CN117771436A - 一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种注射用再生丝素蛋白‑透明质酸钠凝胶及其制备方法。所述凝胶由再生丝素蛋白1.5～10份、透明质酸钠1～3份和交联剂0.9～2.5份交联而成。本发明制备的注射用交再生丝素蛋白‑透明质酸钠凝胶具有弹性模量高、生物相容性好、通针性好、体内降解周期长的优势。特别地，凝胶中的再生丝素蛋白还可以刺激组织的纤维细胞和胶原蛋白再生，延长了填充剂的效果维持时间，是一种具有创新性的组织再生医疗美容填充材料。

Description

一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及医疗美容技术领域，具体涉及一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶及其制备方法。

背景技术

随着近年来医疗美容行业的快速发展，可注射软组织填充材料越来越受到广泛关注。通过注射软组织填充材料可以实现丰颊、改善法令纹、饱满下颚、紧致下巴轮廓、隆鼻等面部美容功效。目前，医疗美容行业最常使用的软组织填充材料交联透明质酸钠凝胶具有较好的即刻填充、塑形效果，但是由于透明质酸钠在组织环境中降解速度较快，同时，单一性状的凝胶材料本身硬度较低，不具备刺激组织自身细胞生长和胶原蛋白生成的组织再生功能，导致患者通常每6个月左右就需要进行重复注射，大大增加了患者的治疗费用和不良感受。

丝素蛋白是蚕丝的主要组成部分，它是一种天然的高分子嵌段共聚物，由18种氨基酸组成，主要包括非活性的甘氨酸(43％)、丙氨酸(30％)，以及活性氨基酸：丝氨酸(12.1％)、络氨酸(5.3％)、苏氨酸(0.9％)、谷氨酸(0.6％)、天冬氨酸(0.5％)、赖氨酸(0.2％)，其中活性氨基酸可用于化学交联改性，为功能性丝素蛋白材料的广泛应用提供了可能。再生丝素蛋白自1993年被美国食品和药物管理局(FDA)批准为生物材料以来，由于其出色的机械性能，良好的生物相容性，生物降解性以及结构调整的多功能性而被广泛应用于生物医药和组织工程领域。再生丝素蛋白可以被加工成溶液、丝膜、微球/微粒、水凝胶、支架和电纺膜等具有不同结构的材料，应用于创伤修复、药物载体、组织填充和人造器官等领域。

近年来，已上市的再生丝素蛋白产品包括艾尔健公司开发的SERI外科支架，用于腹壁重建和整形外科。美国Sofregen公司开发了一种SilkVoice天然蚕丝蛋白注射剂，用于治疗声带介质化和声带功能不全。苏州苏豪生物材料公司开发了一种再生丝素蛋白的创面敷料，用于烫伤及烧伤创面的愈合修复。浙江星月生物科技公司开发了丝素蛋白膜状敷料和丝素蛋白水凝胶敷料，分别用于供皮区覆盖和激光术后非慢性创面的覆盖及护理。除了已上市的产品，亦有部分公司的产品开展了临床试验，包括用于韧带重建的再生丝素蛋白绷带，用于股骨沟疝的再生丝素蛋白组织网片，口腔手术用再生丝素蛋白缝合线，半月板软骨修复的再生丝素蛋白多孔组织再生支架等。目前，将再生丝素蛋白制备成面部整形填充产品尚属空白。

丝素蛋白水凝胶是再生丝素蛋白材料的一种重要形式，它因具有特殊的三维交联结构表现出了优异的可透性，可用于药物缓释载体、填充材料、细胞培养支架及组织工程支架等方面而广受关注。通过物理方法交联制备的再生丝素蛋白凝胶存在弹性强度低、对热及辐照不稳定易出现胶水分离等问题；通过化学方法交联制备的再生丝素蛋白凝胶存在溶胀度低、对热和辐照不稳定易二次交联等问题，以及缺乏可注射的快速降解体内错位凝胶的酶。因此，采用单纯丝素蛋白交联制备的凝胶存在临床应用、生产工艺选择及生产成本控制等多方面的局限性。

综上丝素蛋白凝胶存在的问题，本研究在采用化学交联发的基础上引入透明质酸钠与再生丝素蛋白凝胶进行交联制备成复合凝胶。该复合凝胶避免了两种材料单独交联的缺陷，其溶胀度适中、弹性模量高、通针性好、对热和辐照稳定，并可以通过注射透明质酸钠酶快速降解错位凝胶，具有临床应用范围广、生产工艺选择多元化、生产成本可控等诸多优势。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶及其制备方法。

本发明的技术方案如下：一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，所述凝胶由再生丝素蛋白1.5～10份，透明质酸钠1～3份，交联剂0.9～2.5份在催化剂的作用下交联而成；其中再生丝素蛋白与透明质酸钠的质量比为＝2：1～6:1所述凝胶按如下步骤制备：

1)将催化剂加入至纯化水中搅拌溶解、定溶，将再生丝素蛋白加入至催化剂溶液中搅拌溶解，接着将透明质酸钠加入至再生丝素蛋白-催化剂溶液中搅拌溶解，随后加入交联剂搅拌均匀，进行交联反应；

2)交联结束后的初凝胶捣成小块后采用磷酸盐缓冲液进行洗涤溶胀，进行第一次过筛破碎，整粒后继续洗涤、溶胀、离心去除催化剂和游离交联剂，再进行第二次过筛破碎制备成凝胶颗粒；

3)加入磷酸盐缓冲液复配后，预充针注射器灌装并终端灭菌，制备成可注射的软组织再生填充剂。

在一些实施方案中，所述再生丝素蛋白的分子量在10KDa至300KDa，优选20KDa至200KDa；所述透明质酸钠的分子量在300KDa至1200KDa，优选600KDa至900KDa。

在一些实施方案中，所述再生丝素蛋白与透明质酸钠的质量比为＝3：1～6:1，优选为3:1～4:1。

在一些实施方案中，所述交联剂为乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、二缩水甘油醚或二乙烯砜中的一种或一种以上，优选为1,4-丁二醇二缩水甘油醚；所述交联剂投入量为再生丝素蛋白和透明质酸钠总量的1/3～1/10，优选为1/4～1/6。

在一些实施方案中，所述催化剂为溴化锂、氯化钙、氢氧化锂、氢氧化钠中的一种或一种以上，优选溴化锂。

在一些实施方案中，所述步骤1)中催化剂的浓度为9～15M，优选为12M；再生丝素蛋白的浓度为2％～15％(w/v)，优选10％～15％(w/v)；透明质酸钠的浓度为1％～10％(w/v)，优选2％～5％(w/v)。

在一些实施方案中，所述步骤1)中交联反应温度为18～35℃，优选22～28℃；交联反应时间为36～72h，优选44～52h。

在一些实施方案中，所述步骤2)、3)中磷酸盐缓冲液pH为7.0～7.6，优选7.2～7.4；磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M。

在一些实施方案中，所述步骤2)中第一次过筛破碎的筛网孔径为4mm；第二次过筛破碎的筛网孔径为200～300μm。

在一些实施方案中，所述步骤2)中第一次过筛破碎前洗涤溶胀2次；第二次过筛破碎前洗涤溶胀6～8次；每次洗涤溶胀时间为30～45min。

在一些实施方案中，所述步骤3)中复配用磷酸盐缓冲液的加入量为凝胶颗粒重量的20％～40％。

在一些实施方案中，所述步骤3)中终端灭菌选用湿热灭菌或辐照灭菌。

本发明提供了注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶在制备软组织填充材料中的应用；优选地，所述软组织填充材料为组织再生医疗美容填充材料。

本发明的有益效果：1)本发明与传统透明质酸钠自交联凝胶相比，再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶的体外酶降解时间明显延长，在同等酶处理条件、相同作用时间点下，再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶的剩余质量明显大于单纯交联透明质酸钠凝胶的；并且再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶的弹性模量强度也明显高于单纯交联透明质酸钠凝胶。由此可见，再生丝素蛋白与透明质酸钠复合交联，能够有效延长凝胶的降解时间，增强其在体内的作用效果，提高了材料的有效性；同时还通过提高凝胶的弹性模量强度拓宽了材料的应用范围。

2)本发明与单纯再生丝素蛋白化学相比，HA的加入增加了凝胶的吸水与锁水能力，避免了再生丝素蛋白在高温或辐照下的二次交联，提高了凝胶的润滑性和通针效果；本发明与单纯再生丝素蛋白物理交联相比，HA的加入以及化学交联的选用，明显提高了凝胶的弹性模量强度以及延长了凝胶的体外降解时间。

3)本发明与现有的丝素蛋白-透明质酸钠复合凝胶相比，本发明将丝素蛋白与透明质酸钠原料直接溶于催化剂溶液中进行交联反应，并且未对透明质酸钠进行改性处理，操作更加简单可控，还可避免凝胶在安全性方面的隐患；此外，本发明通过调整丝素蛋白与透明质酸钠的加入比例可获得从弱到强不同弹性模量的凝胶，该材料的应用前景广泛。本发明制备的注射用交再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶具有弹性模量高、生物相容性好、通针性好、体内降解周期长的优势。特别地，凝胶中的再生丝素蛋白还可以刺激组织的纤维细胞和胶原蛋白再生，延长了填充剂的效果维持时间。

附图说明

图1对比实施例1再生丝素蛋白凝胶湿热灭菌样品照片

图2对比实施例1再生丝素蛋白凝胶辐照灭菌样品照片

图3对比实施例2再生丝素蛋白凝胶粘弹性检测结果

图4对比实施例2再生丝素蛋白凝胶剪切粘度检测结果

图5对比实施例3丝素蛋白透明质酸复合凝胶粘弹性检测结果

图6对比实施例3丝素蛋白透明质酸复合凝胶剪切粘度检测结果

图7实施例1再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶灭菌后样品照片

图8实施例1再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶粘弹性检测结果

图9实施例1再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶剪切粘度检测结果

图10实施例1再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶粒径检测结果

图11实施例1再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶红外光谱图

图12实施例2再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶粘弹性检测结果

图13实施例2再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶粒径检测结果

图14实施例3再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶粘弹性检测结果

图15实施例4再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶粘弹性检测结果

图16实施例5再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶粘弹性检测结果

图17实施例6再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶粘弹性检测结果

图18实施例1再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶体外酶解结果

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业的本领域技术人员更全面地理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

对比实施例1(化学交联)

一种注射用再生丝素蛋白凝胶制备方法：该制备方法包括以下步骤：

a)称取再生丝素蛋白60g，加入至600ml 12M溴化锂溶液中搅拌溶解，再加入6mlBDDE搅拌均匀，于25℃交联48h。

b)凝胶捣成小块后，采用6L纯化水搅洗2次，每次30min，接着过4mm筛网整粒破碎。整粒后凝胶先用6L纯化水搅洗2次，每次30min；再用6L乙醇溶液搅洗30min；最后用6L纯化水搅洗3次，每次30min。过滤收集凝胶并在离心机中离心除去多余的水分，接着过106μm筛网2次获得凝胶颗粒。

c)凝胶颗粒加入凝胶重量30％的纯化水；再加入凝胶、纯化水总重5％的甘露醇复配，搅拌均匀后采用1ml预充针注射器灌装，121℃下12min湿热灭菌或15KGY辐照灭菌。

图1展示了本对比实施例制备的再生丝素蛋白凝胶经121℃湿热灭菌12min后的图片。由图1可知，再生丝素蛋白凝胶经湿热灭菌后发生胶水分离。

图2展示了本对比实施例制备的再生丝素蛋白凝胶经15KGY辐照灭菌后的图片。由图2可知，再生丝素蛋白凝胶经辐照灭菌后发生胶水分离，且预灌封注射器颜色发生改变。

对比实施例2(物理交联)

一种注射用再生丝素蛋白凝胶制备方法：该制备方法包括以下步骤：

a)称取再生丝素蛋白30g，加入至600ml注射水中搅拌溶解，再加入6g油酸钠搅拌溶解完全。

b)上述溶液过滤除去不溶性颗粒，再过滤除菌得中间体溶液。

c)中间体溶液在无菌条件下采用1mL预灌封注射器灌装。

d)灌装后样品在37℃下孵化48h，得到再生丝素蛋白凝胶。

图3展示了本对比实施例中制备的再生丝素蛋白凝胶，在25士0.2℃，采用流变仪在剪切速率从0.1Hz～100Hz下，选行频率扫描绘制黏性模量G”、弹性模量G'和损耗因子tan(δ)与频率f的坐标图。由图3可知，在剪切速率从0.1Hz下，弹性模量G'：277.4Pa，黏性模量G”：44.5Pa，结果显示单纯物理交联制备再生丝素蛋白凝胶的粘弹性相对较差。

图4展示了本对比实施例中制备的再生丝素蛋白凝胶，在(25士0.2)℃，采用流变仪在剪切速率：0.001s^-1～1000s^-1进行蠕动扫描，分别绘制剪切应力、粘度η与剪切速率的坐标图。由图4可知，在剪切速率：0.001s^-1～1000s^-1下，剪切粘度≥300mPa·s。

对比实施例3(CN102836465B专利处方工艺)

按照专利CN102836465B实施例3的方法制备丝素蛋白透明质酸复合凝胶，具体步骤如下：

a)丝素蛋白微球的制备：40g桑蚕蚕丝加入到2700ml质量浓度0.2％的碳酸钠水溶液中，96～100℃水浴60min，过滤，取滤饼重复水浴3次，取最后一次过滤的滤饼在60℃烘干后用9mol/L的溴化锂水溶液200ml缓慢溶解，在60℃水浴6h，然后8000rpm离心5min，取上清，将离心处理后的上清液装入透析袋(MW8,000～14,000)，以纯化水为透析液，磁力搅拌透析三天，取截留液，并用纯化水配制成质量浓度为5％的丝素蛋白溶液。

在25℃条件下，取上述5％丝素蛋白溶液5g静置形成白色凝胶材料，将凝胶材料用均质机在24000rpm/min条件下均质5min后，得到直径大小不同的丝素蛋白凝胶颗粒5g，过滤，收集过200目筛的丝素蛋白颗粒，称取少量收集的丝素蛋白颗粒干燥至恒重确定丝素蛋白颗粒的含水量，丝素蛋白颗粒质量浓度约为3.3％。

b)丝素蛋白透明质酸复合凝胶制备：将0.7g透明质酸钠溶解在7ml质量浓度1％氢氧化钠溶液中制成0.1g/ml的透明质酸钠溶液，并向透明质酸钠溶液中加入2.12g(0.07/0.033＝2.12g)丝素蛋白颗粒，充分混合后加入56μl的BDDE，混合均匀后，置于40℃条件下静置5小时进行交联，形成丝素蛋白透明质酸复合凝胶材料。

将上述丝素蛋白-HA复合凝胶材料加入到MW8,000-14,000的透析袋中，以pH值为7.4的PBS缓冲液为透析液，在磁力搅拌下进行透析处理，将透析处理后的复合凝胶材料用均质机在24000rpm/min条件下均质10min后，置于注射器内挤压使凝胶通过60目筛，收集复合凝胶颗粒，120℃高温高压蒸汽灭菌15min后，进行无菌分装，装入一次性注射器中。即得到注射用的丝素蛋白透明质酸复合凝胶35g，可用作皮下注射产品。

图5展示了本对比实施例中制备的再生丝素蛋白凝胶成品，在25士0.2℃，采用流变仪在剪切速率从0.1Hz～100Hz下，选行频率扫描绘制黏性模量G”、弹性模量G'和损耗因子tan(δ)与频率f的坐标图。由图5可知，在剪切速率从0.1Hz下，弹性模量G'：171.65Pa，黏性模量G”：26.98Pa，结果显示丝素蛋白凝胶微球和透明质酸钠交联制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶的粘弹性差。

图6展示了本对比实施例中制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶，在(25士0.2)℃，采用流变仪在剪切速率：0.001s^-1～1000s^-1进行蠕动扫描，分别绘制剪切应力、粘度η与剪切速率的坐标图。由图6可知，在剪切速率：0.001s^-1～1000s^-1下，剪切粘度≥180mPa·s。

实施例1(SF：HA＝3：1、SF浓度10％)

一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶制备方法，该制备方法包括如下步骤：

a)称取再生丝素蛋白60g，加入至600ml 12M溴化锂溶液中搅拌溶解，接着加入20g透明质酸钠搅拌溶解，再加入16ml BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)搅拌均匀，于25℃交联48h。

b)凝胶捣成小块后，采用6LPBS溶液(pH7.2-7.4)搅洗2次，每次30min；而后过4mm筛网整粒破碎，整粒后凝胶再用6L PBS溶液搅洗6次，每次30min，最后三次搅洗后离心除去游离的溴化锂和BDDE；收集到的离心后凝胶过200μm筛网2次获得凝胶颗粒。

c)凝胶颗粒加入凝胶重量40％的PBS溶液复配，搅拌均匀后采用1ml预充针注射器灌装，121℃下12min湿热灭菌。

取1支凝胶样品，选用25G针按照YY/T 0962-2021中6.4方法检测，平均推挤力：7.70N、最大推挤力：10.35N、最小推挤力：6.24N。取1.0g凝胶，按YY/T 0962-2021《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中6.6方法检测，溶胀比为18.8。

取凝胶适量，按照YY/T 0962-2021中6.7方法测定，渗透压为318mOsmol/kg。取凝胶适量，按照YY/T 0962-2021中6.8方法测定，pH值为7.18。

取适量凝胶，加入透明质酸钠酶水解后，采用高效气相仪器检测交联剂BDDE残留，结果显示BDDE：未检出(限度为＜2.0μg/g)。

取凝胶适量，按照《中华人民共和国药典(四部)》(2020年版)0412电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定，锂离子残留为1.6μg/g(限度为＜220μg/g)。

取凝胶适量，按照《中华人民共和国药典(四部)》(2020年版)0513离子色谱法测定，溴离子残留为146μg/g(限度为＜2mg/g)。

图7展示了本实施例制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶经121℃湿热灭菌12min后的图片。由图7可知，再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶为白色至类白色凝胶，性状均一、无胶水分离。

图8展示了本实施例中制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶成品，在25士0.2℃，采用流变仪在剪切速率从0.1Hz～100Hz下，选行频率扫描绘制黏性模量G”、弹性模量G'和相位角δ与频率f的坐标图。由图8可知，在剪切速率从0.1Hz下，弹性模量G'：1187.5Pa，黏性模量G”：161.3Pa，结果显示再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶(3：1)成品有良好的粘弹性，相比于单纯物理交联丝素蛋白凝胶的粘弹性要强很多。

图9展示了本实施例中制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶成品，在(25士0.2)℃，采用流变仪在剪切速率：0.001s^-1～1000s^-1进行蠕动扫描，分别绘制剪切应力、粘度η与剪切速率的坐标图。由图9可知，在剪切速率：0.001s^-1～1000s^-1下，剪切粘度≥300mPa·s。

图10展示了本实施例中制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶成品的粒度图谱，由图10可知，本实施例制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶粒粒径分布均匀，d(0.5)为285.6μm、d(0.9)为548.4μm。

图11展示了本实施例中制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶成品的红外光谱图，由图11可知，本实施例制备凝胶的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)实测谱带在1700cm^-1～1600cm^-1，1590cm^-1～1460cm^-1，1450cm^-1～1400cm^-1，1350cm^-1～1300cm^-1，1280cm^-1～1190cm^-1，1000cm^-1～900cm^-1处存在特征峰。

实施例2(SF：HA＝3：1、SF浓度10％)

一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶制备方法，该制备方法包括如下步骤：

a)称取再生丝素蛋白60g，加入至600ml 12M溴化锂溶液中搅拌溶解，接着加入20g透明质酸钠搅拌溶解，再加入16ml BDDE搅拌均匀，于25℃交联48h。

b)凝胶捣成小块后，采用6LPBS溶液(pH7.2-7.4)搅洗2次，每次45min；而后过4mm筛网整粒破碎，整粒后凝胶再用6L PBS溶液搅洗5次，每次45min，最后三次搅洗后离心除去游离的溴化锂和BDDE；收集到的离心后凝胶过300μm筛网2次获得凝胶颗粒。

c)凝胶颗粒加入凝胶重量40％的PBS溶液复配，搅拌均匀后采用1ml预充针注射器灌装，121℃下12min湿热灭菌。

图12展示了本实施例中制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶成品，在25士0.2℃，采用流变仪在剪切速率从0.1Hz～100Hz下，选行频率扫描绘制黏性模量G”、弹性模量G'和损耗因子tan(δ)与频率f的坐标图。由图12可知，在剪切速率从0.1Hz下，弹性模量G'：2156Pa，黏性模量G”：277.9Pa，结果显示再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶(3：1)过300μm筛网制备成品的粘弹性良好，且其粘弹性强于过200μm筛网所制备的凝胶成品。

图13展示了本实施例中制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶成品的粒度图谱，由图13可知，本实施例制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶粒粒径分布均匀，d(0.5)为721.4μm、d(0.9)为1353.8μm。

实施例3(SF：HA＝6：1、SF浓度15％)

一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶制备方法，该制备方法包括如下步骤：

a)称取再生丝素蛋白90g，加入至600ml 12M溴化锂溶液中搅拌溶解，接着加入15g透明质酸钠搅拌溶解，再加入21ml BDDE搅拌均匀，于25℃交联48h。

b)凝胶捣成小块后，采用6LPBS溶液(pH7.2-7.4)搅洗2次，每次30min；而后过4mm筛网整粒破碎，整粒后凝胶再用6L PBS溶液搅洗6次，每次30min，最后三次搅洗后离心除去游离的溴化锂和BDDE；收集到的离心后凝胶过200μm筛网2次获得凝胶颗粒。

c)凝胶颗粒加入凝胶重量40％的PBS溶液复配，搅拌均匀后采用1ml预充针注射器灌装，121℃下12min湿热灭菌。

图14展示了本实施例中制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶成品，在25士0.2℃，采用流变仪在剪切速率从0.1Hz～100Hz下，选行频率扫描绘制黏性模量G”、弹性模量G'与频率f的坐标图。由图14可知，在剪切速率从0.1Hz下，弹性模量G'：2972.8Pa，黏性模量G”：236.4Pa，结果显示再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶(6：1)粘弹性良好，随着再生丝素蛋白加入量的增加成品粘弹性显著增加。

实施例4(SF：HA＝4：1、SF浓度10.7％)

一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶制备方法，该制备方法包括如下步骤：

a)称取再生丝素蛋白64g，加入至600ml 12M溴化锂溶液中搅拌溶解，接着加入16g透明质酸钠搅拌溶解，再加入16ml BDDE搅拌均匀，于25℃交联48h。

b)凝胶捣成小块后，采用6LPBS溶液(pH7.2-7.4)搅洗2次，每次30min；而后过4mm筛网整粒破碎，整粒后凝胶再用6L PBS溶液搅洗6次，每次30min，最后三次搅洗后离心除去游离的溴化锂和BDDE；收集到的离心后凝胶过200μm筛网2次获得凝胶颗粒。

c)凝胶颗粒加入凝胶重量40％的PBS溶液复配，搅拌均匀后采用1ml预充针注射器灌装，121℃下12min湿热灭菌。

图15展示了本实施例中制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶成品，在25士0.2℃，采用流变仪在剪切速率从0.1Hz～100Hz下，选行频率扫描绘制黏性模量G”、弹性模量G'与频率f的坐标图。由图15可知，在剪切速率从0.1Hz下，弹性模量G'：1916.8Pa，黏性模量G”：124.8Pa，结果显示再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶(4：1)粘弹性良好，随着再生丝素蛋白加入量的增加成品粘弹性显著增加。

实施例5(SF：HA＝2：1、SF浓度10％)

一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶制备方法，该制备方法包括如下步骤：

a)称取再生丝素蛋白60g，加入至600ml 12M溴化锂溶液中搅拌溶解，接着加入30g透明质酸钠搅拌溶解，再加入18ml BDDE搅拌均匀，于25℃交联48h。

b)凝胶捣成小块后，采用6LPBS溶液(pH7.2-7.4)搅洗2次，每次30min；而后过4mm筛网整粒破碎，整粒后凝胶再用6L PBS溶液搅洗6次，每次30min，最后三次搅洗后离心除去游离的溴化锂和BDDE；收集到的离心后凝胶过200μm筛网2次获得凝胶颗粒。

c)凝胶颗粒加入凝胶重量40％的PBS溶液复配，搅拌均匀后采用1ml预充针注射器灌装，121℃下12min湿热灭菌。

图16展示了本实施例中制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶成品，在25士0.2℃，采用流变仪在剪切速率从0.1Hz～100Hz下，选行频率扫描绘制黏性模量G”、弹性模量G'与频率f的坐标图。由图16可知，在剪切速率从0.1Hz下，弹性模量G'：588.2Pa，黏性模量G”：78.3Pa，结果显示再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶(2：1)粘弹性稍差，随着再生丝素蛋白加入量的减少成品粘弹性显著降低。

实施例6(SF：HA＝0.5：1、SF浓度2.5％)

一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶制备方法，该制备方法包括如下步骤：

d)称取再生丝素蛋白15g，加入至600ml 12M溴化锂溶液中搅拌溶解，接着加入30g透明质酸钠搅拌溶解，再加入9ml BDDE搅拌均匀，于25℃交联48h。

e)凝胶捣成小块后，采用6LPBS溶液(pH7.2-7.4)搅洗2次，每次30min；而后过4mm筛网整粒破碎，整粒后凝胶再用6L PBS溶液搅洗6次，每次30min，最后三次搅洗后离心除去游离的溴化锂和BDDE；收集到的离心后凝胶过200μm筛网2次获得凝胶颗粒。

f)凝胶颗粒加入凝胶重量40％的PBS溶液复配，搅拌均匀后采用1ml预充针注射器灌装，121℃下12min湿热灭菌。

图17展示了本实施例中制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶成品，在25士0.2℃，采用流变仪在剪切速率从0.1Hz～100Hz下，选行频率扫描绘制黏性模量G”、弹性模量G'与频率f的坐标图。由图17可知，在剪切速率从0.1Hz下，弹性模量G'：289.01Pa，黏性模量G”：47.49Pa，结果显示再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶(0.5：1)粘弹性差，随着再生丝素蛋白加入量的减少成品粘弹性显著降低。

实施例7(SF：HA＝10：1、SF浓度16.7％)

一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶制备方法，该制备方法包括如下步骤：

a)称取再生丝素蛋白100g，加入至600ml 12M溴化锂溶液中搅拌溶解，接着加入10g透明质酸钠搅拌溶解，再加入22ml BDDE搅拌均匀，于25℃交联48h。

b)凝胶捣成小块后，采用6LPBS溶液(pH7.2-7.4)搅洗2次，每次30min；而后过4mm筛网整粒破碎，整粒后凝胶再用6L PBS溶液搅洗6次，每次30min，最后三次搅洗后离心除去游离的溴化锂和BDDE；收集到的离心后凝胶过200μm筛网2次获得凝胶颗粒。

c)凝胶颗粒加入凝胶重量40％的PBS溶液复配，搅拌均匀后采用1ml预充针注射器灌装，121℃下12min湿热灭菌。

湿热灭菌后凝胶出现一定程度的二次交联，样品通针困难，在采用23G通针时出现阻塞，按照YY/T 0962-2021中6.4方法检测，最大推挤力＞60N。故该实施例制备的凝胶难以用于临床注射填充。

测试例1体外抗降解能力试验

取实施例1制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶和市售产品瑞蓝2号交联透明质酸钠凝胶，采用透明质酸钠酶在体外进行降解，通过观察不同时间点剩余凝胶的重量，从而判断复合凝胶及单纯交联透明质酸钠凝胶的体外抗酶解能力。

具体实施方案如下：

a)透明质酸酶溶液(1500单位/ml)配制(临用现配)

精密称取20mg透明质酸酶(1500单位/mg)至20ml量瓶中，用0.9％氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，得浓度为(1500单位/ml)的透明质酸酶溶液。

b)样品准备

取16个离心管，分别标号1-1～1-7及2-1～2-7，分别精密称取5g再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶至1-1～1-7号离心管中，分别精密称取5g交联丝素蛋白钠凝胶至2-1～2-7号离心管中。将上述8个离心管置于离心机中离心3min(2500g),收集试管底部的所有凝胶(观察表层是否有液体，若有用吸管吸出即可)

c)酶解

分别在1-1、2-1号离心管中加入0.9％氯化钠溶液2ml作为0时样品，其余1-2～1-7及2-2～2-7号离心管各加入2ml透明质酸酶溶液(1500单位/ml)，轻轻摇动使透明质酸酶与凝胶充分接触，避免在离心管壁处产生凝胶，目视混合均匀后，将上述离心管全部置于37℃烘箱中。

d)取样称量

分别于1h，2h，3h，4h，6h，8h，依次于烘箱中取出离心管1-2～1-7及2-2～2-7号。加入6ml 0.9％氯化钠溶液，摇晃溶液混合内容物，并用0.22μm滤膜进行抽滤，抽滤瓶收集滤液，继续分次加入共计90ml 0.9％氯化钠溶液来洗涤离心管，取出滤饼称其重量。0时样品处理同上。

e)计算

以0时样品重记为100％，凝胶剩余量(％)＝不同时间点样品重/0时样品重×100％。结果如图18所示，可见再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶的体外抗酶降解能力明显优于单纯的交联透明质酸钠凝胶。

测试例2短期生物学试验

取实施例1制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，按照GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》规定的浸提液法(MTT法)进行，浸提介质为细胞培养液。结果显示该凝胶在MTT细胞毒性试验条件下无细胞毒性。

取实施例1制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，按照GB/T 16886.10-2017《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验》推荐的皮肤致敏试验(最大剂量法)的要求，对试验样品在试验条件下使豚鼠产生皮肤致敏反应的潜能做出评定。结果显示试验样品未引起皮肤致敏反应，阳性激发结果的发生率为0％。

取实施例1制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，按照GB/T 16886.10-2017《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验》》中推荐的皮内反应的要求对样品浸提液进行生物相容性试验。试验样品采用极性浸提液(0.9％氯化钠注射液)和非极性浸提液(棉籽油)浸提，所得浸提液通过皮内注射途径给予新西兰白化兔，对材料在试验条件下产生的刺激反应的潜能做出评定。结果显示试验样品极性浸提液皮内反应最终记分为0.00；非极性浸提液皮内反应最终记分为0.00，最终结果显示皮内反应良好。

取实施例1制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，按照GB/T 16886.11-2021《医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验》中推荐的方法进行试验。直接使用样品作为试验液，对小鼠进行皮下注射，结果显示试验样品对小鼠无急性全身毒性反应。

取实施例1制备的再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，按照GB/T 16886.11-2021《医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验》中推荐的方法进行试验。采用0.9％氯化钠注射液对试验样品进行浸提，取浸提上清液对新西兰兔进行耳缘静脉注射，结果显示试验样品胶的试验液热原检查符合规定，无材料致热作用。

Claims (10)

1.一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，所述凝胶由再生丝素蛋白1.5～10份，透明质酸钠1～3份，交联剂0.9～2.5份在催化剂的作用下交联而成；其中再生丝素蛋白与透明质酸钠的质量比为＝2：1～6:1；所述凝胶按如下步骤制备：

1)将催化剂加入至纯化水中搅拌溶解、定溶，将再生丝素蛋白加入至催化剂溶液中搅拌溶解，接着将透明质酸钠加入至再生丝素蛋白-催化剂溶液中搅拌溶解，随后加入交联剂搅拌均匀，进行交联反应；

2)交联结束后的初凝胶捣成小块后采用磷酸盐缓冲液进行洗涤溶胀，进行第一次过筛破碎，整粒后继续洗涤、溶胀、离心去除催化剂和游离交联剂，再进行第二次过筛破碎制备成凝胶颗粒；

3)加入磷酸盐缓冲液复配后，预充针注射器灌装并终端灭菌，制备成可注射的软组织再生填充剂。

2.根据权利要求1所述的注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述再生丝素蛋白的分子量在20KDa至200KDa；所述透明质酸钠的分子量600KDa至900KDa。

3.根据权利要求1所述的注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述再生丝素蛋白与透明质酸钠的质量比为＝3：1～6:1，优选为3:1～4:1。

4.根据权利要求1所述的注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述交联剂为乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、二缩水甘油醚或二乙烯砜中的一种或一种以上，优选为1,4-丁二醇二缩水甘油醚；所述交联剂投入量为再生丝素蛋白和透明质酸钠总量的1/3～1/10，优选为1/4～1/6；优选地，所述催化剂为溴化锂、氯化钙、氢氧化锂、氢氧化钠中的一种或一种以上，优选溴化锂。

5.根据权利要求1所述的注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述步骤1)中催化剂的浓度为12M；再生丝素蛋白的浓度为10％～15％(w/v)；透明质酸钠的浓度为2％～5％(w/v)；所述步骤1)中交联反应温度为22～28℃；交联反应时间为44～52h。

6.根据权利要求1所述的注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述步骤2)、3)中磷酸盐缓冲液pH为7.0～7.6，优选7.2～7.4；磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M。

7.根据权利要求1所述的注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述步骤2)中第一次过筛破碎的筛网孔径为4mm；第二次过筛破碎的筛网孔径为200～300μm；所述步骤2)中第一次过筛破碎前洗涤溶胀2次；第二次过筛破碎前洗涤溶胀6～8次；每次洗涤溶胀时间为30～45min。

8.根据权利要求1所述的注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述步骤3)中复配用磷酸盐缓冲液的加入量为凝胶颗粒重量的20％～40％。

9.根据权利要求1所述的注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶，其特征在于，所述步骤3)中终端灭菌选用湿热灭菌或辐照灭菌。

10.权利要求1所述的注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶在制备软组织填充材料中的应用；优选地，所述软组织填充材料为组织再生医疗美容填充材料。