CN1351665A

CN1351665A - 山梨糖醇脱氢酶、其编码基因及它们的用途

Info

Publication number: CN1351665A
Application number: CN00807765A
Authority: CN
Inventors: 柴田孝; 市川千代; 松浦光高; 野口祐嗣; 斋藤善正; 山下道雄; 高田叶子
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-03-17
Filing date: 2000-03-16
Publication date: 2002-05-29
Also published as: US20040235105A1; EP1164192A4; US6825018B1; KR20010111574A; HK1047130A1; WO2000055329A1; CA2365092A1; EP1164192A1

Abstract

本发明提供编码D－山梨糖醇脱氢酶(SLDH)的基因;通过培养该基因用表达载体转化的宿主细胞制备SLDH的方法;以及用该培养物制备L－山梨糖或2－酮－L－古洛糖酸(2KLGA)的方法。2KLGA是L－抗坏血酸制备过程中重要的中间体。因此,本发明还提供由上述方法得到的2KLGA制备L－抗坏血酸的方法。

Description

山梨糖醇脱氢酶、其编码基因及它们的用途

技术领域

本发明涉及新型山梨糖醇脱氢酶(本发明中，山梨糖醇脱氢酶是指能催化D-山梨糖醇经氧化转变为L-山梨糖反应的酶，以下略作SLDH)，编码山梨糖醇脱氢酶的基因，应用该基因通过基因操作制备L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸(以下略作2KLGA)的方法，以及与它们的制备相关的表达体系。本发明还涉及L-抗坏血酸或其盐的制备方法，它应用了用上述方法所得到的2KLGA。

背景技术

L-山梨糖是用Reichstein法合成L-抗坏血酸(维生素C)中的重要中间体(参照图1)。D-山梨糖醇经化学氧化后，其生成物中约有一半是D-山梨糖，与此相对，让D-山梨糖醇与具有SLDH活性的微生物接触，可得到收率约为95％的L型山梨糖，所以，以往由D-山梨糖醇转变为L-山梨糖工程中通常应用发酵法。

另一方面，工业上通过化学氧化L-山梨糖而合成2KLGA。已知有这样的微生物，它们用L-山梨糖脱氢酶(SDH)和L-山梨酮脱氢酶(SNDH)，经过两步酶氧化反应，将L-山梨糖转变为2KLGA。但在这些方法中2KLGA的产量很低。

作为用发酵法比以往更有效的生成2KLGA的方法，如分离SLDH基因，将之导入具有SDH和SNDH的微生物中，制备出能从D-山梨糖醇合成2KLGA的重组微生物，然后让该微生物接触D-山梨糖醇。

到目前为止已分离出几个类型的SLDH[Agric.Biol.Chem.，46(1)，135-141(1982)；Biokhimiia，43(6)，1067-1078(1978)；J.Biol.Chem.，224，323(1957)；J.Biol.Chem.，226，301(1957)；J.Bacteriol.，71，737(1956)]。本发明者们已经从氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)属的菌株中分离出编码SLDH的基因，该SLDH是一种膜结合蛋白，由大小两个亚基构成，并与细胞色素c样多肽结合来发挥作用(国际专利申请公开WO99/20763号公报)。除此之外，目前为止还没有有关于其他类型SLDH基因克隆的报道。

因此，本发明的目的是提供新型的在2KLGA发酵生产中有用的SLDH基因，还提供用该基因转化的宿主微生物，尤其是将该基因导入已经具有SDH和SNDH活性的宿主的转化体，或将该基因与SDH基因和SNDH基因一起导入的转化体。本发明的另一目的是提供应用该微生物由D-山梨糖醇制备成L-山梨糖或2KLGA的方法，还提供由该方法所得到的2KLGA制备L-抗坏血酸的方法。本发明的其他目的是提供通过培养用SLDH基因转化的宿主微生物来制备重组SLDH的方法及应用该SLDH通过酶学方法制备L-山梨糖的方法。

发明内容

为了达到上述目的，本发明者们进行了广泛深入研究，结果从具有SLDH活性的葡糖杆菌属菌株的染色体DNA文库中成功地克隆出包括该酶编码区域的DNA。测序的结果表明，该DNA与本发明者们以前分离出的SLDH基因完全不同，它包含新型的SLDH基因。本发明者们还用包含该DNA的表达载体转化假单胞菌，从该重组假单胞菌的培养物中成功地纯化出重组SLDH。另外，再用包含SDH基因和SNDH基因的表达载体转化经包含该DNA的表达载体转化的假单胞菌，用该转化体的培养物成功地将D-山梨糖醇有效地转变成2KLGA，进而完成了本发明。

也就是说，本发明如下所述。(1)SLDH，它具有下述理化性质的。(a)作用：催化将D-山梨糖醇转变为L-山梨糖的反应；(b)分子量：大约54kDa；(c)辅酶：NAD(P)⁺依赖性；(d)底物特异性：特异性氧化山梨糖醇、甘露醇、***糖醇，对木糖醇、核糖醇、肌醇、甘油无作用。(2)上述(1)的SLDH，它来源于氧化葡糖杆菌G624株。(3)SLDH，它与上述(2)所述的SLDH在分子进化上来源于同一基因。(4)上述(3)所述的SLDH，它来源于葡糖杆菌属的细菌。(5)SLDH为以下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表序列号1中所示氨基酸序列构成的蛋白质；(b)上述(a)的氨基酸序列中，一个或数个氨基酸发生缺失、置换、***、添加或修饰，由这样的氨基酸序列构成且催化将D-山梨糖醇转变为L-山梨糖反应的蛋白质。(6)DNA，它编码上述(1)-(5)任一项中所述的SLDH。(7)上述(6)中的DNA为以下(a)或(b)的DNA：(a)由序列表序列号2中所示碱基序列中碱基序号537-1991所示的碱基序列构成的DNA；(b)在严格条件下可与上述(a)中的碱基序列杂交的DNA。(8)上述(6)或(7)的DNA，它来源于葡糖杆菌属的细菌。(9)编码具有SLDH活性的蛋白质的基因，它是能与由序列表序列号2中所示碱基序列中碱基序号537-1991所示的碱基序列构成的DNA及其部分DNA杂交的DNA。(10)来源于葡糖杆菌属的蛋白质，它由上述(9)中的基因编码并具有SLDH活性。(11)一种启动子基因，它含有下述(a)或(b)的DNA。(a)由序列表序列号2所示碱基序列中碱基序号1-536所示的碱基序列构成的DNA；(b)上述(a)的碱基序列中，一个或数个碱基发生缺失、置换、***、添加或修饰，由这样的碱基序列构成且至少在一种微生物中具有启动子活性的DNA。(12)重组载体，它包含上述(6)-(9)任一项的DNA。(13)表达载体，它包含上述(6)-(9)任一项的DNA。(14)上述(13)的表达载体，它还包含编码SDH的DNA和/或编码SNDH的DNA。(15)用上述(13)或(14)的表达载体转化宿主细胞而得到的转化体。(16)上述(15)的转化体，它属于大肠杆菌属、假单胞菌属、葡糖杆菌属、醋杆菌属及假葡糖杆菌属构成的组。(17)上述(15)或(16)的转化体，它具有将D-山梨糖醇转变为2KLGA的能力。(18)具有SLDH活性的蛋白质的制备方法，它包括在培养基中培养用上述(13)的表达载体转化的宿主细胞，从所得培养物中提取(1)-(5)和(10)任一项中的蛋白质等步骤。(19)L-山梨糖的制备方法，它包括在培养基中培养用上述(13)的表达载体转化的宿主细胞，让所得培养物或其处理物接触D-山梨糖醇的过程。(20)2KLGA的制备方法，它包括在培养基中培养用包含编码SDH的DNA和编码SNDH的DNA的表达载体转化的宿主细胞，让所得培养物或其处理物接触用上述(19)的方法得到的L-山梨糖的过程。(21)2KLGA的制备方法，它包括在培养基中培养上述(17)的转化体，让所得培养物或其处理物接触D-山梨糖醇的过程。(22)L-抗坏血酸或其碱金属盐或其碱土金属盐的制备方法，它包括将由上述(20)或(21)的方法得到的2KLGA转变成L-抗坏血酸或其碱金属盐或其碱土金属盐的过程。

本发明的表达SLDH基因的重组细胞是发酵生产L-山梨糖和2KLGA的有效手段。因此，本发明对简单且大量制备L-抗坏血酸极为有利。

附图的简单说明

图1是L-抗坏血酸合成反应路线的示意图。图中R表示烷基。

图2是质粒pUCP19-B7SX2和pUCP19-HC的DNA***片断部分的限制酶谱图，以及pUCP19-HC的DNA***片断部分的测序策略的示意图。

图3是质粒pUCP19-SLDH的基因图。

图4是表达载体pSDH-tufB1-Eco-d9U的基因图。

图5是表达载体pBBR(Km)-SDH·SNDH的基因图。

图6是表达载体pBBR(Tc)-SDH·SNDH的基因图。

图7是表达载体pUCP19-SDH·SNDH的基因图。

实施本发明的最佳方案

本发明的SLDH是催化D-山梨糖醇转变为L-山梨糖的反应、分子量大约54kDa的蛋白质；其特征是以NADP⁺或NAD⁺作为辅酶。除山梨糖醇以外，该酶能特异性氧化甘露醇、***糖醇，但对木糖醇、核糖醇、肌醇、甘油等无作用。

本发明的SLDH只要具有上述特征，其来源不限，除了来源于天然存在的生物之外，还包括来源于自发或人为诱变的突变体或异种、即来源于导入了外源SLDH基因的转化体。优选来源于醋杆菌，特别是葡糖杆菌属细菌，更优选来源于氧化葡糖杆菌，例如氧化葡糖杆菌G624株(FERM BP-4415；国际专利申请公开WO95/23220号公报)的SLDH。在其他优选方案中，本发明的SLDH与氧化葡糖杆菌G624株的SLDH在分子进化上起源于同一基因。这里所讲的“在分子进化上起源于同一基因”是指通过其DNA序列分析、生理学作用的解析等，可以合理地判断该SLDH在分子进化上与氧化葡糖杆菌G624株来源的SLDH由同一基因起源并进化而来，并且它们在DNA序列上保持高度同源性。优选这些SLDH与氧化葡糖杆菌G624株来源的在DNA序列上有60％以上的同源性，最优选有80％以上的同源性。如后面所讲述的，这些SLDH可以序列表序列号2所示的DNA序列为基础，用适当的引物通过PCR法，或通过用适当的探针进行杂交的方法来克隆它们的基因。

在更优选的实施方案中，本发明的SLDH是具有序列表序列号1中所示氨基酸序列的蛋白质，或者在不削弱SLDH活性的范围内，该氨基酸序列中有1或多个氨基酸发生了缺失、置换、***、添加或修饰的氨基酸序列构成的蛋白质。

本发明的SLDH是适当选用以下方法而得到的：(1)以产生该酶的细胞或组织的培养物为原料进行分离、纯化的方法；(2)化学合成方法或；(3)通过基因重组技术制备表达SLDH的细胞，从该细胞中纯化的方法等。

从天然的SLDH产生细胞中分离纯化SLDH的方法可如下进行。即，在适当的液体培养基中培养该细胞，从所得培养物中分离回收包含SLDH活性的组分。例如，当该酶定位于细胞质时(由于本发明的SLDH有NAD(P)⁺依赖性，所以预测它定位于细胞质)，将培养物离心和/或过滤并回收菌体后，通过超声波处理和溶菌酶处理及渗透压休克等将菌体破碎，10000-40000rpm离心，回收上清(可溶性部分)。适当组合应用酶蛋白质分离纯化中常用的分离技术，可从得到的可溶性部分中纯化出目的物SLDH。这样的分离技术有盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度差的方法，透析、超滤、凝胶过滤、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、SDS-PAGE等利用分子量差异的方法，离子交换色谱、羟基磷灰石色谱等利用电荷的方法，亲和色谱等利用特异亲和性的方法，反相高效液相色谱等利用疏水性的方法，等电聚焦电泳等利用等电点的方法等。

通过化学合成制备本发明的SLDH的方法是，如以序列表序列号1所示氨基酸序列为基础，用多肽合成仪合成各序列的全部或一部分，在适当的条件下使所得多肽复性(renaturation)。

但是，在本发明一实施方案中来源于氧化葡糖杆菌G624的SLDH，由于该酶在非生理条件下非常的不稳定，在用上述方法进行纯化的过程中酶有时会失活。象这样的酶，就要利用组氨酸-tag法、GST法等通过添加、改变序列，使之对特定物质具有亲和性，并用亲和色谱快速纯化。因此，本发明SLDH的特别优选的制备方法是，如下所述，从具有该酶的细胞的DNA中克隆出编码该酶的DNA，再通过基因操作，将编码可吸附到金属离子螯合剂的氨基酸序列的核酸序列添加到该DNA中。

酶基因的克隆通常用以下方法进行。首先，从产生目标酶的细胞或组织中，通过上述手段完全或部分纯化出该酶，用埃德曼法确定其N端氨基酸序列。另外，同样用埃德曼法确定用序列特异性蛋白酶将该酶部分水解而得到的寡肽的氨基酸序列。合成具有与所确定的部分氨基酸序列相对应的碱基序列的寡核苷酸，将之作为引物或探针，用PCR法或菌落(或斑点)杂交法，从由产生该酶的细胞或组织中制备的RNA或DNA克隆出编码该酶的DNA。

或者，用完全或部分纯化的酶的全部或一部分作抗原，用常规方法制备该酶的抗体，并由产生该酶的细胞或组织中制备的cDNA或基因组DNA文库，通过抗体筛选克隆出编码该酶的DNA。

但是，象上述来源于氧化葡糖杆菌G624的SLDH那样因不稳定而难以纯化的酶，以其酶活性作标志，可从基因组DNA文库筛选出包含其启动子序列的该酶基因片段。由于SLDH能将D-山梨糖醇转变为L-山梨糖，所以可通过检测生成的L-山梨糖来筛选具有SLDH活性的克隆。但本方法的实施中伴随着许多技术难点。

具体而言，首先用常规方法从具有SLDH活性的细胞或组织中提纯染色体DNA，然后用适当的限制酶酶切上述DNA，优选用在染色体内有多个酶切位点的限制酶进行部分酶切，将所得片段***到适当的克隆载体中。克隆载体例如质粒载体、噬菌体载体等，但从能容纳大的DNA***片段、且能以菌落回收的角度考虑，优选应用粘粒载体和卡隆粒载体。应用噬菌体载体和粘粒载体时，为了得到基因组DNA文库，要进行体外包装。

应用粘粒文库时，用上述所得包装液感染适当的指示菌，优选感染具有高度转化能力的大肠杆菌感受态细胞后，将之涂布到固体培养基上培养。将产生的各菌落分别接种到含有D-山梨糖醇的液体培养基上培养。培养终了后，回收培养上清，用间苯二酚-盐酸反应(Cohen，J.Biol.Chem.，201，71，1953)、间苯二酚-三价铁盐-盐酸反应(Kulka，Biochem.J.，63，542，1956)等己酮糖显色反应筛选具有SLDH活性的候选克隆。

可通过HPLC等检测培养上清中的山梨糖来证实所得克隆具有SDLH活性(即，将D-山梨糖醇转换为L-山梨糖)。

因为粘粒克隆的DNA***片段为35-45kb的非常大的片段，所以为了使亚克隆于质粒的过程更加容易，最好预先去除***DNA的非SLDH基因区域的一部分，使之缩小。作为这种DNA***片段的缩小方法，例如亚克隆到卡隆粒载体等。因为卡隆粒载体有各种长度的间隔DNA，所以可克隆比粘粒载体小的各种长度的DNA。本发明中优选使用能容纳约10-20kb DNA***片段的卡隆粒载体。可用上述方法筛选出具有SLDH活性的卡隆粒克隆。

质粒载体的亚克隆策略是，对上述所得多个卡隆粒克隆进行限制酶图谱分析，用SLDH基因内不存在限制性酶切位点的限制酶使DNA***片段再缩小化，然后与用同样的限制酶处理的质粒载体连接。

除上述策略之外，也可用PCR法直接克隆编码本发明SLDH的DNA。即，用来源于具有该酶活性的细胞或组织的基因组DNA或cDNA(或mRNA)为模板，用可使扩增出的片段覆盖SLDH编码区域的适当的寡核苷酸对作引物，用常规方法进行PCR并扩增包含SLDH编码区的DNA片段。上述方法，在克隆分子进化上与序列已知的SLDH具有相同起源的SLDH基因时特别有用。例如克隆与氧化葡糖杆菌G624株来源的SLDH在分子进化上具有相同起源的其他细菌来源的SLDH基因时，可以序列表序列号2中所示的DNA序列为基础，构建能扩增与包含该序列中碱基序号537-1991所示的碱基序列的DNA片段具有高度同源性的DNA片段的正向及反向引物并进行PCR。另一方面，当与目的SLDH有高度同源性的SLDH的DNA序列未知时，可用5’上游区域比较保守的几个序列作正向引物，以3’下游区域比较保守的几个互补链序列作反向引物，进行PCR并克隆该SLDH基因。SLDH的上下游序列未知时，有必要将退火温度设定得低一些，使模板DNA和使用的引物间既便有某种程度的错配也有可能结合。因此，PCR产物可能是除含有包含目的SLDH基因的片段外，还含有非特异性扩增片段的混合物。此时，将所得扩增片段克隆到适当的克隆载体(例如，TA克隆用的质粒载体)。或者，在目的扩增片段不包含启动子区域时，将之克隆到表达载体并转化大肠杆菌等感受态细胞，用上述方法筛选具有SLDH活性的转化体。

作为克隆分子进化上与序列已知的SLDH具有相同起源的SLDH基因的其他策略，例如以来源于具有该酶活性的细胞或组织的基因组DNA或cDNA(或mRNA)为模板，应用已知DNA序列的全部或一部分作探针，通过Southern法等杂交法直接进行克隆。杂交的条件可根据DNA来源不同，适当变化漂洗强度。例如，根据用于克隆的微生物亲缘关系的远近来适当改变条件，如碱基序列中仅有60％以上的同源性序列形成杂交的条件，或具有80％以上的同源性序列形成杂交的条件等。

上述所得DNA***片段的碱基序列，可用Maxam-Gilbert方法和双脱氧终止法等已知的测序技术进行确定。

编码本发明SLDH的DNA，优选编码序列表序列号1中所示氨基酸序列的DNA，或者编码该氨基酸序列中有1个或多个氨基酸发生缺失、置换、***或添加的氨基酸序列(但是，由该突变氨基酸序列构成的蛋白质能催化由D-山梨糖醇变换成L-山梨糖的反应)的DNA。更优选的是，编码本发明SLDH的DNA基本上由序列表序列号2所示的碱基序列中碱基序号537-1991所示的碱基序列构成的DNA。这里，“基本构成DNA”是指，除由该特定碱基序列构成的DNA以外，由在严格条件下能与该特定碱基序列构成的DNA杂交的碱基序列构成，且编码与该特定碱基序列构成的DNA编码的蛋白质具有同样理化性质的蛋白的DNA。另外，这里“严格条件”是指碱基序列中约60％以上具有同源性的DNA可以杂交的条件。严格程度可通过适当改变杂交反应和漂洗温度、盐浓度等进行调节。

本发明的其他DNA还包括由能与序列表序列号2所示的碱基序列中碱基序号537-1991所示的碱基序列及其部分DNA杂交的碱基序列构成，且编码具有SLDH活性的蛋白质的基因。因此，该基因编码的具有SLDH活性的蛋白质，尤其是来源于葡糖杆菌属的蛋白质，也包含在本发明的范围内。

本发明的DNA不仅可以是上述来自基因组DNA的DNA，也可是来自mRNA的cDNA，或是以序列表序列号2中所示的碱基序列中碱基序号537-1991所示的碱基序列为基础化学合成的DNA。

如上所述以SLDH活性为指标从基因组DNA获得的编码SLDH的DNA，其5’上游区域中包含启动子基因序列。该启动子基因，优选具有序列表序列号2中所示的碱基序列中碱基序号1-536所示的碱基序列，或者由该碱基序列中有1个或多个碱基发生缺失、置换、***、添加或修饰的碱基序列的构成，且是在至少一种微生物中具有启动子活性的DNA。这里的“微生物”优选应用细菌(例如大肠杆菌，枯草杆菌、假单胞菌、葡糖杆菌、假葡糖杆菌、醋杆菌等)和放线菌等原核生物以及酵母等一部分真核生物。

本发明还提供包含编码本发明SLDH的DNA的重组载体。本发明的重组载体包括质粒载体及噬菌体载体等，只要在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞内能复制或自主增殖就没有特殊限制。可利用适当的限制酶切位点，将编码SLDH的DNA***该领域内常用的克隆载体或表达载体内，简单制备该重组载体。

特别是本发明的重组载体为一种表达载体，它配置了在某种宿主细胞内，在功能性启动子的调控下编码SLDH的DNA。对所使用的载体无特殊限制，只要所使用的载体可在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞内发挥作用，并包括调控其下游基因转录的启动子区域和该基因的转录终止信号，即终止子区域，该启动子区域与该终止子区域之间至少包含一个限制酶识别位点，只要是通过包含独一无二的限制酶切位点的序列进行连接的即可，优选包括用于转化体筛选的选择标记基因。还希望该表达载体包含的起始密码子和终止密码子分别位于启动子区域的下游和终止子区域的上游。

当用细菌作宿主细胞时，一般情况下，表达载体除包含上述启动子区域和终止区域外，还有必要含有在宿主细胞内能自主复制的可复制单位。启动子区域中包含启动子、操纵子和Shine-Dalgarno(SD)序列。例如，应用大肠杆菌作宿主时，作为启动子区域有trp启动子，lac启动子、recA启动子、lpp启动子、tac启动子等。用枯草杆菌作宿主时，作为启动子区域有SP01启动子，SP02启动子、penP启动子等。终止区域可用常规的天然或合成终止子。另外，作为选择标记基因，可以应用对四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等各种药物具有抗性的基因。通常用ATG作起始密码子，但根据情况可以用GTG。终止密码子常用TGA、TAA和TAG。

当编码本发明的SLDH的DNA，由产生该酶的细胞或组织来源的基因组DNA制备且在包含原有启动子和终止子区域的状态下得到时，可通过将该DNA***到已知克隆载体的适当位置中而得到本发明的表达载体，上述克隆载体要在转化的宿主细胞内保持复制或自律增殖。当宿主为细菌时，所用的克隆载体如大肠杆菌来源的pBR系列载体、pUC系列载体等或枯草杆菌来源的pUB110、pTP5、pC194载体等。

应用包含编码本发明SLDH的DNA的表达载体制备重组SLDH时，特别是SLDH非常不稳定且在常规纯化方法纯化过程中酶活性有可能失活时，特别优选应用以下包含修饰SLDH编码序列的表达载体。该修饰SLDH编码序列是指将编码特定氨基酸序列的碱基序列添加到原来SLDH编码序列的末端，这样在SLDH表达时，原来SLDH氨基酸序列的末端加上了能迅速纯化SLDH的特定氨基酸序列。作为能迅速纯化SLDH的特定氨基酸序列，如可吸附于金属离子螯合剂的氨基酸序列，优选由组氨酸、赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸构成的序列，更优选由组氨酸构成的序列。这些序列可加到SLDH的氨基端或羧基端，但优选添加到羧基端。构建修饰SLDH编码序列，可通过合成与原来的SLDH编码序列的末端序列一致的碱基序列上添加了编码所要添加氨基酸序列的碱基序列的寡核苷酸，并以此作为引物，以SLDH DNA为模板进行PCR来完成。所得重组SLDH，如下所述，可用固定了可使添加的氨基酸序列吸附的金属离子螯合剂的载体迅速分离纯化。

当包含编码本发明SLDH的DNA的表达载体用于制备2KLGA时，还可应用可在宿主细胞内表达的、除该DNA之外还包含编码SDH和/或SNDH的DNA的表达载体。编码SLDH的DNA、编码SDH的DNA和编码SNDH的DNA可分别在不同的启动子的调控下，也可将其中两个以上串联并受同一启动子的调控。

本发明的转化体可以通过包含编码本发明SLDH的DNA的重组载体转化宿主细胞而进行制备。对宿主细胞无特殊限制，可使用该领域内通常使用的天然存在的细胞或人工制备的突变体细胞或者重组细胞等各种细胞，只要适用于所用重组载体、能进行转化即可。优选细菌，尤其是大肠杆菌(例如DH5α、HB101等)、枯草杆菌、假单胞菌属细菌(例如荧光假单胞菌等)、葡糖杆菌属细菌(例如氧化葡糖杆菌等)、假葡糖杆菌属细菌、醋杆菌属细菌等。

重组载体导入宿主细胞的方法可以用已知方法。例如宿主为大肠杆菌和枯草杆菌等细菌时，可以用Cohen等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69：2110(1972)]、原生质体法[Mol.Gen.Genet.，168：111(1979)]、感受态方法[J.Mol.Biol.，56：209(1971)]、电穿孔方法等。

特别地，本发明的转化体是用包含编码本发明SLDH的DNA的表达载体转化的宿主细胞。当该转化体以由D-山梨糖醇制备2KLGA为目的制备时，宿主细胞必须具有将L-山梨糖转换成2KLGA的能力。优选该宿主细胞是产生SDH和SNDH活性的细胞。作为天然存在的这种细胞，例如属于葡糖杆菌属和醋杆菌属、假葡糖杆菌属细菌，具体而言，如氧化葡糖杆菌T-100(FERM BP-4415；国际专利申请公开WO95/23220)等。另外，作为人工制备的这种细胞，如用功能上含有从上述天然存在的细胞分离出的、编码SDH和SNDH的DNA的表达载体转化的细胞，优选大肠杆菌、假单胞菌属细菌、葡糖杆菌属细菌、假葡糖杆菌属细菌、醋杆菌属细菌等。具体而言，如大肠杆菌JM109-pUC19SD5(国际专利申请公开WO94/20609)、氧化葡糖杆菌NB6939-pSDH-tufB1、氧化葡糖杆菌NB6939-pSDH-trp6、氧化葡糖杆菌NB6939-pSDH-PL1、氧化葡糖杆菌NB6939-pSDH-tac8(以上，国际专利申请公开WO95/23220)等。

另外，本发明的转化体可用在宿主细胞内处于能表达状态的、除编码上述SLDH的DNA之外，还包含编码SDH和/或SNDH的DNA的表达载体转化宿主细胞而得到。当该表达载体缺失编码SDH的DNA或编码SNDH的DNA任何一方时，可与包含该DNA的其他表达载体一起进行共转化。

本发明的重组SLDH的制备是，在适当的培养基中培养上述任一种转化体，该转化体含有包含编码SLDH的DNA的表达载体，从所得培养物中提取SLDH。

所用的营养培养基中的碳源，如葡萄糖、果糖等糖类、甘油等，优选含有L-山梨糖、D-山梨糖醇作为碳源的培养基。另外，也可含有无机或有机氮源(例如：硫酸铵、氯化铵、酪蛋白等水解物，酵母提取物，聚胨，细菌用胰蛋白胨，牛肉提取物等)。另外，根据需要，还可向培养基中添加其他营养源，[例如：无机盐(例如二磷酸钠、或二磷酸钾、磷酸氢二钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钙)、维生素类(例如维生素B1)、抗生素类(例如，氨苄青霉素、卡那霉素)等]。优选以D-山梨糖醇、酵母提取物、CaCO3、甘油为组成成分的培养基。另外，培养基中的糖(D-山梨糖醇)浓度通常为1-50％，优选2-40％。

培养转化体通常在pH5.5-8.5、优选pH6-8，温度通常在18-40℃、优选20-35℃的条件下，培养5-150小时。

根据存在SLDH活性的组分，SLDH的纯化通常适当组合各种分离技术进行。由于本发明的SLDH具有NAD(P)⁺依赖性，所以存在于转化体的可溶性组分的可能性高。此时，在培养结束后，将培养物过滤或离心并回收菌体，通过超声波处理和溶菌酶处理及渗透压休克等将细胞破碎，应用所得菌体提取液。

当重组SLDH以上述的其末端附加了特定氨基酸序列的形式产生时，可通过应用固定了金属离子螯合剂的载体的色谱处理(固定化金属亲合色谱；IMAC)，快速且容易地纯化该SLDH，上述固定了金属离子螯合剂的载体可吸附该特定氨基酸序列。所使用的金属离子螯合吸附剂的制备是，将过渡金属，如钴、铜、镍、二价铁离子，或铁、铝的三价离子等，优选含有二价钴离子的溶液，与吸附了配体、如亚氨基二醋酸盐、次氮基三醋酸盐、三(羟甲基)乙二胺等的基质接触，使之与该配体结合。螯合吸附剂的基质部分只要是通常的不溶性载体，无特殊限制。

本发明的L-山梨糖的制备方法是，在适当的培养基中培养上述任一种转化体，该转化体含有包含编码SLDH的DNA的表达载体，让所得培养物与D-山梨糖醇接触，或者当SLDH活性存在于该转化体的菌体内组分时，通过让菌体抽提液与D-山梨糖醇接触生产L-山梨糖。让D-山梨糖醇接触培养物的方法中包括用含有D-山梨糖醇的培养基培养转化体的方法。

本发明还提供2KLGA的制备方法，它利用了上述方法中得到的L-山梨糖。即，在适当的培养基中培养能将L-山梨糖转换成2KLGA的宿主细胞，优选用包含编码SDH的DNA和编码SNDH的DNA的表达载体转化的宿主细胞。让所得培养液与用上述方法得到的L-山梨糖接触，或者当SDH和SNDH活性存在于该宿主细胞的菌体内组分时，通过让菌体提取液与上述方法得到的L-山梨糖接触产生2KLGA。让L-山梨糖接触培养物的方法中也包括用含有L-山梨糖的培养基培养该宿主细胞的方法。

本发明的其他2KLGA的制备方法是，在适当的培养基中培养用包含编码上述SLDH的DNA的表达载体转化的、能将L-山梨糖转换成2KLGA的宿主细胞，让所得培养液与D-山梨糖醇接触，或者当SLDH、SDH和SNDH活性存在于该宿主细胞的菌体内部分时，通过让菌体提取液与D-山梨糖醇接触产生2KLGA。让D-山梨糖醇接触培养物的方法中也包括用含有D-山梨糖醇的培养基培养该宿主细胞的方法。

本发明的L-山梨糖的制备方法及2KLGA的制备方法中所应用的培养基和培养条件，与上述SLDH的制备方法中应用的条件相同或有一部分差异。

让D-山梨糖醇或L-山梨糖与菌体抽提液接触时，离心或滤过培养终止后的培养物并回收菌体，将之悬浮到适当的缓冲液中，如醋酸缓冲液，通过超声波处理等破碎菌体，离心后将所得上清作为菌体抽提液使用。

可用常规应用的纯化方法(例如，透析、凝胶过滤、用适当的吸附材料进行的柱色谱、高效液相色谱等)，从反应液(用含有D-山梨糖醇或L-山梨糖的培养基培养该转化体时的培养上清)中纯化生产出的L-山梨糖或2KLGA。

可用已知的手段将纯化的2KLGA转换成L-抗坏血酸或其盐(例如，与碱金属或碱土类金属的盐)。这类手段无特殊限制，例如向2KLGA中加入盐酸等强酸并加热的方法。

以下列举实施例对本发明进行详细说明，但本发明的范围不限定于这些简单的例子。实施例1 SLDH的克隆(1)染色体DNA的制备

用由2.5％甘露醇、0.3％聚胨和0.5％酵母提取物组成的培养基(pH6.0)，37℃、48小时培养氧化葡糖杆菌G624株(FERM BP-4415：国际专利申请公开WO95/23220号公报)的单菌落。离心(6000rpm，10分钟)并收集菌体，悬浮到1ml灭菌水中。用1ml STE[20％蔗糖-50mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM EDTA]缓冲液稀释悬浮液，加入2mg溶菌酶后，37℃放置30分钟。加入2.5ml十二烷基肌氨酸钠溶液[1％十二烷基肌氨酸钠-100mM EDTA(pH8.5)]和蛋白激酶K(终浓度100μg/ml)，50℃放置2小时。向其中加入5.5g氯化铯和5mg/ml溴化乙锭0.3ml，20℃、50000离心16小时。分离含染色体DNA部分，用30ml TE[10mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM EDTA]缓冲液溶解后，用5L 1mM的1EDTA透析2次。透析液用异丁醇洗4次，苯酚洗2次，氯仿洗4次后，乙醇沉淀，通过这些步骤进行纯化。用10ml TE溶液将之溶解，得到180μg/ml染色体DNA。(2)粘粒文库的制备

在3ml含有0.5μg/ml卡那霉素的LB培养基[1％聚胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠(pH7.4)]中，37℃、16小时培养大肠杆菌DH1/pcos6EMBL(ATCC 37571；经住友Pharma International公司从ATCC购入)的单菌落，然后取0.5ml接种到放入了50ml含卡那霉素50μg/ml的LB培养基的500ml体积的三角烧瓶中。37℃、8小时培养后，离心(6000rpm，10分钟)收集菌体，用QIAGEN Plasmid MidiKit(QIAGEN公司)纯化粘粒pcos6EMBL。用50U的BamHI37℃、2小时酶切125μg pcos6EMBL，然后用乙醇沉淀进行纯化。用3U小牛小肠来源的碱性磷酸梅(CIAP)37℃、1小进行时脱磷酸处理，然后用乙醇沉淀进行纯化。另一方面，用5U的Sau3A I于37℃、1分钟部分酶切100μg上述(1)中得到的氧化葡糖杆菌G624株的染色体DNA，然后用乙醇沉淀进行纯化。用3U的T4DNA连接酶将1μg该部分酶切产物与约3μg pcos6EMBL的BamH I酶切产物4℃连接16小时。取其中的3μl，用GIGAPACK II Gold Packaging Exact(STRATAGENE公司)进行体外包装。用SM缓冲液[50mM Tris-HCl(pH7.5)-100mMNaCl-8mM MgSO4-0.1％明胶]50倍稀释该包装液，用其25μl感染25μl指示菌(大肠杆菌XL1-Blue MRA)，然后接种到含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃放置一晚。因为得到大约400个菌落，所以大约得到40万克隆的粘粒文库。(3)选具有SLDH活性的克隆

在每孔150μl含有5％山梨糖醇和50μg/ml卡那霉素的0.9倍稀释的LB培养基的96孔圆底培养板(Nalge)上，30℃、3天缓慢振荡培养368个质粒克隆。离心(2000rpm，10分钟)后，向20μl培养上清中加入30μl 0.5mg/ml间苯二酚-乙醇溶液和30μl0.216mg/ml硫酸铁(III)铵-盐酸溶液后，80℃加热1小时。将培养基进行同样反应以作为对照，选择与对照相比出现较强褐色的3个克隆1A4、1A5、4A9作为具有向山梨糖(左旋糖)转换能力的克隆。用HPLC[柱：Polyspher OA KC(E.Merck公司)，7.8×300mm；温度：室温；流动相：0.01N H₂SO₄；流速：0.4ml/min；检测：RI]对这些上清进行分析，由于每个克隆均有山梨糖检测出，所以这3个克隆是具有SLDH活性的克隆。这些粘粒克隆的***片段部分的长度均约为40kb。(4)卡隆粒载体的亚克隆(***片段缩小化)

用20mU的Sau3AI 37℃、1小时部分酶切300ng具有SLDH活性的粘粒克隆1A4。另外，用4U的BamHI37℃、1小时酶切1μg卡隆粒9-28(Nippon gene公司)。将两部分溶液混和后，用乙醇沉淀进行纯化。用2倍稀释的TE缓冲液5μl溶解沉淀，用1U的T4DNA连接酶4℃连接16小时。取其中1μl，用GIGAPACK II XL PackagingExtract(STRATAGENE公司)进行体外包装。将该包装液75μl与75μl SM缓冲液混和，用其感染150μl指示菌(大肠杆菌DH-1)，然后接种到含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养1天。在每孔150μl含有5％山梨糖醇和50μg/ml卡那霉素的0.9倍稀释的LB培养基的96孔圆底培养板(Nalge公司)上，30℃、3天缓慢振荡培养上述培养过程中出现的菌落中的95个。离心(2000rpm，10min)后，向20μl培养上清中加入30μl 0.5mg/ml间苯二酚-乙醇溶液和30μl 0.216mg/ml硫酸铁(III)铵-盐酸溶液后，80℃加热1小时。将培养基的进行同样反应以作为对照，选择与对照相比出现较强褐色的6个克隆G1、C2、A4、B7、H10、B12作为具有向山梨糖转换能力的克隆。这些卡隆粒克隆的***片段部分的长度均约为15kb。(5)SLDH基因向质粒载体中的亚克隆

从到目前为止所得克隆的限制酶图谱可以看出，SLDH基因中不存在SacI位点和XbaI位点。因此，用10U的Sac I和10U的Xba I酶切1μg的卡隆粒B7，得到约6kb(B7SX3)和约9kb(B7SX2)的Sac I-Xba I片段。将这两个片段分别连接到大肠杆菌-假单胞菌穿梭载体pUCP19[pUC19的NarI位点中***了来源于pRO1614的1.8kb的Pst I片段，自大肠杆菌DH5αF’(ATCC 87110)纯化]，然后用电穿孔法转化假单胞菌(Pseudomonas)(随后，将该菌株命名为假单胞菌属F-1。以下应用该命名)，得到Ps./pUCP19-B7SX3和Ps./pUCP19-B7SX2。感受态细胞的制备和转化的条件按大肠杆菌的条件进行。用含山梨糖醇的培养基培养这2个克隆时，发现Ps./pUCP19-B7SX2具有向山梨糖的转化能力。然后用由5％山梨糖醇、1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠、50μg/ml氨苄青霉素构成的培养基(pH7.4)培养Ps./pUCP19-B7SX2，30℃培养4天，得到2.4mg/ml的山梨糖(转换率5％)。用HPLC分析所得山梨糖，可以确认与标准品的保留时间一致。HPLC在与上述(3)同样的条件下进行。再用GC/MS[柱：DB-5(J&W Scientific)，0.32×30m(膜0.25μm)；温度：注射上样＝230℃，柱＝100℃(5分钟)→10℃/分钟加温10分钟→200℃(5分钟)→30℃/分加温1分钟→230℃(4分钟)，检测＝230℃；流量：压力控制20kPa(He)]，确认与标准品的质谱图一致。(6)SLDH基因碱基序列的测定

推测表达SLDH活性的假单胞菌转化株Ps./pUCP19-B7SX2的质粒pUCP19-B7SX2的***片段部分的限制酶图谱如图2所示。用10U的Hind III于37℃、1小时酶切1μg的pUCP19-B7SX2，得到约4kb的Hind III-Hind III片段。将该Hind III-Hind III片段连接到载体pUCP19，构建质粒pUCP19-HC。然后，用该质粒转化假单胞菌，得到Ps./pUCP19-HC。用含山梨糖醇的培养基培养该转化株时，因为可看到SLDH活性的表达，所以可以知道该Hind III-Hind III片段中包含全长SLDH基因。因此，决定测定这一约4kb的Hind III-Hind III片段的碱基序列。首先，将pUCP19-HC的***片段部分分成约1.1kb的SphI-SphI片段(S1)、约0.8kb的EcoRI-SphI片段(ES)和约1.3kb的EcoRI-EcoRI(E1)片段3个部分(图2)，分别将它们亚克隆到pUC18，得到pUC18-S1、pUC18-ES和pUC18-E1。

以质粒pUCP19-HC、pUC18-S1、pUC18-ES和pUC18-E1为模板，用通用引物和反向引物(New England Labs.)作为M13测序引物，进行最初测序。用BigDye Terminator Cycle Sequencingkit(Applied Biosystems公司)荧光标记样品，用ABI PRISM 310Genetic Analyzer(Applied Biosystems公司)进行分析。然后，合成如下11种引物，以pUCP19-HC为模板进行测序，确定了约4kb的Hind III-Hind III片段的碱基序列(序列表序列号2)。SLDH基因测序用引物

SL1 GCTGCTGAGTGATCCG(序列表序列号3)

SL2 GACTGCTACTTCGATCC(序列表序列号4)

SL3 CCTACACCTAGCCTGC(序列表序列号5)

SL4 CAGTGCCGTCATGAGG(序列表序列号6)

SL5 TCCTGATCTCGGTGCG(序列表序列号7)

SL6 GATGCTTCAGCACGGC(序列表序列号8)

SL7 GACGATCACGGAAGGC(序列表序列号9)

SL8 GGTTACGTGGTCGAGG(序列表序列号10)

SL9 CTATACGTGACAGGTCC(序列表序列号11)

SL10 GCGCGATCTGGATACG(序列表序列号12)

SL11 CGAGGATCTCGAACGG(序列表序列号13)

根据碱基序列分析可以找到1455bp的ORF(碱基序号537-1991)。因此，可以推定SLDH由485个氨基酸构成，分子量约为54kDa.。另外，同源性比较的结果发现与荧光假单胞菌的甘露醇脱氢酶有42％的同源性。实施例2重组SLDH的制备(1)表达具有组氨酸-Tag的SLDH(以下叫做His-Tagged SLDH)的质粒的构建

利用6×组氨酸的Tag***是纯化重组蛋白的非常简便的方法。即，表达具有6个组氨酸Tag的蛋白质，利用钴和镍等金属与组氨酸残基的相互作用，通过IMAC分离该蛋白质。首先，为了在SLDH的C末端***6×His，分别应用如下所示的2对引物，以pUCP19-HC(5ng)为模板，用pfu DNA聚合酶(2.5U)进行PCR(94℃，30秒→55℃，2分钟→72℃，2分钟，25个循环)。另外，将引物(各20pmol)在99℃加热4分钟，迅速冷却后应用。

PCR1

引物1(正向)[与SLDH编码序列内NheI位点(下划线)附近的序列一致的序列]

CGGATTGCTAGCGATGGC(序列表序列号14)

引物2(反向)[与SLDH编码序列的3’末端一致的序列，包含6×His(H)、终止密码子(*)及BamH I位点(下划线)]

ATCGAGGATCC TCA ATGATGATGATGATGATG GGCCGGGATGGCGGC

* H H H H H H(序列表序列号15)PCR2

引物3(正向)[包含与BamH I位点(下划线)和与SLDH基因的终止密码子下游序列一致的序列]

ATCGAGGATCCATTCGGCTTTTAGGGTAGC(序列表序列号16)

引物4(反向)[包含与SLDH基因3’非编码区域内Bgl II位点附近序列一致的序列及SacI位点(下划线)]

TAGCTGAGCTCATGGGACAGATCTGAGC(序列表序列号17)

用Nhe I和BamH I酶切PCR1中特异性扩增的约360bp的片段，另外，用BamH I和Sac I酶切PCR2中特异性扩增的约100bp的片段。另外，将用Bgl II和Pst I酶切pUCP19-HC而得的2kb左右的片段***到pUCP19的BamH I-Pst I片段，得到除去了***片段的Bgl II位点下游的质粒pUCP19-SLDH(图3)。用Nhe I和Sac I酶切上述质粒，得到约6.2kb的片段，用T4DNA连接酶将它与上述两次PCR扩增片段连接，构建pUCP19-SLDH-His。用该质粒转化假单胞菌，得到Ps./pUCP19-SLDH-His。(2)His-Tagged SLDH的纯化

将1铂环量的转化株Ps./pUCP19-SLDH-His的冻存菌株接种到15ml体积的加入了2ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的离心管(Corning公司)中，30℃培养16小时。取其1.5ml接种到500ml体积的加入了50ml含5％山梨糖醇和50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的三角烧瓶中，25℃培养3天。通过离心(6000rpm，4℃，5分钟)，收集细菌，然后用10ml含100mM NaCl的20mM Tris-HCl(pH8.0)悬浮。用超声波破碎装置(Tomy UD-201型)将该悬浮液处理5分钟(50％空隙)，离心(15000rpm，4℃，10分钟)后，回收上清作为无细胞提取液。将2ml TARON树脂(CLONTECH公司)加入到15ml体积的离心管(Corning公司)中，用10ml含100mM NaCl的20mMTris-HCl(pH8.0)洗涤2次进行平衡。然后加入上述无细胞提取液5ml，室温振荡20分钟，使His-Tagged SLDH吸附后，用10ml含100mM NaCl的20mM Tris-HCl(pH8.0)洗涤3次，每次10分钟。然后依次加入分别含有10mM、30mM、50mM及100mM咪唑的2ml含100mMNaCl的20mM Tris-HCl(pH8.0)，分别在室温振荡2分钟，洗脱出His-Tagged SLDH。结果，在30mM-50mM咪唑的组分中洗脱出SLDH活性。对该组分进行SDS-PAGE分析时，检测到的几乎是单一条带。(3)N末端氨基酸序列分析

用胶浓度为12.5％的多层胶(第一化学药品公司制)对上述(2)中纯化的His-Tagged SLDH进行电泳，40mA电泳1小时，然后用Horiz-Blot(Atto公司)转移到PVDF膜(Immobilon PSQ，Millipore公司)上。用考马斯亮蓝G250将膜染色，然后用剪刀切出55kDa的认为是SLDH的条带。用蛋白质测序仪G100A(Hewlett-Packard公司)和PTH分析仪1090型(Hewlett-Packard公司)进行氨基酸序列分析，得到与根据SLDH基因的ORF预测的N末端氨基酸序列一致的序列(MITRETLKSL；序列表序列号18)。(4)SLDH活性的确认

除应用的无细胞提取液为10ml、吸附His-Tagged SLDH后的树脂洗涤6次以及用5ml含50mM咪唑及100mM Nacl的20mMTris-HCl(pH8.0)洗脱以外，用与上述(2)同样的方法纯化His-TaggedSLDH。然后，分析所得His-Tagged SLDH与山梨糖醇反应时的生成物。反应液(2ml)组成为10mM(1.82mg/ml)山梨糖醇、0.1M甘氨酸/NaOH缓冲液(pH10.1)、5mM NADP⁺和0.2ml His-Tagged SLDH(41.4μg蛋白)，并于25℃反应24小时。结果生成1.12mg/ml的山梨糖(山梨糖醇残存0.70mg/ml；转换率62％)。由此，可以确认用钴型IMAC纯化的His-Tagged SLDH是氧化山梨糖醇生成山梨糖的山梨糖醇脱氢酶。实施例3 SLDH的特性分析(1)辅酶依赖性及作用的pH范围

向由50mM NAD⁺(或NADP+)0.1ml、500mM缓冲液0.2ml、实施例2的(4)中制备的His-Tagged SLDH溶液10μl(2.1μg蛋白)和蒸馏水0.29ml组成的溶液中添加500mM山梨糖醇0.4ml并开始反应(25℃)，以340nm的吸光度为指标，用分光光度计(UV-2200；岛津制作所)检测NADH(或NADPH)的增加。pH10.1和pH9.0的反应液使用甘氨酸/NaOH缓冲液，pH8.0和pH7.0的反应液使用磷酸钾缓冲液。酶活性1U的定义是1分钟内生成的1μmol NADH(或NADPH)所需的酶量。NAD(P)H的分子吸光系数为6.3mM^-1cm^-1。另外，蛋白量的测定是以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，用Lowry法进行测定。结果表明，SLDH能利用NAD⁺和NADP⁺任一种作辅酶，而NADP+特异性高。另外，该酶活性在碱性pH下较高(表1)。

表1

辅酶	pH	活性(U/mg蛋白)
辅酶	pH	活性(U/mg蛋白)	NADP⁺	10.1	130.2
9.0	30.0			10.1	130.2
9.0	30.0	8.0		22.9
7.0	4.2	8.0		22.9
7.0	4.2	NAD⁺		10.1	8.1
9.0	3.4			10.1	8.1
9.0	3.4		8.0	1.2
7.0	0.1		8.0	1.2

(2)底物特异性

除用各种底物替换山梨糖醇、缓冲液用甘氨酸/NaOH缓冲液(pH10.1)、以NADP⁺为辅酶外，其余与上述(1)的反应液完全相同的条件下测定SLDH活性。结果表明，该酶可利用山梨糖醇、甘露醇、***糖醇作底物，而对木糖醇、核糖醇、肌醇或甘油无作用(表2)。

表2

底物	活性(U/mg蛋白)
底物	活性(U/mg蛋白)	山梨糖醇	130.2
甘露醇	85.7	山梨糖醇	130.2
甘露醇	85.7	***糖醇	88.1
木糖醇	0	***糖醇	88.1
木糖醇	0	核糖醇	0
肌醇	0	核糖醇	0
肌醇	0	甘油	0

(3)Michaelis常数

以山梨糖醇为底物，按上述(2)的方法测定SLDH活性时，对应于山梨糖醇的Km值为132mM(25℃)。实施例4携有SNDH/SDH表达载体的假单胞菌转化株的制备及用该转化株研究2KLGA的生产性能

应用Louisiana州立大学医学中心的Kovach博士提供的广谱质粒pBBR系列质粒[Gene，166，175(1995)]中的pBBR1MCS-2(卡那霉素抗性)和pBBR1MCS-3(四环素抗性)作载体，将SNDH/SDH基因导入假单胞菌属株，研究所得转化体由L-山梨糖发酵生成2KLGA的能力。(1)SNDH/SDH表达广谱质粒的构建

用50U的EcoR I(Behringer-Mannheim公司)于37℃、1小时酶切5μg含有以tufB作启动子的SNDH/SDH基因的质粒pSDH-tufB1-Eco-d9U(图4)，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳后，分离出含有SNDH/SDH基因的3.7kb的EcoR I-EcoR I片段。将该片段***pBBR1MCS-2的EcoRI位点。将其中与β-半乳糖苷酶基因按同一方向***的质粒命名为pBBR(Km)-SDH·SNDH(图5)。

用50U的EcoR I(Behringer-Mannheim公司)于37℃、1小时酶切10μg含有以tufB作启动子的SNDH/SDH基因的质粒pSDH-tufB1(构建方法记载于欧洲专利申请公开公报EP0758679A1)，然后用Klenow片段(Nippon Gene公司)室温处理30分钟，使末端平滑化。用T4DNA连接酶(TOYOBO公司)将Pst I接头(GCTGCAGC，TOYOBO公司)连接到该末端后，用50U Pst I(Behringer-Mannheim公司)于37℃酶切1小时。酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，分离出含有SNDH/SDH基因的3.7kb的Pst I-Pst I片段。将该片段***pBBR1MCS-3的Pst I位点。将其中与β-半乳糖苷酶基因按同一方向***的质粒命名为pBBR(Tc)SDH·SNDH(图6)。(2)假单胞菌感受态细胞的制备

将假单胞菌属F-1的甘油冻存菌体接种到16.5×165mm试管中，该试管中含有3ml由1％细菌用胰蛋白胨(Difco公司)、0.5％酵母提取物(Difco公司)、1％氯化钠构成的培养基(pH7.4)，30℃培养一晚。将所有培养液接种到含50ml L培养基的500ml体积的三角烧瓶中，25℃培养6小时。将培养液离心并收集细菌，然后用预冷的10％甘油水溶液30ml洗涤2次。将洗涤过的菌体悬浮到少量预冷的10％甘油水溶液中，分装成每份60μl，液氮中速冻。(3)假单胞菌的转化

冰浴中解冻液氮中冻存的假单胞菌属F-1的感受态细胞，分别加入1μl(约1μg)在上述(1)中构建的SNDH/SDH表达广谱质粒pBBR(Km)-SDH·SNDH和pBBR(Tc)-SDH·SNDH的溶液，4℃保持30分钟。用Gene Pluser基因导入装置(Bio-Rad公司)在电极间距离为0.1cm的小杯中，200欧姆、1.8kV、25μF的条件下进行转化，然后悬浮到含0.4％甘油的L培养基中，30℃振荡1小时。分别接种到含50μg/ml卡那霉素的L琼脂培养皿上和含20μg/ml四环素的L琼脂培养皿上，30℃培养2天，得到转化株Ps./pBBR(Km)-SDH·SNDH和Ps./pBBR(Tc)-SDH·SNDH。(4)用转化株由山梨糖醇发酵生产2KLGA

将上述(3)中得到的转化株Ps./pBBR(Km)-SDH·SNDH和Ps./pBBR(Tc)-SDH·SNDH的单菌落分别接种到含5ml L培养基的16.5×165mm试管中，30℃培养2天。将其培养液0.5ml接种到含有10ml 2KLGA生产用培养基(pH7.4)的100ml体积的三角烧瓶中，该培养基由5％山梨糖、0.1％葡萄糖、0.9％细菌用胰蛋白胨(Difco公司)、0.45％酵母提取物(Difco公司)、0.9％氯化钠、2％碳酸钙构成，30℃培养5天。将培养液离心，确定培养上清中山梨糖、山梨酮、2KLGA和L-艾杜糖酸的含量。用HPLC分别在以下条件下确定山梨糖、山梨酮、2KLGA和L-艾杜糖酸的含量。[山梨糖]柱：Polyspher OA KC(7.8mm内径×300mm；Cica-MERCK)流动相：0.01N H₂SO₄柱温：室温流速：0.4ml/分钟检测：示差折射计[山梨酮(柱后标记法)]柱：Polyspher OA KC(7.8mm内径×300mm；Cica-MERCK)流动相(标记试剂)：0.04M盐酸苄醚

0.25M亚硫酸钾

2mM硼酸/0.1N氢氧化钾流速：0.3ml/分钟检测：荧光检测器(激发波长：315nm，检测波长405nm)[2KLGA和L-艾杜糖酸]柱：Capcell pak NH2(4.6mm内径×250mmm；资生堂)流动相：30％乙腈，20mM磷酸钙(pH3.0)流速：1.2ml/分钟检测：UV-210nm

结果表明，Ps./pBBR(Km)-SDH·SNDH的由山梨糖生成2KLGA的转换率约为18％，与生成L-艾杜糖酸的转换率合计时约为37％。Ps./pBBR(Tc)-SDH·SNDH的由山梨糖生成2KLGA的转换率约为26％，与生成L-艾杜糖酸的转换率合计时约为47％。

表3 转化株的培养结果(mg/ml)

转化株山梨糖山梨酮 2KLGA L-艾杜糖酸Ps./pBBR(Km)-SDH·SNDH 12.5(25.0) 0.3(0.6) 8.9(17.8) 9.6(19.6)Ps./pBBR(Tc)-SDH·SNDH 15.6(31.2) 0.15(0.3) 13(26.0) 10.3(20.6)括符内的数值表示转换率(相对于初期山梨糖浓度的生成物浓度％)

为了进行比较，对非转化株假单胞菌属F-1的2KLGA和L-艾杜糖血酸的生产能力也进行了检测。将假单胞菌属F-1的甘油冻存菌体接种到含5ml L培养基的16.5×165mm试管中，30℃培养1天。将其培养液1ml接种到含有10ml培养基(pH7.4)的100ml体积的三角烧瓶中，该培养基由5％山梨糖、0.9％细菌用胰蛋白胨(Difco公司)、0.45％酵母提取物(Difco公司)、0.9％氯化钠构成，30℃培养3天。将培养液离心，用同样的方法确定培养上清中山梨糖、山梨酮、2KLGA和L-艾杜糖酸的含量。结果表明，山梨糖仅剩5.7mg/ml，但未检测到山梨酮、2KLGA和L-艾杜糖酸。

由以上可知，通过将SNDH/SDH基因导入2KLGA和L-艾杜糖酸的非生产性假单胞菌属F-1中，可得到由山梨糖生成2KLGA和L-艾杜糖酸的高生产性转化株。实施例5携有SNDH/SDH表达载体的假单胞菌转化株的制备及用该转化株研究2KLGA的生产性能(2)

与实施例4同样，以假单胞菌属的其他菌株(假单胞菌IFO3309株；由(财)发酵研究所(大阪市淀川区十三本街2-17-85)提供)作宿主，制备导入了SNDH/SDH基因的转化株，检测该转化株的2KLGA和L-艾杜糖酸的生产性能。(1)假单胞菌IFO3309株中导入SNDH/SDH基因

用与实施例4中(2)同样的方法处理假单胞菌IFO3309株的甘油冻存菌体，制备感受态细胞的冻存菌体。冰浴中解冻液氮中冻存的该感受态细胞后，加入1μl(约1μg)SNDH/SDH表达广谱质粒Ps./pBBR(Km)-SDH·SNDH，4℃保持30分钟。用Gene Pluser基因导入装置(Bio-Rad公司)在与实施例4中(3)相同的条件下进行转化，得到转化株Ps.IFO3309/pBBR(Km)-SDH·SNDH。(2)转化株的2KLGA的发酵生产

将上述(1)中得到的Ps.IFO3309/pBBR(Km)-SDH·SNDH 1铂环量接种到含5ml由2％山梨糖醇和0.5％酵母提取物(Difco公司)构成的培养基(pH7.0)的16.5×165mm试管中，28℃培养1天。将其培养液1ml接种到含有10ml培养基(pH7.0)的100ml体积的三角烧瓶中，该培养基由5％山梨糖醇、0.2％聚胨(和光纯药)、0.5％酵母提取物(Difco公司)、0.1％K₂HPO₄、0.5％MgSO·7H₂O、2％CaCO构成，28℃培养7天。将培养液离心，用与实施例4中(4)同样的方法确定培养上清中山梨糖醇、山梨糖、山梨酮、2KLGA和L-艾杜糖酸的含量。为了进行比较，在相同的条件下培养非转化株假单胞菌IFO3309株，确定培养上清中山梨糖醇、山梨糖、山梨酮、2KLGA和L-艾杜糖酸的含量。

结果表明，非转化株的山梨糖醇仅剩0.4mg/ml，并生成3.9mg/ml的山梨糖，但未检测到山梨酮、2KLGA和L-艾杜糖酸。另一方面，转化株Ps.IFO3309/pBBR(Km)-SDH·SNDH生成1.2mg/ml的2KLGA和0.5mg/ml的L-艾杜糖酸(表4)。也就是说，在假单胞菌IFO3309不能生成2KLGA和L-艾杜糖酸的条件下，也能通过将SNDH/SDH基因导入该宿主细胞而给予由山梨糖醇生成2KLGA和L-艾杜糖酸的能力。

表4转化株的培养结果(mg/ml)

转化株山梨糖山梨酮 2KLGA L-艾杜糖酸Ps.3309/pBBR(Km)-SDH·SNDH 0.41 1.8 1.2 0.5实施例6用导入了SLDH表达载体和SNDH/SDH表达载体的假单胞菌转化株制备2KLGA(1)携有SLDH表达载体和SNDH/SDH表达载体的假单胞菌转化株的制备

如上所述，将来源于氧化葡糖杆菌T-100(FERM BP-4188；欧洲专利申请公开公报EP 0758679 A1)的SNDH/SDH基因整合到pBBR1MCS-2中，构建表达载体pBBR(Km)-SDH·SNDH(图5)。用电穿孔法将pBBR(Km)-SDH·SNDH导入实施例1的(5)中获得的重组假单胞菌Ps./pUCP19-B7SX2中，获得Ps./pUCP19-B7SX2+pBBR(Km)-SDH·SNDH。(2)用假单胞菌转化株生产2KLGA

在由5％山梨糖醇、1％细菌用胰蛋白胨(Difco公司)、0.5％酵母提取物(Difco公司)、1％氯化钠、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、2％轻质碳酸钙构成的培养基(pH7.4)中培养Ps./pUCP19-B7SX2+pBBR(Km)-SDH·SNDH，30℃培养4天，得到1.1mg/ml的2KLGA和1.7mg/ml的艾杜糖酸。用HPLC分离提取2KLGA，并证实与标准品的保留时间一致。再用GC/MS证实与标准品的质谱图形一致。HPLC与GC/MS分别在与实施例1中(3)和(5)相同的条件进行。实施例7各种假单胞菌转化株的制备(1)Ps./pUCP19-SLDH+pBBR(Km)-SDH·SNDH

用实施例2的(1)中构建的pUCP19-SLDH转化假单胞菌属F-1，得到Ps./pUCP19-SLDH。再将pBBR(Km)-SDH·SNDH导入该重组假单胞菌中，得到Ps./pUCP19-SLDH+pBBR(Km)-SDH·SNDH。(2)Ps./pUCP19-SLDH-tufB+pBBR(Km)-SDH·SNDH

为了在SLDH基因起始密码子上游导入Ssp I位点，以pUCP19-SLDH(5μg)作模板，在下述引物(各20pmol)存在下，用pfu DNA聚合酶(2.5U)进行PCR(94℃，30秒→55℃，2分钟→72℃，2分钟，25个循环)。

正向引物[包含与Ssp I位点(下划线)和SLDH编码序列的5’端一致的序列]

TAGGAATATTTCTCATGATTACGCGCGAAACCC(序列表序列号19)

反向引物[与SLDH编码序列内Eag I位点下游序列一致的序列]

GATGCTTCAGCACGGC(序列表序列号20)

用Ssp I和Eag I酶切PCR特异性扩增的约360bp的片段。另外，用Pst I和Eag I酶切pUCP19-SLDH，得到约5.7kb的片段。用T4DNA连接酶连接这两个片段与包含tufB启动子的Pst I-Ssp I片段(序列表序列号21)，构建pUCP19-SLDH-tufB。然后用该质粒转化假单胞菌，得到Ps./pUCP19-SLDH-tufB。再导入表达SNDH/SDH活性的pBBR(Km)-SDH·SNDH，得到Ps./pUCP19-SLDH-tufB+pBBR(Km)-SDH·SNDH。(3)Ps./pUCP19-3DH

用40U的Kpn I和40U的Pst I酶切5μg的pUCP19-SLDH-tufB，37℃酶切1小时，得到1.6kb片段。另外，用10U的Kpn I和10U的Pst I酶切1μg的pUCP19-SDH·SNDH(将氧化葡糖杆菌T-100来源的SNDH/SDH基因整合到pUCP19的表达载体；图7)，37℃酶切1小时，得到8.2kb片段。用T4DNA连接酶连接这两个片段，构建pUCP19-3DH。然后用该质粒转化假单胞菌，得到Ps./pUCP19-3DH。实施例8 2KLGA的生产性能的研究

由于证实了重组假单胞菌能生产2KLGA，用实施例6和7中得到的4种转化株，研究在各种组成的培养基中的2KLGA生产性能。[培养1]

将1铂环量的Ps./pUCP19-B7SX2+pBBR(Km)-SDH·SNDH接种到含2ml由1％细菌用胰蛋白胨(Difco公司)、0.5％酵母提取物(Difco公司)、I％NaCl、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素构成的培养基(pH7.4)的15ml体积的试管(Falcon公司)中，30℃预培养1天。将预培养液0.5ml接种到含有10ml主培养基(pH7.0)的100ml体积的三角烧瓶中，该培养基由5％山梨糖醇、5％酵母提取物(Difco公司)、0.15％MgSO₄·7H₂O、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、4％CaCO₃构成，30℃培养3天。[培养2]

除将培养基中的5％酵母提取物换成5％酪蛋白水解物外，其余与[培养1]相同的条件下进行培养。[培养3]

除在主培养基中再添加1％甘油外，其余与[培养1]相同。[培养4]

本培养中，除应用Ps./pUCP19-SLDH+pBBR(Km)-SDH·SNDH作生产菌，向主培养基中再添加5％甘油外，其余条件与[培养1]相同。[培养5]

本培养中，除应用Ps./pUCP19-SLDH-tufB+pBBR(Km)-SDH·SNDH作生产菌，向主培养基中再添加5％甘油外，其余与[培养1]相同。[培养6]

本培养中，除应用Ps./pUCP19-SDH作生产菌，除去预培养基和主培养基中的卡那霉素，向主培养基中再添加5％甘油外，其余与[培养1]相同。

确定各培养中山梨糖醇、山梨糖、山梨酮、2KLGA的含量。结果如表5所示。可以证实，通过向培养基中添加甘油，可提高向2KLGA的转换率。[培养7]

除将主培养基中的酵母提取物浓度定为2％、再向主培养基中添加5％甘油外，在与[培养1]相同的条件下培养7天。确定培养第1、3、5和7天时山梨糖醇、山梨糖、山梨酮、2KLGA的含量。结果如表5所示。

表5

培养		山梨糖醇	山梨糖	山梨酮	2KLGA	艾杜糖酸
培养		山梨糖醇	山梨糖	山梨酮	2KLGA	艾杜糖酸	1		44.1	6.3	0.1	3.7	1.6
2		44.8	3.1	0	4.8	2.2	1		44.1	6.3	0.1	3.7	1.6
2		44.8	3.1	0	4.8	2.2	3		26.7	5.1	0	10.9	8.4
4		26.6	0	0	9.0	ND	3		26.7	5.1	0	10.9	8.4
4		26.6	0	0	9.0	ND	5		26.6	0	0	10.7	ND
6		30.7	5.2	0	7.5	ND	5		26.6	0	0	10.7	ND
6		30.7	5.2	0	7.5	ND	7	天数	山梨糖醇	山梨糖	山梨酮	2KLGA	艾杜糖酸
1	41.1	0	0	4.2	ND			天数	山梨糖醇	山梨糖	山梨酮	2KLGA	艾杜糖酸
1	41.1	0	0	4.2	ND	3		25.6	0	0	10.6	ND
5	14.2	0	0	16.3	ND	3		25.6	0	0	10.6	ND
5	14.2	0	0	16.3	ND	7		7.6	0	0	18.4	15.5

(单位：mg/ml)ND：未定量实施例9用导入了SLDH表达载体和/或SNDH/SDH表达载体的恶臭假单胞菌转化株发酵生产山梨糖或2KLGA

以下实验中，恶臭假单胞菌IFO3738株感受态细胞的制备和转化与上述假单胞菌属F-1同样的条件下进行。但是，由于恶臭假单胞菌IFO3738株具有氨苄青霉素抗性，所以应用氨苄青霉素抗性作选择标记时，在电穿孔后，将细胞接种到含500μg/ml氨苄青霉素(通常量的10倍)的L琼脂培养皿上，30℃培养1天，通过挑选大的菌落筛选转化体。(1)用导入了SLDH表达载体的转化株由山梨糖醇发酵生产山梨糖

将SLDH基因导入恶臭假单胞菌IFO3738株中(pUCP19-SLDH)。将所得转化株恶臭假单胞菌IFO3738/pUCP19-SLDH的单菌落接种到含有10ml山梨糖生产用培养基(pH7.4)的100ml体积的三角烧瓶中，该培养基由5％山梨糖醇、0.9％细菌用胰蛋白胨(Difco公司)、0.45％酵母提取物(Difco公司)、0.9％氯化钠和500μg/ml氨苄青霉素构成，30℃培养3天。将培养液离心，确定培养上清中山梨糖醇和山梨糖的含量。结果表明，残存34.6mg/ml的山梨糖醇，生成7.6mg/ml的山梨糖。(2)用导入了SNDH/SDH表达载体的转化株由山梨糖发酵生产2KLGA

将SNDH/SDH基因(pBBR(Km)-SDH·SNDH)导入恶臭假单胞菌IFO3738株中。将所得转化株恶臭假单胞菌IFO3738/pBBR(Km)-SDH·SNDH的单菌落接种到含有10ml 2KLGA生产用培养基(pH7.4)的100ml体积的三角烧瓶中，该培养基由5％山梨糖、0.9％细菌用胰蛋白胨(Difco公司)、0.45％酵母提取物(Difco公司)、0.9％氯化钠、2％碳酸钙和50μg/ml卡那霉素构成，30℃培养7天。将培养液离心，确定培养上清中山梨糖、2KLGA和艾杜糖酸的含量。结果表明，残存34.3mg/ml的山梨糖，生成13.9mg/ml的2KLGA和3.5mg/ml的艾杜糖酸。(3)用导入了SLDH表达载体和SNDH/SDH表达载体的转化株由山梨糖醇发酵生产2KLGA

将SLDH基因和SNDH/SDH基因(pUCP19-SLDH和pBBR(Km)-SDH·SNDH)导入恶臭假单胞菌IFO3738株中。将所得转化株恶臭假单胞菌IFO3738/pUCP19-SLDH+pBBR(Km)-SDH·SNDH的单菌落接种到含有10ml 2KLGA生产用培养基(pH7.4)的100ml体积的三角烧瓶中，该培养基由5％山梨糖醇、0.9％细菌用胰蛋白胨(Difco公司)、0.45％酵母提取物(Difco公司)、0.9％氯化钠、2％碳酸钙、500μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素构成，30℃培养7天。将培养液离心，确定培养上清中山梨糖醇、山梨糖、2KLGA和艾杜糖酸的含量。结果表明，残存35.6mg/ml的山梨糖醇，生成13.2mg/ml的2KLGA和2mg/ml的艾杜糖酸。但未检测出山梨糖。

序列表的说明序列号3：pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸。序列号4：pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸。序列号5：pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸。序列号6：pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸。序列号7：pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸。序列号8：pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸。序列号9：pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸。序列号10：pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸。序列号11：pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸。序列号12：pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸。序列号13：pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸。序列号14：为了扩增编码His-tagged SLDH和启动子的DNA序列而设计的作为正向引物应用的寡核苷酸。序列号15：为了扩增编码His-tagged SLDH和启动子的DNA序列而设计的作为反向引物应用的寡核苷酸。序列号16：为了扩增SLDH基因的3’端非编码区域的DNA序列而设计的作为正向引物应用的寡核苷酸。序列号17：为了扩增SLDH基因的3’端非编码区域的DNA序列而设计的作为反向引物应用的寡核苷酸。序列号18：SLDH的N末端氨基酸序列。序列号19：为了将Ssp I限制性位点导入SLDH编码序列的5’上游区域而设计的作为PCR引物(正向)应用的寡核苷酸。序列号20：为了将Ssp I限制性位点导入SLDH编码序列的5’上游区域而设计的作为PCR引物(反向)应用的寡核苷酸。

本专利是以在日本申请的平成11年专利申请第72810号和平成11年专利申请第224679号为基础，其内容均包括在本说明书中。

另外，本说明书中所引用的包含专利和专利申请的文献，引用部分其全部内容均已公开并相应地在本说明书中作为参考。

序列表<110>藤泽药品工业株式会社<120>山梨糖醇脱氢酶、其编码基因及它们的用途<130>09348<150>JP11-72810<151>1999-03-17<150>JP11-224679<151>1999-08-06<160>20<210>1<211>485<212>PRT<213>氧化葡糖杆菌(G1uconobacter oxydans)<400>1Met Ile Thr Arg G1u Thr Leu Lys Ser Leu Pro Ala Asn Val Gln Ala1 5 10 15Pro Pro Tyr Asp Ile Asp Gly Ile Lys Pro Gly Ile Val His Phe Gly

20 25 30Val Gly Asn Phe Phe Arg Ala His Glu Ala Phe Tyr Val Glu Gln Ile

35 40 45Leu Glu His Ala Pro Asp Trp Ala Ile Val Gly Val Gly Leu Thr Gly

50 55 60Ser Asp Arg Ser Lys Lys Lys Ala Glu Glu Phe Lys Ala Gln Asp Cys65 70 75 80Leu Tyr Ser Leu Thr Glu Thr Ala Pro Ser Gly Lys Ser Thr Val Arg

85 90 95Val Met Gly Ala Leu Arg Asp Tyr Leu Leu Ala Pro Ala Asp Pro Glu

100 105 110Ala Val Leu Lys His Leu Val Asp Pro Ala Ile Arg Ile Val Ser Met

115 120 125Thr Ile Thr Glu G1y Gly Tyr Asn Ile Asn Glu Thr Thr G1y Ala Phe

130 135 140Asp Leu Glu Asn Ala Ala Val Lys Ala Asp Leu Lys Asn Pro Glu Lys145 150 155 160Pro Ser Thr Val Phe Gly Tyr Val Val Glu Ala Leu Arg Arg Arg Trp

165 170 175Asp Ala Gly Gly Lys Ala Phe Thr Val Met Ser Cys Asp Asn Leu Arg

180 185 190His Asn Gly Asn Val Ala Arg Lys Ala Phe Leu Gly Tyr Ala Lys Ala

195 200 205Arg Asp Pro Glu Leu Ala Lys Trp Ile Glu Glu Asn Ala Thr Phe Pro

210 215 220Asn Gly Met Val Asp Arg Ile Thr Pro Thr Val Ser Ala Glu Ile Ala225 230 235 240Lys Lys Leu Asn Ala Ala Ser Gly Leu Asp Asp Asp Leu Pro Leu Val

245 250 255Ala Glu Asp Phe His Gln Trp Val Leu Glu Asp Gln Phe Ala Asp Gly

260 265 270Arg Pro Pro Leu Glu Lys Ala Gly Val Gln Met Val Gly Asp Val Thr

275 280 285Asp Trp Glu Tyr Val Lys Ile Arg Met Leu Asn Ala Gly His Val Met

290 295 300Leu Cys Phe Pro Gly Ile Leu Val Gly Tyr Glu Asn Val Asp Asp Ala305 310 315 320Ile Glu Asp Ser Glu Leu Leu Gly Asn Leu Lys Asn Tyr Leu Asn Lys

325 330 335Asp Val Ile Pro Thr Leu Lys Ala Pro Ser Gly Met Thr Leu Glu Gly

340 345 350Tyr Arg Asp Ser Val Ile Ser Arg Phe Ser Asn Lys Ala Met Ser Asp

355 360 365Gln Thr Leu Arg Ile Ala Ser Asp Gly Cys Ser Lys Val Gln Val Phe

370 375 380Trp Thr Glu Thr Val Arg Arg Ala lle Glu Asp Lys Arg Asp Leu Ser385 390 395 400Arg Ile Ala Phe Gly Ile Ala Ser Tyr Leu Glu Met Leu Arg Gly Arg

405 410 415Asp Glu Lys Gly Gly Thr Tyr Glu Ser Ser Glu Pro Thr Tyr Gly Asp

420 425 430Ala Glu Trp Lys Leu Ala Lys Ala Asp Asp Phe Glu Ser Ser Leu Lys

435 440 445Leu Pro Ala Phe Asp Gly Trp Arg Asp Leu Asp Thr Ser Glu Leu Asp

450 455 460Gln Lys Val Ile Val Leu Arg Lys Ile Ile Arg Glu Lys Gly Val Lys465 470 475 480Ala Ala Ile Pro Ala

485<210>2<211>4115<212>DNA<213>氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)<220><221>CDS<222>(537)..(1994)<400>2aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccggtt ttggcagcgc tccctagatt 60gatgcggcgt ctgttgaccg acatgatgct ggtggcacgt gccattgcga cggggcgtgc 120gaccgggaac acaggcctgc tgcctttgta caaggggctg agtcatgcgc tgcgtgggct 180ggcacatagt tgcgaagagc agttgcgcgc aaagcagaac cagcatgaac agcagtccga 240agacgaggaa atcctcggcc tcctaccgcg attggaagag cagacccgtc ctgagatgcg 300ttttgtgatg tccctgttcc gcgaggatct cgaacgggct gttggggtgc tcatgcgttc 360tgatgcgagt gccgcaaaag gtctctgaac aggacgtccc gcggagggca gtcagaggtc 420gaaatggctc ctgttgaaac cgtcattcgg tttttacgtt gtttcggggc tatgatggca 480catgcccggc cttgtcggtc cccgtcagcg accggcccga aaccacggag aattcc atg 539

Met

1att acg cgc gaa acc ctt aag tct ctt cct gcc aat gtc cag gct ccc 587Ile Thr Arg Glu Thr Leu Lys Ser Leu Pro Ala Asn Val Gln Ala Pro

5 10 15ccc tat gac atc gac ggg atc aag cct ggg atc gtg cat ttc ggt gta 635Pro Tyr Asp Ile Asp Gly Ile Lys Pro Gly Ile Val His Phe Gly Val

20 25 30ggt aac ttt ttt cga gcc cat gag gcg ttc tac gtc gag cag att ctt 683Gly Asn Phe Phe Arg Ala His Glu Ala Phe Tyr Val Glu Gln Ile Leu

35 40 45gaa cac gct ccg gac tgg gcg att gtt ggt gtt ggc ctg acg ggc agt 731Glu His Ala Pro Asp Trp Ala Ile Val Gly Val Gly Leu Thr Gly Ser50 55 60 65gac cgt tca aag aaa aaa gcc gag gaa ttc aag gcc cag gac tgc ctg 779Asp Arg Ser Lys Lys Lys Ala Glu Glu Phe Lys Ala Gln Asp Cys Leu

70 75 80tat tcc ctg acc gag acg gct ccg tcc ggc aag agc acg gtg cgc gtc 827Tyr Ser Leu Thr Glu Thr Ala Pro Ser Gly Lys Ser Thr Val Arg Val

85 90 95atg ggc gcg ctg cgt gac tat ctg ctt gcc ccg gcc gat ccg gaa gcc 875Met Gly Ala Leu Arg Asp Tyr Leu Leu Ala Pro Ala Asp Pro Glu Ala

100 105 110gtg ctg aag cat ctt gtt gat ccg gcc atc cgc atc gtt tcc atg acg 923Val Leu Lys His Leu Val Asp Pro Ala Ile Arg Ile Val Ser Met Thr

115 120 125atc acg gaa ggc ggc tac aac atc aac gag acg acc ggt gcg ttc gat 971Ile Thr Glu Gly Gly Tyr Asn Ile Asn Glu Thr Thr Gly Ala Phe Asp130 135 140 145ctg gag aat gcg gca gta aag gcc gac ctc aag aac ccg gaa aag ccg 1019Leu Glu Asn Ala Ala Val Lys Ala Asp Leu Lys Asn Pro Glu Lys Pro

150 155 160tct acc gtt ttc ggt tac gtg gtc gag gcc ctg cgt cgt cgt tgg gat 1067Ser Thr Val Phe Gly Tyr Val Val Glu Ala Leu Arg Arg Arg Trp Asp

165 170 175gcc ggt ggt aag gca ttt acg gtc atg tcc tgt gat aac ctg cgt cat 1115Ala Gly Gly Lys Ala Phe Thr Val Met Ser Cys Asp Asn Leu Arg His

180 185 190aac ggc aat gtc gcc cgc aag gcc ttc ctc ggc tat gcg aag gcg cgc 1163Asn Gly Asn Val Ala Arg Lys Ala Phe Leu Gly Tyr Ala Lys Ala Ala

195 200 205gat ccg gag ttg gcg aag tgg att gag gaa aac gcg acc ttc ccg aac 1211Asp Pro Glu Leu Ala Lys Trp Ile Glu Glu Asn Ala Thr Phe Pro Asn210 215 220 225gga atg gtt gat cgc atc acc ccg acc gtt tcg gcg gaa atc gcc aag 1259Gly Met Val Asp Arg Ile Thr Pro Thr Val Ser Ala Glu Ile Ala Lys

230 235 240aag ctc aac gcg gcc agt ggg ctg gat gac gac ctg ccg ctg gtg gcc 1307Lys Leu Asn Ala Ala Ser Gly Leu Asp Asp Asp Leu Pro Leu Val Ala

245 250 255gag gat ttc cat cag tgg gtg ctg gaa gac cag ttt gcg gat ggc cgt 1355Glu Asp Phe His Gln Trp Val Leu Glu Asp Gln Phe Ala Asp Gly Arg

260 265 270ccg ccg ctt gaa aaa gcc ggc gtg cag atg gtc ggg gac gtg acg gac 1403Pro Pro Leu Glu Lys Ala Gly Val Gln Met Val Gly Asp Val Thr Asp

275 280 285tgg gag tac gtc aag atc cga atg ctc aat gca ggg cat gtc atg ctc 1451Trp Glu Tyr Val Lys Ile Arg Met Leu Asn Ala Gly His Val Met Leu290 295 300 305tgc ttc cca ggc att ctg gtc ggc tat gag aat gtg gat gac gcc att 1499Cys Phe Pro Gly Ile Leu Val Gly Tyr Glu Asn Val Asp Asp Ala Ile

310 315 320gaa gac agc gaa ctc ctt ggc aat ctg aag aac tat ctc aac aag gat 1547Glu Asp Ser Glu Leu Leu Gly Asn Leu Lys Asn Tyr Leu Asn Lys Asp

325 330 335gtc atc ccg acc ctg aag gcg cct tca ggc atg acg ctc gaa ggc tat 1595Val Ile Pro Thr Leu Lys Ala Pro Ser Gly Met Thr Leu Glu Gly Tyr

340 345 350cgg gac agc gtc atc agc cgt ttc tcc aac aag gcg atg tcg gac cag 1643Arg Asp Ser Val Ile Ser Arg Phe Ser Asn Lys Ala Met Ser Asp Gln

355 360 365acg ctc cgg att gct agc gat ggc tgt tcc aag gtt cag gtg ttc tgg 1691Thr Leu Arg Ile Ala Ser Asp Gly Cys Ser Lys Val Gln Val Phe Trp370 375 380 385acg gaa acc gtg cgt cgg gcg atc gaa gac aag cgg gac ctg tca cgt 1739Thr Glu Thr Val Arg Arg Ala Ile Glu Asp Lys Arg Asp Leu Ser Arg

390 395 400ata gcg ttc gga att gca tcc tat ctc gaa atg ctg cgt ggt cgc gac 1787Ile Ala Phe Gly Ile Ala Ser Tyr Leu Glu Met Leu Arg Gly Arg Asp

405 410 415gag aag ggc ggg acg tat gaa tcg tcc gag ccg act tat ggc gac gcc 1835Glu Lys Gly Gly Thr Tyr Glu Ser Ser Glu Pro Thr Tyr Gly Asp Ala

420 425 430gaa tgg aag ttg gcc aag gcg gac gac ttc gaa agc tct ctg aag ctc 1883Glu Trp Lys Leu Ala Lys Ala Asp Asp Phe Glu Ser Ser Leu Lys Leu

435 440 445ccg gcg ttc gat ggg tgg cgc gat ctg gat acg tcc gaa ctg gat caa 1931Pro Ala Phe Asp Gly Trp Arg Asp Leu Asp Thr Ser Glu Leu Asp Gln450 455 460 465aag gtc atc gtg ctg cgg aag atc atc cgc gaa aag ggc gta aaa gcc 1979Lys Val Ile Val Leu Arg Lys Ile Ile Arg Glu Lys Gly Val Lys Ala

470 475 480gcc atc ccg gcc tga attcggcttt tagggtagcg actgaaacag aaaaccgcgc 2034Ala Ile Pro Ala

485tctggaagga gcgcggtttt ttttatgctc agatctgtcc catcaggaca aggatcacga 2094cgaccacgat caggacaagt ccgctggagg gggagcccca tttcgaactg tacggccatg 2154acggcagcgc accgagatca ggattacaag aaggatcagt cccatggcac atctctcttg 2214ccggttgaga ctggtctgtg ttccgggtgt ctaaaaagtt tccgtagggg cgcgaaagat 2274caaagctgtc ggtcgcgctt aatccggtcc caagccgcat tgatgcgggc cacccggtcc 2334tgtgcgcgtt tgcgctctgt ctctgacata ggtttctggg ccagcacgtc cggatgatgt 2394tcgcggatca gggtgcgcca gcgcacgcgg atttctgtgt cagttgcgct gcgggtgatg 2454ccgagaatac gataggcatc cggctcgttt ccgctggcgg cgcgattgtt gccgctttcg 2514gcccggtccc atgctcctgg cggcaggcca aatgccccgt gaacgcgctg cagaaaatcg 2574atttccttcg ggtgaagctc gcggctgggg ccggcatcgg cacgggcgat acggaacagt 2634gccgtcatga ggttctcaag cggcgccgta ttatcggcat aggccttgcc catttcgcgg 2694gcatacatct cgaaatcgtc cgtccggtcg cgggcgcgat cgaacagcat gccgacttcc 2754ttggtgttat cgggggggaa ctggaagcag gtcttgaaag cgttgatttc gtgtcggttc 2814accggcccgt cgatcttcgc cagcttcgcg cacagggcaa caaggccgat ggcgtaaagc 2874tgatctcgtt tgcccagggc cgcagcaatc ttggcagcgc cgaaaaaggc cgcgctgttg 2934ggatcgggac ggccattcgc gggaaagcgc tcactccagc cgcccgttga gggcttgagt 2994agcgaaccgt tatcggcggc atgccccagc gctgcgccca tcagtgctcc gaaaggacca 3054ccaaccgcga agcccgcgac accaccgaac atcttgcccc agatagccat gtcatcaacc 3114tagcacgccc gctcacagcg gcaaatgaca gatcgcaggc taggtgtagg tgctgatgcg 3174ccaaccgccc gggcttgcgg tgtggtagaa gctaggagtt acgaacttat cgctgtctca 3234tgcttttgag gcgcaggttc ttctgttcgt ttcatgacgg atatttttat gcccaccttg 3294atccagactg ctacttcgat ccctttccgc tctgatgacg aactgatgga tcttttgatc 3354aagcgtctgc caatgtggct gcagaaagtg ctgaactggt tgcgggaagc ggatcataaa 3414tgggttcgga ttccggcggg cgtgctgttc atgctgggcg gcgttctgtc catcctgcct 3474gttctgggtc tgtggatgct gccggtcggc gtgatgttgc ttgcgcagga tattccgttc 3534ttccgtcgcc ttcagggccg cctcttgcgc tggatcgaac gtcaacatcc ggattggctg 3594ggccttccgg cgaaaagcgg cagaagctaa ccgttcgtct ggacgtgttt ctgaagatgt 3654gtcagtgctg caacccgcag ggctgaagcc agtgggcgct ctggtggtcg cgcggcatcg 3714agagaagcca ccagagacgc aaagctctgc tggcggactg cggccatcgc gtccagtata 3774gcccagaact cgggttccag tgccacggac gtccggtgtc ctgacagaga caggctgcgt 3834ttgacgagat cactcattcc ggttgtttct caaggcgctt caaagcccat tgtgcggttt 3894cggaaacatc agggtccgga tcactcagca gctcccgcgc agaagatata agcgacggat 3954cggccgagtt gccgatcgcg atcaggacag ttacgtacga accggttgcg tccaatccgt 4014ttgaccggag agccagaaaa aaacgtccgg aatgtcgcat tatccagccg caccagttcg 4074tcgagttttg gtgcaatcag ctccgggcgg gcctgaagct t 4115<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸<400>3gctgctgagt gatccg 16<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸<400>4gactgctact tcgatcc 17<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸<400>5cctacaccta gcctgc 16<210>6<211>16<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸<400>6cagtgccgtc atgagg 16<210>7<211>16<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸<400>7tcctgatctc ggtgcg 16<210>8<211>16<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸<400>8gatgcttcag cacggc 16<210>9<211>16<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸<400>9gacgatcacg gaaggc 16<210>10<211>16<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸<400>10ggttacgtgg tcgacg 16<210>11<211>17<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸<400>11ctatacctga caggtcc 17<210>12<211>16<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸<400>12gcgcgatctg gatacg 16<210>13<211>16<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>pUCP19-HC的***DNA测序时作为引物应用的寡核苷酸<400>13cgaggatctc gaacgg 16<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>为了扩增编码His-tagged SLDH和启动子的DNA序列而设计的

作为正向引物应用的寡核苷酸<400>14cggattgcta gcgatggc 18<210>15<211>47<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>为了扩增编码His-tagged SLDH和启动子的DNA序列而设计的

作为反向引物应用的寡核苷酸<400>15atcgaggatc ctcaatgatg atgatgatga tgggccggga tggcggc 47<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>为了扩增SLDH基因的3’端非编码区域的DNA序列而设计的

作为正向引物应用的寡核苷酸<400>16atcgaggatc cattcggctt ttagggtagc 30<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>为了扩增SLDH基因的3’端非编码区域的DNA序列而设计的

作为反向引物应用的寡核苷酸<400>17tagctgagct catgggacag atctgagc 28<210>18<211>10<212>PRT<213>氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)<220><223>SLDH的N未端氨基酸序列<400>18Met Ile Thr Arg Glu Thr Leu Lys Ser Leu1 5 10<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>为了将Ssp I限制性位点导入SLDH编码序列的5’上游区域

而设计的作为PCR引物(正向)应用的寡核苷酸<400>19taggaatatt tctcatgatt acgcgcgaaa ccc 33<210>20<211>16<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>为了将Ssp I限制性位点导入SLDH编码序列的5’上游区域

而设计的作为PCR引物(反向)应用的寡核苷酸<400>20gatgcttcag cacggc 16

Claims

1.一种山梨糖醇脱氢酶，它具有下述理化性质，

(a)作用：催化D-山梨糖醇转变为L-山梨糖的反应；

(b)分子量：约54kDa；

(c)辅酶：NAD(P)⁺依赖性；

(d)底物特异性：特异性氧化山梨糖醇、甘露醇、***糖

醇，对木糖醇、核糖醇、肌醇、甘油无作用。

2.根据权利要求1所述的山梨糖醇脱氢酶，它来源于氧化葡糖杆菌G624株。

3.一种山梨糖醇脱氢酶，它与权利要求2所述的山梨糖醇脱氢酶在分子进化上为同一基因来源。

4.根据权利要求3所述的山梨糖醇脱氢酶，它来源于葡糖杆菌属细菌。

5.一种山梨糖醇脱氢酶，它是以下(a)或(b)的蛋白质，

(a)序列表序列号1中所示氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由上述(a)的氨基酸序列中一个或数个氨基酸发生缺

失、置换、***、添加或修饰的氨基酸序列构成，且催化D

-山梨糖醇转变为L-山梨糖反应的蛋白质。

6.一种DNA，它编码权利要求1～5任一项中所述山梨糖醇脱氢酶。

7.根据权利要求6中所述的DNA，它是以下(a)或(b)的DNA，

(a)序列表序列号2所示的碱基序列中碱基序号537-1991

所示的碱基序列构成的DNA；

(b)在严格条件下，可与上述(a)的碱基序列杂交的DNA。

8.根据权利要求6或7所述的DNA，它来源于葡糖杆菌属细菌。

9.一种基因，它是可与序列表序列号2所示的碱基序列中碱基序号537-1991所示的碱基序列构成的DNA及其部分DNA杂交的DNA，且编码具有山梨糖醇脱氢酶活性的蛋白质。

10.一种来源于葡糖杆菌属的蛋白质，它由权利要求9中所述的基因编码，并具有山梨糖醇脱氢酶活性。

11.一种启动子基因，它含有以下(a)或(b)的DNA，

(a)序列表序列号2所示的碱基序列中碱基序号1-536所

示的碱基序列构成的DNA；

(b)由上述(a)的碱基序列中一个或数个碱基发生缺失、置

换、***、添加或修饰的碱基序列构成，且至少在一种微生

物中具有启动子活性的DNA。

12.一种重组载体，它包含权利要求6～9任一项中所述的DNA。

13.一种表达载体，它包含权利要求6～9任一项中所述的DNA。

14.根据权利要求13所述的表达载体，它还包含编码山梨糖脱氢酶的DNA和/或编码山梨酮脱氢酶的DNA。

15.一种转化体，它是用权利要求13或14所述的表达载体转化宿主细胞而得到的。

16.根据权利要求15所述的转化体，它属于选自大肠杆菌属、假单胞菌属、葡糖杆菌属、醋杆菌属及假葡糖杆菌属的属。

17.根据权利要求15或16所述的转化体，它具有将D-山梨糖醇转变为2-酮-L-古洛糖酸的能力。

18.一种制备具有山梨糖醇脱氢酶活性的蛋白质的方法，它包括在培养基中培养用权利要求13所述的表达载体转化的宿主细胞，从所得培养物中提取权利要求1～5任一项中所述的山梨糖醇脱氢酶或权利要求10所述的蛋白质。

19.一种制备L-山梨糖的方法，它包括在培养基中培养用权利要求13所述的表达载体转化的宿主细胞，并让所得培养物或其处理物接触D-山梨糖醇的步骤。

20.一种制备2-酮-L-古洛糖酸的方法，它包括在培养基中培养用包含编码山梨糖脱氢酶的DNA和编码山梨酮脱氢酶的DNA的表达载体转化的宿主细胞，并让所得培养物或其处理物接触用 19所述的方法得到的L-山梨糖的步骤。

21.一种制备2-酮-L-古洛糖酸的方法，它包括在培养基中培养权利要求17所述的转化体，并让所得培养物或其处理物接触D-山梨糖醇的步骤。

22.一种制备L-抗坏血酸、或其碱金属盐或其碱土金属盐的方法，它包括将由权利要求20或21所述的方法得到的2-酮-L-古洛糖酸转变成L-抗坏血酸、或其碱金属盐或其碱土金属盐的步骤。