CN113621528B - 一株低产杂醇高产酯酿酒酵母菌株及其在发酵食品中的应用 - Google Patents

一株低产杂醇高产酯酿酒酵母菌株及其在发酵食品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株低产杂醇高产酯酿酒酵母菌株及其在发酵食品中的应用，属于发酵工程与生物技术领域。本发明提供的酿酒酵母jiangnan1#抗逆性优良、发酵性能好，能够满足不同酒精饮料和发酵食品低产杂醇、高产酯的工业生产需求，该菌株还具备低产尿素、低产氨基甲酸乙酯的发酵特性，发酵后的黄酒中尿素含量为18.60±0.53mg/L，氨基甲酸乙酯含量含量为67.91±3.06μg/L，显著低于工厂目前常用的酿酒酵母菌株，能够显著提高黄酒风味，满足高舒适度、高安全性的优质黄酒工业生产需要，有很好的应用前景，同时该菌株在其他发酵食品中应用也能够实现安全性和品质的提高。

Description

一株低产杂醇高产酯酿酒酵母菌株及其在发酵食品中的应用
技术领域
本发明涉及一株低产杂醇高产酯酿酒酵母菌株及其在发酵食品中的应用，属于发酵工程与生物技术领域。
背景技术
酿酒酵母是酒精饮料的主要风味生成微生物，酿酒酵母的发酵力是酿造生产的重要动力源，酵母利用原料中的糖生成酒精，蛋白质和脂肪经酵母和乳酸菌等微生物作用后转变为有机酸、氨基酸及酯类等。酵母性能优劣直接影响最终产品的生产效率与风味品质。同时，酵母在酿造过程中与一些非喜好物质高级醇(杂醇油)、尿素和氨基甲酸乙酯的生成密切相关，这些物质含量超过限量值会造成消极影响，影响饮用舒适性和安全性，而随着消费者消费水平和消费认知的提高，目前已不再优先考虑产品品质、价值和价格，越来越重视产品的安全和健康因素，因而就出现了产品特点与消费者需求不匹配的矛盾问题。
杂醇和一些乙酸酯类物质是发酵过程中酵母的代谢产物。醇酯不平衡(杂醇含量高、酯类含量低)，生物胺、尿素和氨基甲酸乙酯等非喜好代谢物质是黄酒、料酒、啤酒、葡萄酒和果酒等发酵酒，以及白酒、伏特加和白兰地等蒸馏酒普遍存在的问题。酿酒酵母贯穿整个发酵过程，直接或间接参与上述物质的代谢生成，如何通过控制发酵微生物代谢对于提升发酵食品品质极为重要。
目前，利用诱变手段选育得到的酿酒酵母突变株能够显著降低杂醇、尿素、氨基甲酸乙酯等物质含量，但诱变手段选育菌株优先考虑的是满足单一目的需求即可，而且诱变具有不确定性，往往不容易得到渴望的性状，而且诱变手段会改变了菌株原有的不同代谢物质组成相对均衡的发酵特性，突变菌株往往不能够同时具备优良发酵特性。利用基因工程手段对酿酒酵母进行改造能够明确实现不同的目的需求，例如在公开号为CN201511017931.3的专利申请中，发明人构建了一株高产酯低产高级醇酿酒酵母工程菌，提高了白酒中酯的含量和降低了高级醇的含量，CN201610012975.5专利申请中，发明人构建了一种低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，显著提高乳酸乙酯生成量的同时降低高级醇生成量。另外，国外也采用基因工程对葡萄酒酿酒酵母进行菌株改造，目前只有2株转基因葡萄酒酵母菌株ML01和ECMO01分别实现了不产生物胺和尿素的目的改造且只在一定范围内允许使用，但转基因技术是否绝对安全尚不明确，因此尚未被广泛接受，尤其是在像黄酒和食醋等发酵食品中，酿酒酵母的代谢物往往大部分会保留在最终产品中。通过自然选育获得低产杂醇高产酯酿酒酵母仍然是最有效的选育手段。
关于低产杂醇高产酯酿酒酵母在白酒、黄酒、啤酒和葡萄酒等发酵食品中的选育及应用的相关研究，CN201510971067.4专利中报道了一株低产尿素黄酒酵母菌及其应用，CN201210136289.0专利中报道了一株用于快速发酵生产绍兴黄酒的酵母菌，在可检索到的应用于食品相关领域的酿酒酵母的研究及专利中，目前尚没有有效的方法能从根本上***解决以上这些问题，尚未发现在满足正常发酵的前提下，同时兼具高酒精度、低杂醇、高酯，尿素和氨基甲酸乙酯含量显著低于规定限量的安全性工业生产酿酒酵母菌株及其应用。因此，本发明经过酿酒酵母菌株分离筛选、***评价选育获得的低产杂醇高产酯酿酒酵母及其在发酵食品中的应用对于黄酒等酒精饮料和食醋等发酵食品的品质、健康和安全的提升具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，针对目前发酵食品生产中尚未有低产杂醇高产酯，发酵性能优良，同时安全性高的酿酒酵母。本发明提供一株抗逆性优良、发酵性能好的低产杂醇高产酯的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株及其在发酵食品中的应用。
本发明提供了一株低产杂醇高产酯酿酒酵母(Saccharomyces.cerevisiae)菌株jiangnan1#，已于2021年05月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2021523，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母jiangnan1#的单克隆菌落形态特征为乳白色，呈卵圆形或椭圆形，凸起，表面光滑、湿润有光泽，菌株边缘整齐。
本发明的还提供了所述低产杂醇高产酯酿酒酵母在发酵食品中的应用方式。
在本发明还提供了还有所述酿酒酵母jiangnan1#的微生物菌剂、与其他微生物复配制备的组合物。
在一种实施方式中，所述组合物包括但不限于强化酒药或强化麦曲。
在一种实施方式中，所述的微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
在一种实施方式中，所述的微生物菌剂含有所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#菌体的活细胞、冷冻干燥得到的所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#干菌体、固体化技术得到的所述低产杂醇高产酯酿酒jiangnan1#酵母细胞、所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#的液体菌剂、所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#菌株。
在一种实施方式中，所述微生物制剂中酿酒酵母jiangnan1#的数量≥1×106CFU/g。
在一种实施方式中，所述微生物制剂中酿酒酵母jiangnan1#的数量≥1×106CFU/g。
在一种实施方式中，所述其他微生物包括但不限于细菌或真菌。
在一种实施方式中，所述的与其他微生物复配应用方式是指将所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#，与其他微生物复配，所述其他微生物包含酿酒酵母、非酿酒酵母；所述非酿酒酵母包括但不限于乳酸菌。在一种实施方式中，所述微生物制剂按如下方法制备：将菌株接种在大米糖化液培养基中，在培养温度为28℃±2℃的条件下振荡培养20～24h，得到一级种子液；再以5％-10％的比例将一级种子液接种至新的大米糖化液培养基，在培养温度为28℃±2℃的条件下振荡培养36h-48h，得到二级种子液，获得酵母数≥1×107CFU/mL，出芽率≥30％的速酿酒母制剂。
在一种实施方式中，所述的强化酒药是指在酒药的制作过程中以所述酿酒酵母jiangnan1#或所述微生物菌剂，所述与其他微生物复配或其他任何形式添加在酒药中，达到酒药在使用时能够强化酒药的发酵特性的目的。
在一种实施方式中，所述的强化酒曲是指在酒曲制作过程中以所述酿酒酵母jiangnan1#或所述微生物菌剂以任何形式添加在酒曲中，达到酒曲在使用时能够强化酒曲的发酵特性的目的。
本发明还提供所述低产杂醇高产酯酿酒酵母在发酵食品中的应用。
在一种实施方式中，所述的发酵食品中的应用包含以上述低产杂醇高产酯酿酒酿酒的所有应用方式在发酵食品中的应用。
在一种实施方式中，所述的发酵食品包括但不限于黄酒、料酒、米酒、甜米酿、葡萄酒、果酒、果醋、食醋、白酒、啤酒、烟叶或发酵型雪糕等。
在一种实施方式中，所述的应用是用于黄酒酿造，使用所述低产杂醇高产酯酿酒酵母为速酿酒母。
在一种实施方式中，所述黄酒酿造是将所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#作为速酿酒母，按照5％-15％的添加量添加到蒸煮或糊化的原料(稻米、黍米、玉米、小米等)中，经发酵、压榨、煎酒、陈酿、过滤、灭菌灌装得到的黄酒。
在一种实施方式中，所述的应用是用于料酒酿造。
在一种实施方式中，所述料酒酿造是先利用所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#作为速酿酒母先发酵得到黄酒，再利用黄酒制备料酒。
在一种实施方式中，所述的应用是用于米酒酿造，使用所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#为发酵剂。
在一种实施方式中，所述米酒酿造是将所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#与酒曲作为发酵剂进行酿造，按照0.5％-1.5％的添加量添加到蒸煮的大米原料中，经蒸煮、加曲(添加所述酿酒酵母)、糖化、发酵、压榨等工艺得到。
在一种实施方式中，所述的应用是用于甜米酿酿造，使用所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#为发酵剂。
在一种实施方式中，所述米酒酿造是将所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#与酒曲作为发酵剂进行酿造，按照0.5％-1.5％的添加量添加到蒸煮的原料(稻米、黍米、玉米、小米等)中，经蒸煮、加曲(添加所述酿酒酵母)、糖化、发酵等工艺得到。
在一种实施方式中，所述的应用是用于食醋酿造。
在一种实施方式中，所述的应用是用于食醋酿造是先利用所述低产杂醇高产酯酿酒酵母作为酒母先发酵得到黄酒，再利用黄酒作为醋酸发酵原料来酿造食醋。
在一种实施方式中，所述的应用是用于酿造白酒。
在一种实施方式中，所述酿造白酒，是在白酒发酵入池发酵时额外添加所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#。
在一种实施方式中，所述酿造白酒时低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#添加量为原料体系的1％(v/v)。
在一种实施方式中，所述的应用是用于酿造葡萄酒。
在一种实施方式中，所述酿造葡萄酒，是在酒精发酵阶段额外添加所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#。
在一种实施方式中，所述酿造葡萄酒时低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#添加量为发酵体系总体积的0.5％(v/v)-1.5％(v/v)。
在一种实施方式中，所述的应用是用于酿造果酒。
在一种实施方式中，所述酿造果酒包括但不限于李子酒，杨梅酒、猕猴桃酒、青梅酒、山楂酒、石榴酒、柠檬酒、枇杷酒中的任一种。
在一种实施方式中，所述酿造果酒包括如下工艺：发酵前的处理，向果汁澄清后的清汁中接种所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#。
在一种实施方式中，所述酿造果酒时低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#接种量为清汁总体积的1％(v/v)-5％(v/v)。
在一种实施方式中，所述的应用是用于酿造果醋。
在一种实施方式中，所述的应用是用于酿造果醋是先利用所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#先发酵得到果酒，再利用果酒作为发酵原料接入醋酸菌种，进行醋酸发酵来酿造果醋。
在一种实施方式中，所述的应用是用于酿造啤酒。
在一种实施方式中，所述的应用是用于酿造啤酒，是将所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#作为纯种酵母，扩培后按照0.2％-1％的添加量添加到麦芽汁中，经麦芽处理，酿造，灌装等工艺得到。
在一种实施方式中，所述的应用是用于制作卷烟。
在一种实施方式中，所述的应用是用于制作卷烟，是将所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#培养液直接制备烟草香料；或将梨、葡萄、桂花和烟草提取物等为培养基原料，接种所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#进行发酵制备发酵型烟草香料，然后将所得烟草香料按照卷烟叶组质量的1％-5％的添加量直接添加到卷烟叶组中。
在一种实施方式中，所述的应用是用于制作发酵型营养雪糕。
在一种实施方式中，所述的应用是用于制作发酵型营养雪糕，是将所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#作为发酵剂以5％-10％的添加量对原料(水果汁，糖、蜂蜜、全脂奶粉等，红薯、紫薯、玉米等淀粉)进行发酵，再添加一些其他食品添加剂，然后混合、巴氏灭菌、均质、冷却老化、凝冻搅拌、选注模、冷冻、出模等工艺等工序得到。
本发明还提供了酿酒酵母jiangnan1#发酵产品经蒸馏、调配、勾兑或添加等方式得到的产品。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一株低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#，抗逆性优良，乙醇耐受性高达20％(v/v)，在1.6mol/L氯化钠渗透压条件下仍然有较好的生长状况，该酿酒酵母菌株具有较好的温度耐受性范围，在15℃-45℃范围内菌株仍有较好的生长状况，能够满足不同类型发酵食品的需求。
(2)黄酒发酵实验表明，本发明的jiangnan1#在主发酵温度在20℃-35℃，后酵温度为10℃-15℃的发酵条件下能够表现出良好的发酵性能。
(3)采用本发明提供的低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#进行机械化黄酒酿造时，与专利CN 105385613 B公开的黄酒行业普遍使用的85#酵母菌相比，jiangnan1#菌株发酵启动较快，48h酒精度可达13％(v/v)以上，发酵结束后得到的黄酒中酒精度为16.5％(v/v)，杂醇含量为398.68±13.25mg/L，2-苯乙醇含量为79.43±5.21mg/L，降低20％以上，乙基酯(乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯)含量增加50％以上，菌株低产杂醇高产酯发酵特性较为显著，经压榨、调配、过滤后最终得到的黄酒酒体香气和味道更柔和、协调，饮用舒适度好，表现为适量饮用不易上头，饮用后醒酒快。
(4)采用本发明提供的低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#进行机械化黄酒酿造时，尿素含量为18.60±0.53mg/L，氨基甲酸乙酯含量为67.91±3.06μg/L，显著低于工厂目前常用菌株，低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#发酵时代谢生成氨基甲酸乙酯量较少，能够提高以低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#为发酵菌株发酵食品的安全性。
生物材料保藏
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan1#，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan1#，已于2021年05月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2021523，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
附图说明
图1是本发明的酿酒酵母(S.cerevisiae)jiangnan1#不同温度下生长变化曲线。
图2酵母分离株与风味物质的相关性分析。
图3是本发明的酿酒酵母(S.cerevisiae)jiangnan1#酿造黄酒的香气、口感轮廓图。
具体实施方式
黄酒理化指标的检测：酒精度、氨基酸态氮和总酸的测定参照《GB/T 13662-2018黄酒》进行测定。有机酸和氨基酸含量采用高效液相色谱(HPLC)，氨基甲酸乙酯和高级醇、酯类等挥发性风味物质采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)进行检测。还原糖含量测定采用DNS方法。尿素和菌液浓度采用分光光度法测定。黄酒中高级醇(又称杂醇)主要包括正丙醇、异丁醇、异戊醇和2-苯乙醇4种，采用分散液液微萃取技术(DLLME)，利用GC-MS检测，以4-甲基-2-戊醇作为内标，建立外标曲线进行定量测定杂醇含量。
单位酒精度杂醇：单位酒精度杂醇是指乙醇代谢过程中4种杂醇的总量与酒精度的比值，即1％(v/v)对应的杂醇含量，单位为mg/L。
感官评价：选择有酒精饮料感官评价经验的年龄在20-40岁之间的评价员10人(5男和5女)，按照相应国标中向评价员对酒精饮料的感官要求(外观、香气、口味和风格特征)进行介绍后，比较样品与对照的差异。
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
YPD培养基：10g酵母浸粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，加水至1000mL，2％琼脂，121℃高压灭菌20min，冷却后备用。
大米糖化液培养基：取适量优质大米原料，60℃水浴恒温浸米30min，常压条件下蒸煮20min，然后分别加入大米原料为基准150U/g-300U/g的糖化酶和200U/g-400U/g的液化酶，加入10％大米质量的生麦曲，在55℃-65℃条件下糖化4h-5h，至糖度13Brix以上，分装121℃高压灭菌15min-20min，冷却后备用。
实施例1酿酒酵母菌株的筛选、鉴定与低产杂醇高产酯酿酒酵母的选育
1、样品制备、菌株分离及保藏
采集来自绍兴地区传统手工黄酒酿造过程中的黄酒发酵液于4℃储存，取混匀后的样品1mL，用无菌水进行梯度稀释(10-1-10-5)，取稀释后的样品100μL，在YPD平板上进行平板涂布，将涂布后的平板倒置，于28℃静置培养48h，选择有单克隆菌落的稀释度，挑选菌落形态、颜色、外观符合酵母生理形态的菌株，进行多次划线对菌株纯化，最终对得到的纯种菌株进行编号、保藏。
2、基于酿酒酵母分离株黄酒发酵的初筛：为了选择能够满足黄酒酿造需求的具备优良发酵性能酿酒酵母，对所有分离株分别制作速酿酒母后进行黄酒发酵，发酵结束后测定酒精度等理化指标，对菌株进行初步筛选，根据不同批次对酒精度满足国标的测定杂醇和风味物质进行筛选。具体步骤如下：
(1)本实施例所选取的传统黄酒发酵的原料配比
按照100％糯米(基准)：500g；125％水：625g；12％-15％麦曲：60g-75g；10％-15％酵母三角瓶培养液：50mL-75mL。
速酿酒母的制作方法为：酿酒酵母甘油管保藏菌株进行斜面制备，将斜面培养的酿酒酵母(S.cerevisiae)jiangnan1#菌株接种在大米糖化液培养基中，在培养温度为28℃±2℃的条件下振荡培养24h，得到一级种子液(菌液浓度106-108CFU/mL)，以5％-10％的比例接种一级种子液至新的大米糖化液培养基，在培养温度为28℃±2℃的条件下振荡培养36h-48h，得到二级种子液，得到的二级种子液测定酵母活菌数和出芽率，满足酵母数≥1×107CFU/mL，出芽率≥30％，作为速酿酒母进行黄酒酿造。
实验组：以分离获得的酿酒酵母菌株作为纯种酵母制作速酿酒母。
对照组：以工厂生产用酿酒酵母菌株85#(公开于专利CN 105385613 B中)作为纯种酵母制作速酿酒母。
(2)传统黄酒酿造过程
a)发酵原料米饭的制备：生产用量的生米加水至超出液面10cm以上进行浸米，3-5天，浸米的米浆水酸度达到4.5g/L以上，将水沥干得到湿米，将湿米在蒸饭柜，121℃，蒸饭20min-30min，至米饭熟而不透，饭粒内无白心，米饭有酸味带有饭香，出饭率在140％-160％。
b)按照传统黄酒发酵的原料配比进行落料和发酵：
按照传统黄酒发酵的原料配比进行落料和发酵，具体步骤如下：
S1、将甘油管冻存保藏的菌株分别在平板划线后出现单克隆菌落，挑取单克隆菌落接种于斜面，得到可以低温保藏的酿酒酵母斜面培养基；
S2、将S1的菌株从斜面上转接至大米糖化液培养基，在28℃±2℃培养至数量级≥1×107，出芽率大于30％，作为接种液；
S3、向灭菌的发酵容器中投入原料米饭，水，向米水混合发酵体系中接入占原料米质量10％-15％的步骤S2获得的接种液，并加入占原料米质量12％-15％比例的麦曲，25℃-28℃条件下完成物料混合，20℃-35℃范围条件下静置进行前发酵3～5天；
S4、将发酵罐温度降低至10℃-15℃，静置进行15-20天的后发酵；
S5、将S4获得的发酵醪液经过板框压榨(4次进料，进醪压力为0.2-0.6MPa，过滤面积100m2，滤板直径1m)、硅藻土过滤(硅藻土添加比例为4％-6％，压力0.3-0.5MPa)，得到的滤液经过澄清得到清酒、清酒调配按照黄酒国标添加1‰-3‰焦糖色，煎酒后为黄酒。
共144株分离株，以其中包含酿酒酵母(S.cerevisiae)jiangnan1#(选育时菌株编号为CYY-661)的批次为例。发酵结束选择酒精度16％(v/v)以上的进行理化指标、杂醇和风味测定。根据菌株的风味和杂醇指标进行PCA分析(图2)，低产杂醇高产酯的菌株明显被区分出来。
3、基于酿酒酵母分离株黄酒发酵的复筛：对步骤2初筛的得到具备优良发酵性能的的菌株进行3个重复进行复筛，测定发酵结束的理化指标、风味和杂醇。复筛获得优良低产杂醇高产酯酿酒酵母发酵后的理化指标均符合黄酒国标，杂醇和酯类含量如表2，CYY-690菌株表现出低产杂醇高产酯特性，但是酒精度相对较低，不适合黄酒发酵。综合分析酿酒酵母jiangnan1#(CYY-661)表现出优良的低产杂醇高产酯发酵特性。
表1复筛获得优良低产杂醇高产酯酿酒酵母发酵结束时理化指标
Figure BDA0003196416940000071
表2复筛获得优良低产杂醇高产酯酿酒酵母发酵结束时杂醇和总酯含量
Figure BDA0003196416940000081
4、基于酿酒酵母分离株黄酒发酵的稳定性验证：对复筛得到的菌株jiangnan1#(CYY-661)重复1次发酵进行稳定性验证，测定发酵结束的理化指标、风味和杂醇。由于原料批间品质差异，各批次的产酸、产酯结果存在一定波动性，重点关注酿酒酵母jiangnan1#与对照菌株在产杂醇、酯方面的差异，为了验证菌株低产杂醇能力，采用单位酒精度杂醇总量(杂醇总量与乙醇含量的比值)进行比较。结果显示，发酵结束后85#的杂醇总量为432.12±22.44mg/L，总酯为126.77±7.84mg/L；酿酒酵母jiangnan1#为378.82±7.35mg/L，总酯为326.79±66.2mg/L，jiangnan1#1菌株发酵黄酒中的主要酯类(乙酸乙酯、乳酸乙酯等)都高于对照菌株85#，其中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯和乙酸异戊酯的含量分别增加了1.6倍，53.85％和2.25倍，表明jiangnan1#具备低产杂醇高产酯的酿酒特性，为低产杂醇、高产酯菌株。
表3复筛获得优良低产杂醇高产酯酿酒酵母发酵结束时理化指标
Figure BDA0003196416940000082
表4复筛获得优良低产杂醇高产酯酿酒酵母发酵结束后主要杂醇和酯含量
Figure BDA0003196416940000083
5、菌株鉴定
菌株的形态特征，通过ITS测序，酿酒酵母jiangnan1#的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。在NCBI数据库比对分析菌株与酿酒酵母的同源性大于99％，可以鉴定为酿酒酵母(S.cerevisiae)。菌株已保藏于于2021年05月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2021523，保藏地址为中国武汉，武汉，大学。
实施例2低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#发酵剂的制备
(1)以速酿酒母为例，制备黄酒酿造含酿酒酵母jiangnan1#的速酿酒母。
速酿酒母的制作方法为：酿酒酵母甘油管保藏菌株进行斜面制备，将斜面培养的实施例1筛选的酿酒酵母jiangnan1#菌株接种在大米糖化液培养基中，在培养温度为28℃±2℃的条件下振荡培养24h，得到一级种子液(菌液浓度106-108CFU/mL)，以5％-10％的比例接种一级种子液至新的大米糖化液培养基，在培养温度为28℃±2℃的条件下振荡培养36h-48h，得到二级种子液，得到的二级种子液测定酵母活菌数和出芽率，满足酵母数≥1×107CFU/mL，出芽率≥30％，作为速酿酒母(发酵剂)进行黄酒酿造。
(2)将酿酒酵母jiangnan1#制备发酵剂用于其它类型的发酵食品
根据不同发酵食品需求将步骤(1)制备的含纯种菌株的速酿酒母用于食品的发酵生产，制备含酿酒酵母的发酵酒精饮料，培养基可选择大米糖化液、麦芽汁、糖溶液等满足食品发酵生产C，N营养需求的各类培养基对酿酒酵母jiangnan1#进行活化培养至满足要求的相应菌落数。
实施例3低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在黄酒工业中的应用
(1)在传统黄酒生产中的应用
按照实施例2(1)的方法，以低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#和工厂生产菌株85#分别作为实验菌株和对照菌株制作速酿酒母，按照实施例1步骤(2)的方法用于机械化发酵，发酵结束后测定酒精度等理化，杂醇和风味，尿素含量，氨基甲酸乙酯，氨基酸，有机酸等。
酿酒酵母jiangnan1#发酵结束后得到的黄酒中酒精度为16.5％(v/v)，杂醇含量为398.68±13.25mg/L，2-苯乙醇含量为79.43±5.21mg/L，与菌株85#相比，酿酒酵母jiangnan1#发酵的黄酒中2-苯乙醇含量降低20％以上，乙基酯(乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯)含量为196.5mg/L，增加50％以上，菌株低产杂醇高产酯发酵特性较为显著，经压榨、调配、过滤后最终得到的黄酒酒体香气和味道更柔和、协调(图3)，饮用舒适度好，表现为适量饮用不易上头，过量饮用后醒酒快，尿素含量为18.60±0.53mg/L，氨基甲酸乙酯含量为67.91±3.06μg/L，显著低于菌株85#，氨基酸、有机酸等其他指标均符合黄酒国标GB/T13662-2018黄酒。
(2)酿酒酵母jiangnan1#在20吨机械化黍米黄酒中的应用
按照实施例1步骤(1)的方法制备速酿酒母，并按照实施例1步骤(2)的方法进行传统黄酒酿造，区别在于，将步骤S2的接种液分别替换为酿酒酵母jiangnan1#菌液或安琪酿酒高活性干酵母菌液；步骤S5将发酵醪液进行板框压榨、硅藻土过滤，得到的滤液经过澄清得到清酒煎酒后为黄酒(不添加焦糖色)。
机械化黍米黄酒发酵的原料配比为：
实验组：黍米：5500kg；水：6600kg(L)；生麦曲：550kg-82.5kg；熟麦曲；99kg；速酿酒母：62.7L；
对照组：黍米5500kg；水6600kg(L)；安琪酿酒高活性干酵母11kg，安琪酿酒曲27.5kg，提前用150L水温30℃-35℃的含20g/L葡萄糖的糖水活化安琪酿酒高活性干酵母和安琪酿酒曲20min-30min，作为活化发酵剂，活化发酵剂中酵母数＞108CFU/mL。
发酵结束后菌株jiangnan1#发酵得到的最终黄酒酒精度为19.6％(v/v)，单位酒精度杂醇和2-苯乙醇含量分别为20.5mg/L和4.34mg/L，酯类总量为229.15mg/L，氨基甲酸乙酯含量为82.25±1.26μg/L；对照组发酵黄酒为19.4％(v/v)，单位酒精度杂醇含量和2-苯乙醇含量分别为29.7mg/L和12.0mg/L，酯类总量为173.33mg/L，单位酒精度杂醇降低30.98％，单位酒精度2-苯乙醇降低63.8％，杂醇降低效果显著，酯类总量增加32.2％，其他指标均符合黄酒国标GB/T 13662-2018。
(3)酿酒酵母jiangnan1#在小米黄酒中的应用
本实施例所选取的小米黄酒发酵的原料配比为：
小米(基准)：500g；水：500g(mL)-625g(mL)；生麦曲：50g-75g；熟麦曲：9g；实施例2制备的酿酒酵母jiangnan1#速酿酒母：57mL；对照组使用安琪酿酒高活性干酵母和安琪酿酒曲时，用活化发酵剂代替生麦曲、熟麦曲和速酿酒母。
实验组：按照实施例2步骤(1)的方法，以低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#作为纯种酵母制作而成的速酿酒母。
对照组1：按照实施例2步骤(1)的方法，以工厂生产用酿酒酵母菌株85#作为纯种酵母制作而成的速酿酒母.
对照组2：按照实施例3(2)的方法,将安琪酿酒高活性干酵母1g，安琪酿酒曲2.5g用于制备活化发酵剂，提前用30mL水温30℃-35℃的含20mg/mL葡萄糖的糖水活化安琪酿酒高活性干酵母和安琪酿酒曲20min-30min，作为活化发酵剂，活化发酵剂中酵母数＞108CFU/mL。
小米黄酒酿造过程：
a)发酵原料米饭的制备方法为：小米生米重量的2-3倍的水进行常温浸米1-3天，酸度大于3mg/L，将水沥干得到湿米，将湿米在蒸饭柜，121℃，蒸饭30min-50min，至米饭熟而不透，内无夹生，出饭率在140％-160％。
b)按照小米黄酒发酵的原料配比分别将步骤a)处理后的实验组、对照组原料米饭冷却至25℃-28℃时进行前发酵，前酵发酵温度为20℃-35℃，发酵3-7天进入后酵，后酵10℃-15℃，后发酵进行15-20天后。
c)工厂生产将发酵醪液进行板框压榨、硅藻土过滤，得到的滤液经过澄清得到清酒、清酒调配煎酒后为黄酒，陈酿后，可选择加入枸杞、红枣、蜂蜜、黄芪、山参、话梅等进行勾兑。本实例为实验室规模小体系模拟发酵，采用纱布过滤、离心的方式进行。
发酵结束后对照组和实验组菌株jiangnan1#发酵得到的最终小米发酵醪液酒精度为10％(v/v)-15％(v/v)，菌株jiangnan1#杂醇含量低于400mg/L，单位酒精度杂醇和2-苯乙醇含量相比于对照组1和对照组2降低15％以上，酯类总量为80mg/L-160mg/L，与对照组1和对照组2相比增加20％以上，氨基甲酸乙酯含量小于100μg/L，其他指标均符合黄酒国标，发酵得到的小米黄酒酒体透亮，色泽光亮，口感清爽，菌株jiangnan1#发酵得到的最终小米黄酒具有果香，酯香，能够满足消费者对酒精饮料低杂醇、高酯、营养健康的需求。
(4)酿酒酵母jiangnan1#在降低红曲黄酒中的应用
按照实施例1步骤(2)的方法进行红曲黄酒生产应用，区别在于，用红曲代替步骤S3原料中的麦曲，步骤S5发酵15-20天后，将发酵醪液进行板框压榨、硅藻土过滤，得到的滤液经过澄清得到清酒煎酒后为红曲黄酒(不添加焦糖色)。
以低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#作为实验菌株按照实施例2的方式，制作速酿酒母，用安琪酿酒高活性干酵母和安琪酿酒曲代替红曲和速酿酒母作为对照组制作活化发酵剂，按照原料配比分别进行红曲黄酒发酵，发酵结束后测定酒精度等理化，杂醇和风味，尿素含量，氨基甲酸乙酯，氨基酸，有机酸等。
发酵结束后对照组和实验组发酵得到的红曲黄酒酒精度为15％(v/v)-18％(v/v)，发酵得到的红曲黄酒酒体为褐色或深褐色，口感清爽无异味，酒体协调，菌株jiangnan1#发酵得到的红曲黄酒具有较浓郁的果香，酯香，与对照组相比，单位酒精度杂醇含量和2-苯乙醇含量分别为30.6mg/L和13.5mg/L，酯类总量为165.28mg/L，单位酒精度杂醇降低32.12％，单位酒精度2-苯乙醇降低55.20％，杂醇降低效果显著，酯类总量增加35.12％，其他指标均符合黄酒国标。
实施例4低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在料酒中的应用
按照实施例3(1)中的方式首先发酵得到黄酒，区别在于，米水比1:1，其他原料添加比例不变，取部分黄酒酒样加入食用盐10％，可根据产品需要添加食用水、香辛料和焦糖色，灭菌处理后得到低产杂醇高产酯酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株jiangnan1#所酿黄酒为主要原料制备的料酒，酒精度为10％(v/v)-15％(v/v)，氨基态氮含量高于0.5g/L，氨基甲酸乙酯含量为80.5μg/L，所酿料酒酯类含量高，富含氨基酸，风味较好，安全性提高，产品符合SB/T 10416-2007调味料酒。
实施例5低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在米酒中的应用
以大米为主要原料，用清水淘洗，在常温下浸泡4h左右至充分吸水，要求浸后手捏易碎，无硬米芯为止；将浸泡后的米粒水分沥干，常压下蒸煮30min左右至米饭内无白心；米饭蒸熟后用冷开水淋冷至25℃-28℃左右，加入大米质量0.4％-0.8％甜酒曲搭窝进行28℃±2℃糖化36h-42h，糖化结束后，接种5％-10％按照实施例2制备的低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#速酿酒母，搅拌均匀，加入原料米质量1-1.5倍的饮用水，在26℃-34℃条件下的发酵3-5天，降低温度至10℃-15℃范围发酵10-15天，发酵结束后，压榨、过滤得到米酒。发酵所得米酒富含米香果香、高级醇含量低，单位酒精度杂醇含量小于20mg/L，饮后不易醉。
实施例6低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在甜米酿的应用
以大米为主要原料，用清水淘洗，在常温下浸泡4h左右至充分吸水，要求浸后手捏易碎，无硬米芯为止；将浸泡后的米粒水分沥干，常压下蒸煮30min左右至米饭内无白心；米饭蒸熟后用冷开水淋饭至25℃-28℃左右，转移至发酵罐内，添加大米生米质量0.4％-0.8％安琪甜酒曲，接种0.5％-1.5％实施例2制备的低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#速酿酒母，搅拌均匀，并在饭中央挖出凹槽，以保证一定的溶氧量；加入原米质量1-1.5倍的饮用水，在26℃-34℃条件下的恒温发酵36h-72h有酒香味。所得甜米酿酒精度2％-4％(v/v)，香气协调、浓郁、质地均匀，口感酸甜适口。
实施例7低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在食醋的应用
以参照实施例3(1)的方法得到的黄酒为原料，进行醋酸发酵。
食醋酿造采用固态发酵工艺：将黄酒、麸皮和大糠按照10:4:1的质量比混匀，接种总体系质量3％-8％的醋醅后对物料进行翻醅，保持发酵温度为35℃-40℃，前2天进行物料表明翻醅。2-8天自上而下翻醅至物料底部，8-12天，从底部自下而上翻醅进行降温。发酵结束后淋醋获得生醋，灭菌后罐坛露天陈酿，不同年份的醋灌装前需85℃高温灭菌30min后进行热管装。发酵结束后所得食醋中理化指标正常，醋酸含量均为50-80g/L，氨基甲酸乙酯含量较低，安全性提高。
实施例8低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在白酒的应用
以高粱为原料，采用2轮发酵法进行白酒固态酿造，蒸熟高粱后冷却至30℃左右，添加麸曲10％-25％、稻壳8％-12％、曲10％-15％、麸皮6％-10％，接种1％实施例2制备的低产杂醇高产酯酿酒酵母菌株jiangnan1#纯种速酿酒母进行第一轮密闭发酵30天后蒸馏。二次发酵添加中温大曲10％-15％，继续添加1％实施例2制备的jiangnan1#速酿酒母或含jiangnan1#的菌液，继续发酵15天后蒸馏，2轮所得蒸馏白酒混合后得到酒精度60％(v/v)的白酒，白酒乙酸酯含量增加，主要为乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯，总量提高65％以上，同时，杂醇含量降低25％以上，氨基甲酸乙酯含量降低60％以上，安全性提高。
实施例9低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在葡萄酒的应用
以100kg果粒完整、成熟度较好的赤霞珠葡萄为原料，除梗破碎后分装150L发酵罐中，添加20mg/L果胶酶(酶活20000U/g)和50mg/L SO2混匀，4℃低温浸渍24h左右。随后在温度升至20℃时，分别混匀后接种终浓度为1×106CFU/mL的法国LAFFORT公司生产的商业酿酒酵母(S.cerevisiae)F15，和终浓度为1×106CFU/mL的实施例2制备的低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#纯种酿造酒母，并用泵打循环混匀，进行混菌发酵；控制发酵温度25℃-27℃，每日早、晚2次打循环后取样监测发酵液的比重和温度。当比重不再下降时视为酒精发酵结束，4℃条件下密封贮存，期间进行几次排污以分离沉淀。每组有2个平行发酵罐。添加低产杂醇高产酯酿酒酵母发酵得到的葡萄酒酒精度为12.8％(v/v)-14％(v/v)，总糖(以葡萄糖计)<5g/L，总酸(酒石酸计)在4.6g/L左右，挥发酸(乙酸计)在0.15-0.4g/L，高级醇含量为195.5mg/L-210mg/L，酯类总量为40mg/L-48.5mg/L，杂醇降低25％以上，酯类增加30％以上。感官评价结果表明添加所述低产杂醇高产酯酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株jiangnan1#发酵葡萄酒色、香、味均优于商业酿酒酵母单独发酵，果香和花香更为浓郁突出。酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株jiangnan1#与其他微生物复配能够满足正常发酵需求，指标满足国家标准GB/T 15037—2006《葡萄酒》。
实施例10低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在果酒的应用
以李子为原料，依次进行清洗、去核、沥干、破碎后添加原料质量2-3倍果葡糖浆溶液，获得100L混料分装150L发酵罐中，添加20mg/L-40mg/L果胶酶(酶活20000U/g)和40mg/L-80mg/L偏重亚硫酸钾，分别以1％(v/v)-5％(v/v)的量接种1x107 CFU/mL浓度的低产杂醇高产酯酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株jiangnan1#扩培液，于20℃-25℃，pH 2.5-3.5条件下进行主发酵10-15天，温度降为5℃-8℃进行后发酵5-10天，获得发酵李子酒。每组有2个平行发酵罐。发酵得到的李子酒精度为10.5％(v/v)-12％(v/v)，总糖(以葡萄糖计)<40g/L。感官评价结果表明添加所述低产杂醇高产酯酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株jiangnan1#酿造李子酒酒体协调、口感柔和，果酒品质更佳。发酵李子酒其他指标符合GB 2758-2012和QB/T 5476-2020果酒通用技术要求的规定。
实施例11低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在果醋的应用
以实施例10中得到的果酒为原料，利用醋酸进行醋酸发酵。果醋酿造采用液态发酵工艺：接种1％-3％的醋酸菌于34℃进行醋酸发酵16天，淋醋，下胶澄清，脱气、杀菌后得到成品果醋。所得果醋中醋酸度为的3％-8％(g/100mL)，其他理化指标正常，满足国家标准《苹果醋饮料》GB/T 30884-2014，具有浓郁的果醋味，口感柔和、爽净，风味独特。
实施例12低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在啤酒的应用
以大麦芽(15kg-20kg)、酒花(50g-70g)和水(100L-120L)为主要原料，具体是采用多步浸泡出糖法，以麦芽汁为培养基按照实施例2的方法制备的低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#纯种速酿酒母，按照0.2％-1％的添加量添加到麦芽汁中，经麦芽粉碎，糖化，过滤，麦汁煮沸，发酵等工艺得到，采用上面发酵酵母，18％～23℃前发酵，时间为2-3天，发酵压力0.15Mpa，前发酵期间，每天糖度，待糖度降低至5Brix以下时降温至5℃贮存。所得啤酒酒精度为3％-5％(v/v)，总糖(以葡萄糖计)<50g/L，香味突出不浓郁，有麦芽香和果香味，杂醇含量低于120mg/L，其他理化指标正常。
实施例13低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在卷烟的应用
本实施例所指的烟叶为加工处理好的烟丝样品，烟草提取物为水提物或醇提物，市售购买获得。
将所述低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在培养温度为28℃±2℃的条件下，YPD培养基中振荡培养24h，得到浓度为106CFU/mL-108CFU/mL一级种子液，再以5％-10％的比例接种至含梨汁、葡萄汁、桂花或烟草提取物的种子培养基中发酵培养基中，培养48h后得到的酿酒酵母培养液，浓度为108CFU/mL-109CFU/mL，即为烟用添加香料，然后将所得烟用添加香料按照卷烟叶组质量的1％-5％的添加量直接添加到卷烟叶组中，补水至10％-20％，之后25℃-37℃培养4h-8h，最后进行烘烤后平衡水分，然后制作卷烟，或者将烟用添加香料溶于酒精75％制备香液(0.1g/mL-0.5g/mL)，按照适当比例均匀的喷洒在已经处理好的烟丝样品中后制作卷烟。所得卷烟烟气柔和、刺激性低，具有淡淡的果香、花香，宜人的甜醇香气和提取物特殊香气，可提高卷烟的抽吸品质，适合卷烟和新型烟草制品特殊香气提升和品质改善。
实施例14低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#在发酵型营养雪糕中的应用
以将饮用水、压榨果汁、糖、蜂蜜等为主要原料以(2～4):(0.05～0.2):(0.05～0.2):(0.01～0.05)的比例混合，进行调配至糖浓度在10Brix-20Brix，用食品级乳酸调节pH至4-5，接种5％-10％比例的麦芽汁培养的菌液浓度在106-108CFU/mL的低产杂醇高产酯酿酒酵母jiangnan1#，在30℃±2℃的恒温培养箱振荡培养24h-48h，发酵结束后，离心，用上清液或实施例3(1)中所得黄酒代替饮用水比例添加30％-50％全脂奶粉，1％-5％增稠剂、1％-5％乳化剂、1％-5％膨化剂、5％-10％植脂末等添加剂，至总干物为20％-30％，混合后进行巴氏灭菌，均质，然后4℃进行低温冷却老化1h左右，凝冻搅拌混合料后分装至模具，将模具进行冷冻、出模等后得到营养型发酵雪糕。所得雪糕具有淡淡的甜醇香气香和花果香，在消热解暑的同时口感柔和，可降低雪糕的入口刺激性和甜腻感。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
江南大学（绍兴）产业技术研究院
<120> 一株低产杂醇高产酯酿酒酵母菌株及其在发酵食品中的应用
<130> BAA210949A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 812
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 1
gggcttgggt ttatattttg aatggatttt tttgttttgg caagagcatg agagctttta 60
ctgggcaaga agacaagaga tggagagtcc agccgggcct gcgcttaagt gcgcggtctt 120
gctaggcttg taagtttctt tcttgctatt ccaaacggtg agagatttct gtgcttttgt 180
tataggacaa ttaaaaccgt ttcaatacaa cacactgtgg agttttcata tctttgcaac 240
tttttctttg ggcattcgag caatcggggc ccagaggtaa caaacacaaa caattttatt 300
tattcattaa atttttgtca aaaacaagaa ttttcgtaac tggaaatttt aaaatattaa 360
aaactttcaa caacggatct cttggttctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 420
acgtaatgtg aattgcagaa ttccgtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgcccc 480
ttggtattcc agggggcatg cctgtttgag cgtcatttcc ttctcaaaca ttctgtttgg 540
tagtgagtga tactctttgg agttaacttg aaattgctgg ccttttcatt ggatgttttt 600
tttccaaaga gaggtttctc tgcgtgcttg aggtataatg caagtacggt cgttttaggt 660
tttaccaact gcggctaatc ttttttatac tgagcgtatt ggaacgttat cgataagaag 720
agagcgtcta ggcgaacaat gttcttaaag tttgacctca aatcaggtag gagtacccgc 780
tgaacttaag catatcaata agcggaggaa tt 812

Claims (15)

1.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）jiangnan1#，已于2021年05月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2021523。
2.含有权利要求1所述酿酒酵母jiangnan1#的组合物，其特征在于，所述组合物为微生物菌剂。
3.含有权利要求1所述酿酒酵母jiangnan1#的组合物，其特征在于，所述组合物为酒药。
4.含有权利要求1所述酿酒酵母jiangnan1#的组合物，其特征在于，所述组合物为麦曲。
5.一种微生物制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的酿酒酵母jiangnan1#，或含有酿酒酵母jiangnan1#与其它微生物的活细胞，或含有酿酒酵母jiangnan1#与其它微生物冷冻干燥得到的干菌体。
6.根据权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中的酿酒酵母jiangnan1#的细胞数量≥1×107 CFU/mL，出芽率≥30%。
7.权利要求1所述的酿酒酵母jiangnan1#，或权利要求2~4任一所述的组合物，或权利要求5~6任一所述的微生物制剂在生产发酵制品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵制品为发酵烟叶或发酵雪糕。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵制品为发酵食品。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵制品为发酵饮品。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述发酵饮品为发酵酒精饮料或发酵醋。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述发酵酒精饮料为：黄酒、料酒、米酒、果酒、啤酒或白酒。
13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述发酵酒精饮料为葡萄酒。
14.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述发酵醋为果醋。
15.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述发酵醋为食醋。
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