CN1302117C - 生产l-抗坏血酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了EP 0 832 974 A2中公开的G.oxydans DSM 4025的酶B在从L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖或L-塔罗糖,或从L-古洛糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-古洛糖酸)和从L-半乳糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-半乳糖酸)来生产L-抗坏血酸的方法中的用途。
Description
本发明涉及EP 0 832 974 A2中公开的Gluconobacter oxydans DSM4025的酶B在生产L-抗坏血酸的方法中的用途。
从1934年“Reichstein方法”被建立以来,对L-抗坏血酸(维生素C)生物技术合成的可行性研究已经进行了很多年。微生物Gluconobacteroxydans DSM 4025或携带有Saccharomyces cerevisiae的D-***糖酸-1,4-内酯氧化酶基因的Escherichia coli、Candida albicans和Saccharomycescerevisiae能将L-半乳糖酸-1,4-内酯氧化成维生素C。Saccharomycescerevisiae和Candida albicans拥有D-***糖脱氢酶,催化分别从D-***糖和L-半乳糖产生D-***糖酸-1,4-内酯和L-半乳糖酸-1,4-内酯的过程。然而,未有报道描述用另外的L-己糖作为中间产物来对维生素C进行生物生产的可能性,所述己糖是L-艾杜糖(L-idose)、L-古洛糖和L-塔罗糖(L-talose),其具有与维生素C相应的构型(在C4和C5位置上)。
本发明提供了EP 0 832 974 A2中公开的G.oxydans DSM 4025的酶B在从L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖或L-塔罗糖,或从L-古洛糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-古洛糖酸)和从L-半乳糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-半乳糖酸)来生产L-抗坏血酸的方法中的用途。
本发明还提供了EP 0 832 974 A2中公开的G.oxydans DSM 4025的酶B在分别从L-古洛糖或L-半乳糖来生产L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸-1,4-内酯或其酸的形式L-古洛糖酸或L-半乳糖酸的方法中的用途。
EP 0 832 974 A2通过引用的方式被包括在本文内,其中公开了G.oxydans DSM 4025的酶B具有下列物理-化学属性:
(a)在SDS-PAGE上分子量为大约60,000Da;
(b)具有对一级及二级醇和醛的底物特异性;
(c)在pH为大约6至大约9之间时,具有pH稳定性;
(d)最佳pH是pH为大约8.0;以及
(e)受Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+和Fe3+抑制。
此外,EP 0 832 974 A2中公开了酶B的氨基酸序列和核苷酸序列,其在本序列表中由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1所代表。从EP 0 832 974A2中已知:酶B能将D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-山梨糖酮(D-sorbosone)、D-甘露醇、L-艾杜糖、甘油、D-葡萄糖酸、D-甘露糖酸分别转化为D-葡萄糖酸、L-山梨糖、2-KGA、D-果糖、L-艾杜糖酸、二羟基丙酮、5-酮基-D-古洛糖酸和5-酮基-D-甘露糖酸。
本发明涉及用酶来生产L-抗坏血酸的方法,所述的酶具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列90%相同的氨基酸序列,并且具有生产L-抗坏血酸的活性,通过此酶从底物生产出L-抗坏血酸,所述底物选自由L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖和L-塔罗糖所构成的组。
L-己糖,例如L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖和L-塔罗糖,是稀有的糖,其基本通过化学方法来生产,在商业上是高成本的化合物。然而,近来已有对L-古洛糖和L-半乳糖的生物制备的报道。EP 0 832 974 A2中报道了通过G.oxydans DSM 4025的酶A从D-山梨糖醇对L-古洛糖进行的生产。US 6,037,153中公开了通过L-核糖异构酶从L-山梨糖对L-古洛糖进行的生产。Izumori et al.(2001 Annual Meeting of the Society for Bioscienceand Bioengineering,Japan)中报道了从L-山梨糖对L-半乳糖进行的生产。在此方法中,他们将两种用到酶的方法加以组合,所述方法由用Pseudomonas cichorii ST-24菌株的L-塔格糖(tagatose)差向异构酶来进行的“L-山梨糖到L-塔格糖”的反应(US 5,811,271)和用Bacillusstearothermophilus 14a菌株的D-***糖异构酶来进行的“L-塔格糖到L-半乳糖”的反应构成。L-古洛糖酸-1,4-内酯可从D-古洛糖来制备。
在本发明的另一个方面,提供了一种方法,用于:
(a)生产
(i)L-抗坏血酸,该过程是通过酶从L-古洛糖或L-半乳糖来进行的,其中包括将L-古洛糖或L-半乳糖和酶或其功能等同物在反应混合物中相接触,所述的酶具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列90%相同的氨基酸序列或其部分,并且具有从L-古洛糖及L-半乳糖生产L-抗坏血酸的活性;
(ii)L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸-1,4-内酯,该过程是通过酶分别从L-古洛糖或L-半乳糖来进行的,其中包括将L-古洛糖或L-半乳糖和酶或其功能等同物在反应混合物中相接触,所述的酶具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列90%相同的氨基酸序列或其部分,并且具有从L-古洛糖生产L-古洛糖酸-1,4-内酯及从L-半乳糖生产L-半乳糖酸-1,4-内酯的活性;
(iii)L-抗坏血酸,该过程是通过酶从L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸-1,4-内酯来进行的,其中包括将L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸-1,4-内酯和酶或其功能等同物在反应混合物中相接触,所述的酶具有SEQID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列90%相同的氨基酸序列或其部分,并且具有从L-古洛糖酸-1,4-内酯及L-半乳糖酸-1,4-内酯生产L-抗坏血酸的活性;和
(b)从反应混合物中分离出L-抗坏血酸、L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸-1,4-内酯。
本发明的一种实施方式提供了用酶来生产L-抗坏血酸的方法,所述的酶具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列90%相同的氨基酸序列,并且具有生产L-抗坏血酸的活性,通过此酶从底物生产出L-抗坏血酸,所述底物选自由L-古洛糖酸-1,4-内酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1,4-内酯、L-半乳糖酸、L-艾杜糖酸-1,4-内酯、L-艾杜糖酸、L-塔罗糖酸-1,4-内酯和L-塔罗糖酸所构成的组。
在另一种实施方式中,本发明包括用酶生产L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-古洛糖酸的方法,所述的酶具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ IDNO:2的氨基酸序列90%相同的氨基酸序列,并且具有生产L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-古洛糖酸的活性,通过此酶从L-古洛糖生产出L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-古洛糖酸。
另外,本发明的一个方面提供了用酶生产L-半乳糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸的方法,所述的酶具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ IDNO:2的氨基酸序列90%相同的氨基酸序列,并且具有生产L-半乳糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸的活性,通过此酶从L-半乳糖生产出L-半乳糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸。
上述根据本发明的方法包括:(a)将酶与各自的底物相接触,和(b)从反应混合物中分离出各自的产物。在维生素C作为产物的情况下,底物选自由L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖、L-塔罗糖、L-古洛糖酸-1,4-内酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1,4-内酯、L-半乳糖酸、L-艾杜糖酸-1,4-内酯、L-艾杜糖酸、L-塔罗糖酸-1,4-内酯和L-塔罗糖酸所构成的组。在L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-古洛糖酸作为产物的情况下,底物是L-古洛糖。在L-半乳糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸作为产物的情况下,底物是L-半乳糖。
本发明中,酶的功能等同物可以通过本领域内已知的化学肽合成来制得,或者可以依靠现有技术中已知的方法,在本文公布的DNA序列的基础上通过重组手段来制得。在蛋白质和肽中进行的大体上不改变此类分子活性的氨基酸交换在本领域的范畴内是已知的。最常见的交换是:Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly及其颠倒过来的形式。
此外,酶的功能等同物包括公布的SEQ ID NO:1的DNA序列所编码的氨基酸序列,所述DNA序列例如,在序列表中的序列及其互补序列,或包括上述序列的序列,在标准条件下能与此类序列或其片段杂交的DNA序列,以及由于遗传密码简并在标准条件下不与此类序列杂交但编码具有完全相同的氨基酸序列的多肽的DNA序列;其中,所述的功能等同物具有如下酶活性:
(i)从L-古洛糖和L-半乳糖生产L-抗坏血酸;
(ii)从L-古洛糖生产L-古洛糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-古洛糖酸)和从L-半乳糖生产L-半乳糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-半乳糖酸),或
(iii)从L-古洛糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-古洛糖酸)和从L-半乳糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-半乳糖酸)生产L-抗坏血酸。
用于杂交的“标准条件”在上下文中表示:本领域内技术人员为了探测特定杂交信号通常所用的条件,或者,优选地,所谓的严谨杂交和非严谨洗涤条件,或更优选地,所谓的严谨杂交和严谨洗涤条件,这些都是本领域内技术人员所熟悉的。此外,依靠本领域内已知的方法,用基于本文中公开的DNA序列而设计的引物,通过聚合酶链式反应能制得的DNA序列也包括在本发明中。应当理解:也可以按照例如EP 747 483 A2中所述通过合成来制得本发明的DNA序列。
可以用诱变原,例如紫外线辐射、X射线辐射、γ-射线辐射,或与含氮的酸N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine,NTG)相接触,或用其它适合的诱变原来处理基因或携带有所述基因的微生物,来制备该基因的突变体;或者通过对自发突变产生的或用本领域内已知的体外诱变标准方法产生的菌落或克隆进行分离来制备所述突变体。所述标准方法中的很多种都已被描述于若干份公开文本中。
在本文中使用的“突变体”是任何编码非天然多核苷酸序列或编码从其天然形式变化来的多核苷酸序列(例如,通过对1-100个核苷酸,优选20-50个,更优选为少于10个核苷酸进行重新排列或缺失或替换)的基因。如上所述,可以通过随机诱变、化学诱变、自发突变、UV辐射、易错PCR(PCR-prone error generation)、定点诱变等来获得这样的非天然序列。优选地,所述突变导致与未突变的母体多肽相比产量提高或活性增强的多肽的表达,这可以通过实施例中给出的检测手段检测出来。用于产生、筛选和鉴定此类突变体细胞的方法是本领域内公知的。
按照《布达佩斯条约》的规定,一种特定的优选G.oxydans菌株,作为编码多肽的DNA序列的供体,已于1987年3月17日被保藏到Gttingen(德国)的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ),编号为DSM No.4025。具有G.oxydans DSM4025鉴定特征的微生物的生物学和/或分类学上的均一培养物也可作为所述DNA序列的供体。
G.oxydans DSM 4025的传代培养物也已被保藏到Agency of IndustrialScience and Technology,Fermentation Research Institute,Japan,保藏编号为FERM BP-3812。EP 0 278 447 B1中公开了该菌株的特征。
如果必要的话,利用已被确定的核苷酸序列的信息(要考虑到密码子的使用),通过菌落杂交或Southern杂交,或者通过聚合酶链式反应,可以从不同的生物中分离出编码分歧进化的(evolutionally divergent)酶的基因,所述的酶具有从L-古洛糖或L-半乳糖形成维生素C的活性,以及(i)从L-古洛糖和L-半乳糖生产L-抗坏血酸的活性,(ii)从L-古洛糖生产L-古洛糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-古洛糖酸)和从L-半乳糖生产L-半乳糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-半乳糖酸)的活性,或(iii)从L-古洛糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-古洛糖酸)和从L-半乳糖酸-1,4-内酯(及其酸的形式,L-半乳糖酸)生产L-抗坏血酸的活性,所述菌落杂交或Southern杂交是用根据从所述核苷酸序列推断出的氨基酸序列而合成的探针来进行的,所述聚合酶链式反应采用也是根据所述信息而合成的引物来进行的。
此外,用于构建携带有G.oxydans DSM 4025的酶B及上面定义的其功能等同物或突变体的重组微生物的优选宿主微生物可以是Escherichiacoli、Pseudomonas putida和G.oxydans DSM 4025及其生物学和/或分类学上的均一培养物或突变体。
为构建在重组表达载体或在宿主微生物的染色体DNA上携带有编码G.oxydans DSM 4025的酶B及其功能等同物或突变体的基因的重组微生物,可以使用多种基因转移方法,包括转化、转导、接合(conjugalmating)和电穿孔。用于构建重组微生物的方法可以选自细胞生物学领域中公知的方法。通常的转化***可以用于Escherichia coli和Pseudomonas。转导***也可以用于Escherichia coli。接合***也可以广泛地使用于***和革兰氏阴性细菌,包括E.coli、Pseudomonasputida和G.oxydans。接合可以发生于液体培养基中或固体表面上。优选的受体选自E.coli、Pseudomonas putida和G.oxydans,其能通过合适的重组表达载体产生出具有活性的酶B。通常向用于接合的受体中加入选择性标志;例如,通常选用对萘啶酸或利福平的抗性。
本发明中提供的微生物可在有氧条件下被培养于补充有合适营养物的水性培养基中。培养在大约1.0至大约9.0之间的pH下进行,优选在大约2.0至大约8.0之间。虽然培养时间根据所用的pH、温度和营养培养基而改变,但是通常2至5天会带来有利的结果。用于开展培养的合适的温度范围为大约13℃至大约45℃,优选为大约18℃至大约42℃。
因此,上述本发明用于生产维生素C的方法在大约1至大约9之间的pH和大约13℃至大约45℃之间的温度下进行1至120小时。优选地,该方法进行于大约2至大约8之间的pH和大约13℃至大约45℃之间的温度下。如本发明的其它实施方式所述,上述条件也可以用于生产L-古洛糖酸-1,4-内酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸。
通常要求培养基中含有如下营养物:可被吸收的碳源、可被消化的氮源和无机物、维生素、痕量元素和其它促进生长的因子。可被吸收的碳源的例子包括甘油、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-果糖、D-阿糖醇、D-山梨糖醇和L-山梨糖。
若干有机或无机物质也可被用作氮源,例如酵母提取物、肉类提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、尿素、氨基酸、硝酸盐、铵盐等。无机物硫酸镁、磷酸钾、氯化亚铁和氯化铁、碳酸钙等也可以使用。
在本文中使用的L-抗坏血酸指以游离酸的形式或以盐的形式存在的物质,所述盐的形式例如是钠盐、钾盐或半钙(hemicalcium)盐,例如二水合L-抗坏血酸钙。此外,除非另有指明,L-抗坏血酸的浓度都是以游离酸的形式来描述的。
在本文中使用的L-古洛糖酸-1,4-内酯和L-半乳糖酸-1,4-内酯指以其内酯的形式和/或其酸的形式存在的物质,在多种物理-化学条件下,这两种形式以平衡状态共同存在。
在本文中使用的短语“用于杂交的标准条件”指本领域内技术人员为了探测特定杂交信号通常所用的条件,或者,优选地,所谓的严谨杂交和非严谨洗涤条件,或更优选地,所谓的中度严谨的条件,或进一步优选地,所谓的严谨杂交和严谨洗涤条件,这些都是本领域内技术人员所熟悉的。
例如,可以恰当地使用下列杂交条件和洗涤条件的组合:
“高严谨度杂交”:6×SSC、0.5% SDS、100μg/ml变性鲑鱼精DNA、50%甲酰胺,在42℃下轻摇培养过夜。
“高严谨度洗涤”:在2×SSC、0.5% SDS中于室温下洗涤一次,15分钟;然后在0.1×SSC、0.5% SDS中于室温下再洗涤一次,15分钟。
“低严谨度杂交”:6×SSC、0.5% SDS、100μg/ml变性鲑鱼精DNA、50%甲酰胺,在37℃下轻摇培养过夜。
“低严谨度洗涤”:在0.1×SSC、0.5% SDS中于室温下洗涤一次,15分钟。
中度严谨的条件可通过改变上述杂交反应发生的温度和/或洗涤条件来获得。
反应混合物中,L-醛糖和L-醛糖内酯等底物的浓度可根据其它反应条件而改变,但是,其通常在大约1g/l至大约300g/l之间,优选在大约10g/l至大约200g/l之间。
所述反应可在有氧条件下进行。
在反应中使用的酶可以是任何形式的,其包括但不限于酶溶液、固定的酶、完整细胞和固定的细胞。
反应之后,可以通过多种色谱的组合方式从反应混合物中回收L-抗坏血酸和L-醛糖内酯,所述色谱例如是薄层色谱、吸附色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱或高效液相色谱。也可以将本发明的反应混合物中未经纯化的作为反应产物的L-醛糖内酯,作为进一步反应的底物。
下述实施例被用来进一步地阐述本发明的方法。这些实施例仅作阐述用,而并非欲以任何方式对本发明的范围加以限制。
实施例1:通过携带有酶B基因的Escherichia coli JM 109从L-古洛糖生产L-古洛糖酸-1,4-内酯/L-古洛糖酸
如EP 0 832 974 A2中所述,从pSS103R中将编码酶B的基因克隆并亚克隆到载体pTrcMalE中,以构建pTrcMalE-EnzB。在2ml加有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中,将带有pTrcMalE-EnzB的Escherichiacoli JM 109于30℃培养15小时,从获得的培养液中取100μl转移到加有100μg/ml氨苄青霉素的新鲜的LB培养基中,在30℃培养4小时。然后,将IPTG加入到培养物中,其终浓度为0.2mM,将所述培养物在30℃再培养2小时。对带有pTrcMalE-EnzB的Escherichia coli JM 109还进行了不加IPTG的对照培养。Escherichia coli JM 109被用作对照菌株,在有或没有IPTG的条件下按照上述同样的方式进行培养。通过离心收集来自8ml培养物的细胞,再将其悬浮到1ml蒸馏水中。得到的细胞悬浮液被用于在400μl反应混合物中进行的反应,所述反应混合物由250μl所述的细胞悬浮液、1%的底物、0.3%的NaCl、1%的CaCO3、1μg/ml的PQQ和1mM的PMS构成,在室温将该混合物培养16小时。此实验中使用的底物是L-古洛糖。表1中概括了L-古洛糖酸-1,4-内酯加L-古洛糖酸的量和维生素C的量。
表1
菌株 | IPTG | HPLC | |
L-GuL+L-GuA(mM) | 维生素C(mg/L) | ||
JM 109/pTrcMalE-EnzB | + | 8.4 | 42.5 |
- | 4.6 | 10.5 | |
JM 109 | + | nd | nd |
- | nd | nd |
L-GuL:L-古洛糖酸-1,4-内酯;L-GuA:L-古洛糖酸;nd:无法探测到
实施例2:通过携带有酶B基因的Escherichia coli JM 109从L-古洛糖酸-1,4-内酯/L-古洛糖酸生产维生素C
如实施例1中所述来开展实验,除了本实施例中所用的底物为L-古洛糖酸-1,4-内酯。维生素C的量被概括于表2中。
表2
菌株 | IPTG | HPLC |
维生素C(mg/L) | ||
JM 109/pTrcMalE-EnzB | + | 1.4 |
- | 1.2 | |
JM 109 | + | nd |
- | nd |
nd:无法探测到
实施例3:通过携带有酶B基因的Escherichia coli JM 109从L-半乳糖生产L-半乳糖酸-1,4-内酯/L-半乳糖酸
如实施例1中所述来开展实验,除了本实施例中所用的底物为L-半乳糖。表3中概括了L-半乳糖酸-1,4-内酯加L-半乳糖酸的量和维生素C的量。
表3
菌株 | IPTG | HPLC | |
L-GaL+L-GaA(mM) | 维生素C(mg/L) | ||
JM 109/pTrcMalE-EnzB | + | 6.2 | 2.7 |
- | 3.9 | 1.6 | |
JM 109 | + | nd | nd |
- | nd | nd |
L-GaL:L-半乳糖酸-1,4-内酯;L-GaA:L-半乳糖酸;nd:无法探测到
实施例4:通过携带有酶B基因的Escherichia coli JM 109从L-半乳糖酸-1,4-内酯/L-半乳糖酸生产维生素C
如实施例1中所述来开展实验,除了本实施例中所用的底物为L-半乳糖酸-1,4-内酯。维生素C的量被概括于表4中。
表4
菌株 | IPTG | HPLC |
维生素C(mg/L) | ||
JM 109/pTrcMalE-EnzB | + | 4.7 |
- | 3.7 | |
JM 109 | + | nd |
- | nd |
nd:无法探测到
《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》
国际表格
东方科学仪器进出口集团有限公司
为 存活证明
中华人民共和国北京市 按照规定10.2,由本页页尾指
三里河路52号 明的国际保藏单位出具。
中国科学院微生物研究所
I.送交保藏者 | II.微生物识别号 |
名称:东方科学仪器进出口集团有限公司为地址:中华人民共和国北京市三里河路52号中国科学院微生物研究所 | 由所述国际保藏单位给予的编号:DSM 4025保藏日或转移日1:1987-03-17 |
III.存活证明 | |
在2003-08-13对上述第II项中指明的微生物进行了存活性试验。在该日期,所述微生物(x)3存活( )3不再存活 | |
IV.存活性试验所进行的条件4 | |
V.国际保藏单位 | |
名称:DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNGVON MIKROORGANISMENUND ZELLKULTUREN GmbH地址:Mascheroder Weg 1bD-38124 Braunschweig | 具有代表所述国际保藏单位的权力的个人或被授权官员的签名:日期:2003-08-15 |
1.表示最初保藏日期,或者如果进行了新保藏或转移,则表示最近的相关日期(新保藏的日期或转移的日期)。
2.对规定10.2(a)(ii)和(iii)中所指的情况,指最近的存活性试验。
3.在适用的框中打叉。
4.如果已要求该信息并且试验结果为阴性,则需要填写。
DSMZ-BP/9表格(单页)12/2001
序列表
<110>罗奇维生素股份公司(Roche Vitamins AG)
<120>抗坏血酸的生产
<130>Case 21409
<150>EP 02021602
<151>2002-09-27
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1740
<212>DNA
<213>氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1740)
<400>1
atg aac ccc aca acg ctg ctt cgc acc agc gcg gcc gtg cta ttg ctt 48
Met Asn Pro Thr Thr Leu Leu Arg Thr Ser Ala Ala Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
acc gcg ccc gcc gca ttc gcg cag gta acc ccg att acc gat gaa ctg 96
Thr Ala Pro Ala Ala Phe Ala Gln Val Thr Pro Ile Thr Asp Glu Leu
20 25 30
ctg gcg aac ccg ccc gct ggt gaa tgg att aac tac ggc cgc aac caa 144
Leu Ala Asn Pro Pro Ala Gly Glu Trp Ile Asn Tyr Gly Arg Asn Gln
35 40 45
gaa aac tat cgc cac tcg ccc ctg acc cag atc act gcc gac aac gtt 192
Glu Asn Tyr Arg His Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr Ala Asp Asn Val
50 55 60
ggt cag ttg caa ctg gtc tgg gcc cgc ggg atg gag gcg ggg gcc gta 240
Gly Gln Leu Gln Leu Val Trp Ala Arg Gly Met Glu Ala Gly Ala Val
65 70 75 80
cag gtc acg ccg atg atc cat gat ggc gtg atg tat ctg gca aac ccc 288
Gln Val Thr Pro Met Ile His Asp Gly Val Met Tyr Leu Ala Asn Pro
85 90 95
ggt gat gtg atc cag gcg ctg gat gcg caa aca ggc gat ctg atc tgg 336
Gly Asp Val Ile Gln Ala Leu Asp Ala Gln Thr Gly Asp Leu Ile Trp
100 105 110
gaa cac cgc cgc caa ctg ccc gcc gtc gcc acg cta aac gcc caa ggc 384
Glu His Arg Arg Gln Leu Pro Ala Val Ala Thr Leu Asn Ala Gln Gly
115 120 125
gac cgc aag cgc ggc gtc gcc ctt tac ggc acg agc ctc tat ttc agc 432
Asp Arg Lys Arg Gly Val Ala Leu Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Phe Ser
130 135 140
tca tgg gac aac cat ctg atc gcg ctg gat atg gag acg ggc cag gtc 480
Ser Trp Asp Asn His Leu Ile Ala Leu Asp Met Glu Thr Gly Gln Val
145 150 155 160
gta ttc gat gtc gaa cgt gga tcg ggc gaa gac ggc ttg acc agt aac 528
Val Phe Asp Val Glu Arg Gly Ser Gly Glu Asp Gly Leu Thr Ser Asn
165 170 175
acc acg ggg ccg att gtc gcc aat ggc gtc atc gtc gcg ggt tcc acc 576
Thr Thr Gly Pro Ile Val Ala Asn Gly Val Ile Val Ala Gly Ser Thr
180 185 190
tgc caa tat tcg ccc tat gga tgc ttt atc tcg ggg cac gat tcc gcg 624
Cys Gln Tyr Ser Pro Tyr Gly Cys Phe Ile Ser Gly His Asp Ser Ala
195 200 205
acg ggt gag gag ctg tgg cgc aac cac ttt atc ccg cag ccg ggc gaa 672
Thr Gly Glu Glu Leu Trp Arg Asn His Phe Ile Pro Gln Pro Gly Glu
210 215 220
gag ggt gac gag act tgg ggc aat gat ttc gag gcg cgc tgg atg acc 720
Glu Gly Asp Glu Thr Trp Gly Asn Asp Phe Glu Ala Arg Trp Met Thr
225 230 235 240
ggc gtc tgg ggt cag atc acc tat gat ccc gtg acg aac ctt gtg ttc 768
Gly Val Trp Gly Gln Ile Thr Tyr Asp Pro Val Thr Asn Leu Val Phe
245 250 255
tat ggc tcg acc ggc gtg ggc cca gcg tcc gaa acc cag cgc ggc acg 816
Tyr Gly Ser Thr Gly Val Gly Pro Ala Ser Glu Thr Gln Arg Gly Thr
260 265 270
ccg ggc ggc acg ctg tat ggc acc aac acc cgc ttt gcg gtg cgt ccc 864
Pro Gly Gly Thr Leu Tyr Gly Thr Asn Thr Arg Phe Ala Val Arg Pro
275 280 285
gac acg ggc gag att gtc tgg cgt cac cag acc ctg ccg cgc gac aac 912
Asp Thr Gly Glu Ile Val Trp Arg His Gln Thr Leu Pro Arg Asp Asn
290 295 300
tgg gac caa gaa tgc acg ttc gag atg atg gtc gcc aac gtc gat gtg 960
Trp Asp Gln Glu Cys Thr Phe Glu Met Met Val Ala Asn Val Asp Val
305 310 315 320
caa ccc tcg gcc gag atg gag ggt ctg cgc gcc atc aac ccc aat gcg 1008
Gln Pro Ser Ala Glu Met Glu Gly Leu Arg Ala Ile Asn Pro Asn Ala
325 330 335
gcg acg ggc gag cgc cgt gtg ctg acg ggt gcg cct tgc aag acc ggc 1056
Ala Thr Gly Glu Arg Arg Val Leu Thr Gly Ala Pro Cys Lys Thr Gly
340 345 350
acg atg tgg tcg ttt gat gcg gcc tcg ggc gaa ttc ctg tgg gcg cgt 110
Thr Met Trp Ser Phe Asp Ala Ala Ser Gly Glu Phe Leu Trp Ala Arg
355 360 365
gat acc aac tac acc aat atg atc gcc tcg atc gac gag acc ggc ctt 1152
Asp Thr Asn Tyr Thr Asn Met Ile Ala Ser Ile Asp Glu Thr Gly Leu
370 375 380
gtg acg gtg aac gag gat gcg gtg ctg aaa gag ctg gac gtt gaa tat 1200
Val Thr Val Asn Glu Asp Ala Val Leu Lys Glu Leu Asp Val Glu Tyr
385 390 395 400
gac gtc tgc ccg acc ttc ctg ggt ggg cgc gac tgg tcg tca gcc gca 1248
Asp Val Cys Pro Thr Phe Leu Gly Gly Arg Asp Trp Ser Ser Ala Ala
405 410 415
ctg aac ccg gac acc ggc att tac ttc ttg ccg ctg aac aat gcc tgc 1296
Leu Asn Pro Asp Thr Gly Ile Tyr Phe Leu Pro Leu Asn Asn Ala Cys
420 425 430
tac gat att atg gcc gtt gat caa gag ttt agc gcg ctc gac gtc tat 1344
Tyr Asp Ile Met Ala Val Asp Gln Glu Phe Ser Ala Leu Asp Val Tyr
435 440 445
aac acc agc gcg acc gca aaa ctc gcg ccg ggc ttt gaa aat atg ggc 1392
Asn Thr Ser Ala Thr Ala Lys Leu Ala Pro Gly Phe Glu Asn Met Gly
450 455 460
cgc atc gac gcg att gat atc agc acc ggg cgc acc ttg tgg tcg gcg 1440
Arg Ile Asp Ala Ile Asp Ile Ser Thr Gly Arg Thr Leu Trp Ser Ala
465 470 475 480
gag cgc cct gcg gcg aac tac tcg ccc gtt ttg tcg acg gca ggc ggt 1488
Glu Arg Pro Ala Ala Asn Tyr Ser Pro Val Leu Ser Thr Ala Gly Gly
485 490 495
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500 505 510
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Glu Thr Gly Glu Thr Leu Trp Gln Ala Arg Leu Ala Thr Val Ala Thr
515 520 525
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530 535 540
ggt gcg ggc ggt ctg acc tat ggc acg caa ttg aac gcg ccg ctg gcc 1680
Gly Ala Gly Gly Leu Thr Tyr Gly Thr Gln Leu Asn Ala Pro Leu Ala
545 550 555 560
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565 570 575
ctg ccg cag taa 1740
Leu Pro Gln
<210>2
<211>579
<212>PRT
<213>氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)
<400>2
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20 25 30
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145 150 155 160
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Glu Gly Asp Glu Thr Trp Gly Asn Asp Phe Glu Ala Arg Trp Met Thr
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Asp Val Cys Pro Thr Phe Leu Gly Gly Arg Asp Trp Ser Ser Ala Ala
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420 425 430
Tyr Asp Ile Met Ala Val Asp Gln Glu Phe Ser Ala Leu Asp Val Tyr
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Gly Gln Ala Ile Ser Tyr Glu Leu Asp Gly Val Gln Tyr Ile Ala Ile
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Gly Ala Gly Gly Leu Thr Tyr Gly Thr Gln Leu Asn Ala Pro Leu Ala
545 550 555 560
Glu Ala Ile Asp Ser Thr Ser Val Gly Asn Ala Ile Tyr Val Phe Ala
565 570 575
Leu Pro Gln
Claims (12)
1.一种用酶来生产L-抗坏血酸的方法,所述方法包括:
(a)将酶与底物相接触,所述底物选自由L-古洛糖、L-半乳糖所构成的组;以及
(b)从反应混合物中分离出L-抗坏血酸。
其中,所述的酶具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列90%相同的氨基酸序列,并且具有生产L-抗坏血酸的活性。
2.一种用酶来生产L-抗坏血酸的方法,所述的酶具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列90%相同的氨基酸序列,并且具有生产L-抗坏血酸的活性,通过该酶从底物生产出L-抗坏血酸,所述底物选自由L-古洛糖酸-1,4-内酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1,4-内酯、L-半乳糖酸所构成的组。
3.一种用酶来生产L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-古洛糖酸的方法,所述的酶具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列90%相同的氨基酸序列,并且具有生产L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-古洛糖酸的活性,通过该酶从L-古洛糖生产出L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-古洛糖酸。
4.一种用酶来生产L-半乳糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸的方法,所述的酶具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列90%相同的氨基酸序列,并且具有生产L-半乳糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸的活性,通过该酶从L-半乳糖生产出L-半乳糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的方法,其中包括(a)将所述的酶与各自的底物相接触和(b)从反应混合物中分离出产物,所述产物选自由L-抗坏血酸、L-古洛糖酸-1,4-内酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1,4-内酯和L-半乳糖酸所构成的组。
6.如权利要求1至4中任意一项所述的方法,其中所述的方法在1至9之间的pH和13℃至45℃之间的温度下进行1至120小时。
7.如权利要求5所述的方法,其中所述的方法在1至9之间的pH和13℃至45℃之间的温度下进行1至120小时。
8.如权利要求6所述的方法,其中所述的方法在2至8之间的pH和18℃至42℃之间的温度下进行。
9.如权利要求7所述的方法,其中所述的方法在2至8之间的pH和18℃至42℃之间的温度下进行。
10.G.oxydans DSM 4025的酶B在从底物生产L-抗坏血酸的方法中的用途,所述底物选自由L-古洛糖、L-半乳糖、L-古洛糖酸-1,4-内酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1,4-内酯和L-半乳糖酸所构成的组;其中,酶B由根据SEQ ID NO:1的DNA序列或在高严谨度的杂交及洗涤条件下能与SEQ ID NO:1杂交的DNA序列编码。
11.G.oxydans DSM 4025的酶B在用于从L-古洛糖来生产L-古洛糖酸-1,4-内酯或L-古洛糖酸的方法中的用途,其中,酶B由根据SEQ IDNO:1的DNA序列或在高严谨度的杂交及洗涤条件下能与SEQ ID NO:1杂交的DNA序列编码。
12.G.oxydans DSM 4025的酶B在用于从L-半乳糖来生产L-半乳糖酸-1,4-内酯或L-半乳糖酸的方法中的用途,其中,酶B由根据SEQ IDNO:1的DNA序列或在高严谨度的杂交及洗涤条件下能与SEQ ID NO:1杂交的DNA序列编码。
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