产96.3克/升2KGA，分别在4天和5天生产99.9和112.6克/升。
             表2种子培养基(SCM)
         成份              含量(％)
         酵母提取液        0.3
         牛肉提取液        0.3
         玉米浸出液        0.3
         蛋白胨            1.0
         脲                0.1
         KH2PO4         0.1
         MgSO4.7H2O     0.02
         CaCO3 *          0.1
         L-山梨糖          2.0
         pH7.1
*：CaCO3是在pH调整后加入的。
在500毫升锥形烧瓶中的150毫升培养基
对于SCM琼脂斜面，在SCM培养基中加入2％的琼脂
                    表3生产培养基
      L-山梨糖*        11％        14％
      脲*              2.4         3.1
      CSL               1.6         2.0
      MgSO4.7H2O     0.016       0.02
      KH2PO4         0.16        0.2
      CaCO3 **          0.8         1.0
      pH6.7
*L-山梨糖和脲分别高压灭菌
**：CaCO3是在pH调整后加入的。
在500毫升锥形烧瓶中的100毫升培养基
                               表4
菌株                  山梨糖含量        产生的2KGA(克/升)
                      (w/v％)       3天       4天       5天
GORS6-35(pGOC101)-2   11            105.1     106.2
                      14            103.1     130.8     133.3
GORS6-35(pVK102)      11            96.3      106.9
                      14            84.1      99.9      112.6
GORS6-35              11            95.5      104.7
                      14            90.6      104.7     104.8
DSM No.4025           11            102.2     106.4
                      14            81.8      95.6      107.7
  实施例5.由携带细胞色素c551基因与弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025
            的AADH基因的恶臭假单胞菌转接合体生产2KGA
通过实施例3-(2)所述的三亲本接合交配方法构建Nalr恶臭假单胞菌ATCC21812的四种转导接合体：携带pSSA102R(携带含有从弱氧化葡糖杆菌DSM4025克隆的酶A基因、编码转化L-山梨糖成2KGA的AADH的基因的2.7kbDNA片段的载体pVK100，T.Hoshino等，欧洲专利申请No.9611500.8)和pGOC402的恶臭假单胞菌，携带pVK102和pGOC402的恶臭假单胞菌，携带pSSA102R和pMMB22的恶臭假单胞菌，和携带pVK102和pMMB22的恶臭假单胞菌。将生长在含有10微克/毫升四环素和50微克/毫升的链霉素的MB琼脂培养基上的四种转导接合体的细胞接种到10毫升用10微克/毫升四环素，50微克/毫升的链霉素和10mM IPTG补充的MB培养基中，并在30℃温育18小时。离心得到的细胞并用0.9％NaCl洗涤。在30℃，将含有20OD600单位的细胞、4％L-山梨糖、0.3％NaCl、1％CaCO3、1微克/毫升吡咯并喹啉醌(PQQ)的静止细胞反应混合物振摇温育48小时。携带pSSA102R和pGOC402的恶臭假单胞菌生产的2KGA的量为36.4克/升，而其它三个菌株的低于0.5克/升。细胞色素c551的表达提供了从弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025的AADH到恶臭假单胞菌的电子传递链的生理连接。
            实施例6AADH-细胞色素c551共轭物
如图4说明构建带有编码AADH-细胞色素c551共轭物的基因的质粒。这里，将酶A/B3和酶B基因(T.Hoshino等，欧洲专利申请No.9611500.8)用作AADH基因。在醋化醋杆菌的ADH模仿过程中构建AADH和细胞色素c551的连接物(Inoue T.等，细菌学杂志171：3115-3122，1989)。将质粒导入Nalr恶臭假单胞菌ATCC21812并用制备的抗AADH或细胞色素c551的抗体对得到的共轭物进行Werstern影印分析。分析显示构建的共轭物在一个分子中含有AADH和细胞色素多肽。如实施例5所述将携带酶A/B3-细胞色素c551共轭物基因和酶B-细胞色素c551共轭物基因的转导接合体用于静止细胞反应。结果，在40小时中，前面的转导接合体从40克/升的L-山梨糖生产7.8克/升的2KGA，后者从40克/升的D-山梨醇生产9.0克/升的L-山梨糖。
                          序列表
(1)总资料
   (i)申请人
      姓名：F.HOFFMANN-LA ROCHE AG
      街道：Grenzacherstrasse 124
      城市：Basle
      国家：瑞士
      邮编：CH-4070
      电话：061-6882505
      传真：061-6881395
      电传：962292/965542 hlrc
   (ii)发明的题目：新细胞色素c
   (iii)序列的数目：6
   (iv)计算机可读形式：
      (A)介质类型：软盘
      (B)计算机：Macintosh
      (C)操作***：Macintosh
      (D)软件：微软Word 5.1a
(2)SEQ ID NO：1的资料：
   (i)序列特征：
      (A)长度：744碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链数：双链
      (D)几何结构：线性
   (ix)序列描述：SEQ ID NO：1
CAAGGCGGAG TTGTCCGGCA AAGACTGACA TTTCTGTTTG CGGCCGTTAT ATAGGGGCTG   60
CTCGCAGATG TCGGCACCTT GTCCGGCCTG CGACGCAGCA AGGTAAAGGA AGCTAAAATG  120
AAAAACAAAA CCACTCTGGG CGGCGCGCTT GCACTTGCAG CACTGCTGGC CGGAACGACC  180
GGGGCACTGG CGTTCAGCAA CATCGAACGT CCCGCACCGG CCGCTGATAC TGCAGCTACC  240
GAAGAAGCAC CTGCTGCCGC TGCTGGCGCC GCCACTTCGA TCTACGACGG CGTTTACACT  300
GCAGCCCAGG CCGAAGCTGG CCAGGCTGCA TGGATGACCA GCTGCGCAAG CTGCCACGGC  360
CCGACCGCTC GCGGCTCGTC GGGTGGTCCG CGCGTTATCG GCCCTGTCAT CAACAACAAG  420
TATGCTGACA AGCCGCTGCT GGACTACTTC AACTACACCC GCGACAACAT GCCGATGGGC  480
GCGCCTCACT CGTTGAGCGA CGATACCTAT GTTGAAATCG TTGCGTTCAT TCTGCAATCG  540
CACGGCGCAG AGCCGGGCGA GACGGAACTG ACCTCGGACG AAGCGCTGCT CGGCAGCCTG  600
ATGATGGGCC GTAACCCCAA CTAAACGCAG GGTCGCCAAC CGCTTGACGG TAAGCAACCT  660
ACCAGATTGG CCGGCTACGG TCGGCCAATC CTCCTTTACC AACCCTCCAT CCCAAACAAG  720
GTAAAACCTG ATGAAGACGT CGTC                                         744
(2)SEQ ID NO：2的资料：
   (i)序列特征：
     (A)长度：168个残基
     (B)类型：氨基酸
     (C)几何结构：线性
   (ix)序列描述：SEQ ID NO：2
Met Lys Asn Lys Thr Thr Leu Gly Gly Ala Leu Ala Leu Ala Ala
-25                 -20                 -15
Leu Leu Ala Gly Thr Thr Gly Ala Leu Ala Phe Ser Asn Ile Glu
-10                  -5                   1               5
Arg Pro Ala Pro Ala Ala Asp Thr Ala Ala Thr Glu Glu Ala Pro
                 10                  15                  20
Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ser Ile Tyr Asp Gly Val Tyr
                 25                  30                  35
Thr Ala Ala Gln Ala Glu Ala Gly Gln Ala Ala Trp Met Thr Ser
                 40                  45                  50
Cys Ala Ser Cys His Gly Pro Thr Ala Arg Gly Ser Ser Gly Gly
                 55                  60                  65
Pro Arg Val Ile Gly Pro Val Ile Asn Asn Lys Tyr Ala Asp Lys
                 70                  75                  80
Pro Leu Leu Asp Tyr Phe Asn Tyr Thr Arg Asp Asn Met Pro Met
                 85                  90                  95
Gly Ala Pro His Ser Leu Ser Asp Asp Thr Tyr Val Glu Ile Val
                100                 105                 110
Ala Phe Ile Leu Gln Ser His Gly Ala Glu Pro Gly Glu Thr Glu
                115                 120                 125
Leu Thr Ser Asp Glu Ala Leu Leu Gly Ser Leu Met Met Gly Arg
                130                 135                 140
Asn Pro Asn
        143
(3)SEQ ID NO：3的资料：
   (i)序列特征：
      (A)长度：52个残基
      (B)类型：氨基酸
      (C)几何结构：线性
   (ix)序列描述：SEQ ID NO：3
Ala Asp Thr Ala Ala Thr Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ala Thr Ser Ile Tyr Asp Gly Val Tyr Thr Ala Ala Gln Ala
                 20                  25                  30
Glu Ala Gly Gln Ala Ala Trp Met Thr Ser Xaa Ala Ser Xaa His
                 35                  40                  45
Gly Pro Thr Ala Arg Gly Ser
                 50      52
(4)SEQ ID NO：4的资料：
   (i)序列特征：
      (A)长度：44个残基
      (B)类型：氨基酸
      (C)几何结构：线性
   (ix)序列描述：SEQ ID NO：4
Gly Pro Arg Val Ile Gly Pro Val Ile Asn Asn Lys Tyr Ala Asp
  1               5                  10                  15
Lys Pro Leu Leu Asp Tyr Phe Asn Tyr Thr Arg Asp Asn Met Pro
                 20                  25                  30
Met Gly Ala Pro His Ser Leu Ser Asp Asp Thr Tyr Val Glu
                 35                  40              44
(5)SEQ ID NO：5的资料：
   (i)序列特征：
      (A)长度：13个残基
      (B)类型：氨基酸
      (C)几何结构：线性
   (ix)序列描述：SEQ ID NO：5
Ile Leu Gln Ser His Gly Ala Glu Pro Gly Glu Thr Glu
  1              5                  10          13
(6)SEQ ID NO：6的资料：
   (i)序列特征：
      (A)长度：50个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链数：双链
      (D)几何结构：线性
   (ix)序列描述：SEQ ID NO：6：
ATCAACAACA AGTATGCTGA CAAGCCGCTG CTGGACTACT
TCAACTACAC 50

Claims (11)

1、一种DNA序列，其包括由SEQ ID NO：1确定的DNA序列或其互补序列，该序列编码具有细胞色素c551活性的多肽。
2、一种DNA序列，其包括SEQ ID NO：1序列和编码具有醇/醛脱氢酶活性的多肽的DNA序列，其中所述两种序列连接在一起编码融合蛋白。
3、一种具有细胞色素c活性的多肽，它是由根据权利要求1的DNA序列编码的。
4、一种根据权利要求3的多肽，它是从属于葡糖杆菌属的微生物得到并选自包括分别显示下列物理化学特性的细胞色素c551I和II：
(i)细胞色素c551I；
(a)分子量：通过凝胶过滤测得为19.0±1kDa，通过SDS-PAGE分析测得为18.0±1.0kDa；
(b)吸收光谱：还原形式分别作为α、β和γ峰在551nm、522nm和417nm处显示最大吸收；
(c)血红素含量：约每摩尔蛋白质1摩尔血红素；
(d)等电点：约3.95；和
(ii)细胞色素c551II；
(a)分子量：通过凝胶过滤测得为19.0±1kDa，通过SDS-PAGE分析测得为16.8±1.0kDa；
(b)吸收光谱：还原形式分别作为α、β和γ峰在551nm、522nm和417nm处显示最大吸收；
(c)血红素含量：约每摩尔蛋白质1摩尔血红素；
(d)等电点：约3.75。
5、一种载体，该载体包括权利要求1或2中所述的DNA序列。
6、一种宿主细胞，该细胞已经用权利要求1或2中的DNA序列转化。
7、权利要求6的宿主细胞，该宿主细胞选自细菌。
8、权利要求7的宿主细胞，其中所述细菌选自大肠杆菌、恶臭假单胞菌、木醋杆菌、巴氏醋杆菌、醋化醋杆菌、汉氏醋杆菌和弱氧化葡糖杆菌。
9、权利要求7的宿主细胞，该细胞是弱氧化葡糖杆菌DSM No.4025。
10、生产细胞色素c551的方法，该方法包括在适当的培养基中培养权利要求6的宿主细胞并从培养物中回收细胞色素c551。
11、权利要求3或4的多肽在生产维生素C中的用途。
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