CN116716315B - 烟草耐低温基因NtZFP66L1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草耐低温基因NtZFP66L1，所述基因NtZFP66L1的CDS编码序列如SEQ ID NO.9所示，编码的蛋白SEQ ID NO.10所示，同时，以湘烟7号为背景，利用CRISPR技术获得了该基因的敲除株系zfp66l1‑15和zfp66l1‑16。表型鉴定结果表明，低温胁迫下与湘烟7号(WT)相比，两个敲除株系萎蔫程度更严重，其叶片中MDA、H₂O₂含量明显升高，可溶性蛋白(SP)、脯氨酸(PRO)和谷胱甘肽(GSH)含量显著降低。该结果表明，敲除NtZFP66L1基因导致烟草低温耐受性降低，也证明了该基因正调控烟草耐冷性。

Description

烟草耐低温基因NtZFP66L1及其应用

技术领域

本发明涉及烟草耐低温基因筛选技术领域，更具体的说是涉及烟草耐低温基因NtZFP66L1及其应用。

背景技术

烟草(Nicotiana tabacum L.)起源于温暖的南美洲，是一种喜温不耐冷的叶用经济作物，其最适生长温度为25℃～28℃，烟草对低温胁迫敏感，-2℃～3℃的低温胁迫就会导致烟草的死亡。烟草苗期对低温胁迫更为明显，在6～7叶龄时，如果烟草遭受到两周左右的12℃低温胁迫就会导致烟草提早开花，降低烟叶产量与品质，从而减少烟农收入。

在中国南方烟区，烟草移栽之后经常会遭受“倒春寒”的天气，使烟草遭受低温胁迫。目前主要是通过适时移栽等方法来应对“倒春寒”，这种方式虽然可以在一定程度上减少低温造成的损失，但是要从根本上解决这个问题还是需要结合分子生物技术手段挖掘烟草耐低温基因，选育更为耐低温的烟草品种。

锌指蛋白(zinc fingerprotein)，一类能够结合Zn²⁺的“手指”状DNA结合蛋白。该蛋白以锌指基序为特征，通常作为一种重要的转录因子发挥功能，通过与目的基因启动子序列相结合的方式调控基因表达。依据锌指结构域中半胱氨酸(C)以及组氨酸(H)数目以及排列方式将锌指蛋白分为9个亚家族：C2H2、C2HC、C2HC5、C3H、C3HC4、C4、C4HC3、C6、C8。CCCH型锌指蛋白是锌指蛋白家族中很小的一类，其是指包含有CCCH型锌指基序的一类蛋白质。典型的CCCH型锌指蛋白至少含有一个或者更多的由3个半胱氨酸和1个组氨酸残基顺序排列组成的锌指基序，这种锌指基序最早被定义为C-X6-14-C-X4-5-C-X3-H(X为任意氨基酸)。近来的研究发现，与其他类型的锌指蛋白不同，CCCH锌指蛋白不仅能与DNA和蛋白质互作，也能与RNA结合。

C3H型锌指蛋白在植物整个生长发育过程中发挥了重要作用，同时还是植物激素响应和逆境响应的重要调节因子。虽然目前已经发现了不少CCCH型锌指蛋白基因，但是仅有很少一部分的基因功能被揭示。研究发现，拟南芥AtTZF5，AtTZF6/PEI1和AtTZF4/SOMNUS参与光和激素介导调控的种子萌发过程，调控种子萌发和胚发育。AtC3H14和AtC3H15基因调控次生壁增厚、影响花粉粒的形成，参与了拟南芥花粉粒和花药壁的发育过程。超表达含3个CCCH锌指基序的AtC3H17基因使得拟南芥早花，而其突变体材料可延迟开花，这说明AtC3H17在拟南芥成花诱导进程中发挥作用。水稻OsTZF1起到延缓叶片衰老的作用，杨树PdC3H17在次生壁的形成过程中发挥作用。在激素应答方面，AtZF1，AtZF4，AtZF5，AtZF6参与调控ABA和GA的响应，AtC3H49/AtC3H20、ATOZF1/ATOZF2和ATTZF2/ATTZF3参与ABA和JA的响应。CCCH型锌指蛋白在植物抗逆方面也发挥着积极作用，在拟南芥中过表达AtTZF2和AtTZF3显著增强了植株的耐旱性、耐盐性以及抗氧化能力，AtSZF1和AtSZF2提高了拟南芥的盐胁迫耐受力。

因此，如何提供一种新的含锌指基序的烟草耐低温基因是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种烟草耐低温基因NtZFP66L1及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种烟草耐低温基因NtZFP66L1，所述基因NtZFP66L1的CDS编码序列如SEQ IDNO.9所示。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种基因NtZFP66L1的CDS编码序列编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的基因NtZFP66L1在提高烟草耐低温性能中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的基因NtZFP66L1在筛选耐低温烟草材料中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明本研究基于前期多组学联合分析，从中挖掘到一个受低温显著诱导的基因，研究发现该基因CDS序列长度为2076bp，编码691个氨基酸，编码一个CCCH锌指结构蛋白类似蛋白(Nicotiana tabacum zinc fingerCCCH domain-containing protein 66-like)，因此将其命名为NtZFP66L1。***进化树和蛋白序列同源比对结果发现，NtZFP66L1与绒毛烟草NtoZFP66L、林烟草NsZFP66L-X1/X2及渐狭叶野生烟草NaZFP66L、NaZFP66亲缘关系较近、同源性较高。以湘烟7号为背景，利用CRISPR技术获得了该基因的敲除株系zfp66l1-15和zfp66l1-16。表型鉴定结果表明，低温胁迫下与湘烟7号(WT)相比，两个敲除株系萎蔫程度更严重，其叶片中MDA、H₂O₂含量明显升高，可溶性蛋白(SP)、脯氨酸(PRO)和谷胱甘肽(GSH)含量显著降低。该结果表明，敲除NtZFP66L1基因导致烟草低温耐受性降低，也证明了该基因正调控烟草耐冷性。该基因的挖掘与功能鉴定，为烟草耐低温育种提供了重要的基因资源和理论基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为NtZFP66L1***发育树图；

图2附图为NtZFP66L1蛋白序列同源比对结果图；

图3附图为zfp66l1-15和zfp66l1-16株系测序比对结果和测序峰值分析图；

图4附图为zfp66l1-15和zfp66l1-16株系蛋白序列比对结果；

图5附图为zfp66l1-15和zfp66l1-16株系与野生型株系的表型对比图；

图6附图为在低温胁迫处理下，zfp66l1-15和zfp66l1-16株系中MDA、H₂O₂含量与野生型对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围

实施例1

基于前期对耐低温品种湘烟7号和低温敏感品种台烟8号的转录组学和代谢组学联合分析，从湘烟7号中挖掘到一个受低温显著诱导的基因，经克隆、测序分析发现该基因CDS序列长度为2076bp，编码691个氨基酸，编码一个CCCH锌指结构蛋白类似蛋白(Nicotianatabacum zinc finger CCCH domain-containing protein 66-like)，因此将其命名为NtZFP66L1，其中，该基因CDS序列与其编码的蛋白序列如下：

NtZFP66L1基因：

ATGTGTAGTGGTTCTAAGAGTAAGGTCTGTTCTGCTGATTTAGCCATGGAAGCTGAAATTCAGAAGCAAAAGGATCTTCTCCCTGGTTTCTCCCTCTTGCTCGAGTTATCAGCCTCGGATGATATTATCAACTTCCAAAAGGCTGTAGAAGAGGAGGGTCATGACATGAATGAGGTGGGTTTATGGTATGGTAGGAGAATTGGTGTAAAGAAGATGGGATATGAGGAGAGGACACCCCTTATGATTGCTGCTACTTTTGGTAGCAAACGGGTGCTGAATTATATGCTTGAGAAGGGCTGTCTTGATGTTAATCAAGCCTGTGGTTCCGACGGGGCTACATCGCTTCACTGCGCAATTGCTGGTGGCTCTTCAGCTTTGCTTGAGGTTGTCAAGCTCTTGCTTGATGCTTCTGCTGATGTGAATTTGGTTGATGCAAATGGAAAACAGGCTGTTGACCTGATCTCAGCTCAGGGCTGTTGTCTCAACTCTAGGAGGAAGATACTGGAGCACTTGCTTGGAGGAAGCAGCGACGACGGGGAAGCAAGTGGACTCATCGATCAGATTATCTCTGAACAAGCAGAAGAACAGCTGTTATTGACTCCAAACATCTCTAAATTTGGGAGCGAGAAGAAAGAGTATCCTGTTGATCCCTCTCTTCCGGACATAAAGATTGGGATATATGGGACAGATGACTTCAGAATGTACATATTTAAGGTGAAACCATGCTCAAGAGCTTACTCCCATGACTGGACAGAGTGTCCCTTTGTACACCCTGGTGAAAACGCAAGAAGGCGTGACCCTAGAAAATACCACTATAGTTGTGTCCCTTGTCCAGACTTTCGCAAGGGGGCATGCCAGCGAGGAGATGCTTGTGAGTATGCGCATGGGATTTTTGAGTGCTGGCTTCACCCTGCACAGTACCGAACTCGTATGTGCAAGGACGAAACAAATTGCAATAGGAGGGTGTGCTTCTTTGCCCACAAACCTGAAGAGCTCCGCCCCTTGTACCCTTCTACAGGGTCTGCTATGCTTTCACCTAGATCTTATTCCAATGATGCTCTGTCATTGGATATTGCATCAATTTCTCCGCGAGCCCTTGGTTCTCCATCATTTATGATGCCTCCTACTTCAACTCCACCTATGTCTCCTTCTACAGTGGCTTCTTCTGTGGGTGGATCTTTGTGGCCTTGCCAATCCAGTCTTGCAACTCCAACCTTGCAGCTGCCTATAAGTAGGTTGAAAACCGCATATAGTGCCAGAGACGTGGAGTTAGATAATGGTTTACTTGGATTCGAAAGTCATCATCTGCGACAAGATCAACTGATGGATGACTTATCTGCTCTTTCTTCACCGTCCGGGTGGAACAGTTCTTCGGCCAAAGCTGCTGCTTTTGCAGCTTCTTCTAGTGATAGAAACGGTGAACTTGGTAGGCATGGTGGATTGAAACCCACTAATCTTGATGATATCTTAGCGACCCTTGATTCCAAAATTTTGTCTCAGCTACAAGGGCTATCACTTGATGCTGGATCACCCCAACTACAATCTCCCAAAGGGATGCAGATGCGACAAAATATGAACCAGCAACTTATGACAGGCTATTCTTCCGGTCAATCTTCACCATCTTTTAGGACATCATCTTCGTTTGGGATTGATCCATCTGGTGCTGCAGCAGCAGCTTTGAGTTCAAGGTCTGCTGCATTTGCCAAACGAAGCCAGAGTTTCATCGATCGTGGTGCTCCAGGCCGTCTCTCTGGGATATCTTCATCCCTTTCTAACACGTCCGCTGTGCCTCCTAACCTCTCAGGTTGGGGTTCCCCTGATGGTAAATTGGACTGGGGTATTCAGAAGGAAGAGCTCAATAAGTTGAGAAAATCTGCTTCCTTTGGTTTACGGAGCAGTGGCAGTAGGTTTCCTATGAGTGAACCCTCAATTTTAAACTCTTCTGCTGAGCCTATGAGTTCAAGACAATTATCTAGGGAAGATCAGCAATATCATCTGAATGCTAGTCGAGGTTCTGAGACGATTCCAACATGGGCAGATCAGTTATACATGGAGCAGGAGCAGATTGTGCATTGA，如SEQ ID NO.9所示；NtZFP66L1蛋白：

MCSGSKSKVCSADLAMEAEIQKQKDLLPGFSLLLELSASDDIINFQKAVEEEGHDMNEVGLWYGRRIGVKKMGYEERTPLMIAATFGSKRVLNYMLEKGCLDVNQACGSDGATSLHCAIAGGSSALLEVVKLLLDASADVNLVDANGKQAVDLISAQGCCLNSRRKILEHLLGGSSDDGEASGLIDQIISEQAEEQLLLTPNISKFGSEKKEYPVDPSLPDIKIGIYGTDDFRMYIFKVKPCSRAYSHDWTECPFVHPGENARRRDPRKYHYSCVPCPDFRKGACQRGDACEYAHGIFECWLHPAQYRTRMCKDETNCNRRVCFFAHKPEELRPLYPSTGSAMLSPRSYSNDALSLDIASISPRALGSPSFMMPPTSTPPMSPSTVASSVGGSLWPCQSSLATPTLQLPISRLKTAYSARDVELDNGLLGFESHHLRQDQLMDDLSALSSPSGWNSSSAKAAAFAASSSDRNGELGRHGGLKPTNLDDILATLDSKILSQLQGLSLDAGSPQLQSPKGMQMRQNMNQQLMTGYSSGQSSPSFRTSSSFGIDPSGAAAAALSSRSAAFAKRSQSFIDRGAPGRLSGISSSLSNTSAVPPNLSGWGSPDGKLDWGIQKEELNKLRKSASFGLRSSGSRFPMSEPSILNSSAEPMSSRQLSREDQQYHLNASRGSETIPTWADQLYMEQEQIVH，如SEQ ID NO.10所示。

实施例2

于National Center for Biotechnology Information website(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中下载与NtZFP66L1同源性较高的其他物种ZFP66蛋白序列，利用MEGA7.0软件分析基因同源性并使用邻位归并法(NJ)构建进化树，使用DNAMAN软件进行蛋白质相似性比对，结果见图1和图2。***进化树分析发现，该NtZFP66L1与绒毛烟草NtoZFP66L(XP016496637.1)亲缘关系最近(图1)。蛋白序列同源比对分析发现，该蛋白序列具有典型的Zf-CCCH、Ank-2结构域，并与绒毛烟草NtoZFP66L、林烟草NsZFP66L-X1/X2及渐狭叶野生烟草NaZFP66L、NaZFP66同源性较高(图2)。

实施例3基因编辑载体构建

靶标设计

利用http://crispor.tefor.net/在线分析工具，在基因NtZFP66L1(序列如SEQID NO.9所示)外显子上设计靶点，经分析获得以下2个特异性的靶标：

Target1：ACCTATGTCTCCTTCTACAGTGG，如SEQ ID NO.1所示；

Target2：CTGCTCTTTCTTCACCGTCCGGG，如SEQ ID NO.2所示；

合成如下引物

进而设计CRSIPR载体构建引物，其序列信息如下：

F1(+):CAGTGGTCTCATGCAACCTATGTCTCCTTCTACAG，如SEQ ID NO.3所示；

R1(-):CGATGGTCTCAAAACGGACGGTGAAGAAAGAGCAG，如SEQ ID NO.4所示。

PCR体系

做50μL表1所示的体系并按照表2程序进行扩增反应：

表1PCR体系

表2PCR程序

用1.5％琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，将目的片段(约250bp)在紫外灯下切取出来，放在一个体系中进行溶胶回收，用总体积30μL的水溶解回收DNA，检测无误后与载体进行连接。

酶切连接

酶切链接体系和反应条件如表3和表4所示：

表3酶切连接体系

表4酶切连接反应条件

转化及菌落PCR鉴定

将5-10μL连接产物转化大肠杆菌感受态(见大肠杆菌感受态转化标准方法)。

转化涂卡那霉素抗性平皿，37℃培养12h，进行菌落PCR鉴定。

挑取10个单菌落同时进行1.5ml EP管接菌和PCR鉴定，鉴定体系及反应条件参照表5、表6。

引物信息如下：

F2:GTAAAACGACGGCCAGT，如SEQ ID NO.5所示；

R2:CCAGAAATTGAACGCCGAAG，如SEQ ID NO.6所示。

大小：800bp左右

反应体系如下：

表5菌落PCR反应体系

表6PCR反应程序

目标条带为800bp左右的片段。取1-3个阳性条带对应的菌液，取100μL送样测序，其余400μL菌液接种到含有5-10ml卡那霉素抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒，提取质粒后将菌株，质粒保存。

实施例4烟草遗传转化

农杆菌准备：取1μL质粒加入50μL GV3101农杆菌感受态细胞中(见农杆菌感受态转化标准方法)。转化涂卡那霉素抗性平皿，28℃培养48h，进行菌落PCR鉴定。扩增引物、反应体系及反应程序同上。PCR产物通过凝胶电泳检测，电泳结果阳性对照及样品的电泳条带清晰、大小正确，且阴性对照均无条带的情况下，表明该样品可进入下一步骤，可用于侵染烟草。

烟草遗传转化：湘烟7号烟草种子于75％的酒精消毒30s，无菌水清洗1min，再使用84消毒液消毒3-5min，无菌水清洗3次，1min/次。将消毒后的烟草种子播种于萌发培养基上，23℃、16h光照/8h黑暗培养4-5周，将无菌烟草叶片用手术刀切成小块放接种于预培培养基上。挑取农杆菌于侵染液中，制备OD₆₀₀＝0.2的农杆菌重悬液，将预培养2-3d的烟草叶片接种于农杆菌悬浮液中侵染10-15min，将侵染后的烟草叶片接种于滤纸上，经晾干后接种于共培养基上，暗培养48-72h。将共培养2d后的叶片转入诱导培养基上诱导愈伤，约10d，待其长出愈伤组织。挑选符合标准的愈伤组织，接种于对应抗性的筛选培养基上，培养时间15-30d，培养温度：23±2℃。将二筛生长旺盛的阳性愈伤组织接种至分化培养基上，4-5个愈伤/每皿，23℃16h/8h光照/黑暗培养15-30d。分化过程中，愈伤如有幼苗形成，将其接种至壮苗培养基上生长。

阳性苗测序分析

阳性苗叶片基因组DNA的提取使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的Plant DNA Isolation Mini Kit(货号：DC104-01)植物总DNA提取试剂盒进行，详细方法参照说明书。使用宝日医生物技术(北京)有限公司的高保真酶PrimeSTAR MaxDNA Polymerase对敲除材料进行PCR扩增。

引物序列信息如下：

NtZFP66L1-cri-F1：CGCAATTGCTGGTGGCTCTTCAG，如SEQ ID NO.7所示；

NtZFP66L1-cri-R1：GAGCACCACGATCGATGAAACT，如SEQ ID NO.8所示.

目的片段长度约为1300bp。

扩增程序、扩增体系见下表(表7、表8)。所得PCR产物送往北京擎科生物科技有限公司进行测序，分别采用SnapGene Viewer和DNAMAN进行测序峰值图和序列比对分析。

经过测序比对分析，最终筛选获得两个敲除株系zfp66l1-15和zfp66l1-16，发现这两个株系在靶点2位置分别有一个碱基的缺失和***，且靶点附近均为干净的单峰，说明这两个株系的为纯合突变(图3)。蛋白序列进行比对发现，zfp66l1-15和zfp66l1-16株系中NtZFP66L1蛋白翻译提前终止(图4)。

表7PCR程序

表8PCR扩增体系

实施例5敲除株系低温耐受性表型鉴定

选取籽粒饱满大小一致的转基因纯系植株和野生型植株的种子，消毒灭菌后置于4℃低温处理48h。然后将其播种于事先装有烟草专用机质并充分吸水的小方盒中，并盖上上盖子保温保湿，温室(温度25℃，湿度75％，16h光照，8h黑暗)孵育发芽。播种30d(六叶一心期)后，选取长势一致的烟苗放入4℃培养箱中进行低温处理，观察表型并拍照记录。

在0h、12h和24h三个时间点，取第三片叶(从顶端往下数)为植物样本进行生理生化指标检测，每个处理5个生物学重复。取样后迅速用锡纸包裹放入液氮中，-80℃保存。如图5所示，对照条件下敲除株系zfp66l1-15和zfp66l1-16与湘烟7号(WT)表型无明显差别。4℃低温处理到24h后，两个敲除株系出现整株萎蔫的现象，而WT叶片仅表现出轻微下垂，与其处理前无明显变化。该结果表明，与WT相比zfp66l1-15和zfp66l1-16株系耐冷性明显降低。

实施例6敲除株系生理生化指标测定

丙二醛(MDA)含量采用植物丙二醛(MDA)测试盒(南京建成，货号：A003-3-1)测定；

过氧化氢含量(H₂O₂)采用过氧化氢测试盒(南京建成，货号：A064-1-1)测定；

脯氨酸(PRO)含量采用脯氨酸(PRO)含量测试盒(苏州格锐思，货号：G0111W)测定；

可溶性蛋白(SP)采用蛋白定量(TP)测定试剂盒(南京建成，货号：A045-2)测定；

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用的超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成，货号：A001-3)；

过氧化物酶(POD)活性的测定采用的是过氧化物酶(POD)测试盒(南京建成，货号：A084-3-1)；

谷胱甘肽(GSH)含量的测定采用微量还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒进行(货号：A006-2-1)；

抗超氧阴离子能力(anti-superoxide anion)采用抑制与产生超氧阴离子自由基(O₂·^-)测定试剂盒(货号：A052-1-1)进行。

具体方法：参照试剂盒说明书进行。

非生物胁迫可导致ROS积累，积累的ROS主要有过氧化氢(H₂O₂)、超氧阴离子自由基(O₂.^-)、烷氧基自由基(RO)等，过量活性氧的积累导致膜脂过氧化，产生大量的丙二醛(MDA)，MDA与膜上的蛋白质发生反应，造成细胞膜损伤，使得膜通透性增大，发生离子渗漏。生理生化结果显示，对照条件下，敲除株系zfp66l1-15和zfp66l1-16中MDA、H₂O₂含量与WT无明显差异，低温胁迫处理12h和24h后，敲除株系中MDA、H₂O₂含量显著高于WT(图6)。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (1)

1.降低烟草耐低温基因NtZFP66L1表达量的物质在降低烟草耐低温性能中的应用，所述基因NtZFP66L1的CDS编码序列如SEQ ID NO.9所示；蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。