CN115322247A

CN115322247A - 一种新型冠状病毒受体结合区电荷突变体抗原及应用

Info

Publication number: CN115322247A
Application number: CN202110593852.6A
Authority: CN
Inventors: 陈薇; 宰晓东; 徐俊杰; 周楚格; 张军; 殷瑛; 于蕊; 张跃; 李汭桦; 李耀辉; 赵晓帆; 王美荣; 周子清
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-05-11
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2022-11-11

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒受体结合区(Receptor Bind Domain，RBD)电荷突变体抗原，所述突变体是在将新型冠状病毒受体结合区RBD末端加上连续负电氨基酸。所述RBD抗原突变体相较于野生型RBD抗原在联合AL(OH)₃佐剂免疫后，能够显著提升宿主针对新型冠状病毒的中和抗体水平，本发明还提供了所述RBD抗原突变体在制备新型冠状病毒治疗、预防药物或者疫苗中的应用。

Description

一种新型冠状病毒受体结合区电荷突变体抗原及应用

技术领域

本发明涉及一种新型冠状病毒受体结合区电荷突变体抗原和应用，属于多肽技术领域。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种新发现的具有囊膜的正义单链 RNA病毒，属于冠状病毒科、β冠状病毒属，可引发大范围严重呼吸道传染病。自2019年底报道以来，全球新型冠状病毒疫情形势严峻，严重威胁了人类健康和公共卫生安全。

疫苗是防控新发突发传染病的重要手段，针对新型冠状病毒的疫苗研发刻不容缓。表面刺突蛋白(Spike，S)是新型冠状病毒主要的靶标抗原，具有较高的免疫原性，可以诱导机体产生针对病毒的保护性抗体和攻毒保护。S蛋白受体结合区(Receptor BindDomain，RBD)作为独立的结构域，负责与宿主受体血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)结合，被认为是诱导机体产生中和抗体的核心区域。重组RBD抗原蛋白可形成正确构象、在动物模型中可诱导一定中和抗体、细胞反应以及免疫保护效果(Nat Rev Immunol 21(2):73-82(2021))。

铝佐剂是迄今为止使用最广泛的人用疫苗佐剂，在已上市疫苗中显示了可接受的安全性和有效性。目前多个处于临床阶段的新型冠状病毒重组RBD抗原蛋白疫苗采用氢氧化铝(AL(OH)₃)作为有效佐剂成分 (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19- vaccines)。然而，在已有报道中(Nature 586:572–577(2020)；Cell 182: 722–733(2020))，RBD抗原蛋白联合通用的AL(OH)₃佐剂仅能激发有限的抗体与中和抗体反应。

本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒受体结合区电荷突变体抗原，以使所述抗原联合AL(OH)₃佐剂能激发较强的中和抗体反应。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种新型冠状病毒RBD抗原突变体，所述RBD抗原突变体是由RBD抗原以及在其末端连接的3-24个等电点pI小于7.4、亲水指数小于0的负电荷氨基酸构成。

本发明通过在新型冠状病毒受体结合区RBD末端人为设计引入多个负电荷氨基酸，从而改变野生型RBD蛋白电荷特征，构建开发了一种新型冠状病毒电荷突变体RBD抗原蛋白。

通过分析新型冠状病毒野生型RBD(R319-K537)抗原蛋白电荷性质，发现其等电点pI为8.95，在正常生理条件下(pH约为7.4)整体呈现较强正电性。而疫苗常用的AL(OH)₃佐剂在正常生理条件下表面呈现正电荷，不利于对RBD抗原蛋白的吸附以及缓释，可能是导致二者联用免疫效力较低的原因之一。发明人尝试通过在RBD末端人为设计引入连续多个负电荷氨基酸，改变野生型RBD蛋白电荷特征，有助于提升其于 AL(OH)₃佐剂的吸附与缓释，从而提升疫苗免疫效力。

进一步分析新型冠状病毒RBD(R319-K537)蛋白表面电荷分布，发现其C末端区域正电荷性较强。因此，在本发明的一个优选实施方案中，在RBD抗原的C末端连接所述的负电荷氨基酸。

在一个更为优选的实施方案中，将负电荷氨基酸-天门冬氨酸连接至 RBD抗原蛋白的C末端。蛋白质的等电点pI主要依赖于7种带电荷的氨基酸:谷氨酸Glu(等电点pI为3.22)、天门冬氨酸Asp(等电点pI为2.77)、半胱氨酸Cys(等电点pI为5.07)、酪氨酸Tyr(等电点pI为5.66)、组氨酸His(等电点pI为7.59)、赖氨酸Lys(等电点pI为9.74)和精氨酸Arg(等电点pI为10.76)(Nucleic Acid Res.DOI:10.1093/nar/gkab295(2021))。在正常生理条件下(pH约为7.4)，其中4种氨基酸携带有负电荷，分别为谷氨酸Glu(等电点pI为3.22)、天门冬氨酸Asp(等电点pI为2.77)、半胱氨酸Cys(等电点pI为5.07)和酪氨酸Tyr(等电点pI为5.66)。末端连接氨基酸的亲水性是影响RBD蛋白表达与免疫原性的另一个关键因素。某种氨基酸的亲水指数(hydropathy index)是一个描述其支链的亲水性或疏水性程度大小的值。“亲水指数”于1982年被Jack Kyte与Russell Doolittle提出。亲水指数越大，这种氨基酸的疏水性就越强。根据氨基酸亲水指数表，4种负电荷氨基酸亲水指数分别为谷氨酸Glu(亲水指数为 -3.5)、天冬氨酸Asp(亲水指数为-3.5)、半胱氨酸Cys(亲水指数为2.5)和酪氨酸Tyr(亲水指数为-1.3)。末端连接氨基酸的分子大小对RBD蛋白原有的空间结构具有一定影响。根据氨基酸相对分子量表，4种负电荷氨基酸的相对分子量分别为谷氨酸Glu(相对分子量为147.13)、天门冬氨酸Asp(相对分子量为133.10)、半胱氨酸Cys(相对分子量为121.16) 和酪氨酸Tyr(相对分子量为181.19)。通过对氨基酸等电点、亲水性、分子大小等因素进行综合考虑，所连接的氨基酸等电点pI需小于7.4，带有负电荷；亲水指数需小于0，为亲水性氨基酸；此外，相对分子量应小于 150，对RBD空间结构影响较小。天门冬氨酸等电点pI为2.77，带有较强负电荷；其亲水指数为-3.5，亲水性较强；相对分子量为133.10，对RBD空间结构影响较小，将其做为优选的氨基酸连接至RBD抗原C末端。

优选地，所述天门冬氨酸的数量为3-24个。通过Discover Studio与 ProtParam软件分析RBD末端连接不同数量天门冬氨酸后RBD蛋白表面电荷分布情况，发现在RBD的C末端连接3-24个天门冬氨酸时，其等电点pI从8.95分别降至8.56(3个天门冬氨酸)、7.64(6个天门冬氨酸) 和4.30(24个天门冬氨酸)。局部电荷属性直接影响其与AL(OH)₃佐剂的吸附与缓释，当连接至少3个天门冬氨酸时，C末端局部电荷属性由强正电性减弱为弱正电性；当连接24个天门冬氨酸时，C末端局部电荷属性由强正电性偏移为强负电性；连接多于24个天门冬氨酸时，末端添加氨基酸数量超过RBD本身氨基酸序列长度(219个氨基酸)10％，经结构预测可能对RBD整体构象影响较大。尤为优选地，当连接6个天门冬氨酸时即可将RBD的C末端局部电荷属性由正电荷偏移为负电荷，同时对RBD整体结构影响较小。

在本发明的一个具体实施方案中，所述RBD抗原突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

通过人为设计在其C末端引入连续6个负电荷氨基酸-天门冬氨酸(Asp)，改变该区域电荷特征为负电荷性，获得电荷突变体RBD-6Asp 抗原；加上信号肽及纯化标签后，采用真核细胞重组表达制备电荷突变体RBD-6Asp蛋白，纯化后联合AL(OH)₃佐剂对Balb/C小鼠进行免疫。

本发明所表达的电荷突变体RBD-6Asp蛋白抗原克服了野生型RBD 蛋白免疫原性不足的缺点，联合AL(OH)₃佐剂制备成的疫苗能够激发更强的免疫反应，产生更高滴度的中和SARS-CoV-2病毒入侵靶细胞的抗体。电荷突变体RBD-6Asp激发的假病毒中和抗体水平达到510，是野生型RBD(中和抗体滴度为38)的13倍；电荷突变体RBD-6Asp激发的真病毒中和抗体水平达到131，是野生型RBD(中和抗体滴度为16)的 8倍，均具有显著提升(p<0.05)。

其次，本发明提供了上述新型冠状病毒RBD抗原突变体在制备新型冠状病毒治疗、预防药物或者疫苗中的应用

本发明的电荷突变体RBD-6Asp抗原相较于野生型RBD抗原能够显著提升宿主针对新型冠状病毒的中和抗体水平，提升了如前述的13倍(假病毒)与8倍(真病毒)；而且本发明的抗原制备方法简单，AL(OH)₃佐剂为临床最常用佐剂，具有较好的应用前景。

第三，本发明还提供了编码上述RBD抗原突变体的多核苷酸分子。

在本发明的一个优选实施方案中，所述多核苷酸分子的DNA序列如 SEQ ID NO：2所示。

第四，本发明提供了上述多核苷酸分子在制备新型冠状病毒DNA疫苗中的应用。在本发明提供的上述如SEQ ID NO：2所示的多核苷酸分子的基础上，采用本领域常规的技术手段，即可提供所述的应用。例如，以pcDNA3.1、pVAX1等真核表达载体为骨架，对上述多核苷酸分子基因启动密码子ATG的前碱基序列做设计和调整，使其符合Kozak规则，构建编码RBD-6Asp的DNA疫苗，转染真核细胞鉴定目的蛋白的瞬时表达情况后，以肌肉注射等方式免疫宿主发挥免疫保护效果。

第五，本发明还提供了根据上述多核苷酸分子转录的mRNA，在本发明的一个优选实施方案中，所述mRNA的序列如SEQ ID NO：3所示。

最后，本发明提供了上述mRNA在制备新型冠状病毒mRNA疫苗中的应用。在本发明提供的上述如SEQ ID NO：3所示的mRNA分子的基础上，采用本领域常规的技术手段，即可提供所述的应用。例如，以上述表达RBD-6Asp的多核苷酸分子mRNA序列为基础，分别进行5'UTR 或3'UTR的选择、mRNA的二级结构优化、PolyA尾巴的优化、mRNA 密码子的优化、修饰核苷酸的选择等，获得稳定表达的优化后序列，联合脂质体等高效递送***将mRNA疫苗递送至宿主体内发挥免疫保护效果。

本发明将新型冠状病毒受体结合区RBD(R319-K537)末端人为设计引入多个负电荷氨基酸-天门冬氨酸(Asp)，从而改变野生型RBD蛋白电荷特征，构建开发了一种电荷突变体RBD抗原蛋白，同时加上tPA 信号肽和His纯化标签，通过质粒转染真核细胞表达***表达重组蛋白。获得的电荷突变体RBD-6Asp抗原能够克服野生型RBD与AL(OH)₃佐剂联用时免疫原性不足的缺点，有效地激发更强的免疫反应，显著提高宿主针对SARS-CoV-2的中和抗体水平。通过Balb/c小鼠免疫实验，比较电荷突变体RBD-6Asp抗原与野生型RBD抗原的免疫效力，已经证实联合AL(OH)₃佐剂免疫后，RBD-6Asp抗原激发的SARS-CoV-2假病毒中和抗体与真病毒中和抗体均显著高于野生型RBD抗原。本发明抗原制备方法简单，具有较好的应用前景。

附图说明

图1.新型冠状病毒受体结合区电荷突变体抗原RBD-6Asp设计示意图；

图2.野生型RBD和电荷突变体RBD-6Asp抗原蛋白SDS-PAGE图；

图3.Balb/c小鼠免疫策略示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。除非特别说明，本发明所采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。

实施例1新型冠状病毒受体结合区电荷突变体RBD的表达纯化

将新型冠状病毒受体结合区RBD氨基酸序列(序列如Genebank， YP_009724390.1，R319-K537)C末端加上连续6个负电氨基酸-天门冬氨酸(Asp)，并在其N端增加分泌性信号肽tPA以及His纯化标签，获得RBD-6Asp氨基酸序列(如SEQ ID NO：1所示)，序列构建细节见图 1。将该序列经哺乳动物细胞密码子人工优化后，获得RBD-6Asp核苷酸序列(如SEQ IDNO：2所示)，在启动密码子ATG的前碱基序列做设计和调整，使其符合Kozak规则，在3’端加上翻译终止密码子TGA，通过 EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶切位点将基因连接至pcDNA3.1 真核表达载体。

使用Expi293F哺乳动物细胞表达***表达野生型RBD与RBD-6Asp 抗原蛋白。首先进行Expi293F悬浮细胞的培养与扩展，将细胞密度调整至3×10⁶个/mL。随后准备30微克野生型RBD和RBD-6Asp表达质粒，使用Expi293转染试剂盒转染30mL细胞。接着将转染后的细胞置于摇床进行培养，培养条件为120rpm，37℃，相对湿度≥80％，二氧化碳浓度为 8％。转染72h后，取细胞培养液，3000g离心15min。使用0.45μm针头过滤器对上清液进行过滤除去细胞碎片。过滤后的上清液用于后续蛋白纯化。

使用GE公司His-trap亲和层析柱进行蛋白纯化，将层析柱安装在 AKTA蛋白纯化仪上，使用平衡缓冲液平衡层析柱，将含有蛋白的上清液加载到层析柱上。使用5倍柱体积的含有50mM咪唑的缓冲液进行平衡，随后使用含有500mM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱。含有野生型RBD 和RBD-6Asp蛋白的洗脱液使用超滤法进行换液。获得重组蛋白后使用 BCA法和紫外分光光度计测定蛋白浓度，使用还原与非还原SDS-PAGE 实验对纯化蛋白进行鉴定，野生型RBD蛋白和RBD-6Asp蛋白纯度均大于95％，在还原条件下，分子量均为25kDa到35kDa之间，符合理论预期(见图2)。

实施例2免疫小鼠血清的假病毒中和实验

1.小鼠免疫

选择6-8周的雌性BALB/c小鼠，每组8只。将实施例1得到的野生型RBD和RBD-6Asp蛋白用PB缓冲液稀释为100μg/mL，并与等体积 AL(OH)₃佐剂(Alhydrogel，1000μg/mL)混合后室温吸附1h。然后对6-8 周雌性Balb/c小鼠进行分组免疫，分组情况如表1所示。免疫策略如图3 所示，即通过肌肉注射方式，每只小鼠分别在第0天、第二周(14天)，第四周(28天)接受三次疫苗免疫，每次接种100μL体积(5μg抗原， 50μg铝佐剂)。第35d对小鼠进行尾静脉采血，血液在室温下静置4h，待血液分层后8000g离心15min，获得小鼠血清用于后续SARS-CoV-2 假病毒中和抗体检测。

表1.小鼠免疫分组情况

抗原或对照	抗原含量	佐剂	动物数量
				PB	0	50μg AL(OH)<sub>3</sub>	8
RBD	5μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>	8
				RBD-6Asp	5μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>	8

2.假病毒包装

根据NCBI公布新型冠状病毒(NC_045512.2)，合成SARS-CoV-2 的Spike蛋白的核苷酸编码序列，并将其***pCAGGS表达载体。将 SARS-CoV-2的Spike蛋白的表达载体与pNL4.3-Luc-R-E-骨架质粒(Nat Commun 11,4081(2020))共同转染293T细胞。转染6小时后，将上清换为10％FBS的MEM培养基。48小时后收取上清，用0.45μm无菌滤器进行过滤后，获得包装好的假病毒，定量后分装冻存于-80℃待使用。

3.假病毒中和实验

将小鼠免疫后35d的血清56℃灭活30min，将梯度稀释后的血清加入96孔板细胞培养板并进行倍比稀释。每孔加入50μL假病毒液，37℃孵育1h。向96孔板中每孔加100μlACE2-293T细胞，使每孔细胞为2.5×10⁴个。将96孔板前后左右轻轻晃动，使细胞在孔中分散均匀，将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂培养48小时。采用5×裂解液，500 rpm震荡15min。吸取20μl 96孔板中裂解物，加于对应96孔化学发光检测板中，置于化学发光检测仪中读取发光值。计算中和抑制率：抑制率＝[1－(样品组的发光强度均值－空白对照CC均值)/(阴性组的发光强度VC均值－空白对照值CC均值)]×100％。根据中和抑制率结果，计算小鼠血清样本的假病毒半最大中和效价(NT50)。

结果如表2所示，野生型RBD抗原在联合AL(OH)₃免疫小鼠35天后，激发的假病毒中和抗体水平较低，8只小鼠中仅有4只假病毒中和抗体效价达到30以上，平均值为38(95％CI为9-68)；而电荷突变体 RBD-6Asp抗原相对于野生型RBD抗原，联合AL(OH)₃免疫小鼠35天后，激发的假病毒中和抗体效价显著提升，8只小鼠全部产生了较高滴度的中和抗体，平均值为510(95％CI为27-993)，是野生型RBD的13 倍。两组抗原假病毒中和抗体效价通过t检验进行统计分析，差异显著p <0.05，表明电荷突变体RBD-6Asp作为抗原能够显著提升宿主针对新型冠状病毒假病毒的中和抗体水平。

表2.RBD-6Asp抗原与野生型RBD激发小鼠加病毒中和抗体水平的检测

实施例3免疫小鼠血清的真病毒中和实验

使用小鼠免疫后35d的血清，进行SARS-CoV-2真病毒 (SARS-CoV-2/human/CHN/Beijing_IME-BJ01/2020(Genbank No. MT291831)，该病毒株已于Nat Commun 11,4081(2020)中公开)中和实验。将热灭活的小鼠血清梯度稀释后，与100TCID₅₀的SARS-CoV-2IME-BJ01毒株在37℃孵育2小时。将血清-病毒复合物添加到预铺有Vero E6细胞的96孔板中，孵育

小时。用0.05％结晶紫将细胞染色30 分钟。加入脱色溶液后，在570nm/630nm处测量OD。根据中和抑制率结果，计算小鼠血清样本的真病毒半最大中和效价(NT50)。

结果如表3所示，野生型RBD抗原在联合AL(OH)₃免疫小鼠35天后，激发的真病毒中和抗体水平较低，8只小鼠平均中和抗体效价仅为 16(95％CI为8-24)；而电荷突变体RBD-6Asp抗原相对于野生型RBD 抗原，联合AL(OH)₃免疫小鼠35天后，激发的真病毒中和抗体效价显著提升，8只小鼠平均中和抗体效价为131(95％CI为50-213)，是野生型 RBD的8倍。两组抗原真病毒中和抗体效价通过t检验进行统计分析，差异显著p<0.05，表明电荷突变体RBD-6Asp作为抗原能够显著提升宿主针对新型冠状病毒真病毒的中和抗体水平，具有非常显著的针对 SARS-CoV-2真病毒的保护效果。

表3.RBD-6Asp抗原与野生型RBD激发小鼠真病毒中和抗体水平的检测

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并非用以限定本发明，其他的任何未违背本发明的精神实质与原理下所作的改动和修饰，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种新型冠状病毒受体结合区电荷突变体抗原及应用

<150> CN202110508745.9

<151> 2021-05-11

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Asn Ser His His His His His His Arg Val Gln

20 25 30

Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro

35 40 45

Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp

50 55 60

Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr

85 90 95

Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val

100 105 110

Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys

115 120 125

Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val

130 135 140

Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr

145 150 155 160

Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu

165 170 175

Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn

180 185 190

Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe

195 200 205

Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu

210 215 220

Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys

225 230 235 240

Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Asp Asp Asp Asp Asp Asp

245 250

<210> 2

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggacgcca tgaagagggg cctgtgttgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgtttgtg 60

tccaattccc accaccacca ccatcacagg gtgcagccca ccgagtccat cgtgagattc 120

cctaacatca caaacctgtg ccccttcggc gaggtgttca acgccaccag gttcgccagc 180

gtgtacgcct ggaatagaaa gagaatctcc aattgtgtgg ccgactacag cgtgctgtac 240

aacagcgcca gctttagcac cttcaagtgc tacggcgtgt cccctaccaa gctgaatgat 300

ctgtgcttta ccaatgtgta cgccgactcc tttgtgatca gaggcgatga ggtgagacag 360

atcgcccctg gccagacagg caagatcgcc gactacaact acaagctgcc tgatgacttt 420

acaggctgcg tgatcgcctg gaacagcaac aatctggatt ccaaggtggg cggcaattac 480

aactacctgt acagactgtt tagaaagtcc aacctgaagc cctttgagag agatatctcc 540

acagagatct accaggccgg cagcacacct tgcaatggcg tggagggctt caattgctac 600

ttccctctgc agtcctacgg ctttcagccc accaacggcg tgggctacca gccctacaga 660

gtggtggtgc tgtccttcga gctgctgcac gcccccgcca ccgtgtgtgg accaaagaag 720

tccaccaacc tggtgaagaa caagtgcgtg aattttgatg acgacgatga tgattga 777

<210> 3

<211> 777

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

auggacgcca ugaagagggg ccuguguugu gugcugcugc ugugcggcgc cguguuugug 60

uccaauuccc accaccacca ccaucacagg gugcagccca ccgaguccau cgugagauuc 120

ccuaacauca caaaccugug ccccuucggc gagguguuca acgccaccag guucgccagc 180

guguacgccu ggaauagaaa gagaaucucc aauugugugg ccgacuacag cgugcuguac 240

aacagcgcca gcuuuagcac cuucaagugc uacggcgugu ccccuaccaa gcugaaugau 300

cugugcuuua ccaaugugua cgccgacucc uuugugauca gaggcgauga ggugagacag 360

aucgccccug gccagacagg caagaucgcc gacuacaacu acaagcugcc ugaugacuuu 420

acaggcugcg ugaucgccug gaacagcaac aaucuggauu ccaagguggg cggcaauuac 480

aacuaccugu acagacuguu uagaaagucc aaccugaagc ccuuugagag agauaucucc 540

acagagaucu accaggccgg cagcacaccu ugcaauggcg uggagggcuu caauugcuac 600

uucccucugc aguccuacgg cuuucagccc accaacggcg ugggcuacca gcccuacaga 660

gugguggugc uguccuucga gcugcugcac gcccccgcca ccgugugugg accaaagaag 720

uccaccaacc uggugaagaa caagugcgug aauuuugaug acgacgauga ugauuga 777

Claims

1.一种新型冠状病毒RBD抗原突变体，其特征在于，所述RBD抗原突变体是由RBD抗原以及在其末端连接的3-24个等电点pI小于7.4、亲水指数小于0的负电荷氨基酸构成。

2.根据权利要求1所述的RBD抗原突变体，其特征在于，在RBD抗原的C末端连接所述的负电荷氨基酸。

3.根据权利要求2所述的RBD抗原突变体，其特征在于，所述负电荷氨基酸全部为天门冬氨酸。

4.根据权利要求3所述的RBD抗原突变体，其特征在于，所述天门冬氨酸的数量为6个。

5.根据权利要求4所述的RBD抗原突变体，其特征在于，所述RBD抗原突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

6.权利要求1-5任一所述新型冠状病毒RBD抗原突变体在制备新型冠状病毒治疗、预防药物或者疫苗中的应用。

7.一种编码权利要求5所述RBD抗原突变体的多核苷酸分子。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

9.权利要求7或8所述多核苷酸分子在制备新型冠状病毒DNA疫苗中的应用。

10.一种根据权利要求8所述多核苷酸分子转录的mRNA，其特征在于，所述多核苷酸分子的mRNA序列如SEQ ID NO：3所示。

11.权利要求11所述mRNA在制备新型冠状病毒mRNA疫苗中的应用。