CN118240877A

CN118240877A - 一种嵌合抗原受体纳米复合物及其制备方法和在制备抗衰老药物中的应用

Info

Publication number: CN118240877A
Application number: CN202410297300.4A
Authority: CN
Inventors: 王刚; 于寅; 盛强龙; 杨帆
Original assignee: Zhenhe Medicine Hangzhou Co ltd
Current assignee: Zhenhe Medicine Hangzhou Co ltd
Priority date: 2024-03-15
Filing date: 2024-03-15
Publication date: 2024-06-25

Abstract

本发明提供了一种嵌合抗原受体纳米复合物及其制备方法和在制备抗衰老药物中的应用，属于基因治疗技术领域，本发明提供的嵌合抗原受体纳米复合物，包括特异性识别衰老细胞的嵌合抗原受体DNA质粒、偶联有信号肽的多聚物、游离的多聚物和靶向T细胞的抗体聚合物；所述嵌合抗原受体DNA质粒、偶联有信号肽的多聚物、游离的多聚物和靶向T细胞的抗体聚合物依次混合孵育形成嵌合抗原受体纳米复合物；所述嵌合抗原受体纳米复合物可以在体内快速生成衰老细胞标记的嵌合抗原T细胞，这些工程化T细胞具有特异清除体内衰老细胞的能力，并且能够快速持久地清除体内的衰老细胞，具有不可替代性和广泛的应用前景。

Description

一种嵌合抗原受体纳米复合物及其制备方法和在制备抗衰老药物中的应用

技术领域

本发明属于基因治疗技术领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体纳米复合物及其制备方法和在制备抗衰老药物中的应用。

背景技术

随着个体年龄的增长，代谢障碍变得越来越普遍，导致各种与年龄相关的疾病，包括代谢综合症和糖尿病。衰老细胞的积累被认为是衰老过程中的关键因素之一。这些细胞无法正常发挥功能，并分泌促炎因子，进一步损害组织健康，导致运动能力下降、代谢障碍，产生疾病及寿命缩短。衰老细胞清除疗法(Senolytic疗法)通过清除衰老细胞来改善组织功能，减缓衰老进程，被认为具有巨大的潜力。

当前，大部分衰老清除疗法的研究重点在于开发靶向衰老细胞的小分子药物。然而，这些药物需要随着时间的推移反复使用，并且由于其固有的靶向不精确性和副作用较大，存在一些缺陷。现有的Senolytic疗法还有体外CAR T细胞疗法，而体外CAR T细胞疗法是一种新兴的清除衰老细胞的方法，通过使用编码特定疾病嵌合抗原受体(CAR)的基因来编程自体来源的T细胞，并在体外扩增，使它们在重新输注后能够清除衰老细胞。尽管这种CAR T衰老细胞清除疗法的试验取得了进展，但是产生大量衰老细胞特异性T细胞的体外方法过于复杂和昂贵，而由于体外CAR T细胞疗法价格昂贵，无法广泛应用于衰老细胞清除疗法。考虑到全球老龄人口数以十亿计，衰老细胞清除疗法的应用需求非常大，急需一种低成本、操作简单、效果好的衰老细胞清除疗法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种嵌合抗原受体纳米复合物及其制备方法和在制备抗衰老药物中的应用；本发明提供的嵌合抗原受体纳米复合物在衰老细胞清除疗法的应用中，成本低、精准、高效，并且药效持久。

本发明提供了一种特异性识别衰老细胞的嵌合抗原受体DNA质粒，包括依次连接的细胞膜外区域序列、跨膜区域序列和共刺激分子区域序列；所述细胞膜外区域序列包括编码衰老细胞标志物的scFv片段；

所述细胞膜外区域序列、跨膜区域序列和共刺激分子区域序列克隆至初始质粒的多克隆位点。

优选的，所述衰老细胞标志物选自uPAR、DPP4(CD26)和HMGB1衰老细胞表面蛋白中的一种或几种。

优选的，所述初始质粒选自非病毒质粒或病毒质粒；所述非病毒质粒包括转座子质粒。

优选的，当所述衰老细胞标志物为uPAR时，所述嵌合抗原受体DNA质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

当所述衰老细胞标志物为DPP4(CD26)时，所述嵌合抗原受体DNA质粒的核苷酸序列以SEQ ID NO.3替换SEQ ID NO.1的第87-407位，以SEQ ID NO.4替换SEQ ID NO.1的第477-818位；

当所述衰老细胞标志物为HMGB1时，所述嵌合抗原受体DNA质粒的核苷酸序列以SEQ ID NO.5替换SEQ ID NO.1的第87-407位，以SEQ ID NO.6替换SEQ ID NO.1的第477-818位。

本发明还提供了一种嵌合抗原受体纳米复合物，包括所述的特异性识别衰老细胞的嵌合抗原受体DNA质粒、偶联有信号肽的多聚物、游离的多聚物和靶向T细胞的抗体聚合物；

所述嵌合抗原受体DNA质粒、偶联有信号肽的多聚物、游离多聚物和靶向T细胞的抗体聚合物的质量比为1：(14～16)：(14～16)：(2～3)；

所述嵌合抗原受体DNA质粒、偶联有信号肽的多聚物、游离的多聚物和靶向T细胞的抗体聚合物依次混合孵育形成嵌合抗原受体纳米复合物。

优选的，所述多聚物为PBAE-447，偶联有信号肽的多聚物中信号肽的序列如SEQID NO.2所示。

优选的，所述抗体聚合物为聚谷氨酸偶联抗CD3抗体PGA-CD3。

本发明还提供了所述的嵌合抗原受体纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

将嵌合抗原受体DNA质粒溶解于醋酸钠缓冲液中获得质粒溶液；

将偶联有信号肽的多聚物与质粒溶液混合、第一孵育，获得第一复合物；

将游离的多聚物与第一复合物混合、第二孵育，获得第二复合物；

将抗体聚合物与第二复合物混合、第三孵育，获得嵌合抗原受体纳米复合物。

优选的，所述质粒溶液中嵌合抗原受体DNA质粒的浓度为0.05～0.15mg/ml。

本发明还提供了所述的嵌合抗原受体纳米复合物在制备清除衰老细胞的试剂中的应用。

本发明还提供了所述的嵌合抗原受体纳米复合物在制备治疗老年综合征的药物中的应用。

优选的，所述老年综合征包括老年代谢综合征和肝硬化。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种特异性识别衰老细胞的嵌合抗原受体DNA质粒，所述嵌合抗原受体DNA质粒、偶联有信号肽的多聚物、游离的多聚物和靶向T细胞的抗体聚合物依次混合孵育形成嵌合抗原受体纳米复合物。本发明提供的嵌合抗原受体纳米复合物可以在体内快速生成衰老细胞标记的嵌合抗原T细胞，这些工程化T细胞具有特异清除体内衰老细胞的能力，并且能够快速持久地清除体内的衰老细胞。与当前用于生成针对衰老细胞具有特定特异性的T细胞的方法有着截然不同的技术路线和技术效果，本发明提供的嵌合抗原受体纳米复合物可以直接应用于个体，无需从自体血液中分离T细胞，并且也不需要进行基于逆转录病毒或慢病毒载体的复杂而昂贵的实验室程序进行基因修饰，再回输给机体。

本质上，本发明通过巧妙设计获得嵌合抗原受体纳米复合物，应用于机体后，能够将体外复杂而昂贵的嵌合抗原(CAR)T细胞制备，扩增和回输的过程完全转移到体内，身体本身成为CAR T细胞制备工厂，从而指数倍降低成本，大大缩短制备T细胞的时间，同时也可以指数倍放大产能，从而可能惠及每一位需要的人。保守估算本发明可以从目前CAR T 100万-200万人民币/例的成本下降到10-20元人民币/例。考虑到衰老清除疗法是几乎所有中年或者高龄人的需求，数以十亿计，而且随着人口不断老龄化，这个数字还在快速增加，体外生产CAR T细胞是不可能覆盖如此庞大有需求的人群，所以本发明具有不可替代性和广泛的应用前景。

根据实施例的记载，嵌合抗原受体纳米复合物应用于小鼠后，可以降低老年小鼠的衰老生物学标记物(表观遗传年龄)，提高老年小鼠的运动能力，并且可以逆转高脂饮食引起的表观遗传年龄升高，改善葡萄糖代谢障碍和逆转肝脏纤维化，而且这一疗效逆转衰老的结果优于传统的体外培育的针对衰老细胞的uPAR CAR T细胞逆转衰老效果。

进一步的，本发明中的嵌合抗原受体DNA质粒采用的是转座子/转座酶***，临床安全性比慢病毒等潜在激活癌基因的病毒法更高，转座子/转座酶***已经用于安全地将CAR转基因引入患者体外的T细胞，而且很多一期临床的转座子法CAR T细胞试验已经证明了转座子的高效递送基因的安全性。与常规的慢病毒载体相比，这种转座酶介导的转基因整合到安全基因座中，降低了可能的突变风险。

附图说明

图1为体内产生uPAR CAR-T细胞工作流程图。

图2为体内产生uPAR CAR-T细胞能够逆转高脂肪饮食带来的衰老标记物(表观遗传年龄)升高和葡萄糖糖耐量试验障碍，且比体外产生uPAR CAR-T优效。

DNA-纳米颗粒处理即为应用本发明提供的嵌合抗原受体纳米复合物在体内产生uPAR CAR-T细胞处理。(A):体内产生uPAR CAR T细胞，逆转高脂肪饮食带来的表观遗传年龄上升，对比体外CAR T细胞处理优效；(B)：体内产生uPAR CAR T细胞，纠正高脂肪饮食带来代谢异常，对比体外CART细胞处理优效。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图3为体内产生uPAR CAR-T细胞能够逆转老年小鼠衰老标记物(表观遗传年龄)和提高老年小鼠的运动能力，且比体外产生uPAR CAR-T优效。

DNA-纳米颗粒处理即为应用本发明提供的嵌合抗原受体纳米复合物在体内产生uPAR CAR-T细胞处理。(A):体内产生uPAR CAR T细胞，逆转老年小鼠的表观遗传年龄，对比体外CART细胞处理优效；(B):体内产生uPAR CAR T细胞，提高老年小鼠电动跑步机耐受时间，对比体外CART细胞处理优效；(C):体内产生uPAR CAR T细胞，提高老年小鼠电动跑步机最高速度，对比体外CART细胞处理优效。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图4为体内产生uPAR CAR-T细胞能够逆转小鼠CCL4诱导的肝硬化，且比体外产生uPAR CAR-T优效。

DNA-纳米颗粒处理即为应用本发明提供的嵌合抗原受体纳米复合物在体内产生uPAR CAR-T细胞处理。(A):体内产生uPAR CAR T细胞降低Sirius Red染色阳性区域，说明肝纤维化逆转，对比体外CAR T细胞处理优效；(B):体内产生uPAR CAR T细胞降低SA-β-gal阳性细胞比例，对比体外CAR T细胞处理优效。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图5为体内产生DPP4 CAR-T细胞能够逆转老年小鼠衰老标记物(表观遗传年龄)和提高老年小鼠的运动能力，且比体外产生DPPT4 CAR-T优效。DNA-纳米颗粒处理即为应用本发明提供的嵌合抗原受体纳米复合物在体内产生DPP4 CAR-T细胞处理。(A)：体内产生uPARCAR T细胞,逆转老年小鼠的表观遗传年龄，对比体外CAR T细胞处理优效；(B)：体内产生DPP4 CART细胞,提高老年小鼠电动跑步机耐受时间，对比体外CAR T细胞处理优效；(C)：体内产生DPP4 CAR T细胞，提高老年小鼠电动跑步机最高速度，对比体外CAR T细胞处理优效。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图6为体内产生HMGB1 CAR-T细胞能够逆转老年小鼠衰老标记物(表观遗传年龄)和提高老年小鼠的运动能力，且比体外产生HMGB1 CAR-T优效。

DNA-纳米颗粒处理即为应用本发明提供的嵌合抗原受体纳米复合物在体内产生HMGB1 CAR-T细胞处理。(A)：体内产生uPAR CAR T细胞，逆转老年小鼠的表观遗传年龄，对比体外CAR T细胞处理优效；(B：体内产生HMGB1 CAR T细胞，提高老年小鼠电动跑步机耐受时间，对比体外CAR T细胞处理优效；(C)：体内产生DPP4 CAR T细胞，提高老年小鼠电动跑步机最高速度，对比体外CAR T细胞处理优效。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图7为本发明体内产生uPAR CAR T细胞的转座子质粒图谱；

图8为本发明体体内产生DPP4 CAR T细胞的转座子质粒图谱；

图9为本发明体内产生HMGB1CAR T细胞的转座子质粒图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种特异性识别衰老细胞的嵌合抗原受体DNA质粒，包括依次连接的细胞膜外区域序列、跨膜区域序列和共刺激分子区域序列；所述细胞膜外区域序列包括编码衰老细胞标志物的scFv片段；所述细胞膜外区域序列、跨膜区域序列和共刺激分子区域序列克隆至初始质粒的多克隆位点。

在本发明中，所述衰老细胞标志物选自uPAR、DPP4(CD26)和HMGB1衰老细胞表面蛋白中的一种或几种，更优选为uPAR。在本发明中，所述共刺激分子区域序列优选的包括CD28和CD3ζ。

在本发明中，所述初始质粒选自非病毒质粒或病毒质粒；所述非病毒质粒优选的包括转座子质粒。所述非病毒载体还可以选自脂质体、聚合物纳米颗粒、金纳米颗粒和细胞穿透肽等；病毒载体可以选择经过基因工程改造过，在体内靶向T细胞的非复制病毒载体，例如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、疱疹病毒，仙台病毒等。

在本发明中，所述嵌合抗原受体DNA质粒的质粒图谱优选的如图1所示，所述嵌合抗原受体DNA质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

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本发明还提供了一种嵌合抗原受体纳米复合物，包括所述的特异性识别衰老细胞的嵌合抗原受体DNA质粒、偶联有信号肽的多聚物、游离的多聚物和靶向T细胞的抗体聚合物；所述嵌合抗原受体DNA质粒、偶联有信号肽的多聚物、游离多聚物和靶向T细胞的抗体聚合物的质量比为1：(14～16)：(14～16)：(2～3)；所述嵌合抗原受体DNA质粒、偶联有信号肽的多聚物、游离的多聚物和靶向T细胞的抗体聚合物依次混合孵育形成嵌合抗原受体纳米复合物。

在本发明中，所述多聚物优选为PBAE-447，偶联有信号肽的多聚物中信号肽的序列如SEQ ID NO.2所示，包括微管相关序列MTAS和核定微信号序列NLS；具体如下：

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本发明优选的在信号肽序列的N段添加一个半胱氨酸，用于和PBAE-447连接。

在本发明中，所述抗体聚合物为聚谷氨酸偶联抗CD3抗体PGA-CD3。

在本发明中，所述嵌合抗原受体DNA质粒、偶联有信号肽的多聚物、游离多聚物和靶向T细胞的抗体聚合物的质量比优选为1：(14.5～15.5)：(14.5～15.5)：(2.2～2.8)，更优选为1:15:15:2.5。

在本发明中，将嵌合抗原受体DNA质粒溶解于醋酸钠缓冲液中获得质粒溶液；所述质粒溶液中嵌合抗原受体DNA质粒的浓度优选为0.05～0.15mg/ml，更优选为0.05～0.12mg/ml，最优选为0.1mg/ml；所述醋酸钠缓冲液的浓度优选为20～30mM，更优选为22～28mM，最优选为25mM；所述醋酸钠缓冲液的pH优选为5.1～5.3，更优选为5.2。

本发明在获得质粒溶液后，将偶联有信号肽的多聚物与质粒溶液混合、第一孵育，获得第一复合物；所述混合后进行轻微振荡8～12s；所述第一孵育的时间优选为1～3min，优选为1.5～2.5min。

本发明在获得第一复合物后，将游离的多聚物与第一复合物混合、第二孵育，获得第二复合物；所述混合后进行轻微振荡8～12s；所述第二孵育的时间优选为4～6min，优选为4.5～5.5min。

本发明在获得第二复合物后，将抗体聚合物与第二复合物混合、第三孵育，获得嵌合抗原受体纳米复合物。所述混合后进行轻微振荡8～12s；所述第二孵育的时间优选为4～6min，优选为4.5～5.5min。

本发明在获得所述嵌合抗原受体纳米复合物后，优选的进行冻干处理；在所述冻干处理前优选的添加冻干保护剂，所述冻干保护剂优选为蔗糖；所述蔗糖在冻干物料中的终浓度优选为25～35mg/ml，优选为28～32mg/ml，更优选为30mg/ml。本发明得到的嵌合抗原受体纳米复合物冻干颗粒在使用时，优选的重新悬浮于1/3的冻干前体积的水中。

本发明还提供了所述的嵌合抗原受体纳米复合物在制备治疗老年综合征的药物中的应用。在本发明中，所述老年综合征优选的包括老年代谢综合征和肝硬化。本发明所述嵌合抗原受体纳米复合物在应用于机体后，机体获得特异性清除衰老细胞的能力，从而降低受试者衰老生物标记物(表观遗传年龄)，提高运动能力，改善高脂肪饮食的代谢障碍例如葡萄糖耐量，并逆转肝脏纤维化。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

uPAR CAR设计：识别衰老细胞T细胞嵌合抗原CAR质粒DNA序列设计

第二代CAR设计原则

细胞膜外区域序列(uPAR scFC区域)：

VL DNA序列SEQ.ID NO.1：第87-407位

VH DNA序列SEQ.ID NO.1：第477-818位

VL-VH链接序列SEQ.ID NO.1：第408-467位

跨膜区域序列：

CH2CH3 DNA序列SEQ.ID NO.1：第852-1547位

共刺激分子区域序列

CD28 DNA序列SEQ.ID NO.1：第1560-1763位

CD3ζDNA序列SEQ.ID NO.1：第1764-2102位

质粒合成：将上述CAR质粒DNA序列转座子空质粒序列中，形成完整的转座子质粒DNA序列，并交相应生物公司VectorBuilder公司(https://en.vectorbuilder.com)合成对应质粒，完整质粒图谱见图2，完整序列见SEQ.ID NO.1。高活性转座子酶质粒购自SystemBioscience公司(货号PB210PA-1)。

靶向T细胞的DNA-纳米颗粒制备(DNA纳米颗粒即指嵌合抗原受体纳米复合物)：

信号肽(微管相关序列MTAS和核定位信号序列NLS，SEQ ID No.2)

GRYLTQETNKVETYKEQPLKTPGKKKKGKPGKRKEQEKKKRRTR由AnaSpec公司定制合成，并在肽的N-末端添加了一个半胱氨酸，用于连接到PBAE-447聚合物。

纳米颗粒制备：

PBAE多聚物制备：使用参考文献(PMID:25643235)的方法制备：将1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇按1.1:1的摩尔比混合。将这些混合物在90℃下搅拌加热24h，生成丙烯酸酯端的聚(4-氨基-1-丁醇-1,4-丁二醇二丙烯酸酯)。将2.3g聚合物溶解在2ml四氢呋喃(THF)中。为了形成哌嗪端的447聚合物，将786mg 1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪溶解在13ml THF中，然后加入到聚合物/THF溶液中。将得到的溶液在室温下搅拌2h。用5倍体积的***沉淀带有哌嗪端的聚合物。倒去***，然后用2倍体积的新***洗涤收集到的聚合物。将聚合物残留物在真空中干燥2天。将纯聚合物溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，浓度为100mg/ml，并可储存在-20℃。

PBAE多聚体和信号肽偶联：在二甲基亚砜(DMSO)中加入12mg 4-(马来酰亚胺基)苯异氰酸酯(PMPI)的溶液(20mg/ml)到86mgDMSO中的447聚合物溶液(100mg/ml)。在室温下混合3h。将447-马来酰亚胺衍生物加入到含有三(2-羟乙基)磷酸氯化物(TCEP·HCl；3mg/ml)的5.3ml DMSO中的100mg NLS-MTAS肽的溶液中。在室温下混合3h，然后通过装有DMSO的7kZeba离心柱过滤。在真空中过夜蒸发DMSO。447-肽偶联物溶解在DMSO中至100mg/ml，并储存在-20℃。

聚谷氨酸(PGA)-CD3抗体偶联：聚谷氨酸(PGA)溶解在水中，浓度为20mg/ml，然后在水浴超声器中超声10min。向其中加入相等体积的乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液(4mg/ml，16当量)，在室温下混合5min。将得到的被活化的PGA加入到抗体溶液中(InVivoMAb抗小鼠CD3εF(ab')2片段，来源于Bioxcell.com；目录号BE0001-1FAB)，该溶液在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，按4:1的摩尔比混合，室温下混合6h。通过透析(20,000MWCO Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)对多余试剂进行去除，透析液用PBS进行24h，然后通过40kZeba旋转柱过滤。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)确定抗体浓度。

DNA-纳米颗粒制备：将所有组分都稀释在醋酸钠缓冲液中(25mM，pH 5.2)，浓度如下：质粒DNA，0.1mg/ml；PBAE 447和447–NLS-MTAS，3mg/ml；PGA–抗体，0.45mg/ml抗体。

具体步骤如下：将447–NLS-MTAS以PBAE:DNA质量比15:1的比例加入DNA中。混合物轻轻振荡10s，然后在室温下孵育2min。然后将未结合的447以PBAE:DNA质量比15:1的比例加入到复合物中。混合物轻轻振荡10s，然后在室温下孵育5min。然后将PGA–抗体以Ab:DNA质量比2.5:1的比例加入。混合物轻轻振荡10s，然后在室温下孵育5min。蔗糖被加入作为冷冻保护剂，最终浓度为30mg/ml。混合物轻轻振荡，然后在液氮中冷冻，使用FreeZone 2.5升冷冻干燥***(Labconco)进行冻干。冻干颗粒在1/3的冻干前体积中重新悬浮于水中。

DNA-纳米颗粒鉴定：使用NanoSightNS300仪器(Malvern Instruments)确定了纳米颗粒的数量、平均水动力半径和浓度。冻干颗粒以用于转染的相同浓度重新悬浮于水中。轻轻振荡后，颗粒在冰上孵育10min以充分水合。悬浮液在2,400g下离心3min，然后上清液被稀释5倍进行纳米粒子跟踪分析。使用ZetaPALS ZetaPotentialAnalyzer(BrookhavenInstruments Corporation)确定了颗粒的ζ电位。新鲜制备的纳米颗粒在1,000g下离心1min，然后上清液在PBS中进行14倍稀释以进行测量。

实验例1uPAR CART清除衰老细胞疗法

对照治疗组体外uPAR CAR T细胞制备：上述转座子CAR-T细胞制备，扩增和治疗：按参考文献(PMID:35732992)进行，对应数量的小鼠被安乐死，收集脾脏，组织解剖和红细胞溶解后，使用小鼠泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)纯化原代小鼠T细胞。纯化的T细胞在含有10％FBS(HyClone)、10mM HEPES(Invitrogen)、2mM l-谷氨酰胺(Invitrogen)、MEM非必需氨基酸1×(Invitrogen)、55μMβ-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠(Invitrogen)、100IUml-1重组人IL-2(Proleukin；诺华)和小鼠抗CD3/28Dynabeads(Gibco)的RPMI-1640培养基中培养，在珠子(Dynabeads)：细胞比为1:2。T细胞在初始T细胞激活后24h使用上述步骤同样的转座子质粒电穿孔法(Lonza)，3-4天后，并用uPAR磁珠(Miltenyi Biotec)富集和扩增，获得足够数量的uPAR CAR T细胞待用。

在老年小鼠模型(12个月小鼠，购自Jaxson Lab)上，DNA-纳米颗粒(实施例1制备获得的DNA纳米颗粒)静脉输入清除衰老细胞疗法及同体外CAR T治疗头对头疗效对比

DNA-纳米颗粒静脉治疗：通过BS-300注射泵(Braintree Scientific公司)在20min内将3×10¹¹个DNA-纳米颗粒(或对照颗粒，即用报告基因GFP替代编码CAR的转座子DNA质粒)悬浮液缓慢注入18-20月龄C57BL/6小鼠的尾静脉，每天治疗1次，连续5天。

传统体外扩增uPAR CAR T细胞治疗的疗效：外体uPAR CAR转座子载体转导，体外扩增的的500万个uPAR CART细胞通过静脉注射到18-20个月C57BL/6小鼠体内，为单剂量注射，注射前16-24h使用环磷酰胺(200mg kg^-1)。

衰老标记物检测：DNA-纳米颗粒处理和体外uPAR CAR T细胞处理6周后，收集小鼠肝脏并按试剂盒基因组DNA提取和纯化试剂盒(New EnglandLabs，NEB#T3050)及说明书，提取和纯化肝脏基因组DNA，用Illumina RRBS芯片扫描基因组甲基化位点谱，按参考文献PMID24138928及对应的计算方法生物年龄时钟(https://dnamage.genetics.ucla.edu/home)计算衰老生物标记物(表观遗传年龄)。实验结果提示经过体内uPAR CAR T细胞处理6周后，小鼠的表观遗传年龄显著下降，并优于体外uPAR CART细胞的效果。

运动能力检测：DNA-纳米颗粒处理和体外uPAR CAR T细胞处理6周后测定运动能力：运动能力是使用一台电动跑步机(型号1050EXER 3/6；哥伦布仪器公司)进行评估的。在测试前的3天，小鼠被逐渐适应跑步机(小鼠每天以10米/min的速度在跑步机上行走10至15min)。完成适应后，所有小鼠连续几天进行运动能力测试。测试开始时，小鼠以10米/min的速度行走，每2min增加2米/min的速度，直至耐力耗尽(尽管反复鼓励，小鼠无法再达到跑步机的最大速度)。主要终点包括耐力耗尽的时间和最大速度。实验结果提示经过体内uPARCAR T细胞处理6周后，小鼠的电动跑步机耐受时间和最高速度显著提高，并优于体外uPARCAR T细胞的效果。

在高脂肪饮食小鼠模型上，DNA-纳米颗粒复合物静脉输入清除衰老细胞疗法改善衰老标记物(表观遗传年龄)和葡萄糖耐量试验及同体外CART治疗进行头对头疗效对比：雄性C57BL/6J野生型(WT)小鼠，每笼三至四只，可自由进食水。大约在实验开始前4个月，小鼠被转换到饲料(LabDiet 5053，购自Labdiet公司)，实验开始时小鼠高脂肪饲养(小鼠被转换到高脂肪AIN-93G饮食即通过添加氢化椰子油，使其提供60％的热量来自脂肪，建立高脂肪饮食小鼠模型)；高脂肪饲养5个月后，分别进行DNA-纳米颗粒处理和体外uPAR CAR T细胞处理，从受测的小鼠从日历年龄4个月开始实验，5个月后，一组小鼠收集肝脏，进行衰老生物标记物(表观遗传年龄)检测(见上步骤)，一组小鼠禁食8-12h后，在腹腔注射葡萄糖(Sigma-Aldrich；老化实验使用每公斤体重2g，高脂饮食实验使用每公斤体重1g)，在注射后的0、15、30、60和120min采集血样。在0min和15min时间点采集的血清中测定胰岛素浓度，使用UltraSensitive Mouse Insulin ELISA kit(Crystal Chem，90080)进行测定。实验结果提示经过体内uPAR CAR T细胞处理6周后，小鼠的高脂肪饮食的葡萄糖耐量明显改善，优于体外uPAR CAR T细胞。

肝脏纤维化小鼠模型上，DNA-纳米颗粒复合物静脉输入清除衰老细胞疗法逆转肝脏纤维化及同体外CAR T治疗头对头疗效对比：6-8周C57BL/6小鼠每周两次腹腔注射1mlkg^-1四氯化碳(CCl₄)，连续注射12次，诱导肝纤维化，DNA-纳米颗粒治疗和体外uPAR体外CART细胞治疗同上步骤，并分别CCl₄以相同剂量和间隔持续给予，再最后一次CCl₄注射后，48-72h处置收集小鼠肝脏，一组小鼠收集肝脏，进行衰老生物标记物(表观遗传年龄)检测(见上步骤)，一组小鼠进行肝脏SA-β-gal染色：SA-β-gal染色按照先前的描述进行(PMID:30573629)，pH 5.5的条件下新鲜冰冻组织切片，用含有0.5％戊二醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)固定15min，用含有1mMMgCl2的PBS洗涤，并在含有1mM MgCl2、1mg ml-1X-β-gal、5mM钾亚铁***和5mM钾铁***的PBS中染色5-8h。组织切片进行了伊红染色。每个孔或切片的五个高倍视野进行计数并求平均以量化SA-β-gal阳性细胞的百分比。一组小鼠肝脏组织标本在10％***中固定过夜，然后嵌入石蜡并切成5μm厚的切片，切片进行了苏木精-伊红(H&E)染色，以及用于检测纤维化的Sirius Red染色，为了对纤维化进行定量分析，每只小鼠至少有三个完整切片进行扫描，然后利用NIH ImageJ软件对图像进行量化分析。纤维化组织的数量相对于总分析的肝脏面积进行计算。实验结果提示经过体内uPAR CAR T细胞处理6周后，小鼠的肝脏纤维化明显改善，优于体外uPAR CAR T细胞。

实验例2DPP4 CART清除衰老细胞疗法

第一步，DPP4 CAR T的识别衰老细胞嵌合抗原设计和制备除用编码DPP4 VL的DNA序列

SEQ ID No.3:

ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGACATCCT GCTGACCCAGTCTCCATCTTCTCTGTCTGCTACTCCTGGCGAACGTGCACCACACCGCGGCCTCCAGGGCATCCGA ACAACCTGAACGGACAGCAGAAACCAGGTCAGGCCCCACGTCTGCTGACTACACTCTCTAATGCAGCCGGTGTGCC ACCCGTTTCTCCGGATCGGTTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCACTCAGACGCAACCGAAGACGGCCGCCACACG CCAGCAGCACAAGCGCCAACCCGGTTCGGACCAAAGGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG。

编码DPP4 VH的DNA序列：

SEQ ID No.4：

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCCGCAAGCACCAAAGGCCCATCGGTATTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA)替换uPAR对应的VL和VH序列外其余方法同实验例1一样。

第二步，在老年小鼠模型上，DPP4 CAR DNA-纳米颗粒(用DPP4的VL和VH取替换uPAR的VL和VH)静脉输入清除衰老细胞疗法及同体外CAR T治疗进行头对头降低表观遗传学年龄和增强运动能力疗效对比。实验结果(图5)提示经过体内DPP4 CAR T细胞处理6周后，小鼠的表观遗传学年龄显著下降，电动跑步机耐受时间和最大速度显著提高，优于体外DPP4 CAR T细胞效果。

实验例3HMGB1 CART清除衰老细胞疗法

第一步，HMGB1 CAR T的识别衰老细胞嵌合抗原设计和制备除用编码HMGB1 VL的DNA序列：

SEQ ID No.5：

GCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAGGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCACCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGAAGCGTCCAAGAGGGCCACAGGCACCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAGCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCACCGTCACAACTGGCCTCCACAGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGGTCAAA。

编码HMGB1 VH的DNA序列，SEQ ID No.6：

GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTTGGTACGATATGACTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCCATCTCTCCTTCTGGTGGCTATACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACCACAGAATTCTACGATTACCTGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGC。

替换uPAR对应的VL和VH序列外其余方法同实验例1一样。

第二步，在老年小鼠模型上，HMGB1CAR DNA-纳米颗粒(用HMGB1的VL和VH取替换uPAR的VL和VH)静脉输入清除衰老细胞疗法及同体外CAR T治疗进行头对头降低表观遗传学年龄和增强运动能力疗效对比的方法同上述。实验结果(图6)提示经过体内HMGB1 CART细胞处理6周后，小鼠的表观遗传学年龄显著下降，电动跑步机耐受时间和最大速度显著提高，优于体外HMGB1 CART细胞效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种特异性识别衰老细胞的嵌合抗原受体DNA质粒，其特征在于，包括依次连接的细胞膜外区域序列、跨膜区域序列和共刺激分子区域序列；所述细胞膜外区域序列包括编码衰老细胞标志物的scFv片段；

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体DNA质粒，其特征在于，所述衰老细胞标志物选自uPAR、DPP4(CD26)、HMGB1衰老细胞表面特异蛋白中的一种或几种。

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体DNA质粒，其特征在于，所述初始质粒选自非病毒质粒或病毒质粒；所述非病毒质粒包括转座子质粒。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体DNA质粒，其特征在于，当所述衰老细胞标志物为uPAR时，所述嵌合抗原受体DNA质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

当所述衰老细胞标志物为HMGB1时，所述嵌合抗原受体DNA质粒的核苷酸序列以SEQ IDNO.5替换SEQ ID NO.1的第87-407位，以SEQ ID NO.6替换SEQ ID NO.1的第477-818位。

5.一种嵌合抗原受体纳米复合物，其特征在于，包括权利要求1～4任意一项所述的特异性识别衰老细胞的嵌合抗原受体DNA质粒、偶联有信号肽的多聚物、游离的多聚物和靶向T细胞的抗体聚合物；

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体纳米复合物，其特征在于，所述多聚物为PBAE-447，偶联有信号肽的多聚物中信号肽的序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体纳米复合物，其特征在于，所述抗体聚合物为聚谷氨酸偶联抗CD3抗体PGA-CD3。

8.权利要求5～7任意一项所述的嵌合抗原受体纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述质粒溶液中嵌合抗原受体DNA质粒的浓度为0.05～0.15mg/ml。

10.权利要求5～7任意一项所述的嵌合抗原受体纳米复合物、权利要求8或9所述的制备方法制备获得的嵌合抗原受体纳米复合物在制备清除衰老细胞的试剂中的应用。