CN115137840A - 一种用于治疗帕金森的rna递送*** - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种用于治疗帕金森的RNA递送***。该***包括病毒载体,所述病毒载体携带有能够治疗帕金森的RNA片段,所述病毒载体能够在宿主的器官组织中富集,并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有能够治疗帕金森的所述RNA片段的复合结构,所述复合结构能够将所述RNA片段送入目标组织,实现帕金森的治疗。本申请提供的用于治疗帕金森的RNA递送***安全性和可靠性已被充分验证,成药性非常好、通用性强,具有极好的经济效益和应用前景。
Description
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域,特别涉及一种用于治疗帕金森的RNA递送***。
背景技术
帕金森病(PD)又名震颤麻痹,是一种常见的中老年人神经***变性疾病,主要病变在黑质和纹状体,震颤、肌强直及运动减少是本病的主要临床特征。帕金森病是老年人中第四位最常见的神经变性疾病。
RNA干扰(RNAi)疗法自从被发明以来,一直被认为是治疗人类疾病的一种很有前途的策略,但在临床实践过程中遇到了许多问题,该疗法的发展进度远远落后于预期。
一般认为RNA无法在细胞外长期稳定存在,因为RNA会被细胞外富含的RNase降解成碎片,因此必须找到能够使RNA稳定存在于细胞外,并且能够靶向性地进入特定组织的方法,才能将RNAi疗法的效果凸显出来。
目前与siRNA相关的专利很多,主要聚焦在以下几个方面:1、设计具有医学效果的siRNA。2、对siRNA进行化学修饰,提高siRNA在生物体内的稳定性,提高产率。3、提高设计各种人工载体(如脂质纳米粒子、阳离子聚合物和病毒),以提高siRNA在体内传递的效率。其中第3方面的专利很多,其根本原因是研究人员们已经意识到目前缺乏合适的siRNA传递***,将siRNA安全地、精确地、高效地输送到目标组织,该问题已经成为制约RNAi疗法的核心问题。
病毒(Biological virus)是一种个体微小,结构简单,只含一种核酸(DNA或RNA),必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。病毒载体可将遗传物质带入细胞,原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞,进行感染的分子机制,可发生于完整活体(in vivo)或是细胞培养(in vitro)中,主要应用于基础研究、基因疗法或疫苗。但是目前很少有针对将病毒作为载体利用特殊的自组装机制递送RNA,特别是siRNA的相关研究。
公开号为CN108624590A的中国专利公开了一种能够抑制DDR2基因表达的siRNA;公开号为CN108624591A的中国专利公开了一种能够沉默ARPC4基因的siRNA,并且对该siRNA进行了α-磷-硒修饰;公开号为CN108546702A的中国专利公开了一种靶向长链非编码RNA DDX11-AS1的siRNA。公开号为CN106177990A的中国专利公开了一种可以用于多种肿瘤治疗的siRNA前体。这些专利均设计了特定的siRNA并且来针对某些由基因变化引起的疾病。
公开号为CN108250267A的中国专利公开了一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体,使用多肽作为siRNA的载体。公开号为CN108117585A的中国专利公开了一种靶向导入siRNA促进乳腺癌细胞凋亡的多肽,同样使用多肽作为siRNA的载体。公开号为CN108096583A的中国专利公开了一种纳米粒子载体,该载体在包含化疗药物的同时还可以装载具有乳腺癌疗效的siRNA。这些专利均为在siRNA载体方面的发明创造,但是其技术方案具有一个共同特征,那就是载体和siRNA均在体外预先组装,然后再引入宿主体内。事实上,目前绝大部分设计的传递技术均是如此。然而这类传递体系具有共同的问题,那就是这些人工合成的外源性传递体系很容易被宿主的循环***清除,也有可能引起免疫原性反应,甚至可能对特定的细胞类型和组织有毒。
本发明的研究团队发现内源性细胞可以选择性地将miRNAs封装到外泌体(exosome)中,外泌体可以将miRNA传递到受体细胞中,其分泌的miRNA在相对较低的浓度下,即可有力阻断靶基因的表达。外泌体与宿主免疫***生物相容,并具有在体内保护和运输miRNA跨越生物屏障的先天能力,因此成为克服与siRNA传递相关的问题的潜在解决方案。例如,公开号为CN110699382A的中国专利就公开了一种递送siRNA的外泌体的制备方法,公开了从血浆中分离外泌体,并将siRNA通过电穿孔的方式封装到外泌体中的技术。
但是这类在体外分离或制备外泌体的技术,往往需要通过细胞培养获取大量的外泌体,再加上siRNA封装的步骤,这使得大规模应用该产品的临床费用变得非常高,一般患者无法负担;更重要的是,外泌体复杂的生产/纯化过程,使其几乎不可能符合GMP标准。
到目前为止,以外泌体为有效成分的药物从未获得CFDA批准,其核心问题就是无法保证外泌体产品的一致性,而这一问题直接导致此类产品无法获得药品生产许可证。如果能解决这一问题,则对推动RNAi疗法治疗帕金森病意义非凡。
因此,开发一个安全、精确和高效的siRNA传递***是对提高RNAi治疗效果,推进RNAi疗法至关重要的一环。
发明内容
有鉴于此,本申请实施例提供了一种用于治疗帕金森的RNA递送***及其应用,以解决现有技术中存在的技术缺陷。
本申请的一个发明点为提供一种用于治疗帕金森的RNA递送***,该***包括病毒载体,所述病毒载体携带有能够治疗帕金森的RNA片段,所述病毒载体能够在宿主的器官组织中富集,并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有能够治疗帕金森的所述RNA片段的复合结构,所述复合结构能够将所述RNA片段送入目标组织,实现帕金森的治疗。RNA片段送入目标组织后,能够抑制与其相匹配的基因的表达,进而抑制目标组织中疾病的发展。目标组织为大脑。
进一步地,所述病毒载体为腺病毒相关病毒。
进一步地,所述腺病毒相关病毒为腺病毒相关病毒5型、腺病毒相关病毒8型或腺病毒相关病毒9型。
进一步地,所述RNA片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列,所述RNA序列是具有医学意义的siRNA、shRNA或miRNA。
进一步地,所述病毒载体包括启动子和靶向标签,所述靶向标签能够在宿主的器官组织中形成所述复合结构的靶向结构,所述靶向结构位于复合结构的表面,所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织,将所述RNA片段递送进入目标组织。
进一步地,所述病毒载体中包括以下任意一种线路或几种线路的组合:启动子-RNA片段、启动子-靶向标签、启动子-RNA片段-靶向标签;每一个所述病毒载体中至少包括一个RNA片段和一个靶向标签,所述RNA片段和靶向标签位于相同的线路中或位于不同的线路中。
进一步地,所述病毒载体还包括能够使所述线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列和loop序列,所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列;
所述病毒载体中包括以下任意一种线路或几种线路的组合:5'-启动子-5'侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列、5'-启动子-靶向标签、5'-启动子-靶向标签-5'侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列。
进一步地,所述5’侧翼序列为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80%的序列;
所述loop序列为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80%的序列;
所述3’侧翼序列为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80%的序列;
所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列,并删除其中任意1-5位碱基。删除RNA反向互补序列的1-5位碱基的目的是使该序列不表达。
与shRNA不同,在siRNA和miRNA前体中,由于删除作用链的反向互补链(例如siRNA的反向互补链)的第9,10位碱基,导致siRNA和miRNA的作用链会形成凸起结构,以上结构有利于更有效的沉默基因的表达。综上,通过删除第9,10位碱基的反向互补序列来提高沉默效率是目前已公认的结论。
优选地,所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列,并删除其中任意1-3位碱基。
更为优选地,所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列,并删除其中任意1-3位连续排列的碱基。
最为优选地,所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列,并删除其中的第9位和/或第10位碱基。
进一步地,在病毒载体中存在至少两种线路的情况下,相邻的线路之间通过序列1-3组成的序列(序列1-序列2-序列3)相连;
其中,序列1为CAGATC,序列2是由5-80个碱基组成的序列,序列3为TGGATC。
进一步地,在病毒载体中存在至少两种线路的情况下,相邻的线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80%的序列相连;
其中,序列4为CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC。
进一步地,所述器官组织为肝脏,所述复合结构为外泌体。
进一步地,所述靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白。
进一步地,所述靶向肽包括RVG靶向肽、GE11靶向肽、PTP靶向肽、TCP-1靶向肽、MSP靶向肽;
所述靶向蛋白包括RVG-LAMP2B融合蛋白、GE11-LAMP2B融合蛋白、PTP-LAMP2B融合蛋白、TCP-1-LAMP2B融合蛋白、MSP-LAMP2B融合蛋白。
靶向标签优选为能够精准靶向脑组织的RVG靶向肽或RVG-LAMP2B融合蛋白。
进一步地,所述RNA序列的长度为15-25个核苷酸。比如,所述RNA序列的长度可以为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个核苷酸。优选地,所述RNA序列的长度为18-22个核苷酸。
进一步地,所述能够治疗帕金森的RNA选自:LRRK2基因的siRNA,或与上述序列同源性大于80%的RNA序列,或编码上述RNA的核酸分子。需要说明的是,此处“编码上述RNA序列的核酸分子”中的RNA序列也同时包括每种RNA的同源性大于80%的RNA序列。
LRRK2基因的siRNA包括AUUAACAUGAAAAUAUCACUU、UUAACAAUAUCAUAUAAUCUU、AUCUUUAAAAUUUGUUAACGC、UUGAUUUAAGAAAAUAGUCUC、UUUGAUAACAGUAUUUUUCUG、其他具有抑制LRRK2基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80%的序列。
需要说明的是,以上所述的“同源性大于80%的序列”可以为同源性为85%、88%、90%、95%、98%等。可选地,所述RNA片段包括RNA序列本体和对RNA序列本体进行核糖修饰得到的修饰RNA序列。即RNA片段既可以仅由至少一个RNA序列本体组成,也可以仅由至少一个修饰RNA序列组成,还可以由RNA序列本体与修饰RNA序列组成。
在本发明中,所述分离的核酸还包括其变体和衍生物。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对所述核酸进行修饰。修饰方式包括(但不限于):甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。在本发明的其中一种实施方式中,所述修饰为核苷酸间键合,例如选自:硫代磷酸酯、2'-O甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。在本发明的其中一种实施方式中,所述修饰为对核苷酸的修饰,例如选自:肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、***糖-核酸(FANA)、类似物、衍生物及其组合。优选的,所述修饰为2’氟嘧啶修饰。2’氟嘧啶修饰是将RNA上嘧啶核苷酸的2’-OH用2’-F替代,2’-F能够使RNA不易被体内的RNA酶识别,由此增加RNA片段在体内传输的稳定性。
进一步地,所述递送***为用于包括人在内的哺乳动物中的递送***。
本申请的另一个发明点为提供一种如上所述的用于治疗帕金森的RNA递送***在药物中的应用。
所述药物为治疗帕金森及其相关疾病的药物,这里的相关疾病指的是帕金森的形成或发展过程中出现的关联疾病或并发症、后遗症等,或与帕金森具有一定相关性的其他疾病。
所述药物包括上述病毒载体,具体而言,此处的病毒载体表示携带有RNA片段、或携带有RNA片段及靶向标签的病毒载体,并且能够进入宿主体内能够在肝脏部位富集,自组装形成复合结构外泌体,该复合结构能够将RNA片段递送至目标组织,使RNA片段在目标组织中表达,进而抑制与其匹配的基因的表达,实现治疗疾病的目的。
所述药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂等。
进一步地,所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。优选静脉注射。
本申请的技术效果为:
本申请提供的用于治疗帕金森的RNA递送***以病毒作为载体,病毒载体作为成熟的注入物,其安全性和可靠性已被充分验证,成药性非常好。最终发挥效果的RNA序列由内源性外泌体包裹输送,不存在任何免疫反应,无需验证该外泌体的安全性。该递送***可以递送各类小分子RNA,通用性强。并且病毒载体的制备要比外泌体或是蛋白质、多肽等物质的制备便宜地多,经济性好。本申请提供的用于治疗帕金森的RNA递送***在体内自组装后能够与AGO2紧密结合并富集为复合结构(外泌体),不仅能防止其过早降解,维持其在循环中的稳定性,而且有利于受体细胞吸收、胞浆内释放和溶酶体逃逸,所需剂量低。
本申请提供的用于治疗帕金森的RNA递送***应用于药物中,即提供了一个药物递送平台,可以大大提高帕金森病的治疗效果,还可以通过该平台形成更多RNA类药物的研发基础,对RNA类药物研发和使用具有极大的推动作用。
附图说明
图1是本申请一实施例提供的转基因小鼠帕金森治疗情况对比图;
图2是本申请一实施例提供的小鼠小胶质细胞的激活和炎症因子的分泌情况对比图;
图3是本申请一实施例提供的小鼠小胶质细胞的数量对比图。
图4是本申请一实施例提供的负载有siRNA的慢病毒载体具有体内富集的效果图。
图5是本申请一实施例提供的负载有siRNA的慢病毒载体具有体内自组装的效果图。
图6是本申请一实施例提供的负载有siRNA的慢病毒载体具有帕金森治疗效果的数据结果图,数据图中是以LRRK2 mRNA水平进行对比。
图7是本申请一实施例提供的负载有siRNA的腺病毒相关病毒1型、4型、7型载体具有体内富集的效果图。
图8是本申请一实施例提供的负载有siRNA的腺病毒相关病毒1型、4型、7型载体具有体内自组装的效果图。
图9是本申请一实施例提供的负载有siRNA的腺病毒相关病毒1型、4型、7型载体具有帕金森治疗效果的数据结果图,数据图中是以LRRK2 mRNA水平进行对比。
图10是本申请一实施例提供的负载有6种单独RNA序列的腺病毒相关病毒8型载体具有体内富集的效果图.
图11是本申请一实施例提供的负载有6种单独RNA序列的腺病毒相关病毒8型和9型载体具有体内自组装的效果图。
图12是本申请一实施例提供的负载有任意2种RNA序列的RNA片段的腺病毒相关病毒9型载体具有体内富集的效果图。
图13是本申请一实施例提供的负载有任意2种RNA序列的RNA片段的腺病毒相关病毒8型和9型载体具有体内自组装的效果图。
图14是本申请一实施例提供的负载有任意3种RNA序列的RNA片段的腺病毒载体具有帕金森治疗效果的电泳结果图。
图15是本申请一实施例提供的腺病毒相关病毒9型中的序列包含有siRNA和RVG的情况下,其所具有的体内富集数据图。
图16是本申请一实施例提供的腺病毒相关病毒9型中的序列包含有siRNA和RVG的情况下,通过LRRK2 mRNA的表达数据所体现出的针对帕金森治疗的效果图。
图17是本申请一实施例提供的负载有RVG-LAMP2B融合蛋白及其它融合蛋白在腺病毒载体具有体内富集的数据图。
图18是本申请一实施例提供的RVG-LAMP2B融合蛋白及其它融合蛋白在腺病毒载体上针对帕金森治疗效果的数据对比图,数据通过LRRK2 mRNA的相对水平来体现。
图19是本申请一实施例提供的腺病毒载体***中包括有与LRRK2基因的siRNA序列同源性大于80%的3条RNA序列时,其所具有的体内富集数据图。
图20是本申请一实施例提供的腺病毒载体***中包括有与LRRK2基因的siRNA序列同源性大于80%的3条RNA序列时,其针对帕金森治疗效果的数据对比图,数据通过LRRK2mRNA的相对水平来体现。
具体实施方式
下面结合附图对本申请的具体实施方式进行描述。
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。
Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测.对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。其步骤主要包括:提取蛋白、蛋白定量、制胶和电泳、转膜、免疫标记及显影。
免疫组化,应用抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及相对定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化的主要步骤包括:切片浸泡、过夜晾干、二甲苯脱蜡、梯度酒精脱蜡(100%、95%、90%、80%、75%、70%、50%,每次3min)、双蒸水、滴加3%过氧化氢溶液去除过氧化氢酶、水洗、抗原修复、滴加5%BSA、封闭1h、稀释一抗、PBS缓冲液清洗、孵二抗、PBS缓冲液清洗、显色液显色、水洗、苏木精染色、梯度乙醇脱水、中性树胶封片。
本发明中涉及到的siRNA水平、蛋白含量和mRNA含量的检测,均是通过向小鼠体内注射RNA递送***,建立了小鼠干细胞体外模型。利用qRT-PCR检测细胞、组织中mRNA和siRNA表达水平。对于siRNA的绝对定量利用标准品绘制标准曲线的方式进行确定。每个siRNA或mRNA相对于内参的表达量可以用2-ΔCT表示,其中ΔCT=C样品-C内参。扩增siRNA时内参基因为U6 snRNA(组织中)或miR-16(血清、外泌体中)分子,扩增mRNA时基因为GAPDH或18s RNA。利用Western blotting实验检测细胞、组织中蛋白质的表达水平,用ImageJ软件进行蛋白定量分析。
实施例1
本实施例提供一种用于治疗帕金森的RNA递送***,该***包括病毒载体,所述病毒载体携带有能够治疗帕金森的RNA片段,所述病毒载体能够在宿主的器官组织中富集,并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有能够治疗帕金森的所述RNA片段的复合结构,所述复合结构能够将所述RNA片段送入目标组织,实现帕金森的治疗。
除了腺病毒外,其它病毒载体也具有体内富集、自组装和帕金森的治疗效果,如慢病毒,慢病毒的数据如图4-6所示,其中,CTX代表皮层(cortex),STR代表纹状体(Striatum)。
所述病毒载体优选为腺病毒相关病毒,更优选为腺病毒相关病毒5型、腺病毒相关病毒8型或腺病毒相关病毒9型。
除了腺病毒相关病毒5型、8型和9型以外,其它病毒载体也具有体内富集、自组装及帕金森治疗效果,如腺病毒1型、4型和7型,其数据如图7-9所示。
在本实施例中,病毒载体还包括启动子和靶向标签。所述病毒载体包括以下任意一种线路或几种线路的组合:启动子-RNA序列、启动子-靶向标签、启动子-RNA序列-靶向标签,每一个所述病毒载体中至少包括一个RNA片段和一个靶向标签,所述RNA片段和靶向标签位于相同的线路中或位于不同的线路中。换而言之,病毒载体中可以仅包括启动子-RNA序列-靶向标签,也可以包括启动子-RNA序列、启动子-靶向标签的组合,或是启动子-靶向标签、启动子-RNA序列-靶向标签的组合。
进一步地,所述病毒载体还可以包括能够使所述线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列和loop序列,所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列;所述病毒载体包括以下任意一种线路或几种线路的组合:5’-启动子-5’侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列、5’-启动子-靶向标签、5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列。
病毒载体中包含有5'-启动子--靶向标签-5'侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列时,其RNA递送***所具有的体内富集和帕金森治疗效果如图15-16所示,靶向标签为RVG,RNA片段为具有治疗作用的siRNA。
其中,所述5’侧翼序列优选为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80%的序列,包括与ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc同源性为85%、90%、92%、95%、98%、99%的序列等。
所述loop序列优选为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80%的序列,包括与gttttggccactgactgac同源性为85%、90%、92%、95%、98%、99%的序列等。
所述3’侧翼序列优选为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80%的序列,包括与accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag同源性为85%、90%、92%、95%、98%、99%的序列等。
所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列,并删除其中任意1-5位碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时,所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中任意1-5位碱基的反向互补序列。
优选地,所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列,并删除其中任意1-3位碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时,所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中任意1-3位碱基的反向互补序列。
更为优选地,所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列,并删除其中任意1-3位连续排列的碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时,所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中任意1-3位连续排列的碱基的反向互补序列。
最为优选地,所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列,并删除其中的第9位和/或第10位碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时,所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中第9位和/或第10位的反向互补序列。删除第9位和第10位碱基效果最优。
需要说明的是,上述侧翼序列、补偿序列、loop序列均不是随意选择的,而是基于大量的理论研究和试验确定的,在上述特定侧翼序列、补偿序列、loop序列的配合下,能够最大程度的提高RNA片段的表达率。
在病毒载体携带两个或多个线路的情况下,相邻的线路之间可以通过序列1-序列2-序列3相连;其中,序列1优选为CAGATC,序列2可以为由5-80个碱基组成的序列,比如10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个碱基组成的序列均可,优选为10-50个碱基组成的序列,更优选为20-40个碱基组成的序列,序列3优选为TGGATC。
序列2具体如下表1所示。
更为优选地,在病毒载体携带两个或多个线路的情况下,相邻的线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80%的序列相连;其中,序列4为CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC。
序列具体如下表4所示。
序列4 | CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC |
序列4-1 | CAGATCTGGCCGCACTCGTAGAGGTGAGTCGACCAGTGGATC |
序列4-2 | CAGATCTGGCACCCGTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC |
序列4-3 | CAGATCTGGCCGCACAGGTCGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC |
以上所述的RNA片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列,所述RNA序列能够在目标受体中被表达,所述补偿序列在目标受体中不能被表达。RNA序列可以为siRNA序列、shRNA序列或miRNA序列,优选为siRNA序列。
一个RNA序列的长度为15-25个核苷酸(nt),优选为18-22nt,比如18nt、19nt、20nt、21nt、22nt均可。此序列长度的范围并不是随意选择的,而是经过反复的试验后确定的。大量试验证明,在RNA序列的长度小于18nt,特别是小于15nt的情况下,该RNA序列大多无效,不会发挥作用,而在RNA序列的长度大于22nt,特别是大于25nt的情况下,则不仅线路的成本大大提高,而且效果也并未优于长度为18-22nt的RNA序列,经济效益差。因此,在RNA序列的长度为15-25nt,特别是18-22nt时,能够兼顾成本与作用的发挥,效果最好。
所述能够治疗帕金森的RNA选自:LRRK2基因的siRNA或编码上述RNA的核酸分子。
选取3条LRRK2 siRNA序列,分别为UUGGUCAUCUGGAUACAUC,CAUGAUGCUGUUAUUCU,GAUCUGGAAAUAAAGGACCA,并以第一条siRNA为例进行了其同源性为80%,90%和98%的序列的效果验证,分别负载有siRNA三个同源序列的递送***,其所具有的体内富集和帕金森治疗效果如图19-20所示。
所需递送RNA有效序列的数量为1条、2条或多条。
以在同一个病毒载体上联合使用“siRNA1”和“siRNA2”为例,该病毒载体的功能结构区可以表示为:(启动子-siRNA1)-连接序列-(启动子-siRNA2)-连接序列-(启动子-靶向标签),或(启动子-靶向标签-siRNA1)-连接序列-(启动子-靶向标签-siRNA2),或(启动子-siRNA1)-连接序列-(启动子-靶向标签-siRNA2)等。
更加具体地,该病毒载体的功能结构区可以表示为:(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签),或(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列),或(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)、(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA1-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)等。其他情况均可以此类推,在此不再赘述。以上连接序列可以为“序列1-序列2-序列3”或“序列4”,一个括号表示一个完整的线路(circuit)。
优选地,上述RNA还可以通过对其中的RNA序列(siRNA、shRNA或miRNA)进行核糖修饰得到,优选2’氟嘧啶修饰。2’氟嘧啶修饰是将siRNA、shRNA或miRNA上嘧啶核苷酸的2’-OH用2’-F替代,2’-F能够使人体内的RNA酶不易识别siRNA、shRNA或miRNA,如此能够增加RNA在体内传输的稳定性。
具体地,肝脏会吞噬外源性的病毒,高达99%的外源性病毒会进入肝脏,因此当以病毒作为载体时并不需要做特异性设计即可在肝脏组织中富集,随后病毒载体被打开,释放出RNA分子(siRNA、shRNA或miRNA),肝脏组织自发地将上述RNA分子包裹进外泌体内部,这些外泌体就变成了RNA输送机构。
优选地,为了使该RNA输送机构(外泌体)具有“精确制导”的能力,在注入体内的病毒载体中我们设计了靶向标签,该靶向标签也会被肝脏组织组装到外泌体中,尤其是当选择某些特定的靶向标签时,靶向标签能够被***外泌体表面,从而成为能够引导外泌体的靶向结构,这就大大提高了本发明所述的RNA输送机构的精准性,一方面可以使所需引入的病毒载体的用量大大减少,另一方面还大大提高了潜在药物递送的效率。
靶向标签选自具有靶向功能的肽、蛋白质或抗体中的一种,靶向标签的选择是需要创造性劳动的过程,一方面需要根据目标组织选取可用的靶向标签,另一方面还需要保证该靶向标签能够在稳定地出现在外泌体的表面,从而达到靶向功能。目前已经筛选出的靶向标签包括:靶向肽、靶向蛋白、抗体。其中,靶向肽包括但不限于RVG靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)、GE11靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No:2所示)、PTP靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No:3所示)、TCP-1靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No:4所示)、MSP靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No:5所示);靶向蛋白包括但不限于RVG-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No:6所示)、GE11-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No:7所示)、PTP-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No:8所示)、TCP-1-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ IDNo:9所示)、MSP-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No:10所示)。在本实施例中,靶向标签优选采用能够精准靶向脑组织的RVG靶向肽、RVG-LAMP2B融合蛋白。
RVG-LAMP2B融合蛋白在腺病毒载体上所具有的体内富集和帕金森治疗效果如图17-18所示,其治疗效果通过LRRK2 mRNA的水平来体现。
此外,为了达到精准递送的目的,我们实验了多种病毒载体搭载的方案,得出另一优化的方案:所述病毒载体还可以由具有不同结构的多种病毒构成,其中一种病毒包含启动子和靶向标签,其他病毒包含启动子和RNA片段。即将靶向标签与RNA片段装载到不同的病毒载体中,将两种病毒载体注入体内,其靶向效果不差于将相同的靶向标签与RNA片段装载在一个病毒载体中产生的靶向效果。
更优选地,两种不同的病毒载体注入宿主体内时,可以先将装有RNA序列的病毒载体注入,在1-2小时后再注入含有靶向标签的病毒载体,如此能够达到更优的靶向效果。
以上所述的递送***均可用于包括人在内的哺乳动物。
本实施例提供的用于治疗帕金森的RNA递送***以病毒作为载体,病毒载体作为成熟的注入物,其安全性和可靠性已被充分验证,成药性非常好。最终发挥效果的RNA序列由内源性外泌体包裹输送,不存在任何免疫反应,无需验证该外泌体的安全性。该递送***可以递送各类小分子RNA,通用性强。并且病毒载体的制备要比外泌体或是蛋白质、多肽等物质的制备便宜地多,经济性好。本实施例提供的用于治疗帕金森的RNA递送***在体内自组装后能够与AGO2紧密结合并富集为复合结构(外泌体),不仅能防止其过早降解,维持其在循环中的稳定性,而且有利于受体细胞吸收、胞浆内释放和溶酶体逃逸,所需剂量低。
实施例2
在实施例1的基础上,本实施例提供一种药物。该药物包括病毒载体,所述病毒载体携带有能够治疗帕金森的RNA片段,所述病毒载体能够在宿主的器官组织中富集,并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有能够治疗帕金森的所述RNA片段的复合结构,所述复合结构能够将所述RNA片段送入目标组织,实现帕金森的治疗。
可选地,所述RNA片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列,所述RNA序列是具有医学意义的siRNA、shRNA或miRNA。
以腺病毒相关病毒8型和9型为病毒载体,其在携带有1个或多个RNA片段的情况下,具有体内富集、自组装和帕金森治疗效果,图10-11显示了载体携带有6种单独RNA序列的RNA片段所呈现的数据结果;图12-13显示了载体携带有4组包含有任意2种RNA序列的RNA片段所呈现的数据结果;图14显示了载体携带有3组包含有任意3种RNA序列的RNA片段所呈现的治疗数据结果。
序列具体如下表3所示。
可选地,所述病毒载体包括启动子和靶向标签,所述靶向标签能够在宿主的器官组织中形成所述复合结构的靶向结构,所述靶向结构位于复合结构的表面,所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织,将所述RNA片段递送进入目标组织。
关于本实施例中上述病毒载体、RNA片段、靶向标签等的解释说明均可以参考实施例1,在此不再赘述。
该药物可以通过口服、吸入、皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式进入人体后,通过实施例1所述的RNA递送***递送至目标组织,发挥治疗作用。
该药物可以与其他治疗帕金森病的药物联合使用,以提高治疗效果,比如抗胆碱能药(安坦等)、抗组织胺药(苯海拉明、金刚烷胺等)、左旋多巴类药(多芭、息宁、西莱美等)、多巴胺受体激动剂(泰舒达、协良行、克瑞帕、溴隐亭等)、单胺氧化酶B抑制剂(司吉宁、金思平等)、儿茶酚胺氧位甲基转移酶抑制剂(恩托卡朋等)。
本实施例的药物还可以包括药学上可以接受的载体,该载体包括但不限于稀释剂、缓冲剂、乳剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、佐剂、干燥剂、吸附载体等。
本实施例提供的药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂等。
本实施例提供的药物以病毒作为载体,病毒载体作为成熟的注入物,其安全性和可靠性已被充分验证,成药性非常好。最终发挥效果的RNA序列由内源性外泌体包裹输送,不存在任何免疫反应,无需验证该外泌体的安全性。该药物可以递送各类小分子RNA,通用性强。并且病毒载体的制备要比外泌体或是蛋白质、多肽等物质的制备便宜地多,经济性好。本申请提供的药物在体内自组装后能够与AGO2紧密结合并富集为复合结构(外泌体),不仅能防止其过早降解,维持其在循环中的稳定性,而且有利于受体细胞吸收、胞浆内释放和溶酶体逃逸,所需剂量低。
实施例3
在实施例1或2的基础上,本实施例提供一种用于治疗帕金森的RNA递送***在药物中的应用,该药物为治疗帕金森的药物。本实施例结合以下试验对RNA递送***在帕金森治疗方面的应用进行具体说明。
首先,选择LRRK2R1441G转基因小鼠3月龄时进行试验,试验设置LPS干预组和LPS非干预组。LPS干预组LPS干预7天后进行AAV-CMV-scrR/AAV-CMV-RVG-siRLRRK2的治疗(图中将AAV-CMV-scrR、AAV-CMV-RVG-siRLRRK2简写为CMV-scrR、CMV-RVG-siRLRRK2)。
如图1所示,我们选取12周龄的LRRK2R1441G小鼠,腹腔注射5mg/kg LPS进行炎症诱导,7天后,每2天静脉注射5mg/kg CMV-scrR或CMV-RVG-siRLRRK2线路(Genetic),共注射2周。治疗后处死小鼠,定量检测LRRK2/S935在纹状体和黑质致密部的表达。参见图1A,Westernblot分析纹状体和黑质致密部LRRK2/S935蛋白水平,结果显示α-微管蛋白作为内部加载控制。参见图1B,定量显示LRRK2蛋白水平可看出,LPS干预后进行AAV-CMV-scrR治疗的小鼠LRRK2蛋白水平明显高于其他组,而接受AAV-CMV-RVG-siRLRRK2治疗的小鼠LRRK2蛋白水平显著较低。参见图1C-D,这几幅图展示了纹状体(Striatum)和黑质致密部(SNpc)的LRRK2/S935免疫荧光染色(红色)、神经元免疫荧光染色(红色)的结果,比例尺:50μm,结果表明注射AV-CMV-RVG-siRLRRK2的小鼠挽救了TH神经元的丢失,能够抑制小胶质的激活,说明AV-CMV-RVG-siRLRRK2在肝脏释放siRNA组装进入外泌体后可以穿过血脑屏障进入脑深部发挥功能。
如图2所示,选取12周龄的LRRK2R1441G小鼠,腹腔注射5mg/kg LPS进行炎症诱导,7天后,每2天静脉注射5mg/kg AAV-CMV-scrR或AAV-CMV-RVG-siRLRRK2 Genetic,共注射2周。终止治疗后,处死小鼠,观察小胶质细胞的激活和炎症因子的分泌情况。(图中将AAV-CMV-scrR、AAV-CMV-RVG-siRLRRK2简写为CMV-scrR、CMV-RVG-siRLRRK2)
参见图2,抗iba-1抗体免疫染色显示R1441G小鼠纹状体和黑质致密部小胶质细胞激活,比例尺:50μm。参见图3,量化图2中纹状体和SNpc中小胶质细胞的数量后可以看出,LPS干预后进行AAV-CMV-scrR治疗的小鼠纹状体和SNpc中小胶质细胞的数量显著高于其他组,而接受AAV-CMV-RVG-siRLRRK2治疗的小鼠纹状体和SNpc中小胶质细胞的数量显著较低。
以上试验可以说明,静脉注射AAV-CMV-RVG-siRLRRK2有助于抑制多巴胺能神经元中的LRRK2,从而减轻帕金森PD小鼠的神经病理发展。
在本文中,“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等仅用于表示相关部分之间的相对位置关系,而非限定这些相关部分的绝对位置。
在本文中,“第一”、“第二”等仅用于彼此的区分,而非表示重要程度及顺序、以及互为存在的前提等。
在本文中,“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制,还包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。
除非另有说明,本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围,也包括含于其中的若干子范围。
上面结合附图对本申请优选的具体实施方式和实施例作了详细说明,但是本申请并不限于上述实施方式和实施例,在本领域技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本申请构思的前提下做出各种变化。
Claims (19)
1.一种用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,该***包括病毒载体,所述病毒载体携带有能够治疗帕金森的RNA片段,所述病毒载体能够在宿主的器官组织中富集,并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有能够治疗帕金森的所述RNA片段的复合结构,所述复合结构能够将所述RNA片段送入目标组织,实现帕金森的治疗。
2.如权利要求1所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述病毒载体为腺病毒相关病毒。
3.如权利要求2所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述腺病毒相关病毒为腺病毒相关病毒5型、腺病毒相关病毒8型或腺病毒相关病毒9型。
4.如权利要求1所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述RNA片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列,所述RNA序列是具有医学意义的siRNA、shRNA或miRNA。
5.如权利要求1所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述病毒载体包括启动子和靶向标签,所述靶向标签能够在宿主的器官组织中形成所述复合结构的靶向结构,所述靶向结构位于复合结构的表面,所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织,将所述RNA片段递送进入目标组织。
6.如权利要求4所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述病毒载体中包括以下任意一种线路或几种线路的组合:启动子-RNA片段、启动子-靶向标签、启动子-RNA片段-靶向标签;每一个所述病毒载体中至少包括一个RNA片段和一个靶向标签,所述RNA片段和靶向标签位于相同的线路中或位于不同的线路中。
7.如权利要求6所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述病毒载体还包括能够使所述线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列和loop序列,所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列;
所述病毒载体中包括以下任意一种线路或几种线路的组合:5'-启动子-5'侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列、5'-启动子-靶向标签、5'-启动子-靶向标签-5'侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3'侧翼序列。
8.如权利要求6所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述5’侧翼序列为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80%的序列;
所述loop序列为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80%的序列;
所述3’侧翼序列为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80%的序列;
所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列,并删除其中任意1-5位碱基。
9.如权利要求6所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,在病毒载体中存在至少两种线路的情况下,相邻的线路之间通过序列1-3组成的序列相连;
其中,序列1为CAGATC,序列2是由5-80个碱基组成的序列,序列3为TGGATC。
10.如权利要求9所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,在病毒载体中存在至少两种线路的情况下,相邻的线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80%的序列相连;
其中,序列4为CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC。
11.如权利要求1所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述器官组织为肝脏,所述复合结构为外泌体。
12.如权利要求5所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白。
13.如权利要求12所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述靶向肽包括RVG靶向肽、GE11靶向肽、PTP靶向肽、TCP-1靶向肽、MSP靶向肽;
所述靶向蛋白包括RVG-LAMP2B融合蛋白、GE11-LAMP2B融合蛋白、PTP-LAMP2B融合蛋白、TCP-1-LAMP2B融合蛋白、MSP-LAMP2B融合蛋白。
14.如权利要求4所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述RNA序列的长度为15-25个核苷酸。
15.如权利要求14所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述能够治疗帕金森的RNA选自:LRRK2基因的siRNA,或与上述序列同源性大于80%的RNA序列,或编码上述RNA的核酸分子。
16.如权利要求15所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,LRRK2基因的siRNA包括AUUAACAUGAAAAUAUCACUU、UUAACAAUAUCAUAUAAUCUU、AUCUUUAAAAUUUGUUAACGC、UUGAUUUAAGAAAAUAGUCUC、UUUGAUAACAGUAUUUUUCUG、其他具有抑制LRRK2基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80%的序列。
17.如权利要求1所述的用于治疗帕金森的RNA递送***,其特征在于,所述递送***为用于包括人在内的哺乳动物中的递送***。
18.一种权利要求1-17任意一项所述的用于治疗帕金森的RNA递送***在药物中的应用。
19.如权利要求18所述的应用,其特征在于,所述药物为治疗帕金森及其相关疾病的药物,所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。
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