CN117821508A - 一种编码NGF蛋白的工程化circRNA、药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码NGF蛋白的工程化circRNA、药物组合物及其制备方法和应用。所述编码神经生长因子(NGF)的工程化circRNA具有增强NGF稳定性和表达效率的优势。通过包装工程化circRNA于纳米脂质颗粒(LNP)中，可以实现药物的有效输送和释放。该药物组合物可通过局部给药、胃肠道给药或非胃肠道给药等方式进行应用，以提供神经保护和治疗神经损伤的效果。一次给药就有显著神经保护效果，不需要持续给药，也避免了动物源性蛋白的病毒感染风险。与病毒基因递送相比，基于circRNA的治疗的一个优点是mRNA不会转运到细胞核，从而减轻序列***基因组从而诱变癌变风险。

Description

一种编码NGF蛋白的工程化circRNA、药物组合物及其制备方 法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种编码NGF蛋白的工程化circRNA、药物组合物及其制备方法和应用。

背景技术

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)，即NGF蛋白，临床上广泛用于用于治疗视神经损伤，角膜炎等。然而现有的动物源性的NGF蛋白有朊病毒感染的风险，重组蛋白发酵工艺及纯化工艺昂贵，且需要每天肌肉注射，给患者带来较大痛苦。

circRNA是一类没有5’或3’末端的闭合RNA。很长时间内被认为是5’剪接点与上游3’剪接点的罕见和异常剪接的副产品。最近由于高通量RNA测序和生物信息学分析的快速发展，天然circRNA的大量生物学功能被揭示，从蛋白质和基因海绵、细胞活动调节剂到蛋白质翻译模板。此外，随着人们对天然circRNAs生理功能的认识不断加深，近年来，人们对开发circRNA合成技术和探索合成circRNAs在疾病治疗中的应用越来越感兴趣。到目前为止，合成的circRNAs不仅被用于治疗，例如替代治疗性蛋白质和多肽以及疫苗，也用作生物传感器。同时，为了在减少副作用的同时优化治疗效果，已经尝试了各种方法来合成circRNA。以前circRNA主要被认为是非编码RNA，但最近的研究表明，它们能够通过天然circRNA和合成circRNA编码和翻译蛋白质和多肽。circRNA在疫苗和核酸药物的开发中有其独特的优势。首先，它不太容易降解，比mRNA疫苗和核酸药物更稳定。其次，滚环翻译所需的量比信使核糖核酸低，因此毒性较小。由circRNAs包围的共价闭环结构可以保护它免受核酸外切酶的降解，并可以解决mRNA疫苗对降解的脆弱性。这些特性使circRNA具有作为多肽/蛋白质替代疗法和疫苗的巨大潜力。然而，目前还未见关于NGF蛋白的工程化circRNA的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种促进编码NGF蛋白的工程化circRNA形成的核酸。

本发明的第二个目的在于提供含有所述核酸的重组表达载体

本发明的第三个目的在于提供含有所述重组表达载体的重组菌。

本发明的第四个目的在于提供一种编码NGF蛋白的工程化circRNA的制备方法。

本发明的第五个目的在于提供上述制备方法制备得到的编码NGF蛋白的工程化circRNA。

本发明的第六个目的在于一种包裹有上述编码NGF蛋白的工程化circRNA的脂质纳米颗粒。

本发明的第七个目的在于所述脂质纳米颗粒的制备方法。

本发明的第八个目的在于所述编码NGF蛋白的工程化circRNA或所述脂质纳米颗粒的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种促进编码NGF蛋白的工程化circRNA形成的核酸，其具有如下结构：5’→3’依次为体外转录启动子-3'端I型内含子和3'端同源臂-外显子序列E1-间隔序列(Spacer)1-内部核糖体进入位点(IRES)-NGF蛋白编码序列-间隔序列(Spacer)2-外显子序列E2-5'端I型内含子和5端'同源臂；所述NGF蛋白编码序列为编码人源或鼠源NGF的CDS序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。

本发明所述核酸可基于I型内含子的自我剪接，可在GTP(鸟嘌呤核苷)催化下，促进circRNA的环化，为了进一步提高自剪接前体RNA成环效率，其序列结构中的同源臂(homology arm)、间隔序列(spacer)，可解决长编码RNA序列成环的难题，并且能够得到较好的成环效率。

进一步地，所述体外转录启动子为T7、T3或SP6启动子。

优选地，所述体外转录启动子为T7启动子。

进一步地，所述3'端I型内含子和3'端同源臂-外显子序列E1，外显子序列E2-5'端I型内含子和5端'同源臂来源于鱼腥藻。

进一步地，所述外显子序列E1为AAAATCCGTTGACCTTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCA，外显子序列E2为AGACGCTACGGACTT。

进一步地，所述间隔序列(spacer)1为CGCCGGAAACGCAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAA AAACCAAAAAAACAAAACACA；间隔序列2为AAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATTATGCGTTACCGGCG。

进一步地，所述内部核糖体进入位点为柯萨奇病毒B3的内部核糖体进入位点IRES。

进一步地，所述NGF蛋白编码序列为人源NGF的CDS序列经密码子优化后的序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，所述NGF蛋白编码序列3’端还连接有蛋白标签序列。

优选地，所述蛋白标签序列为3×FLAG。

进一步地，所述NGF蛋白编码序列与相邻两个组件间***有酶切位点。可用于基因替换，节省成本。

进一步地，所述核酸的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。

本发明还提供含有上述任一所述核酸的重组表达载体。

本发明还提供含有上述重组表达载体的重组菌。

本发明还提供一种编码NGF蛋白的工程化circRNA的制备方法，包括如下步骤：

S1.合成上述任一所述核酸序列；

S2.将步骤S1的核酸序列连接到基础质粒模板中，并转化宿主菌，质粒抽提，获得转录模板；

S3.将步骤S2转录模板线性化，再体外转录，消化去除DNA，沉淀获得circRNA前体，在添加GTP孵育，实现环化，再纯化得到环化RNA，即得到编码NGF蛋白的工程化circRNA。

进一步地，所述circRNA前体的序列如SEQ ID NO：8～10所示。

进一步地，步骤S3所述纯化为用RNA纯化试剂盒以及RNaseR酶对环化后的circRNA进行消化和纯化。将纯化后的circRNA溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中，并用HPLC进行纯化，收集HPLC的第二个峰产物，并用RNA纯化试剂盒进行纯化。

本发明还提供所述制备方法制备得到的编码NGF蛋白的工程化circRNA。

本发明还提供一种脂质纳米颗粒(LNPs)，包裹有上述编码NGF蛋白的工程化circRNA。

本发明还提供所述脂质纳米颗粒的制备方法，是将上述所述编码NGF蛋白的工程化circRNA与阳离子或聚阳离子化合物混合后用脂质包装即得。

优选地，所述脂质包括但不限于能够促进自组装形成病毒大小的颗粒(～100nm)的脂质、使得circRNA从内涵体中释放到胞内的脂质、支撑磷脂双分子层结构的脂质或用作稳定剂的脂质。更优选地，为了增加LNP的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG化脂质。

本发明所述的circRNA或包含circRNA的脂质纳米颗粒具备的优势在于：1、体外合成，无需细胞培养，无动物源污染的风险；2、研发、生产较快，标准化生产，易于量产和质量控制，同一生产流程适用于多个不同产品；3、可以在一段时间内持续表达；4、支持多种蛋白形式，包括胞内蛋白、跨膜蛋白、VLP等，且可避开VLP产量低而造成的纯化问题；5、无感染、基因组整合风险。

本发明研究显示，上述编码NGF蛋白的工程化circRNA或所述脂质纳米颗粒(LNPs)具有神经保护和治疗神经损伤的效果。因此，本发明还提供所述编码NGF蛋白的工程化circRNA或所述脂质纳米颗粒(LNPs)在制备预防和/或治疗神经损伤和/或神经退行性疾病的药物中的应用。

本发明所述的“预防”指在疾病开始发展之前或之后通过施用本发明所述的产品来避免症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。

本发明所述的“治疗”指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种编码NGF蛋白的工程化circRNA及包裹该工程化circRNA的脂质纳米颗粒，所述编码神经生长因子(NGF)的工程化circRNA具有增强NGF稳定性和表达效率的优势。通过包装工程化circRNA于纳米脂质颗粒(LNP)中，可以实现药物的有效输送和释放。该药物组合物可通过局部给药、胃肠道给药或非胃肠道给药等方式进行应用，以提供神经保护和治疗神经损伤的效果。一次给药就有显著神经保护效果，不需要持续给药，也避免了动物源性蛋白的病毒感染风险。与病毒基因递送相比，基于circRNA的治疗的一个优点是mRNA不会转运到细胞核，从而减轻序列***基因组从而诱变癌变风险。

附图说明

图1为编码NGF蛋白的线性RNA、环状RNA结构示意图。

图2为编码野生型鼠NGF重组蛋白的序列测序结果。

图3为编码野生型人源NGF蛋白的序列测序结果。

图4为编码优化后人源NGF蛋白的序列hNGF-MAhek2测序结果。

图5为环状RNA制备流程产物检测。

图6为HPLC纯化环化产物。

图7为优化前后hNGF序列蛋白表达情况。

图8为转染circ-mNGF的细胞的细胞裂解液的WB检测结果。

图9为LNP-circNGF的神经保护效果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1编码NGF蛋白的工程化circRNA的制备与检测

1、图1为本发明编码NGF蛋白的线性RNA、环状RNA结构示意图，具体的，化学合成circ-CVB3-mNGF-3xFlag的基因序列，其序列结构为：T7promoter+(3'intron+homology)+E1+spacer1+CVB3+mNGF-3xFlag+spacer2+E2+(5'intron+homology)，具体序列如SEQ IDNO.1所示；其中，1-19nt为T7promoter，20-183nt为(3'intron+homology)，184-234nt为E1，235-304nt为spacer1，305-1045nt为CVB3，1046-2062nt为mNGF-3xFlag，2063-2102nt为spacer2，2103-2117nt为E2，2118-2268nt为(5'intron+homology)；成环后为E1+spacer+CVB3+mNGF-3xFlag+spacer2+E2。

另外，将上述野生型鼠源NGF(mNGF)序列分别替换为野生型人源NGF(hNGF)或优化后的优化后人源NGF(hNGF-MAhek3)得到Circ-CVB3-hNGF-3xflag(具体序列如SEQ IDNO.11所示)及Circ-CVB3-hNGF-MAhek3-3xflag(具体序列如SEQ ID NO.12所示)。

2、通过固相亚磷酰胺三酯法合成短核苷酸链(引物)，所述引物如下所示：

primer1(F)：gctagcTAATACGACTCACT，其中“gctagc”为NheⅠ酶切位点；

Primer2(R)：AAGCTTCTAGATATGCTGTT，其中“AAGCTT”为Hind III酶切位点。

3、以步骤1合成的基因序列为模板，用步骤2合成的引物进行PCR扩增。

4、将步骤3扩增得到的产物连接到pUC57载体上，转化测序。

5、经测序验证，结果见图2-4所示。具体的，图2显示了编码含信号肽的野生型鼠NGF重组蛋白的序列测序结果，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。图3显示编码野生型人源NGF蛋白的序列测序结果，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。图4显示编码优化后人源NGF蛋白的序列hNGF-MAhek2测序结果，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，显示序列与预期一致。

6、用摇瓶发酵菌株，用无内毒素质粒大提试剂盒纯化获得转录模板。将转录模板用限制性核酸内切酶BbsI线性化。用T7体外转录试剂盒进行转录，获得SEQ ID NO：8～10所示转录的前体的mRNA。分别用DNaseI消化转录模板，并用沉淀法纯化circRNA前体。用GTP将circRNA环化，并分别用RNA纯化试剂盒以及RNaseR酶对环化后的circRNA进行消化和纯化(图5)。将纯化后的circRNA溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中，并用HPLC进行纯化(图6)，收集HPLC的第二个峰产物(F2)，并用RNA纯化试剂盒进行纯化。

用甲醛变性胶检测各阶段的RNA，如图6所示，其中F2是环化成功的circNGF，可以看到RNA的大小正确且基本无降解。

实施例2优化前后hNGF序列蛋白表达效率对比

将circ-hNGF与circ-hNGF-MAhek2环状RNA分别转染到hek293细胞中，取上清，做ELISA。结果如图7所示，显示circ-hNGF-MAhek2的蛋白表达量比circ-hNGF高。

实施例3 mRNA药物的制备

1、原料准备

1)将阳离子脂质SM-102、二硬脂酰基磷脂酰胆碱DSPC、胆固醇、PEG化脂质PEG-DMG，四个组分按摩尔比50:10:38.5:1.5在乙醇中溶解、混合。

2)提供实施例1制备的编码含mNGF的circRNA(circ-mNGF)。

2、表达检测

用6孔板铺HEK293细胞，用lipofectamine转染0.5μg环化纯化后的编码NGF的circRNA(circ-mNGF)转染细胞，阴性对照只加入lipofectamine messagerMax转染试剂。转染6h、12h、24h、48h、72h后，取细胞裂解液进行WB检测，WB检测结果如图8所示。可以看到表达出来的蛋白大小正确，可以持续表达48h。

3、circRNA的脂质纳米颗粒制备

以步骤1的脂质混合物：circRNA按照流速比1:3，在Precision Nanosystems的纳米颗粒制备仪器Benchtop中分别混合包装上述circRNA。将包装好的circRNA-LNP透析并超滤浓缩到DPBS中，无菌过滤后获得用于动物实验的样品。包装后样品的粒径大小平均值78.83nm，PDI值0.028，截距(intercept)0.953。

实施例4神经保护作用测试

1、方法

6周龄左右的C57雄性小鼠，在第0天玻璃体内注射200ng实施例3制备的circRNA-LNP，在第4天行ONC手术，在第18天杀鼠取材视网膜铺片，并用RBPMS抗体染色，共聚焦显微镜拍摄GCL，并计数RBPMS+细胞。

2、实验结果

RGC计数结果如图9所示，显示正常小鼠单一视野下RGC数目为350左右，ONC损伤后单一视野下RGC数目为60左右，注射NGF蛋白的RGC数目为90左右，而注射circRNA-LNP药物的小鼠ONC损伤后单一视野下RGC数目为140左右，存活RGC数量达到未给药组的2倍，表明NGF蛋白的工程化circRNA相比于NGF蛋白具有更好的预防/治疗神经损伤和/或神经退行性疾病的效果。

Claims (10)

1.一种促进编码NGF蛋白的工程化circRNA形成的核酸，其特征在于，其具有如下结构：5’→3’依次为体外转录启动子-3'端I型内含子和3'端同源臂-外显子序列E1-间隔序列1-内部核糖体进入位点-NGF蛋白编码序列-间隔序列2-外显子序列E2-5'端I型内含子和5端'同源臂；所述NGF蛋白编码序列为编码人源或鼠源NGF的CDS序列，其核苷酸序列分别如SEQID NO.2或SEQ ID NO.4所示；

优选地，所述体外转录启动子为T7、T3或SP6启动子；

优选地，所述体外转录启动子为T7启动子；

优选地，所述3'端I型内含子和3'端同源臂-外显子序列E1，外显子序列E2-5'端I型内含子和5端'同源臂来源于鱼腥藻；

优选地，所述内部核糖体进入位点为柯萨奇病毒B3的内部核糖体进入位点；

优选地，所述NGF蛋白编码序列3’端还连接有蛋白标签序列；

优选地，所述蛋白标签序列为3×FLAG；

优选地，所述NGF蛋白编码序列与相邻两个组件间***有酶切位点；

优选地，所述外显子序列E1为AAAATCCGTTGACCTTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCA，外显子序列E2为AGACGCTACGGACTT；

优选地，所述间隔序列1为CGCCGGAAACGCAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACA，间隔序列2为AAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATTATGCGTTACCGGCG。

2.根据权利要求1所述核酸，其特征在于，所述NGF蛋白编码序列为人源NGF的CDS序列经密码子优化后的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求1或2所述核酸，其特征在于，所述核酸的序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.11或SEQ ID NO.12所示。

4.含有权利要求1～3任一所述核酸的重组表达载体。

5.含有权利要求4所述重组表达载体的重组菌。

6.一种编码NGF蛋白的工程化circRNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.合成权利要求1～3任一所述核酸序列；

S2.将步骤S1的核酸序列连接到基础质粒模板中，并转化宿主菌，质粒抽提，获得转录模板；

S3.将步骤S2转录模板线性化，再体外转录，消化去除DNA，沉淀获得circRNA前体，再添加GTP孵育，实现环化，再纯化得到环化RNA，即得到编码NGF蛋白的工程化circRNA。

7.权利要求6所述制备方法制备得到的编码NGF蛋白的工程化circRNA。

8.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，包裹有权利要求7所述编码NGF蛋白的工程化circRNA。

9.权利要求8所述脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，将权利要求7所述编码NGF蛋白的工程化circRNA与阳离子或聚阳离子化合物混合后用脂质包装即得。

10.权利要求7所述编码NGF蛋白的工程化circRNA或权利要求8所述脂质纳米颗粒在制备预防和/或治疗神经损伤和/或神经退行性疾病的药物中的应用。