CN114507650B

CN114507650B - 亮氨酸脱氢酶突变体及其在合成(s)-邻氯苯甘氨酸中的应用

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Publication number: CN114507650B
Application number: CN202210103919.8A
Authority: CN
Inventors: 王亚军; 谢为邦; 程峰; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2042-01-28
Also published as: CN114507650A

Abstract

本发明公开了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其在合成(S)‑邻氯苯甘氨酸中的应用，所述亮氨酸脱氢酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第362位点进行定点饱和突变获得的。本发明构建的亮氨酸脱氢酶突变体EsLeuDH‑F362L的活性较野生型亮氨酸脱氢酶提高了32倍，其中突变体EsLeuDH‑F362L底物邻氯苯甲酰甲酸投料量可达到500mM，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，4.0h内可反应完成，底物转化率大于99％，产物e.e值始终保持在99.5％以上。因此亮基酸脱氢酶突变体EsLeuDH‑F362L具有工业应用前景。

Description

亮氨酸脱氢酶突变体及其在合成(S)-邻氯苯甘氨酸中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种源自西伯利亚微小杆菌的亮氨酸脱氢酶EsLeuDH的突变体，开发亮氨酸脱氢酶突变体的重组菌及酶在氯吡格雷手性中间体(S)-邻氯苯甘氨酸催化合成方面的应用。

(二)背景技术

(S)-氯吡格雷(Clopidogrel)，化学名为(S)-(+)-2-(2-氯基)-2(4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5)乙酸甲酯，是由法国赛诺菲(Sanofi)公司于1986年研发的一种噻吩并吡啶类药物。1998年，美国FDA批准氯吡格雷上市，其商品名为“波立维”(Plavix)。目前在世界范围内，氯吡格雷也是目前销量最大的药物之一，其年销售额高达64亿美元。

(S)-邻氯苯甘氨酸，又名(S)-2-氨基-(2-氯苯基)乙酸，是一种具有生物活性的非天然手性氨基酸，其最重要的用途之一就是用于合成氯吡格雷。(S)-邻氯苯甘氨酸的合成方法主要分为化学合成和酶法合成。化学拆分法是目前工业上生产(S)-邻氯苯甘氨酸的主要方法，但其仍存在理论收率不高、产物光学纯度差等缺点。相比化学拆分法而言，酶法具有催化效率高、条件温和、工艺简单、选择性好、环境友好等优势。正因如此，用生物酶法合成(S)-邻氯苯甘氨酸具有较为广阔的前景。

得益于蛋白质工程的科技进步，生物催化已广泛应用于工业化生产。本发明通过半理性设计，构建了突变文库，并进一步筛选获得了催化性能最强的“最佳突变体”EsLeuDH-F362L，进一步分析了突变体催化性能提升的分子机理，优化反应工艺参数，并将突变体应用于化学-酶法催化合成氯吡格雷手性中间体(S)-邻氯苯甘氨酸。

(三)发明内容

本发明目的是针对现有亮氨酸脱氢酶对邻氯苯甲酰甲酸不对称胺化活性不高及底物投料量低的问题，提供一种立体选择性亮氨酸脱氢酶突变体及利用该亮氨酸脱氢酶突变体基因重组菌转化邻氯苯甲酰甲酸合成(S)-邻氯苯甘氨酸的应用，催化剂在pH9.0条件下的活性较野生型亮氨酸脱氢酶EsLeuDH在pH7.0条件下的活性提高了32倍，底物投料量提高至500mM，所得到的突变体还应用于化学-酶法合成(S)-邻氯苯甘氨酸路线的构建，为(S)-氯吡格雷的手性中间体(S)-邻氯苯甘氨酸提供了新的合成方法和新生物催化剂。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种亮氨酸脱氢酶EsLeuDH突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体是将SEQID NO.2所示氨基酸序列第362位进行定点饱和突变获得的。所述SEQ ID NO.2所示氨基酸序列源自西伯利亚微小杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)，对应的编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。优选的，所述亮氨酸脱氢酶EsLeuDH突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第362位苯丙氨酸突变为亮氨酸(F362L)。

本发明还涉及所述亮氨酸脱氢酶EsLeuDH突变体的编码基因，包含编码基因的重组载体，以及包含重组载体的基因工程菌，所述重组载体以pET28a(+)为基础载体，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。

本发明还提供一种所述亮氨酸脱氢酶EsLeuDH突变体在不对称催化胺化邻氯苯甲酰甲酸制备(S)-邻氯苯甘氨酸中的应用，所述应用的方法为：将亮氨酸脱氢酶EsLeuDH突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和葡萄糖脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以邻氯苯甲酰甲酸为底物，以葡萄糖为辅底物，以硫酸铵为氨基供体，添加NAD⁺，以pH7-10的缓冲液(优选pH 9.0、100mM的Tris-HCl缓冲液)为反应介质构成转化体系，在30-50℃、500-800rpm(优选40℃、600rpm)条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得(S)-邻氯苯甘氨酸。

进一步，所述转化体系中，底物终浓度20-500mM(优选100mM)，葡萄糖终浓度24-600mM(优选120mM)，硫酸铵终浓度为30-750mM(优选150mM)，NAD⁺终浓度为0.2-5mM(优选1mM)，催化剂用量以混合菌体总干重计为1-10g DCW/L(DCW细胞干重)，优选3g DCW/L；所述混合菌体中亮氨酸脱氢酶EsLeuDH突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体与葡萄糖脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体以干重比1-5:1(w/w)混合，优选2:1。所述葡萄糖脱氢酶基因来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)IWG3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将亮氨酸脱氢酶EsLeuDH突变体基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，以体积浓度1.5％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.10mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，25℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得亮氨酸脱氢酶突变体湿菌体；所述葡萄糖脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体制备方法同亮氨酸脱氢酶突变体湿菌体。

本发明还提供一种所述亮氨酸脱氢酶突变体在化学-酶法合成(S)-邻氯苯甘氨酸中的应用，所述应用方法为：(1)以苯乙酮为底物，二氧化硒为氧化剂，以无水吡啶为溶剂，在N₂保护下100℃回流15h后，反应液减压除去溶剂，并用2M氢氧化钠水溶液调节至pH＝12，搅拌0.5h；再用水萃取2次，用40％的盐酸水溶液调节至pH＝2；之后用乙酸乙酯萃取4次后合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂后，得到邻氯苯甲酰甲酸；(2)将含亮氨酸酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以步骤(1)制备的邻氯苯甲酰甲酸为底物，以葡萄糖为辅底物，加入NAD⁺，以硫酸铵为氨基供体，以pH7-10的缓冲液(优选pH 9.0、100mM的Tris-HCl缓冲液)为反应介质构成转化体系，在30-50℃、500-800rpm(优选40℃、600rpm)条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得(S)-邻氯苯甘氨酸。

步骤(1)所述苯乙酮与二氧化硒投料物质的量之比为1:2；所述无水吡啶体积用量以苯乙酮物质的量计为1.25mL/mmol。

步骤(2)所述转化体系中，底物终浓度20-500mM(优选100mM)，葡萄糖终浓度24-600mM(优选120mM)，NAD⁺终浓度0.2-5mM(优选1mM)，硫酸铵终浓度30-750mM(优选150mM)，催化剂用量以混合菌体总量干重计为1-10g DCW/L(优选3g DCW/L)，所述混合菌体中含亮氨酸脱氢酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体与含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体干重比为1-5:1(优选2:1)。

本发明亮氨酸脱氢酶突变体纯酶按如下方法制备：(1)粗酶液：将亮氨酸脱氢酶EsLeuDH突变体基因工程菌经诱导培养的湿菌体重悬于pH 9.0、100mM Tris-HCl缓冲液中，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s、暂停1s，取破碎混合液，获得粗酶液；(2)纯酶：将破碎混合液在8000rpm，4℃下离心10min，收集上清液；上清液过0.45μm膜微过滤后，滤液作为上样液采用Ni亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)在4℃下纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用缓冲液A(含0.3M NaCl的pH 9.0、20mM Tris-HCl缓冲液)进行预平衡；②上样液以0.5mL/min的速度上样，上样量为10mL；用缓冲液B(含0.3MNaCl、20mM咪唑的pH 9.0、20mM Tris-HCl缓冲液)以1.0mL/min的流速洗去未结合的杂质，洗脱量为10个柱体积，直至电导率稳定；③然后用缓冲液C(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH8.0、20mM Tris-HCl缓冲液)洗脱目的蛋白，洗脱速度为1mL/min，洗脱量为10个柱体积，当UV吸光度达到0.1并开始上升时收集，吸光度大约到达1.0后开始下降，当吸光度再降到0.1时停止收集；④采用透析袋(MD34，Viskase，美国)，将收集的洗脱液用20mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)透析过夜，取截留液即为纯酶。

本发明亮氨酸脱氢酶EsLeuDH及亮氨酸脱氢酶EsLeuDH突变体碱基序列全长均为1125bp，从第一个碱基起至第1125个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。

本发明所述亮氨酸脱氢酶EsLeuDH突变体的获取是采用易错PCR技术和定点饱和突变技术，使用该技术对EsLeuDH亮氨酸脱氢酶基因(SEQ ID NO.1)进行突变，将获得的突变质粒以热击方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导、菌体回收，利用重悬菌液催化邻氯苯甲酰甲酸不对称胺化，制备光学纯(S)-邻氯苯甘氨酸，具体方法如下：第一步将对照菌活化，获得了对照菌EsLeuDH，提取质粒pET28a(+)-esleudh，并保存于-20℃。第二步基于EsLeuDH野生酶的氨基酸序列为模板，在ProteinHomology/analogy Recognition Engine V 2.0(Phyre2)上进行同源建模，并进行分子对接。随后选选取合适的突变位点，选取的位点主要是位于亮氨酸脱氢酶铰链结构上的氨基酸残基。设计突变的引物，以pET28a(+)-esleudh为模板质粒，通过易错PCR和定点饱和突变，获得突变质粒，并转化，进行优势突变菌的筛选，获得亮氨酸脱氢酶突变体EsLeuDH-F362L，将优势突变体送样测序并保存。

本发明亮氨酸脱氢酶突变体和葡萄糖脱氢酶基因工程菌的接种、转接、诱导、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，调节pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择。

与现有技术相比，本发明主要的有益效果主要体现在：本发明构建的亮氨酸脱氢酶突变体EsLeuDH-F362L比酶活较野生型亮氨酸脱氢酶提高了2.2倍，其中突变体EsLeuDH-F362L底物邻氯苯甲酰甲酸投料量可达到500mM，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，4.0h内可反应完成，底物转化率大于99％，产物e.e值始终保持在99.5％以上。本发明采用化学-酶法是从简单的原料开始，通过化学法制备邻氯苯甘氨酸前体酮，再利用亮氨酸脱氢酶突变体进行不对称胺化合成(S)-邻氯苯甘氨酸。相比较全化学合成，本发明的反应条件温和、催化速率高、专一性高、产物e.e值高。因此亮基酸脱氢酶突变体EsLeuDH-F362L具有工业应用前景。

(四)附图说明

图1是亮氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶BmGDH偶联催化邻氯苯甲酰甲酸不对称胺化制备(S)-邻氯苯甘氨酸的反应示意图。

图2是亮氨酸脱氢酶及其突变体纯酶的SDS-PAGE电泳图。泳道1：对照EsLeuDH纯酶；泳道2：EsLeuDH-F362L纯酶；M：标准蛋白分子。

图3是实施例6利用亮氨酸脱氢酶EsLeuDH偶联BmGDH不对称胺化邻氯苯甲酰甲酸制备(S)-邻氯苯甘氨酸时间进程图；A为底物邻氯苯甲酰甲酸投料量为100mM；B为底物邻氯苯甲酰甲酸投料量为500mM。

图4是实施例7利用亮氨酸脱氢酶EsLeuDH-F362L偶联BmGDH不对称胺化邻氯苯甲酰甲酸制备(S)-邻氯苯甘氨酸时间进程图；A为底物邻氯苯甲酰甲酸投料量为100mM；B为底物邻氯苯甲酰甲酸投料量为500mM。

图5是实施例8制备的邻氯苯甲酰甲酸粗品的质谱图。

图6是实施例8制备的邻氯苯甲酰甲酸粗品的核磁共振氢谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-esleudh的构建参照文章(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic 2014(105)11–17)，其中源自西伯利亚微小杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)的亮氨酸脱氢酶esleudh氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例1：亮氨酸脱氢酶随机突变文库的构建和筛选

以出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-esleudh中载体pET28a(+)-esleudh(亮氨酸脱氢酶esleudh氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)为模板，以表1中epPCR-F和epPCR-R为引物，利用易错PCR试剂盒(购自天恩泽公司，即用型易错PCR试剂盒)构建随机突变文库。

EsLeuDH核苷酸序列：

atggtggaaacgaacgttgaggcgcgcttctcgattttcgagacgatggcgatggaagactacgaacaggtggttttttgccatgacaaagtgagcgggctgaaagcaattattgcgattcatgataccaccctgggtccggcactgggtggcctgagaatgtggaattatgcaagcgatgaagaagcattaattgatgcattacgcctggcaaaaggtatgacctacaaaaacgcagcagcaggcctgaatttaggtggtggtaaagcggttataatcggggacgccaaaacccagaaaagcgaagcactgtttagagcatttggtcgttacgttcagagcctgaacggaagatatattacagcagaggatgttaatacaacagttgcagatatggattatatccatatggaaacagatttcgttaccggtgtgagtccggcatttggcagttcaggaaatccgagcccagtcaccgcctatggggtttatcgcggcatgaaagcagcagcaaaggaggtttatggtaccgatagcctggggggtaaaacggttgcaattcagggtgttggtaatgttgcctttaatttatgccgtcatctgcatgaggaaggtgcaaaactgatagtaacagatattaaccaggatgcactgcgtcgtgcagaagaagcatttggtgccctggttgttggaccggatgagatctatagcgttgatgccgatatatttgcgccgtgtgctctgggagcaaccctgaatgacgaaaccattcctcaactgaaagtgaaaattatagcaggtgcagcaaataaccagctgaaagaagatcgtcatggtgatatgctgcaggaacgtggaattctgtatacccctgactttgtgattaacgcaggtggtgtgattaatgttgcggatgaattagatggctataaccgtgaacgggcaatgaaaaaagttgaactggtttatgatgcagttgcaaaagtgattgaaattgcgaaaagagatcatctgccgacctaccgtgcagcagaaaaaatggcagaagaaagaattgcaacaatgggtagcgcccggagccagttcttaagacgtgataaaaatattctgggcagtcggggataa。

EsLeuDH氨基酸序列：

MVETNVEARFSIFETMAMEDYEQVVFCHDKVSGLKAIIAIHDTTLGPALGGLRMWNYASDEEALIDALRLAKGMTYKNAAAGLNLGGGKAVIIGDAKTQKSEALFRAFGRYVQSLNGRYITAEDVNTTVADMDYIHMETDFVTGVSPAFGSSGNPSPVTAYGVYRGMKAAAKEVYGTDSLGGKTVAIQGVGNVAFNLCRHLHEEGAKLIVTDINQDALRRAEEAFGALVVGPDEIYSVDADIFAPCALGATLNDETIPQLKVKIIAGAANNQLKEDRHGDMLQERGILYTPDFVINAGGVINVADELDGYNRERAMKKVELVYDAVAKVIEIAKRDHLPTYRAAEKMAEERIATMGSARSQFLRRDKNILGSRG。

易错PCR反应体系(30μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，3μL10×易错PCR Mix，3μL 10×易错PCR专用Dntp，1μL质粒模板，1.5μL易错PCR专用MnCl₂，0.5μL易错PCR专用Taq DNA聚合酶和19μL超纯水。PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸7s)，72℃终延伸10min，16℃保温。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后用PCR胶回收试剂盒进行回收，得到实验所需的基因DNA片段。基因DNA片段及载体pET28a(+)空质粒经NcoI和XhoI双酶切、消化后连接，转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含50μg/μL的卡那霉素(Kana)的LB平板上，37℃过夜培养12h，获得超过8×10³个克隆的随机突变文库。

从随机突变文库中挑选9600个单克隆接种至100个96孔板中。每孔加有1mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基，在37℃，180rpm条件下培养10h，获得种子液。各转接50μL种子液于新的96孔板中，每孔加有1mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃，180rpm振荡培养4h后，每孔加入终浓度0.15mM的IPTG，转至28℃培养16h。各个96孔板通过96孔板离心机，4000rpm，4℃下离心10min，弃去上清，各孔加入200μL的Tris-HCl溶液(0.1mM、pH＝9.0)，使菌体重悬起来。将溶菌酶(≥20000U/mg)用Tris-HCl溶液(0.1mM、pH＝9.0)配制终浓度为0.3mg/mL的溶菌酶溶液，然后给96孔板每孔加入100μL的溶菌酶溶液，37℃反应1h。待菌体充***解后，通过96孔板离心机，4000rpm，4℃下离心10min，取上清液，得到细胞裂解液。取干净的96孔板，各孔加入150μL反应液(0.8mM的NADH，0.1mM、pH 9.0的Tris-HCl缓冲液，8mM邻氯苯甲酰甲酸和16mM的硫酸铵)，然后加入上述所得50μL的细胞裂解液，40℃，180rpm反应1min，用酶标仪测定反应结束时体系在340nm处的吸光度。

以发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-esleudh作为对照组，筛选得到的活性高于对照的菌株(即反应1min前后吸光值的变化大于对照菌株)。将获得的优势菌株送至杭州擎科生物技术有限公司测序，并保存在-80℃冰箱。经过上述随机突变文构建和筛选，获得了1株活力提高12倍的亮氨酸脱氢酶突变体；其余9000多个突变体均为显示出提高2倍以上的活力，故舍弃。测序得知该突变体1084位碱基T变为C，对应的第362位苯丙氨酸改成亮氨酸，命名该突变体为EsLeuDH-F362L。

表1亮氨酸脱氢酶随机突变引物设计

实施例2：野生型亮氨酸脱氢酶、突变体和葡萄糖脱氢酶的诱导表达

葡萄糖脱氢酶基因工程菌：根据来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)IWG3的葡萄糖脱氢酶基因(Genbank登录号：1RWB_A)，人工合成葡萄糖脱氢酶bmgdh基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)***到pET28b(+)的Nco I和Xho I两个酶切位点之间构建重组表达载体，并将此表达载体转入E.coli BL21(DE3)，制得E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-bmgdh。

bmgdh核苷酸序列：

ATGTACAAGGACCTTGAGGGAAAGGTCGTCGTCATTACTGGATCTTCTACTGGACTGGGAAA

GTCTATGGCTATTCGATTCGCTACTGAGAAGGCTAAGGTCGTCGTGAACTACCGATCTAAGGA

GGACGAGGCTAACTCTGTCCTTGAGGAGATTAAGAAGGTCGGAGGAGAGGCTATTGCTGTC

AAGGGTGACGTCACTGTCGAGTCTGACGTCATTAACCTGGTCCAGTCTGCTATTAAGGAGTT

CGGAAAGCTGGACGTCATGATTAACAACGCTGGACTTGAGAACCCTGTGTCCTCTCACGAG

ATGTCTCTGTCTGACTGGAACAAGGTCATTGACACTAACCTGACTGGTGCTTTCCTGGGATC

TCGAGAGGCTATTAAGTACTTCGTCGAGAACGACATTAAGGGAACTGTCATTAACATGTCCT

CTGTCCACGAGAAGATTCCTTGGCCTCTGTTCGTCCACTACGCTGCTTCTAAGGGTGGAATG

AAGCTGATGACTAAGACTCTGGCTCTTGAGTACGCTCCTAAGGGTATTCGAGTCAACAACAT

TGGACCTGGTGCTATTAACACTCCTATTAACGCTGAGAAGTTCGCTGACCCTGAGCAGCGAG

CTGACGTCGAGTCTATGATTCCTATGGGTTACATTGGAGAGCCTGAGGAGATTGCTGCTGTCG

CTGCTTGGCTGGCTTCTTCTGAGGCTTCTTACGTCACTGGAATTACTCTGTTCGCTGACGGTGGAATGACTCTTTACCCTTCGTTCCAGGCTGGACGAGGATAG.

bmgdh氨基酸序列：

MYKDLEGKVVVITGSSTGLGKSMAIRFATEKAKVVVNYRSKEDEANSVLEEIKKVGGEAIAVK

GDVTVESDVINLVQSAIKEFGKLDVMINNAGLENPVSSHEMSLSDWNKVIDTNLTGAFLGSREA

IKYFVENDIKGTVINMSSVHEKIPWPLFVHYAASKGGMKLMTKTLALEYAPKGIRVNNIGPGAIN

TPINAEKFADPEQRADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASSEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG.

将实施例1出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-esleudh和实施例1筛选的亮氨酸脱氢酶突变菌株以及E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-bmgdh分别接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，培养液以体积浓度1.5％(v/v)的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，用0.9％(w/v)盐水洗涤两次，获得相应的湿菌体细胞。以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液催化不对称还原邻氯苯甲酰甲酸制备(S)-邻氯苯甘氨酸。

实施例3：野生型亮氨酸脱氢酶的酶活测定

1、酶活测定

将实施例2诱导表达的出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-esleudh湿菌体及E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-bmgdh湿菌体以干重比2:1(w/w)混合成出发混合菌体。

酶活单位(U)定义为：在40℃、pH 9.0条件下，每分钟每生成1微摩尔(S)-邻氯苯甘氨酸所需的酶量定义为一个酶活单位，U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，U/mg。

酶活测定方法：将出发混合菌体作为催化剂，以邻氯苯甲酰甲酸为底物，以葡萄糖为辅助底物，添加少量外源性NAD⁺，以pH 9.0、100mM Tris-HCl缓冲液为反应介质，建立起辅酶循环***。反应体系选择为1mL，催化剂用量以混合菌体总干重计3g/L，底物终浓度20mM，葡萄糖终浓度24mM，硫酸铵终浓度30mM，NAD⁺终浓度为0.2mM，pH 9.0、100mM Tris-HCl缓冲液为反应介质构建转化体系，40℃、600rpm反应10min，用6.0M的HCl终止反应。样品经离心(12,000rpm、1min)、超纯水稀释20倍，然过0.22μm微滤膜后，取滤液采用HPLC检测邻氯苯甲酰甲酸、(S)-邻氯苯甘氨酸的峰面积，并根据相应标准曲线获得邻氯苯甲酰甲酸、(S)-邻氯苯甘氨酸含量。

邻氯苯甲酰甲酸标准曲线方程：y＝28.054x+0.8675(R²＝0.999)。

(S)-邻氯苯甘氨酸标准曲线方程：y＝44.89x+4.1074(R²＝0.999)

酶活计算公式：

式中，[S]，产物(S)-邻氯苯甘氨酸的浓度，μmol/mL；V，反应总体积，mL；t，反应时间，min；[E]，酶蛋白的浓度，mg/mL。

HPLC检测条件：色谱柱Crownpack CR(+)(0.4×15cm,5μm)，流动相为10mM高氯酸水溶液(pH＝2.0)，流速为0.6mL/min，紫外检测波长220nm，进样量为10μL，柱温保持25℃。邻氯苯甲酰甲酸、(S)-邻氯苯甘氨酸洗脱峰保留时间分别为15min，10min。

2、出发菌株酶活测定

按照步骤1酶活测定方法，在40℃和pH 7.0PB缓冲液条件下测定出发菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-esleudh湿菌体酶活，酶活为8U/mg。

实施例4：亮氨酸脱氢酶定点饱和突变文库的构建及筛选

1、亮氨酸脱氢酶定点饱和突变

亮氨酸脱氢酶突变体文库的制备通过1轮定点饱和突变来实现，引物设计如表2，以E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-esleudh中载体pET28a(+)-esleudh为模板，以表2中Phe362-F和Phe362-R为引物，进行定点饱和突变PCR反应，将SEQ ID NO.2所示亮氨酸脱氢酶EsLeuDH氨基酸序列的第362位苯丙氨酸突变为其余19种氨基酸。

表2亮氨酸脱氢酶定点饱和突变引物设计

注：表2中N代表A,T,G,C；S代表G,C。

PCR反应体系(50μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，25μL2×Phanta缓冲液，1μLdNTP混合物(各10mM)，1μL质粒模板，1μLDNA聚合酶和21μL超纯水。根据PhantaSuper-Fidelity DNA聚合酶手册设置的PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸7s)，72℃终延伸10min，16℃保温。

将PCR反应得到的重组质粒转移到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并将克隆子在37℃培养12h。然后挑出阳性克隆并转接到10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm培养10h，培养液8000rpm离心10min，收集突变体湿菌体。

2、优势突变体的筛选

将实施例1获得的突变体湿菌体与实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-bmgdh湿菌体以干重比2:1(w/w)混合后作为突变混合菌体进行优势突变体的筛选，筛选条件如下：将突变混合菌体以干重3g/L的量加入pH 9.0的Tris-HCl(100mM)中重悬细胞，再加入终浓度20mM邻氯苯甲酰甲酸，24mM的葡萄糖，30mM的硫酸铵，0.2mM的NAD⁺构成转化体系1mL，在40℃、600rpm条件下反应10min，用6.0M的HCl终止反应。取样采用实施例3方法检测邻氯苯甲酰甲酸、(S)-邻氯苯甘氨酸含量，以相对活力和(S)-邻氯苯甘氨酸的e.e.为指标，筛选优势突变体，实验结果示于表3。结果显示，在pH 9.0条件下，突变体EsLeuDH-F362L相较于野生型EsLeuDH酶活提高了10.4倍。将获得的优势菌株送至杭州擎科生物技术有限公司测序，并保存在-80℃冰箱。

同样条件下，用出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-esleudh替换突变体菌株湿菌体制备出发混合菌体。

e.e.计算公式：

式中，C_S-CPG和C_R-CPG表示产物(S)-邻氯苯甘氨酸和(R)-邻氯苯甘氨酸的摩尔浓度，mol/L。

表3EsLeuDH及其突变体的催化性能和立体选择性

实施例5：亮氨酸脱氢酶母本及其突变体F362L的纯化及相对酶活

1、纯酶

将实施例4获得的最优突变体(表3中EsLeuDH-F362L)，根据实施例2所述方法诱导表达后获得亮氨酸脱氢酶突变体湿菌体。将2g湿菌体按照湿菌体总量100g/L的量加入20mL的pH 9.0、100mM Tris-HCl缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎6min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s、暂停1s，取破碎混合液，获得突变株粗酶液15ml，在8000rpm，4℃下离心10min，收集上清液，上清液过0.45μm膜微过滤后，收集10ml滤液作为上样液，采用Ni亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)在4℃下纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用缓冲液A(含0.3M NaCl的pH 9.0、20mM Tris-HCl缓冲液)进行预平衡。②上样液以0.5mL/min的速度上样，上样量为10mL；用缓冲液B(含0.3M NaCl、20mM咪唑的pH 9.0、20mM Tris-HCl缓冲液)以1.0mL/min的流速洗去未结合的杂质，洗脱量为10个柱体积，直至电导率稳定。③然后用缓冲液C(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 9.0、20mM Tris-HCl缓冲液)洗脱目的蛋白，洗脱速度为1mL/min，洗脱量为10个柱体积，当UV吸光度为0.1并开始上升时开始收集酶液，吸光度降到0.1时停止收集。④采用透析袋(MD34，Viskase，美国)，将步骤③收集的洗脱液用pH9.0、20mM Tris-HCl缓冲液透析过夜，取截留液即为纯酶5ml，采用二喹啉甲酸蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定蛋白浓度为2.7mg/mL。

同样条件下，制备出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-esleudh的纯酶，蛋白浓度为2.5mg/mL。

用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白质大小，电泳结果示于图2，突变菌株的目标酶表达量较E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-esleudh菌株的酶表达量没有显著变化，因此，突变体的酶活提高不是酶的表达量增加引起的，与酶自身比活力增加有关。

2、相对酶活

酶活检测标准条件：10mM邻氯苯甲酰甲酸，15mM(NH₄)₂SO₄，1mM NADH，酶液50mg/L(以蛋白含量计)，于pH 9.0、20mM Tris-HCl缓冲液中，在40℃、600rpm条件下反应10min，采用实施例3方法检测邻氯苯甲酰甲酸、(S)-邻氯苯甘氨酸含量，计算相对酶活和产物的ee值，结果见表4。

表4亮氨酸脱氢酶及其突变体纯酶的相对酶活及其产物的e.e.值

实施例6：野生型亮氨酸脱氢酶EsLeuDH不对称胺化邻氯苯甲酰甲酸

1、100mM邻氯苯甲酰甲酸

根据实施例2方法制备野生型亮氨酸脱氢酶EsLeuDH和葡萄糖脱氢酶BmGDH湿菌体，将野生型亮氨酸脱氢酶EsLeuDH湿菌体和葡萄糖脱氢酶BmGDH湿菌体以干重比2:1(w/w)混合成出发混合菌体。

在10mL转化体系中，先将出发混合菌体用pH 7.0、100mM的PB缓冲液重悬，转化体系中混合菌体加入干重量为3g DCW/L，当底物邻氯苯甲酰甲酸投料量为100mM，葡萄糖浓度为120mM，硫酸铵浓度为150mM，NAD⁺浓度为1mM时，以pH 7.0、100mM的PB缓冲液为反应介质构成转化体系，在40℃、600rpm条件下反应，反应进程如图3中A所示，40h能基本转化成产物(S)-邻氯苯甘氨酸(转化率95％)，底物转化率大于99％，产物e.e值始终保持在99.5％以上。

2、500mM邻氯苯甲酰甲酸

采用步骤1中出发混合菌体，在10mL转化体系中，先将出发混合菌体用pH 7.0、100mM的PB缓冲液重悬，转化体系中混合菌体加入干重量为6g DCW/L，底物邻氯苯甲酰甲酸投料量为500mM，葡萄糖浓度为600mM，硫酸铵浓度为750mM，NAD+浓度为5mM时，pH 7.0、100mM的PB缓冲液为反应介质构建转化体系10mL，40℃、600rpm反应，反应进程如图3中B所示，40h后转化率仅为61％，产物e.e值>99.5％。

实施例7：氨基酸脱氢酶突变体EsLeuDH-F362L不对称还原邻氯苯甲酰甲酸

1、100mM邻氯苯甲酰甲酸

根据实施例2方法制备亮氨酸脱氢酶突变体EsLeuDH-F362L湿菌体和葡萄糖脱氢酶BmGDH湿菌体，将湿菌体EsLeuDH-F362L和葡萄糖脱氢酶BmGDH湿菌体以干重比2:1(w/w)混合成突变混合菌体。

在10mL转化体系中，先将突变混合菌体用pH 9.0、100mM的Tris-HCl缓冲液重悬，转化体系中混合菌体加入干重量为3g DCW/L，底物邻氯苯甲酰甲酸投料量为100mM，葡萄糖浓度为120mM，硫酸铵浓度为150mM，NAD⁺浓度为1mM时，pH9.0、100mM Tris-HCl缓冲液为反应介质构建转化体系10mL，40℃、600rpm反应，反应进程如图4中A所示，底物在4h能完全转化成产物(S)-邻氯苯甘氨酸，产物e.e值>99.5％。

2、500mM邻氯苯甲酰甲酸

采用步骤1的突变混合菌体，在10mL转化体系中，先将混合菌体用pH 9.0、100mM的Tris-HCl缓冲液重悬，转化体系中混合菌体加入干重量为6g DCW/L，底物邻氯苯甲酰甲酸投料量为500mM，葡萄糖浓度为600mM，硫酸铵浓度为750mM，NAD+浓度为5mM时，pH 9.0、100mM Tris-HCl缓冲液为反应介质构建转化体系10mL，40℃、600rpm反应，反应进程如图4中B所示，底物在4h能完全转化成产物(S)-邻氯苯甘氨酸，产物e.e值>99.5％。

实施例8：化学-酶组合合成(S)-邻氯苯甘氨酸

1、邻氯苯乙酮氧化生成邻氯苯甲酰甲酸

向50mL圆底烧瓶中加入1.54g(10mmol)苯乙酮溶解于12.5mL无水吡啶中，加入2.22g(20mmol)二氧化硒，在N₂保护下100℃回流15h，溶液由无色变为黄色。经TLC监测(展开剂为甲醇：二氯甲烷＝1:10，v/v)至反应结束后，减压除去溶剂，随后加入2M氢氧化钠水溶液调节至pH＝12，搅拌0.5h。用水萃取2次，随后加入40％的盐酸水溶液调节至pH＝2.0。之后用乙酸乙酯萃取4次后合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂后，得到邻氯苯甲酰甲酸粗品1.68g，摩尔收率91％。质谱图见图5所示，核磁共振氢谱图见图6所示，表明合成所得物质为目标产物邻氯苯甲酰甲酸。

2、化学-酶组合合成(S)-邻氯苯甘氨酸

在10mL转化体系中，先将实施例7制备的突变混合菌体用pH 9.0、100mM的Tris-HCl缓冲液(即为反应介质)重悬，转化体系中突变混合菌体加入干重量为3g DCW/L，再加入投料量为100mM的步骤1制备的底物邻氯苯甲酰甲酸粗品(0.185g)，终浓度为120mM的葡萄糖，终浓度为150mM的硫酸铵，终浓度为1mM的NAD⁺，40℃、600rpm反应，采用实施例3所述HPLC检测，底物在4h能完全转化成产物(S)-邻氯苯甘氨酸，产物e.e值>99.5％。将反应4h后的反应液置于冰浴中，以6mol/L的盐酸调节至pH＝2.0。用乙酸乙酯萃取1次，并将水相减压蒸干得到白色固体粉末。将白色固体粉末溶解于热异丙醇中，随后旋转蒸干，得到0.15g产物(S)-邻氯苯甘氨酸，质量收率为81.8％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 亮氨酸脱氢酶突变体及其在合成(S)-邻氯苯甘氨酸中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1125

<212> DNA

<213> 西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)

<400> 1

atggtggaaa cgaacgttga ggcgcgcttc tcgattttcg agacgatggc gatggaagac 60

tacgaacagg tggttttttg ccatgacaaa gtgagcgggc tgaaagcaat tattgcgatt 120

catgatacca ccctgggtcc ggcactgggt ggcctgagaa tgtggaatta tgcaagcgat 180

gaagaagcat taattgatgc attacgcctg gcaaaaggta tgacctacaa aaacgcagca 240

gcaggcctga atttaggtgg tggtaaagcg gttataatcg gggacgccaa aacccagaaa 300

agcgaagcac tgtttagagc atttggtcgt tacgttcaga gcctgaacgg aagatatatt 360

acagcagagg atgttaatac aacagttgca gatatggatt atatccatat ggaaacagat 420

ttcgttaccg gtgtgagtcc ggcatttggc agttcaggaa atccgagccc agtcaccgcc 480

tatggggttt atcgcggcat gaaagcagca gcaaaggagg tttatggtac cgatagcctg 540

gggggtaaaa cggttgcaat tcagggtgtt ggtaatgttg cctttaattt atgccgtcat 600

ctgcatgagg aaggtgcaaa actgatagta acagatatta accaggatgc actgcgtcgt 660

gcagaagaag catttggtgc cctggttgtt ggaccggatg agatctatag cgttgatgcc 720

gatatatttg cgccgtgtgc tctgggagca accctgaatg acgaaaccat tcctcaactg 780

aaagtgaaaa ttatagcagg tgcagcaaat aaccagctga aagaagatcg tcatggtgat 840

atgctgcagg aacgtggaat tctgtatacc cctgactttg tgattaacgc aggtggtgtg 900

attaatgttg cggatgaatt agatggctat aaccgtgaac gggcaatgaa aaaagttgaa 960

ctggtttatg atgcagttgc aaaagtgatt gaaattgcga aaagagatca tctgccgacc 1020

taccgtgcag cagaaaaaat ggcagaagaa agaattgcaa caatgggtag cgcccggagc 1080

cagttcttaa gacgtgataa aaatattctg ggcagtcggg gataa 1125

<210> 2

<211> 374

<212> PRT

<213> 西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)

<400> 2

Met Val Glu Thr Asn Val Glu Ala Arg Phe Ser Ile Phe Glu Thr Met

1 5 10 15

Ala Met Glu Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys His Asp Lys Val Ser

20 25 30

Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala

35 40 45

Leu Gly Gly Leu Arg Met Trp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Glu Ala Leu

50 55 60

Ile Asp Ala Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala

65 70 75 80

Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp Ala

85 90 95

Lys Thr Gln Lys Ser Glu Ala Leu Phe Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Val

100 105 110

Gln Ser Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Asn Thr Thr

115 120 125

Val Ala Asp Met Asp Tyr Ile His Met Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly

130 135 140

Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala

145 150 155 160

Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala Ala Ala Lys Glu Val Tyr Gly

165 170 175

Thr Asp Ser Leu Gly Gly Lys Thr Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Asn

180 185 190

Val Ala Phe Asn Leu Cys Arg His Leu His Glu Glu Gly Ala Lys Leu

195 200 205

Ile Val Thr Asp Ile Asn Gln Asp Ala Leu Arg Arg Ala Glu Glu Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Leu Val Val Gly Pro Asp Glu Ile Tyr Ser Val Asp Ala

225 230 235 240

Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Leu Asn Asp Glu Thr

245 250 255

Ile Pro Gln Leu Lys Val Lys Ile Ile Ala Gly Ala Ala Asn Asn Gln

260 265 270

Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu

275 280 285

Tyr Thr Pro Asp Phe Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala

290 295 300

Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Met Lys Lys Val Glu

305 310 315 320

Leu Val Tyr Asp Ala Val Ala Lys Val Ile Glu Ile Ala Lys Arg Asp

325 330 335

His Leu Pro Thr Tyr Arg Ala Ala Glu Lys Met Ala Glu Glu Arg Ile

340 345 350

Ala Thr Met Gly Ser Ala Arg Ser Gln Phe Leu Arg Arg Asp Lys Asn

355 360 365

Ile Leu Gly Ser Arg Gly

370

<210> 3

<211> 786

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 3

atgtacaagg accttgaggg aaaggtcgtc gtcattactg gatcttctac tggactggga 60

aagtctatgg ctattcgatt cgctactgag aaggctaagg tcgtcgtgaa ctaccgatct 120

aaggaggacg aggctaactc tgtccttgag gagattaaga aggtcggagg agaggctatt 180

gctgtcaagg gtgacgtcac tgtcgagtct gacgtcatta acctggtcca gtctgctatt 240

aaggagttcg gaaagctgga cgtcatgatt aacaacgctg gacttgagaa ccctgtgtcc 300

tctcacgaga tgtctctgtc tgactggaac aaggtcattg acactaacct gactggtgct 360

ttcctgggat ctcgagaggc tattaagtac ttcgtcgaga acgacattaa gggaactgtc 420

attaacatgt cctctgtcca cgagaagatt ccttggcctc tgttcgtcca ctacgctgct 480

tctaagggtg gaatgaagct gatgactaag actctggctc ttgagtacgc tcctaagggt 540

attcgagtca acaacattgg acctggtgct attaacactc ctattaacgc tgagaagttc 600

gctgaccctg agcagcgagc tgacgtcgag tctatgattc ctatgggtta cattggagag 660

cctgaggaga ttgctgctgt cgctgcttgg ctggcttctt ctgaggcttc ttacgtcact 720

ggaattactc tgttcgctga cggtggaatg actctttacc cttcgttcca ggctggacga 780

ggatag 786

<210> 4

<211> 261

<212> PRT

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 4

Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ser

1 5 10 15

Thr Gly Leu Gly Lys Ser Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala

20 25 30

Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Lys Glu Asp Glu Ala Asn Ser Val

35 40 45

Leu Glu Glu Ile Lys Lys Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys Gly

50 55 60

Asp Val Thr Val Glu Ser Asp Val Ile Asn Leu Val Gln Ser Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Lys Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu

85 90 95

Asn Pro Val Ser Ser His Glu Met Ser Leu Ser Asp Trp Asn Lys Val

100 105 110

Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Thr Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Lys Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

Claims

1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第362位苯丙氨酸突变为亮氨酸获得的。

2.一种含权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。

3.一种权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体在不对称催化胺化邻氯苯甲酰甲酸制备(S)-邻氯苯甘氨酸中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用方法为：将含亮氨酸酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以邻氯苯甲酰甲酸为底物，以葡萄糖为辅底物，以硫酸铵为氨基供体，添加NAD⁺，以pH7-10的缓冲液为反应介质构成转化体系，在30-50℃、500-800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得(S)-邻氯苯甘氨酸。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述转化体系中，底物终浓度20-500mM，葡萄糖终浓度24-600mM，NAD⁺终浓度0.2-5mM，硫酸铵终浓度30-750mM，催化剂用量以混合菌体总量干重计为1-10g DCW/L，所述混合菌体中含亮氨酸脱氢酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体与含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体干重比为1-5:1。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含亮氨酸脱氢酶突变体基因的工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，以体积浓度1.5％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.10mM异丙基硫代半乳糖苷，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含亮氨酸脱氢酶突变体的湿菌体；所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体制备方法同含亮氨酸脱氢酶基因的湿菌体。

7.一种权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体在化学-酶法合成(S)-邻氯苯甘氨酸中的应用，其特征在于，所述应用方法为：(1)以苯乙酮为底物，二氧化硒为氧化剂，以无水吡啶为溶剂，在N₂保护下100℃回流15h后，反应液减压除去溶剂，并用2M氢氧化钠水溶液调节至pH＝12，搅拌0.5h；再用水萃取2次，用40％的盐酸水溶液调节至pH＝2；之后用乙酸乙酯萃取4次后合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂后，得到邻氯苯甲酰甲酸；(2)将含亮氨酸酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以步骤(1)制备的邻氯苯甲酰甲酸为底物，以葡萄糖为辅底物，加入NAD⁺，以硫酸铵为氨基供体，以pH7-10的缓冲液为反应介质构成转化体系，在30-50℃、500-800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得(S)-邻氯苯甘氨酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述苯乙酮与二氧化硒投料物质的量之比为1:2；所述无水吡啶体积用量以苯乙酮物质的量计为1.25mL/mmol。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述转化体系中，底物终浓度20-500mM，葡萄糖终浓度24-600mM，NAD⁺终浓度0.2-5mM，硫酸铵终浓度30-750mM，催化剂用量以混合菌体总量干重计为1-10g DCW/L，所述混合菌体中含亮氨酸脱氢酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体与含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体干重比为1-5:1。