CN117721028B - 一株葡萄汁有孢汉逊酵母菌株yn321及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食醋发酵技术领域，具体涉及一株适用于果醋发酵的葡萄汁有孢汉逊酵母YN321及其应用。菌株YN321是从枸杞鲜果中筛选出一株能提高果醋不挥发酸及香气物质乙偶姻、异丁酸、乙酸乙酯含量的非酿酒酵母菌，使用该菌株发酵果醋可丰富果醋中的香气物质，提高果醋的不挥发酸含量，从而提升果醋的风味与口感。所述葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）YN321已于2024年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29509。
Description
技术领域
本发明属于食醋发酵技术领域，具体涉及一株适用于果醋发酵的葡萄汁有孢汉逊酵母YN321及其应用。
背景技术
果醋是以水果或其加工下脚料为原材料，通过酒精发酵和醋酸发酵酿制而成的一种酸味调味品。果醋不仅能提供食醋的营养价值，还兼具果品自身的营养与芳香物质。
微生物在上述的发酵过程起到了关键作用，具体来讲是酵母菌与醋酸菌对果实中糖类物质的发酵作用促使含羧酸物质的生成。不挥发酸含量与微生物的发酵代谢活动密切相关，在果醋中其含量虽然较低，但却是构成果醋的重要风味物质之一，能对乙酸刺激性起到缓冲作用，使果醋酸味更加绵长和柔和。
酵母菌在食醋酿造中起主力发酵的作用。酿酒酵母以高糖发酵代谢和乙醇耐受性在酒精发酵阶段占主要优势，主要作用是将糖类物质在厌氧条件下转化为乙醇，并产生其他次级副产物；一些非酿酒酵母如产酯酵母可分泌酯酶，催化醇类与酸类物质反应生成特殊香气的酯类化合物，它们可以通过单独代谢或联合其他微生物相互作用影响食醋的香气成分，例如假丝酵母、复膜酵母和毕赤酵母代谢可产生醇、醛类等风味化合物，能够对醋的风味产生一定的贡献。因此，酵母在果醋发酵过程中是不可缺少的重要功能微生物。
葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）被认为有助于葡萄酒的花香味的积累，多应用于葡萄酒及白酒发酵中。例如：
中国发明专利申请202210429351.9（公开号CN114989995A；公开日：2022年9月2日）公开一株发酵葡萄酒产酒精能力较强的葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)HX17，该菌株发酵的葡萄酒香气馥郁，酯香味丰富并且能够产生一些特有的香味物质，如3-甲基-2-丁醇、2-十六醇、2-苯基乙酸乙酯、壬酸乙酯和甲酸庚酯等。中国发明专利申请201911406443.X（公开号CN110951631A；公开日：2020年4月3日）公开了一株保藏编号为CGMCC No.18666的葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)菌株A14，该菌株发酵白酒产香叶醇的能力高，发酵48h香叶醇的浓度可达63.48μg/L。中国发明专利申请202010265892.3（公开号CN111235307A；公开日：2020年6月5日）披露了一种用于发酵型红枣酒的包括葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)复合菌种，解决甲醇超标、残糖高、酸度高、风味单一等问题，并保持发酵型红枣酒产品丰富的营养价值。中国发明专利申请202110090851.X（公开号CN112746029A；公开日：2021年5月4日）提供了一株以葡萄汁为底物发酵产法呢醇、2-庚醇、正己醇、橙花醇等香气物质的葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）菌株QTX22。中国发明专利申请202110308104.9（公开号CN113061512A；公开日：2021年7月2日）提供了一种多菌种复合发酵蜂蜜醋的方法，该方法可提高蜂蜜醋的不挥发酸至12.89g/L。
而用于果醋中提高不挥发酸并同时提高乙偶姻、异丁酸、乙酸乙酯等香气物质含量的葡萄汁有孢汉逊酵母，本领域未见报道。
发明内容
为了丰富果醋的酸感，改善果醋的口感与风味，发明人从枸杞鲜果中筛选出一株能提高果醋不挥发酸及香气物质乙偶姻、异丁酸、乙酸乙酯含量的非酿酒酵母菌——葡萄汁有孢汉逊酵母YN321，使用该菌株发酵果醋可丰富果醋中的香气物质，提高果醋的不挥发酸含量，从而提升果醋的风味与口感。
本发明提供的技术方案之一，是一株葡萄汁有孢汉逊酵母，具体为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）YN321，该菌株已于2024年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No. 29509；
所述葡萄汁有孢汉逊酵母YN321具备如下特性：
（1）菌落形态为：圆形***、边缘整齐、表面光滑、湿润、呈不透明、乳脂状；
（2）耐受高糖压力：能耐受500g/L葡萄糖；
（3）耐受高醇压力：能耐受14%乙醇；
（4）耐受低pH压力：能耐受pH2.75；
（5）具有产苯甲醇、2,3-丁二酮、2,4-二叔丁基酚、戊酸、糠醛、茶香酮、薄荷醇等挥发性风味物质的性能；
（6）可提高果醋中乙偶姻、异丁酸、乙酸乙酯、苯乙醇、乙偶姻乙酸酯、己酸、2-乙酰基吡咯等挥发性风味物质的含量；
（7）可提高果醋中不挥发酸含量。
本发明提供的技术方案之二，是技术方案之一所述葡萄汁有孢汉逊酵母YN321的应用；
进一步地，是在食醋发酵中的应用，特别是在果醋发酵中的应用，更特别的是在枸杞果醋发酵中的应用；
进一步地，是在改善食醋风味或口感中的应用；特别是在改善果醋风味或口感中的应用；更特别的是在提高果醋中不挥发酸及挥发性风味物质含量中的应用。
本发明提供的技术方案之三，是一种果醋发酵方法，包括如下步骤：
S1.种子液制备：分别将酿酒酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母YN321、巴氏醋杆菌活化、制备种子培养液；
进一步地，所述酿酒酵母选自意大利英纳帝斯公司红佳酿（EnartisFerm VintageRed）；
进一步地，所述巴氏醋杆菌选自巴氏醋杆菌(Acetobacter Pasteurianus) CGMCCNo.3089；
S2.发酵原料制备：将水果榨汁，加入果胶酶酶解并用白砂糖或蔗糖调节糖度至15~20Brix；
进一步地，所述水果包括但不限于枸杞、橙子、葡萄、山楂等；优选枸杞；
进一步地，步骤S2所述酶解方法为：向果汁中加入0.35%~0.4%（w/w）果胶酶50~55℃酶解2~24h；
进一步地，酶解之后进行离心，和/或过滤，获得澄清的果汁再进一步调节糖度；
S3.酒精发酵：
（1）向步骤S2得到的水果汁中接入2%~3%（v/v）葡萄汁有孢汉逊酵母YN321种子培养液，28~30℃无氧条件培养2~3d；
（2）之后再接入3%~4%（v/v）酿酒酵母种子培养液，28~30℃无氧条件培养5~6d；发酵得到果酒发酵液；
S4.醋酸发酵：向S3得到的果酒中加入9.7%~10%（v/v）巴氏醋杆菌种子培养液，发酵得到果醋；
进一步地，于摇瓶中转速180~220r/min，30~32℃培养5~6d得到果醋；
进一步地，于发酵罐中持续通氧，通氧量为0.6~0.8L/min，转速为1500~2000rpm，30~32℃培养5~6d，得到果醋；
进一步地，步骤S1所述活化、制备种子培养液方法为：接种环挑取菌体接种于斜面培养基中，30℃培养1~2d；再将斜面培养基中的菌体接种至试管液体培养基中，30℃静置或摇床培养24h；取一代种子液按2%接种量接入种子液培养基中，30℃静置或摇床培养24h，得到种子培养液；
所述种子液培养基的制备方法为：向果汁中加入白砂糖或蔗糖调节糖度至15Brix，在115℃灭菌20min得到。
进一步地，步骤S4发酵所得果醋8000r/min离心澄清10min，纱布滤去菌泥得到成品。
与现有技术相比，本发明具有以下几个方面的有益效果：
（1）本发明葡萄汁有孢汉逊酵母YN321来源于枸杞鲜果，能耐受500g/L葡萄糖、14%乙醇、pH2.75。不仅适用于酒精发酵阶段与酿酒酵母协同作用，还适用于低酸度环境下协同醋酸菌进行醋酸发酵。
（2）本发明葡萄汁有孢汉逊酵母YN321发酵枸杞果醋，总酸可达74.3g/L，检测发现显著提高枸杞果醋不挥发酸含量43%，以及挥发性风味物质乙偶姻、异丁酸、乙酸乙酯的含量分别提高4倍、11倍、180倍，同时苯乙醇、乙偶姻乙酸酯、己酸、2-乙酰基吡咯含量也有所提升，并且发酵产生苯甲醇、2,3-丁二酮、2,4-二叔丁基酚、戊酸、糠醛、茶香酮、薄荷醇等挥发性香气物质。因此，菌株YN321可作为果醋发酵功能菌提升果醋风味与口感，使得果醋口感柔和，酸感丰满，醋香浓郁柔和不刺激，果香突出，香味宜人舒适。
（3）本发明葡萄汁有孢汉逊酵母YN321还可以应用于其他液态发酵醋的酿造，可以提高液态发酵醋中不挥发酸及乙偶姻、异丁酸、乙酸乙酯等物质的含量，提升液态发酵醋的风味与口感。
附图说明
图1为葡萄汁有孢汉逊酵母YN321平板菌落图；
图2为葡萄汁有孢汉逊酵母YN321电镜图；
图3为葡萄汁有孢汉逊酵母YN321***发育树；
图4为本发明葡萄汁有孢汉逊酵母YN321用于果醋发酵工艺流程图；
图5为本发明实施例中不同菌株发酵速率图。
本发明的葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）YN321，已于2024年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.29509。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方法进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
现参照下列意在举例说明本发明（而非限定本发明）的实施例来描述本发明。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规食品级试剂、方法和设备。
本发明葡萄汁有孢汉逊酵母YN321用于果醋发酵工艺流程如图4所示。
本发明实施例采用的菌株分别如下：
葡萄汁有孢汉逊酵母YN321，保藏编号CGMCC No.29509；
酿酒酵母选自意大利英纳帝斯公司红佳酿（EnartisFerm Vintage Red），官方网址：https://www.enartis.com/en/products/wine/yeast/enartisferm-vintage-red/；
巴氏醋杆菌选自巴氏醋杆菌(Acetobacter Pasteurianus) CGMCC No.3089。
除非特别说明，本发明实施例所用实验条件为本领域常规实验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1YN321菌株的分离筛选
菌株分离YPD培养基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物；
从枸杞鲜果表面和内生部分共分离得到10株酵母，6株来源于内生，4株来源于外表。具体分离步骤如下：
S1.枸杞鲜果内生酵母菌分离：
（1）枸杞鲜果预处理：利用无菌水冲洗掉植株表面的土壤和残屑，再用无菌水彻底冲洗植株，晾干待用。植物组织置于0.5%次氯酸钙溶液（或75%酒精溶液）中消毒0.5～1min, 然后在无菌水中漂洗3次，晾干后研磨使用。
（2）分离：取5g样品+45mL无菌水进行充分研磨；取1mL研磨液，缓慢注入装有9mL无菌水的试管内，得到10-2稀释液，以此类推。选取适当的稀释梯度涂布于加0.1%氨苄青霉素（抑制细菌生长）的YPD固体培养基平板上，30℃培养48h，待菌落长出后，挑取单菌落划线于YPD培养基平板中进行纯化，并保藏于４℃备用。
S2.枸杞鲜果外表酵母菌分离：
（1）枸杞鲜果预处理：采用表面取样法，在无菌操作下准确称取25g枸杞样品，放入装有225ml无菌生理盐水的三角烧瓶中，轻轻振荡8~15分钟。待用。
（2）分离：取1mL上述悬菌液，缓慢注入装有9mL无菌水的试管内进行梯度稀释，以此类推。选取适当的稀释梯度液涂布于加0.1%氨苄青霉素（抑制细菌生长）的YPD固体培养基平板上，30℃培养48h，待菌落长出后，挑取单菌落划线于YPD培养基平板中进行纯化，并保藏于４℃备用。
菌株初筛为了筛选出适合发酵的酵母菌株，对分离得到的酵母通过嗅闻法初步判断是否有酯香或醇香，筛选具有较浓酯香气或特殊果香气的菌株。具体操作如下：
将分离纯化获得的10株酵母菌接种于种子液培养基中，30℃活化培养 24 h 后，以 4.0 % 接种量接种于装有 200 mL 枸杞汁的三角瓶中，30℃培养 3~5 d，通过嗅闻判定具有较浓酯香气或特殊果香气的菌株；
所述种子液培养基具体为：将枸杞榨汁后过滤，向枸杞汁中加入白砂糖调节糖度至15Brix，在115℃灭菌20min得到。
通过分离纯化共获得纯种酵母10株。其中6株分离自枸杞鲜果内部，4株分离自枸杞鲜果外表。通过嗅闻法进一步接入枸杞汁发酵后筛选出5株果香和酒香味较浓的酵母菌，分别为YN321、YN127、YN123、YN121和YW121。
菌株复筛对初筛获得的5株酵母进一步进行耐受性及发酵速率的复筛，以期获得一株耐受性良好且发酵速率快的菌株，具体步骤如下：
S1.将初筛得到的5株菌株接种于不同葡萄糖浓度（100g/L、200g/L、300g/L、400g/L、500g/L）的YPD培养基中，30℃培养48h，观察菌株生长情况，如表1所示：
表1 不同酵母菌葡萄糖耐受实验结果
由表1可知，5株酵母在100g/L~300g/L的糖浓度下均生长良好，YN121、YW121可耐受至400g/L的糖浓度；YN321、YN127可耐受至500g/L的糖浓度，且生长旺盛；此外，YN123、YN121发酵葡萄糖产气能力较弱，YW121发酵葡萄糖不产气。
S2.将初筛获得的5株菌株接种于不同乙醇浓度（6%、8%、10%、12%、14%）的YPD培养基中，30℃培养48h，观察菌株生长情况，如表2所示：
表2 不同酵母菌乙醇耐受实验结果
由表2可知， 菌株YN127和YW121的乙醇耐受能力较其他3株略差，其余3株酵母菌均能不同程度的耐受6%~12%的乙醇浓度，其中菌株YN321能耐受乙醇至14%。
S3.将初筛获得的5株菌株接种于不同pH（2.5、2.75、3.0、3.5、4.0）的YPD培养基中，30℃培养48h，观察菌株生长情况，如表3所示：
表3 不同酵母菌pH耐受实验结果
在我国食用醋酿造过程包括酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段，整个过程中有机酸总量不断增加，其中，最主要的醋酸和乳酸的浓度分别能达到1％~7％和1％~6％，这使得整个体系处于酸性环境，因此，当酵母菌具有较强的耐酸性能时才能在醋酸发酵阶段发挥其协同作用。由表3可知，能耐受pH3.0及以下的菌株有YN321、YN123及YW121，其中菌株YN321、YW121的耐酸性能最强，可在pH2.75生长。
S4.进一步的将5株菌株分别接种于装有200mL枸杞汁的三角瓶中，30℃放置8d，每隔1d监测其CO2失重量，以评估发酵过程中酵母菌的发酵速率。检测结果如图5所示。
由图5可以看出，菌株YN321在发酵枸杞汁的过程中发酵速率最快，菌株YN127在前三天与菌株YN321的发酵速率不相上下，但从第四天之后YN321的发酵速率远远领先于YN127。
综上所述，结合菌株葡萄糖、乙醇、pH耐受性实验，以及发酵速率的实验结果，菌株YN321具有最佳的发酵枸杞果醋的性能，因此，将菌株YN321作为本发明的目的菌株。
菌株YN321在YPD平板培养基上的菌落呈现乳白色，菌落凸起、呈圆形，表面光滑，菌落边缘整齐，呈不透明、乳脂状，菌落形态如图1所示，镜检形态如图2所示。将菌株YN321进行ITS基因序列鉴定，结果与葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）相似度达100%，采用MEGA7.0软件构建***发育树见图3所示，则可确定菌株YN321为一株葡萄汁有孢汉逊酵母，将其命名为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）YN321，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 29509。
实施例2葡萄汁有孢汉逊酵母YN321用于液态发酵枸杞果醋
S1.分别将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）EnartisFerm Vintage Red、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum） YN321、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）CGMCC No.3089活化、制备种子培养液；具体如下：
所述酵母菌活化、制备种子培养液方法为：接种环挑取菌体接种于YPD斜面培养基中，30℃培养1~2d；再将斜面培养基中的菌体接种至YPD试管液体培养基中，30℃静置培养24h；取一代种子液按2%接种量接入种子液培养基中，30℃静置培养24h，得到种子培养液；
所述醋酸菌活化、制备种子培养液方法为：接种环挑取菌体接种于GY斜面培养基中，30℃培养1~2d；再将斜面培养基中的菌体接种至GY试管液体培养基中，30℃、180r/min摇床培养24h；取一代种子液按2%接种量接入种子液培养基中，30℃、180r/min摇床培养24h，得到种子培养液；
YPD培养基：向1L纯水中加入蛋白胨20.0g，酵母浸粉10.0g，葡萄糖20.0g；斜面培养基则需加入2%（w/w）琼脂粉。
GY培养基：向1L纯水中加入葡萄糖20g，酵母膏20g，乙醇3.5%（v/v）；斜面培养基则需加入2%（w/w）琼脂粉，不加乙醇。
种子液培养基：将枸杞复水榨汁后过滤，向枸杞汁中加入白砂糖调节糖度至15Brix，在115℃灭菌20min得到；
S2.将枸杞干果复水榨汁，加入0.35%（w/w）果胶酶，50℃水浴2h；酶解之后进行8000r/min离心10min并用4层纱布过滤获得澄清的果汁，用白砂糖调节糖度至15Brix；
所述复水条件为：料液比1:5（w/w）加纯净水浸泡12h；浸泡完成后将全部料液进行榨汁；
S3.向步骤S2得到的枸杞汁中接入3%葡萄汁有孢汉逊酵母YN321种子培养液，30℃无氧条件培养3d；之后再接入3%酿酒酵母EnartisFerm Vintage Red种子培养液，30℃无氧条件培养6d；发酵得到枸杞酒发酵液；
S4.向步骤S3得到的枸杞酒中加入10%巴氏醋杆菌CGMCC No.3089种子培养液，180r/min，30℃培养6d，发酵得到枸杞果醋。以此作为实验组。
空白对照：以不接种YN321发酵的枸杞果醋作为空白对照，其余均与上述步骤相同；
对照组1： 以接种实施例1中筛选出的编号YN123的菌株替代YN321作为对照组1；
发酵结束后，采用吸附笔结合气相色谱-质谱联用仪检测枸杞果醋中的挥发性风味物质，结果如表4所示：
表4枸杞果醋主要挥发性风味物质检测结果
根据表4可知，1）与空白对照组相比，使用葡萄汁有孢汉逊酵母YN321发酵的枸杞果醋挥发性风味物质种类更丰富，新增了空白对照组未检出的物质，例如：苯甲醇、2,3-丁二酮、2,4-二叔丁基酚、戊酸、糠醛、茶香酮、薄荷醇；对于相同挥发性风味物质的含量有显著提升，例如：乙偶姻提高4倍、异丁酸提高11倍、乙酸乙酯提高180倍。2）与对照组1相比，使用YN321发酵的枸杞果醋中检测出新增挥发性风味物质：己酸、茶香酮、薄荷醇，且相同的挥发性风味物质含量均高于对照组。可见，虽然使用菌株YN123发酵的枸杞果醋中也产生乙偶姻、异丁酸、乙酸乙酯，但挥发性风味物质的含量和种类远不如YN321丰富。
实施例3枸杞果醋不挥发酸检测与感官评价
不挥发酸含量与微生物的发酵代谢活动密切相关，其含量虽然较低，但却是构成枸杞醋的重要风味物质之一，对乙酸刺激性起到缓冲作用，使果醋酸味更加绵长和柔和。对实施例2中发酵的枸杞果醋进行不挥发酸检测，同时，以不接种YN321发酵的对照组1枸杞果醋作为对照，检测结果如表5所示：
表5枸杞果醋不挥发酸检测结果
根据表5的结果可以看出，使用葡萄汁有孢汉逊酵母YN321可以显著提高枸杞果醋的不挥发酸含量，有效减轻挥发酸的刺激性，改善枸杞果醋的口感。
为了验证葡萄汁有孢汉逊酵母YN321发酵的枸杞果醋品质，由感官鉴赏小组进行感官评价。感官鉴赏小组由10名经验丰富专业感官评价人士(5男5女)组成，感官评分表见表6所示：
表6枸杞醋感官评价标准
感官评分结果见表7所示：
表7枸杞果醋感官评分结果
综上所述，使用葡萄汁有孢汉逊酵母YN321发酵枸杞果醋，可提升枸杞果醋中的不挥发酸含量及品质口感，表明YN321可作为枸杞果醋的功能生产菌株。
实施例4葡萄汁有孢汉逊酵母YN321用于5L发酵罐放大培养
S1. 将枸杞干果复水榨汁，加入0.4%果胶酶，50℃水浴2h；酶解之后进行8000r/min离心10min并用4层纱布过滤获得澄清的果汁，用白砂糖调节糖度至15Brix；
所述复水条件为：料液比1:5（w/w）加纯净水浸泡12h；浸泡完成后将全部料液进行榨汁；
S2. 将3.5L枸杞汁添加至发酵罐中，向发酵罐中接入3%葡萄汁有孢汉逊酵母YN321种子培养液，30℃无氧条件培养3d；之后再接入3%酿酒酵母EnartisFerm VintageRed种子培养液，30℃无氧条件培养6d；发酵得到枸杞酒发酵液；发酵菌株及种子液制备方法同实施例2；
S3. 向步骤S2得到的枸杞酒中加入10%巴氏醋杆菌种子培养液，调节发酵温度至30℃，并持续通入氧气，通氧量为0.6L/min，转速为2000rpm，发酵6d，得到枸杞果醋。
该方法制备得到的枸杞果醋风味较好，总酸为78.0g/L，不挥发酸为19.01g/L，醋香浓郁柔不刺激，果香突出，香味宜人舒适，感官评分为85.9分。
采用GC-MS对制备得到的枸杞果醋中挥发性香气物质进行检测，本实施例制备得到的枸杞果醋中挥发性香气物质共有60种，包含2种酸类物质，16种醇类物质，16种酯类物质，10种酮类物质，8种醛类物质，1种呋喃类物质，2种吡嗪类物质，2种酚类物质，2种烷烃类物质，1种吡咯类物质。具体见表8：
表8 枸杞果醋挥发性风味物质结果
实施例5葡萄汁有孢汉逊酵母YN321用于发酵橙子果醋
S1.选成熟的、无腐烂、无虫害的果实进行榨汁，榨汁前去核去皮。
S2.加入0.35%的果胶酶，50℃酶解2h，用4层纱布进行过滤。
S3.测定橙子汁里初始含糖量，用白砂糖调整糖分至20Brix。
S4.酒精发酵：以调整好糖度的澄清橙子汁为原料，接入3%葡萄汁有孢汉逊酵母YN321种子培养液，28℃发酵3d；之后再接入3%酿酒酵母种子培养液，28℃发酵6d；得到橙子酒；发酵菌株和种子液的制备方法同实施例2仅种子液培养基不同。
种子液培养基制备方法为：将橙子果实榨汁后过滤，向橙子汁中加入白砂糖调节糖度至15Brix，在115℃灭菌20min得到；
S5.往步骤S4得到的橙子酒中加柚苷酶脱苦，柚苷酶添加量为0.6 g/L；脱苦条件pH7、酶解温度50℃、酶解时间60 min。
S6.向S5得到的脱苦后的橙子酒中加入10%巴氏醋杆菌种子培养液，220r/min，30℃培养6d，进行发酵得到橙子果醋。
该方法制得的橙子果醋风味较好，总酸为64.7g/L，不挥发酸为15.64g/L，醋香浓郁柔不刺激，果香突出，香味宜人舒适，感官评分为80分。
实施例6葡萄汁有孢汉逊酵母YN321用于发酵山楂醋
S1.山楂液制备：将山楂洗净、去核，按山楂：水为1：1的比例加水，破碎榨汁，加入0.35%果胶酶，50℃水浴2h后过滤；将山楂汁用白砂糖调节糖度至15Brix。
S2. 于步骤S1所得山楂汁中接入3%葡萄汁有孢汉逊酵母YN321种子培养液，28℃发酵3d；之后再接入3%酿酒酵母种子培养液，28℃发酵6d；得到山楂酒；发酵菌株和种子液制备方法同实施例2，仅种子液培养基不同。
种子液培养基制备方法为：将山楂加水（1：1）榨汁后过滤，向山楂汁中加入白砂糖调节糖度至15Brix，在115℃灭菌20min得到；
S3. 向S2得到的山楂酒中加入9.7%巴氏醋杆菌种子培养液，180r/min，30℃培养5d，进行发酵得到山楂醋。
该方法制得的山楂醋风味较好，总酸为70.5g/L，不挥发酸为14.63g/L，醋香浓郁柔不刺激，香味宜人舒适，感官评分为77.5分。
实施例7葡萄汁有孢汉逊酵母YN321用于液态发酵葡萄醋
S1.分选葡萄：取成熟度良好的葡萄，剔除生青、畸形、病虫、破损的穗粒，剔除葡萄叶等杂物。
S2.压榨葡萄：手工去梗，用小型压榨机对葡萄进行压榨，勿撕烂果皮，压破种子。
S3.澄清葡萄汁：向葡萄汁中加入的0.4%果胶酶，放置24小时，分离清汁，并用蔗糖调节糖度至15Brix得澄清葡萄汁。
S4.在S3制备的澄清葡萄汁中接种2%葡萄汁有孢汉逊酵母YN321置于28℃发酵2d，再接入4%酿酒酵母种子培养液，控制发酵温度于28℃，发酵6d得到葡萄酒；发酵菌株及种子液制备方法同实施例2，仅种子液培养基不同。
种子液培养基制备方法为：将葡萄压榨成汁后过滤，向葡萄汁中加入蔗糖调节糖度至15Brix，在115℃灭菌20min得到；
S5. 向S4得到的葡萄酒中加入10%巴氏醋杆菌种子培养液， 220r/min，30℃培养5d，进行发酵得到葡萄醋。
该方法制得的葡萄醋风味较好，总酸为68.9g/L，不挥发酸为16.83g/L，醋香浓郁柔不刺激，果香突出，香味宜人舒适，感官评分为78.1分。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1. 一株葡萄汁有孢汉逊酵母，其特征在于，具体为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）YN321，保藏编号为CGMCC No. 29509。
2.权利要求1所述葡萄汁有孢汉逊酵母YN321的应用，其特征在于，是在食醋发酵中的应用。
3.权利要求1所述葡萄汁有孢汉逊酵母YN321的应用，其特征在于，是在果醋发酵中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，是在枸杞果醋发酵中的应用。
5.一种果醋发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.种子液制备：分别将酿酒酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母YN321、巴氏醋杆菌活化、制备种子培养液；
S2.发酵原料制备：将水果榨汁，加入果胶酶酶解并用白砂糖或蔗糖调节糖度至15~20Brix；
S3.酒精发酵：
（1）向步骤S2得到的水果汁中接入葡萄汁有孢汉逊酵母YN321种子培养液，28~30℃无氧条件培养2~3d；
（2）之后再接入酿酒酵母种子培养液，28~30℃无氧条件培养5~6d；发酵得到果酒发酵液；
S4.醋酸发酵：向S3得到的果酒中加入巴氏醋杆菌种子培养液，发酵得到果醋;
所述的葡萄汁有孢汉逊酵母YN321，保藏编号为CGMCC No. 29509。
6. 如权利要求5所述的一种果醋发酵方法，其特征在于，S1中所述酿酒酵母选自意大利英纳帝斯公司红佳酿EnartisFerm Vintage Red；所述巴氏醋杆菌选自巴氏醋杆菌(Acetobacter Pasteurianus) CGMCC No.3089。
7. 如权利要求5所述的一种果醋发酵方法，其特征在于， S2中所述酶解方法为：向果汁中加入0.35%~0.4%果胶酶50~55℃酶解2~24h。
8.如权利要求5所述的一种果醋发酵方法，其特征在于，S4中摇瓶发酵条件为：于摇瓶中转速180~220r/min，30~32℃培养5~6d得到果醋；发酵罐发酵条件为：于发酵罐中持续通氧，通氧量为0.6~0.8L/min，转速为1500~2000rpm，30~32℃培养5~6d，得到果醋。
9.如权利要求5所述的一种果醋发酵方法，其特征在于，S4中发酵所得果醋8000r/min离心澄清10min，滤去菌泥得到果醋成品。
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