CN117821265A - 一种木霉菌及其在提高金线莲生长量与苷含量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木霉菌及其在提高金线莲生长量与苷含量中的应用。该菌种保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.40759。金线莲木霉菌分离于金线莲野生植株，产孢能力强，可于含有蔗糖与南瓜泥的偏酸性MS培养基培养并产生大量孢子。木霉菌具有促进金线莲生长及提高金线莲苷含量的作用。喷施金线莲木霉菌孢子液可使金线莲植株在6个月的生长期中生长量提高40‑60％，叶面积提高60％，多糖含量提高89％，金线莲苷提高10‑15％。本发明的木霉菌是一种具有提高金线莲生长量与金线莲苷含量的促生长菌株，在金线莲的促进生长与提高金线莲苷含量方面具有很好的应用潜能。
Description
技术领域
本发明涉及一种木霉菌及其在提高金线莲生长量与苷含量中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
金线莲为兰科(Orchid)花叶开唇兰属(Anoectochilus)金线兰(A.roxburghii)及其近缘种植物的统称，为多年生草本植物，在我国南方地区分布广泛，为民间传统用药，有“药王”之称。金线莲生长速度慢，其金线莲苷及多糖是金线莲药用成分的主要指标。
在生产中，如何提高金线莲产量与质量是金线莲种植产业的重要课题。木霉菌已在多种植物中证实具有促进生长与提高次生代谢物的能力，但不同种木霉菌使用间存在显著差异。但是现有的木霉菌对提高金线莲生长量与苷及多糖含量的效果不是很理想。
发明内容
本发明提供了一种木霉菌及其在提高金线莲生长量与苷含量中的应用，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
本发明发明了一种金线莲木霉菌，其保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为为CGMCC NO.40759，菌株号为A21E。
在一些实施例中，所述生木霉菌的ITS序列如SEQ ID NO:5所示。
一种用于提高金线莲生长量与金线莲苷含量的菌剂，所述的金线莲木霉菌进行发酵、低温干燥获得菌剂。
一种上述的金线莲木霉菌的培养方法，将纯化后的金线莲木霉菌菌株接种于固体MS培养基，于27-29℃黑暗环境培养6-8d，菌丝体转入液体培养基发酵3-5d。
在一些实施例中，所述固体MS培养基的配方为：蔗糖20-30g·L-1、香蕉泥100-200g·L-1、琼脂粉6g·L-1，其余为蒸馏水，pH6.5-7.0。
在一些实施例中，所述液体培养基的配方为：蛋白胨3g·L-1、磷酸氢二钾1g·L-1、硫酸镁0.5g·L-1、氯化钾0.5g·L-1、硫酸亚铁0.01g·L-1、麦芽糖30g·L-1、其余为蒸馏水，pH为5.0。
一种金线莲木霉菌用于提高金线莲生长量与金线莲苷含量中的应用。
在一些实施例中，所述金线莲木霉菌以分生孢子的形态使用。
在一些实施例中，所述分生孢子的存在形式为悬浮液或干粉。
在一些实施例中，其特征在于，所述金线莲木霉菌的分生孢子的悬浮液的使用浓度为5×105～5×107孢子·mL-1。
本发明的有益效果是：
本发明的木霉菌具有促进金线莲生长及提高金线莲苷含量的作用。喷施金线莲木霉菌孢子液可使金线莲植株在6个月的生长期中生长量提高40-60％，叶面积提高60％，多糖含量提高89％，金线莲苷提高10-15％。
本发明的木霉菌分离于金线莲野生生境，产孢能力强，可于含有蔗糖与南瓜泥的偏酸性MS培养基培养并产生大量孢子。
本发明的金线莲木霉菌不会对金线莲产生明显的毒害作用，其孢子悬浮液可用于金线莲基质浇灌、搅拌与生长期喷施。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的金线莲木霉菌形态图。图1I是金线莲木霉菌正面菌落形态；图1J是是金线莲木霉菌背面菌落形态；图1K是金线莲木霉菌分生孢子梗与瓶梗形态；图1L是是金线莲木霉菌分生孢子形态。
图2为本发明实施例2提供的利用NCBI BLASTn比对获得相似序列，与已知木霉菌一并构建进化树图。
图3为本发明实施例3提供的施与金线莲木霉菌后植株促进生长效果图。图3c是施用A21E菌株孢子液并生长6个月的金线莲植株；图3d是未施用A21E菌株孢子液并生长6个月的金线莲植株。
图4为本发明实施例3提供的施与金线莲木霉菌后植株提高叶面积效果图。图4G是施用A21E菌株孢子液并生长6个月的金线莲全株叶片；图4H是未施用A21E菌株孢子液并生长6个月的金线莲全株叶片。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种金线莲木霉菌，该菌种保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.40759，菌株号为A21E。
在一些实施例中，所述的金线莲木霉菌的ITS序列如SEQ ID NO:5所示。
一种用于提高金线莲生长量与金线莲苷含量的菌剂，所述的金线莲木霉菌进行发酵、低温干燥获得菌剂。
一种上述的金线莲木霉菌的培养方法，将纯化后的金线莲木霉菌菌株接种于固体MS培养基，于27-29℃黑暗环境培养6-8d，菌丝体转入液体培养基发酵3-5d。
在一些实施例中，所述固体MS培养基的配方为：蔗糖20-30g·L-1、香蕉泥100-200g·L-1、琼脂粉6g·L-1，其余为蒸馏水，pH6.5-7.0。
在一些实施例中，所述液体培养基的配方为：蛋白胨3g·L-1、磷酸氢二钾1g·L-1、硫酸镁0.5g·L-1、氯化钾0.5g·L-1、硫酸亚铁0.01g·L-1、麦芽糖30g·L-1、其余为蒸馏水，pH为5.0。
一种所述的金线莲木霉菌用于提高金线莲生长量与金线莲苷含量中的应用。
在一些实施例中，所述金线莲木霉菌以分生孢子的形态使用。
在一些实施例中，所述分生孢子的存在形式为悬浮液或干粉。
在一些实施例中，所述金线莲木霉菌的分生孢子的悬浮液的使用浓度为5×105～5×107孢子·mL-1。
实施例1
将生长6个月的金线莲‘红霞’(A.roxbrghii'Hong xia')组培苗种植于福建龙岩上杭旧县镇具有野生金线莲生长的海拔为600m左右竹林下环境，仿野生种植12个月后，采收生长健壮的植株于无菌袋内用于4℃保存备用。
金线莲植株于超净台酒精浸泡30s，0.1％升汞消毒10min，无菌水清洗2-3次，无菌条件下切成2cm左右茎段接种于PDA培养基，置于25℃，黑暗条件培养4d后，挑取不同形态菌落边缘少许菌丝至PDA培养基进行2-3次分离纯化培养，获得不同类型纯化菌株，命名为A21E菌株。
实施例2
于无菌环境下，利用接种针挑取生长5-7d的木霉菌(实施例1分离的)菌落边缘菌丝于新PDA平板培养基进行2-3次纯化培养，纯化后的金线莲木霉菌菌株接种含有20g·L-1蔗糖、100g·L-1南瓜泥、6g·L-1琼脂粉、pH6.0的固体PDA培养基平板，置于25℃，黑暗条件培养，每日观察并记录菌落形特征并利用显微镜(Olympus BX53)40倍物镜下观察木霉菌菌丝、分生孢子梗及孢子形态。如图1所示。
金线莲木霉菌菌株在PDA培养基生长迅速，3d可布满70mm培养皿，由图1I所示，菌落为羊毛毡状，菌落正面初期为黄白色，最终变成浅绿色。由图1J所示，菌落背面为黄白色，呈现放射状。由图1K所示，显微镜下可见金线莲木霉菌的分生孢子梗从菌丝侧枝长出，较多分枝，瓶茎呈瓶梗状，由图1L所示，其分生孢子光滑，呈圆或椭圆形。
实施例3
利用CTAB法提取实施例1的纯化菌株DNA。利用真菌通用rDNA ITS(internaltranscribed sapcer)引物ITS1(5′-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)(SEQ ID NO:1)及ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)(SEQ ID NO:2)扩增ITS序列，利用rpb2引物rpb2-5f(5′-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3′)(SEQ ID NO:3)及rpb2-7cr(5′-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3′)(SEQ ID NO:4)扩增rpb2序列。20μL PCR反应体系为：2×Taq MIX 10μL，上下游10μmol·L-1引物各1μL，模板DNA1μL，双蒸水补至20μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；95℃变性30s，依照引物温度退火30s，72℃延伸40s，设40个循环；72℃延伸6min。1％琼脂糖电泳，回收500bp左右ITS序列条带，1100bp左右rpb2序列条带，送铂尚生物技术有限公司测序。根据NCBIGenBank数据库比对测序结果，选取同源性高及已知木霉菌的ITS与rpb2序列为建树对象，利用MEGA 1软件采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建进化树。
测序结果显示，A21E菌株与T.longifialidicum LESF552聚在一个分支，一致性达98.28％。
结合外观性状与分子鉴定结果，将A21E菌株鉴定为木霉(Trichodema sp.)。
将该菌株保藏，保存日期为2023年08月21日，菌株号为A21E，保藏编号为：CGMCCNO.40759。分类命名为：木霉(Trichodema sp.)，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
A21E ITS序列如下：
GGGGGTTCGTAGCATCACTCCCAACCCATGTGACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGAATCAACCAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCTTCCTTCACGGGGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAG TTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAGCGGAGGAA(SEQ IDNO:5)。
A21Erpb2序列如下：
ACTGGGGGTGATCAGAAGAAAGACCATGAGCTCAACTGCAGGTGTGTCCCAGGTGCTTAACCCGTTACACATTTGCTTCGACTCTGTCACATTTGCGTCGTACCAACACTCCATTGGAAGAGATGGTAAGCTGGCGAAGCCCCGACAGCTTCACAACACGCATTGGGGTTTGGTCTGCCCAGCCGAGACACCTGAGGGACAGGCTTGTGGTCTAGTCAAAAACTTGTCTTTGATGTGTTACGTCAGTGTCGGCTCTCCTTCCGAACCTCTGATTGAGTTCATGATCAACAGAGGTATGGAAGTCGTCGAAGAGTACGAGCCGCTGCGTTATCCTCATGCTACAAAGATTTTTGTGAACGGTGTCTGGGTTGGAGTTCACCAAGACCCTAAGCACTTGGTGAACCAGGTTCTGGACACTCGTCGCAAGTCCTATCTGCAGTACGAAGTCTCTCTCGTGAGAGAAATTCGAGACCAGGAGTTCAAGATCTTTTCTGATGCAGGTCGTGTCATGCGACCTGTCTTCACTGTTCAGCAGGAAGATGACCCGGAAACAGGCATCAACAAGGGCCACCTTGTATTGACCAAGGAGCTCGTCAATAGACTGGCCAAGGAGCAGGCTGAACCTCCGGAAGATCCCAGCATGAAGATCGGATGGGAGGGATTAATCAGAGCCGGTGCGGTTGAATATCTCGACGCCGAGGAAGAGGAGACGTCCATGATCTGCATGACGCCAGAGGATCTCGAGCTGTATCGTCTTCAGAAGGCTGGTATTTCCACTGATGAAGACATGGGAGATGATCCGAACAAGCGACTAAAGACAAAGACAAACCCGACAACTCACATGTACACCCATTGCGAGATTCACCCAAGTATGATCTTAGGTATCTGTGCTAGTATCATTCCTTTCCCCGATCACAACCAGGTATGTCGTCCACCCTTCCAGTCTTATTAACAAAGAAAATACTAATGGTGTGTATATGCCCCGAATTAGCGTGGGTAA(SEQ ID NO:6)。
实施例4
木霉菌促生作用分析与品质测定
一种上述的木霉菌的培养方法，包括以下步骤：
S1，将纯化后的金线莲木霉菌菌株接种于固体MS培养基平板上，于28℃黑暗环境培养7d；无菌水清洗制备浓度为1×109孢子·mL-1的孢子悬浮母液，所述固体MS培养基的配方为：蔗糖20-30g·L-1、香蕉泥100-200g·L-1、琼脂粉6g·L-1，其余为蒸馏水，pH6.5-7.0。
S2，取所述孢子悬浮母液接种于液体培养基，接种量为每升液体培养基5ml所述孢子悬浮母液，于28℃，120rpm摇床培养5d，得发酵液；所述液体培养基的配方为：蛋白胨3g·L-1、磷酸氢二钾1g·L-1、硫酸镁0.5g·L-1、氯化钾0.5g·L-1、硫酸亚铁0.01g·L-1、麦芽糖30g·L-1、其余为蒸馏水，pH为5.0。
利用血小板计数法计算产孢量。孢子数计算公式为，孢子数·mL-1＝每小格孢子平均数×400×10000×10。计得培养每mL液体培养基可产孢子数为5.7×109孢子·mL-1。
以草炭土：细砂比例为3：1的混合土为基质，选择生长6个月金线莲组培苗移栽于直径为8cm营养杯，置于28℃、14h·d-1光周期、40μmol·m-2·s-1光照强度条件培养，每15d喷施1次A21B-1和A21E发酵液(5×106孢子·mL-1)，种植6个月后收集并统计植株生长量及SPAD值。SPAD值采用柯尼卡-美能达SPAD-502Plus仪进行测定。试验以5株为1个处理，每个处理设置3个重复。
其中，菌株A21 B-1的保藏日期为2022年12月26日，保藏编号为：CGMCC NO.40450。分类命名为：木霉(Trichodema sp.)，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。
分别采用苯酚-硫酸法与NaNO2-Al(NO3)3-NAOH显色法于赛默飞Tecan M200pro酶标仪进行测定金线莲多糖及黄酮含量。采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)于Waters e2695 alliance高效液相色谱仪进行测定金线莲苷含量。试验以以5株为1个处理，每个处理设置3个重复。
如图3、4所示，在促进生长方面，施用木霉菌的金线莲均在单株重、株高、茎粗、叶面积及SPAD值方面较CK显著提高。其中，在单株重方面，2株木霉菌株分别较对照提高2.5％和58.6％；株高分别提高25.9％和38.2％；叶面积分别提高7.4％和66.8％。综合以上结果，2种木霉菌A21 E与A21 B-1均具有较强的促进生长作用。
如表1所示，在提高药用成分方面，2种木霉菌在提高干物质含量、多糖及金线苷含量方面均有较为显著的作用，特别是A21E，其多糖及金线苷含量均较对照提高89.6％与11.8％，在2种木霉菌中较好。
表1木霉菌对金线莲促生效果
实施例5
A21E木霉菌株的生长特性鉴定
pH对木霉菌菌丝生长和产孢的影响
以lmol·L-1NaOH和1mol·L-1HCl将PDA培养基的pH分别调整为4、5、6、7、8后，将直径为5mm的木霉菌饼接种于不同pH的液体基础培养基(硫酸胺3g；磷酸氢二钾1g；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g；氯化钾0.5g；硫酸亚铁0.01g；葡萄糖30g；蒸馏水1000mL)，pH7.0，25℃培养，每个处理重复3次，7d后计算菌丝直径和孢子量。
温度对木霉菌菌丝生长和产孢的影响
将直径为5mm的木霉菌饼接种于PDA液体培养基，分别置于10、15、20、25及30℃恒温培养，每个处理重复3次，培养7d后统计孢子量。实验结果如表3所示。
碳源对木霉菌菌丝生长和产孢的影响
以等质量的葡萄糖、木糖、麦芽糖、果糖置换基础培养基中的蔗糖。将直径为5mm的木霉菌饼接种于不同碳源的液体培养基，每个处理重复3次，25℃培养，培养7d后统计孢子量。实验结果如表4所示。
氮源对木霉菌菌丝生长和产孢的影响
以等质量的牛肉膏、蛋白胨、尿素置换基础培养基中的硫酸胺。将直径为5mm的木霉菌饼接种于不同氮源的基础培养基平板上，每个处理重复3次，25℃培养，培养30h后采用十字交叉法测量菌落直径，培养7d后统计孢子量。实验结果如表5所示。
结果显示，最适宜A21E木霉菌株孢子生长培养基的pH值为5.0、培养温度为30℃、最适碳源为麦芽糖、最适氮源为牛肉膏。
综合上述结果，适宜A21E木霉菌株孢子生长培养条件为：以牛肉膏3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、麦芽糖30g、蒸馏水1000mL配置培养基，pH调整为5.0，于30℃条件进行培养。
表2培养基pH值对A21E木霉菌株孢子产量的影响
表3培养温度对A21E木霉菌株孢子产量的影响
表4培养基碳源对A21E木霉菌株孢子产量的影响
表5培养基氮源对A21E木霉菌株孢子产量的影响
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种金线莲木霉菌，其特征在于，其保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.40759，菌株号为A21E。
2.根据权利要求1所述的金线莲木霉菌，其特征在于，其ITS序列如SEQ ID NO:5所示。
3.一种用于提高金线莲生长量与金线莲苷含量的菌剂，其特征在于，将如权利要求1所述的金线莲木霉菌进行发酵、低温干燥获得菌剂。
4.一种权利要求1或2所述的金线莲木霉菌的培养方法，其特征在于，将纯化后的金线莲木霉菌菌株接种于固体MS培养基，于27-29℃黑暗环境培养6-8d，菌丝体转入液体培养基发酵3-5d。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述固体MS培养基的配方为：蔗糖20-30g·L-1、香蕉泥100-200g·L-1、琼脂粉6g·L-1，其余为蒸馏水，pH6.5-7.0。
6.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基的配方为：蛋白胨3g·L-1、磷酸氢二钾1g·L-1、硫酸镁0.5g·L-1、氯化钾0.5g·L-1、硫酸亚铁0.01g·L-1、麦芽糖30g·L-1、其余为蒸馏水，pH为5.0。
7.根据权利要求1或2所述的金线莲木霉菌用于提高金线莲生长量与金线莲苷含量中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述金线莲木霉菌以分生孢子的形态使用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述分生孢子的存在形式为悬浮液或干粉。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述金线莲木霉菌的分生孢子的悬浮液的使用浓度为5×105～5×107孢子·mL-1。
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