CN116875522A - 含有醇脱氢酶突变体基因的工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了含有醇脱氢酶突变体基因的工程菌及其应用。本发明技术领域涉及含有醇脱氢酶突变体的基因工程菌及其在合成稀有糖方面的应用。所述基因工程菌，由醇脱氢酶突变体基因构建入芽孢杆菌或酿酒酵母获得，所述醇脱氢酶突变体，选自如SEQ ID NO:1所示PDH酶的如下突变中的一种：D36A/I37R、D36G/I37R、D36R/I37R、D36H/I37R、D36K/I37R、D36I/I37R、D36F/I37R、A14T/D36A/I37R、或A14T/D36G/I37R，或如SEQ ID NO:2所示GDH醇脱氢酶如下突变：E42A。本发明所述基因工程菌，具有提高的合成塔格糖活性。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程菌及其应用，具体的，涉及含有醇脱氢酶突变体基因的工程菌在合成稀有糖方面的应用，属于酶工程和细胞工厂合成稀有糖的技术领域。
背景技术
稀有糖是一类存在于自然界中但含量极少的单糖及衍生物，通常在膳食、保健、医药等领域中发挥着重要的功能。塔格糖（tagatose）是一种罕见的天然己酮糖，属于稀有糖类别。其甜味类似于蔗糖，甜度可达蔗糖的92%，而产生的热量只是蔗糖的30%，没有后味也不会产生任何不良风味，是一种新型低热量甜味剂，用于食品和药品领域，近些年引起广泛关注，是FDA批准的低能量甜味剂中口感、甜度和蔗糖最为相似的一个，是理想的蔗糖替代品。
生物法合成塔格糖具有环境友好、特异性高、副产物少等优势，目前工业合成塔格糖大部分采用酶法，具有高效和高特异性的特点，而酶法合成塔格糖主要是通过异构酶，由于异构反应的可逆性，所以理论转化率在50%以下，往往导致底物（半乳糖）和产物（塔格糖）混合，很难分离，所以工业化生产成本很高。
在自然界，塔格糖的合成首先利用木糖还原酶 XR 将半乳糖还原生成半乳糖醇，所述木糖还原酶 XR 为 NADPH 辅因子依赖，然后利用醇脱氢酶（PDH）将半乳糖醇氧化生成塔格糖，所述醇脱氢酶（PDH）为 NAD+辅因子依赖，两步反应的不同辅因子依赖性限制了反应的高效进行，有必要通过辅因子工程，逆转其中一个酶的辅因子偏好性来实现辅因子的统一，以提高生产效率，降低生产成本。
发明内容
发明目的：提供一种芽孢杆菌和酿酒酵母基因工程菌，及其在生产稀有糖方面的应用。所述稀有糖为塔格糖。
鉴于此目的，本发明提供了一种含有NADPH辅因子偏好性多元醇脱氢酶突变体的基因工程菌，其能够将中间体半乳糖醇高效氧化生成塔格糖，在酶反应体系中形成了NADPH辅因子循环。
本发明的技术方案是：基因工程菌，由醇脱氢酶突变体基因构建入芽孢杆菌或酿酒酵母获得，所述醇脱氢酶突变体，为氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的PDH 或SEQ IDNO: 2所示的GDH醇脱氢酶基因改良所得突变体。
所述基因工程菌，具有提高的合成塔格糖活性。
所述醇脱氢酶突变体，其辅因子偏好性为NAD+。
所述醇脱氢酶，来源于脱氮付球菌（Paracoccus denitrificans）的多元醇脱氢酶（polyol dehydrogenase, PDH，GenBank ID：WP_011751060），其氨基酸序列如SEQ ID NO:1 所示，命名为PdPDH；或来源于豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）的醇脱氢酶（galactitol dehydrogenase, GDH，GenBank ID：WP_011650422.1），其氨基酸序列如SEQID NO:2所示，命名为RlGDH。如附图1所示，SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2的氨基酸序列一致性在30%以上。
在一些实施例中，描述了所述醇脱氢酶，进一步优选的，包含与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2具有至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少100%的序列一致性的酶。
所述醇脱氢酶PDH或GDH突变体，其辅因子依赖为NADP+依赖，逆转了醇脱氢酶PDH或GDH的辅因子偏好性（NAD+依赖），具有依赖NADP+辅因子将半乳糖醇氧化为塔格糖的活性。
所述醇脱氢酶PDH突变体，为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列N末端具有如下突变中的一种D36A/I37R、D36G/I37R、D36R/I37R、D36H/I37R、D36K/I37R、D36I/I37R、D36F/I37R、A14T/D36A/I37R、或A14T/D36G/I37R。
所述醇脱氢酶GDH突变体，为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列N末端发生E42A突变。
所述醇脱氢酶PDH或GDH突变体在合成塔格糖方面的应用，以乳糖来源的半乳糖为底物，以木糖还原酶（XR）和醇脱氢酶突变体作为催化剂，以NADPH及其生成的NADP+为催化辅因子形成辅因子循环反应；所述木糖还原酶（XR），来源于毕赤酵母（Pichia stipitis），GenBank ID:XP_001385181，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
说明书附图2描述了以半乳糖为底物合成塔格糖的两种不同路径。其中，两种路径的第一步均利用木糖还原酶XR将半乳糖还原生成半乳糖醇，所述木糖还原酶XR为NADPH辅因子依赖；合成路径I为自然界的路径，其第二步利用醇脱氢酶（PDH）将半乳糖醇氧化生成塔格糖，所述醇脱氢酶（PDH）为NAD+辅因子依赖，两步反应的不同辅因子依赖性限制了反应的高效进行。
综上，合成路径I醛糖还原酶XR酶促反应的辅因子为NADPH，而野生型醇脱氢酶的辅酶为NAD+，因此，在使用二者催化生成塔格糖的过程中需要加入NADPH和NAD+两种辅因子，而塔格糖的生成量依赖于加入辅因子的量，需要大量消耗辅因子，造成生产成本过高。
合成路径II为本发明所述醇脱氢酶PDH或GDH的突变体合成塔格糖的路径，其中，第二步反应中醇脱氢酶PDH或GDH的突变体可直接利用第一步中生成的NADP+辅因子将半乳糖醇氧化生成塔格糖。
所述PDH或GDH突变体，逆转了醇脱氢酶PDH/或GDH的辅因子偏好性，辅因子从NAD+依赖变为NADP+依赖，与木糖还原酶XR协同作用时形成了第一步和第二步反应之间的辅因子循环。与合成路径I的自然界路径相比，本发明通过酶联反应实现了辅因子的循环利用合成塔格糖，显著减少了辅因子的用量，且不需要额外添加NAD+辅因子，简化了后处理工艺，极大地降低了生产成本，为塔格糖的规模化生产提供了可能性。
所述醇脱氢酶或其突变体的表达，其宿主细胞包括自然界分离的野生株、或者物理化学诱变后的变异株、或基因工程改造后的工程菌。使用本领域已知的方法在适合于产生所述醇脱氢酶或其突变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许醇脱氢酶或其突变体的表达和/或分离的条件下，在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。培养是使用本领域已知的程序，在适合的营养培养基中发生，所述培养基包含碳和/或氮的来源和/或无机盐。适合的培养基可以通过商业渠道购买，或根据公开的组成制备。
所述醇脱氢酶或其突变体，可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过多种常规程序从营养培养基中回收所述醇脱氢酶或其突变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的一些实施例中，描述了芽孢杆菌基因工程菌，其含有如前所述醇脱氢酶PDH或GDH突变体的基因。
所述芽孢杆菌基因工程菌，其出发菌株可以是野生株、物理化学诱变后的变异株、或基因工程改造后的工程菌。
所述芽孢杆菌属可以是多黏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、嗜热芽孢杆菌(B.thermophilus)、或耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)。
所述蜡样芽孢杆菌家族成员选自炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌等。
在优选的实施方案中，所述芽孢杆菌，选自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 168。
由于其GRAS (公认安全的) 状态，几种芽孢杆菌属种，如解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)被用于食品和制药工业中使用的多种蛋白质和化合物的生物技术生产。来自枯草芽孢杆菌的糖酶和蛋白酶被美国食品与安全监督管理局(FDA)认为是公认安全的(GRAS)。枯草芽孢杆菌也被欧洲食品***授予“ 安全资格认定(Qualified Presumptionof Safety)”地位。
在另一些实施例中，描述了酿酒酵母基因工程菌，其含有如前所述醇脱氢酶PDH或GDH的突变体的基因。
所述酿酒酵母（Saccharomyces），又称面包酵母或出芽酵母，酿酒酵母是发酵工业的重要微生物，主要用于酒精、啤酒和面包工业。传统的酿酒酵母选育改良方法主要为自然筛选、诱变育种和杂交育种，但这些方法转移性不强。基因工程技术提高了选育及改良酿酒酵母的特异性。酿酒酵母已被美国FDA认定为安全性生物，其表达产物不需经过大量宿主安全性实验,且发酵工艺简单，申请人发现，其导入本声明所述醇脱氢酶PDH或GDH的突变体的基因后，具有优异的合成稀有糖的性能。
在优选的实施方案中，所述酿酒酵母选自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4741。
以上物种的菌株，可以容易地在国内市场通过商业渠道购买，也可以在许多培养物保藏中心为公众所获得，如中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）、中国典型培养物中心（CCTCC）、广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）等。
本领域普通技术人员应该理解，遗传改变可以参考适合的宿主生物及其相应的代谢反应或用于希望的遗传材料(例如希望的代谢途径的基因)的适合的来源生物加以描述。然而，考虑到多种多样的生物的全基因组测序以及基因组学领域中的较高水平的技能，本领域普通技术人员可以将本发明所述基因工程菌重组技术应用于其他生物中。
在一些实施例中，还描述了所述芽孢或酿酒酵母基因工程菌的构建方法。所述构建方法，包括以枯草芽孢杆菌168和酿酒酵母BY4741细胞为出发菌株，导入如前所述醇脱氢酶PDH或GDH的突变体的基因的步骤。
所述基因工程菌的构建方法，优选的，包括：导入醇脱氢酶PDH或GDH的突变体的基因。
所述基因工程菌的构建方法，优选的，所述步骤包括：首先构建PDH突变体或GDH突变体构建体或重组表达载体，然后导入宿主细胞中，构建工程化宿主细胞。
在可行的实施方案中，优选的，如宿主细胞为枯草芽孢杆菌，在此情况下，用于转化宿主细胞的重组表达载体的质粒为pMA5-PDH以及pMA5-PDH1至pMA5-PDH9、或pMA5-GDH、pMA5-GDH1。
具体的，所述基因工程菌的构建方法，包括：
步骤1.根据醇脱氢酶及其突变体的基因序列，合成突变体PDH 、PDH1、PDH2、PDH3、PDH4、PDH5、PDH6、PDH7、PDH8、 PDH 9或GDH、GDH1的基因；
步骤2. 将步骤1合成的基因分别连接于含有不同抗性基因和整合位点的pMA5质粒上，转化大肠杆菌感受态，获得重组表达质粒pMA5-XR，pMA5-PDH 、pMA5-PDH1、pMA5-PDH2、pMA5-PDH3、pMA5-PDH4、pMA5-PDH5、pMA5-PDH6、pMA5-PDH7、pMA5-PDH8、pMA5-PDH9 和pMA5-GDH、 pMA5-GDH1；
步骤3. 将步骤2所得重组质粒转化到枯草芽孢杆菌中。
在可行的实施方案中，优选的，如宿主细胞为酿酒酵母，在此情况下，用于转化宿主细胞的重组表达载体的质粒为BYg-iXiP、BYg-iXiP1至BYg-iXiP19和BYg-iXiG、BYg-iXiG1。
具体的，所述基因工程菌的构建方法，包括：
步骤1. 根据醇脱氢酶及其突变体的基因序列，合成突变体PDH 、PDH1、PDH2、PDH3、PDH4、PDH5、PDH6、PDH7、PDH8、 PDH 9或GDH、GDH1的基因；
步骤2. 将步骤1合成的基因分别连接于含有不同抗性基因和整合位点的BYg质粒上，转化大肠杆菌感受态，获得重组表达质粒BYg-iXiP、BYg-iXiP1、BYg-iXiP2、BYg-iXiP3、 BYg-iXiP4、 BYg-iXiP5、 BYg-iXiP6、 BYg-iXiP7、 BYg-iXiP 8、BYg-iXiP9和BYg-iXiG、BYg-iXiG1。
步骤3. 将步骤2所得重组质粒转化到酿酒酵母中。
所述基因工程菌的构建方法，所述出发菌株包括自然界分离的野生株，或者物理化学诱变后的变异株，或者基因工程改造后的工程菌。
在一些实施例中，还描述了所述基因工程菌在D-塔格糖合成方面的应用。
所述应用，优选的，以乳糖来源的半乳糖为底物。
所述基因工程菌可以直接使用未纯化的含基因工程菌的溶液，优选纯化后的基因工程菌。
所述应用，优选的，与木糖还原酶联合使用，通过酶联反应实现辅因子NADPH和NADP+循环利用催化合成塔格糖，且无需额外添加NAD+，减少了辅因子的使用量。
工程菌株(Bacillus subtilis BStgtP8)BStgtP8和(Saccharomyces cerevisiaeSctgtP8)SctgtP8 保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，电话,027-68754052，保藏日期2023年6月29日，保藏编号分别为：CCTCCNO: M 20231126 和CCTCC NO: M 20231127。
术语：修饰是指对所述酶的氨基酸序列或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个氨基酸的置换、缺失和/或***，以及一个或多个氨基酸侧链的置换。
有益效果：本发明成功构建了含有所述醇脱氢酶突变体基因的芽孢杆菌或酿酒酵母基因工程菌，并利用其合成塔格糖。本发明所述醇脱氢酶突变体逆转了原酶的辅因子偏好性，并实现了辅因子在合成塔格糖两步反应中的循环使用，大大减少了反应过程中的辅因子消耗量，同时消除了辅因子反应副产物杂质的产生，有利于后期产品的纯化；所述醇脱氢酶突变体导入酿酒酵母或芽孢杆菌所构建的工程菌，提高了基础菌株的生产塔格糖的能力。本发明技术方案简单易行，适合工业化生产应用，同时解决了规模化工业生产中的高成本问题，具有重要的经济意义。
附图说明
图1. SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2的氨基酸序列比对。
图2. 由半乳糖合成塔格糖的路径。
图3. XR酶及实施例1所得醇脱氢酶突变体的SDS-PAGE分析图谱。从左到右分别为泳道1至泳道13。泳道1为XR酶，泳道2-10依次为PDH酶及其突变体PDH1、PDH2、 PDH3、 PDH4、PDH5、 PDH6、 PDH7、PDH8、 PDH9，泳道11-12依次是GDH酶及其突变体GDH1；泳道13是蛋白Marker。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得。
下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，在不偏离本发明的构思和使用范围情况下对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换均落入本发明的保护范围内。
除非有其他定义，本说明书中使用的所有技术术语以及科学术语与本领域技术人员通常理解的术语具有相同的意义。一般情况下，本说明书中使用的命名法以及以下记述的实验方法，是在本领域中众所周知且通常被使用的。
如下实施例中，乳糖、半乳糖、半乳糖醇和塔格糖等利用高效液相色谱（HPLC）分析，条件如下：色谱柱型号：Shodex SP-0810 column (300 mm × 8mm，Showa Denko K.K.，Tokyo，Japan)，流动相为ddH2O，柱温70℃，进样体积10 μL，示差检测器（RI detectorL2490，HITACHI，Japan日立Chromaster），流速1.0 mL/min，HPLC图谱显示，塔格糖标准品出峰时间rt=14.29 min。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本技术领域内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如 Sambrook 等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1. 醇脱氢酶PDH或GDH及其突变体的重组和表达。
将醇脱氢酶（PDH/GDH）基因送去基因公司合成。依据醇脱氢酶（PDH/GDH）及其氨基酸的氨基酸序列，合成醇脱氢酶（PDH/GDH）基因并连接到PET32a质粒载体上，最终得到PET32a-PDH和PET32a-GDH重组表达质粒。
以PDH/GDH基因合成的DNA为模板，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，设计突变体上游引物和下游引物（详见表1、表2），利用点突变试剂盒，最终转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达质粒。
按如下步骤将上述验证正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中：取BL21感受态菌，置于冰上30 min融化，取100 μL感受态细胞与10 μL的上述重组质粒（浓度50 ng/μL）混合，置于42℃水浴中热激45 s，随后立即冰浴2 min冷却，加入1 mL的新鲜LB培养基（LB培养基：蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，NaCl 1.0%，平板加1.5% 琼脂粉），于37℃、100 rpm条件下复苏培养1 h，之后取100 μL菌液涂布于含有氨苄青霉素（100 μg/ml）的LB平板，37℃恒温培养箱培养12 h后挑取单菌落，通过测序以验证重组质粒构建是否成功。
然后，挑取上述阳性转化子，接种到LB液体培养基中，置于37℃、200 rpm摇床上振荡培养12 h，得种子液；再以1%（v/v）的接种量将种子液接种到新鲜的LB培养基中，于37℃振荡培养至OD 600 为0.8，经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，IPTG终浓度0.1mmol/L，于16℃诱导12 h，转速200 rpm。诱导表达后，在4℃下将发酵液以5000 r/min离心30 min收集菌体。将菌体用20 mM pH7.4 PBS缓冲液重悬后，以plus on 5s / off 5s的频率下超声30 min中以破碎菌体；将破碎后液体于13000×g、4℃离心30 min去除细胞碎片后收集上清液。
利用镍柱亲和层析法纯化得到所述醇脱氢酶突变体，过程如下：向镍柱加入去离子水至柱顶端，自然洗脱后，用5倍体积的Binding buffer洗脱；再将经0.45 μm滤膜过滤的粗酶液上柱，以1.5 ml/min流速使样品与镍柱充分结合，待样品流干后分别用5倍柱体积的Washing buffer连续梯度洗脱去除杂蛋白，最后用5倍Elution buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液。然后利用SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况（详见图3），基因工程菌经诱导后有明显的特异表达条带，所得蛋白为所述醇脱氢酶的突变体PDH1-PDH9或GDH1 ，突变体PDH1-PDH9或GDH1与原酶PDH或GDH的突变方式对应关系见表3。
表1. 醇脱氢酶PDH突变体与引物
。
表2. 醇脱氢酶GDH突变体与引物
。
表3. 醇脱氢酶突变体与突变方式的对应关系
。
实施例2. 醇脱氢酶突变体催化合成塔格糖（一步反应法，辅酶NADPH 2mM）。
分别将20 mM半乳糖，0.02 mg木糖还原酶（XR），1.728 mg醇脱氢酶突变体（ PDH1、或PDH2、或PDH3、或PDH4、或PDH5、或PDH6、或PDH7、或PDH8、 或PDH 9、或GDH1），2 mM 辅因子NADPH，100 mM Tri-HCl缓冲液（pH8.0）混匀，30℃反应15小时，终止反应，用凝胶柱法对其进行纯化。HPLC色谱法分别测定反应液中塔格糖的浓度，结果见表4。
表4.醇脱氢酶突变体与XR催化合成塔格糖研究
。
实施例3. 重组芽孢杆菌的制备。
根据木糖还原酶XR和醇脱氢酶及其突变体（PDH 、PDH1、PDH2、PDH3、PDH4、PDH5、PDH6、PDH7、PDH8、 PDH 9或GDH、GDH1）的基因序列，分别合成基因。利用重组克隆试剂盒的方法，将合成的三个基因分别连接于含有不同抗性基因和整合位点的pMA5质粒上，转化大肠杆菌感受态，获得重组表达质粒pMA5-XR，pMA5-PDH 、pMA5-PDH1、pMA5-PDH2、pMA5-PDH3、pMA5-PDH4、pMA5-PDH5、pMA5-PDH6、pMA5-PDH7、pMA5-PDH8、pMA5-PDH9 和pMA5-GDH和pMA5-GDH1。
按如下步骤将上述验证正确的重组质粒转化到枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168中：
将新鲜活化的枯草芽孢杆菌单菌落接种于5 mL GMI培养基中，30℃，125 rpm条件下过夜培养，按照10%的接种量转接与GMI培养基中，37℃，220 rpm培养3.5 h后，按照10%的接种量转接至GMII培养基中，37℃，125 rpm培养90 min，5000 g，离心10 min收集菌体得到感受态细胞。向0.5 mL感受态中加入5μg上述重组表达质粒，37℃，220 rpm振荡培养30min后涂布于相应抗性平板上，37℃培养过夜得到转化子。
分别挑取各转化子的单菌落接种LB培养基中，37℃，220 rpm培养48h后，分别得菌株BStgtP、BStgtP1、BStgtP2、BStgtP3、BStgtP4、BStgtP5、BStgtP6、BStgtP7、BStgtP8、BStgtP9和BStgtG、BStgtG1，筛选得高产塔格糖的合成菌株。 其中，菌株BStgtP8保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国. 武汉.武汉大学，保藏日期2023年6月29日，保藏编号：CCTCC NO: M 20231126 。
表5. 芽孢杆菌工程菌与其基因型
。
实施例4.重组酿酒酵母的制备 。
根据木糖还原酶（XR）和醇脱氢酶突变体（PDH 、PDH1、PDH2、PDH3、PDH4、PDH5、PDH6、PDH7、PDH8、PDH9或 GDH 、GDH1）的基因序列，分别合成基因。利用重组克隆试剂盒的方法，将合成的三个基因分别连接于含有抗性基因和整合位点的BYg表达质粒上，转化大肠杆菌感受态，获得重组表达质粒BYg-iXiP、BYg-iXiP1、BYg-iXiP2、BYg-iXiP3、 BYg-iXiP4、BYg-iXiP5、 BYg-iXiP6、 BYg-iXiP7、 BYg-iXiP8、BYg-iXiP9和BYg-iXiG、BYg-iXiG1。
按如下步骤将上述验证正确的重组质粒转化到酿酒酵母BY4741中：
Carrier DNA在95-100℃条件下，处理3min后快速冰浴冷却3 min，重复操作一次，得到单链DNA。
取100 uL购买的酿酒酵母BY4741感受态细胞至于冰上融化后，依次加入预冷的目的质粒BYg-iXiGM或者BYg-iXiPM，单链Carrier DNA 10 uL，PEG/LiAc 500 uL，用枪吹打几次充分混匀，30℃冰浴30 min后，置于42℃水浴15 min，5000 rpm离心40s，弃上清，加入400uL的ddH2O重悬沉淀，再次离心去上清，加入50 uL的ddH2O重悬，涂布在含有抗生素的YPD平板上，30℃培养3天。
分别挑取各转化子的单菌落接种YPD培养基中，30℃，220 rpm培养72 h后，分别得重组菌株SctgtP、SctgtP1、SctgtP2、SctgtP3、SctgtP4、SctgtP5、SctgtP6、SctgtP7、SctgtP8、SctgtP9和SctgtG、SctgtG1，得塔格糖的合成菌株。其中，菌株SctgtP8保藏于 中国典型培养物保藏中心，地址：中国. 武汉.武汉大学，保藏日期2023年6月29日，保藏编号：CCTCC NO: M 20231127。
表6. 酿酒酵母基因工程菌与其基因型
。
实施例5. 实施例3所得枯草芽孢基因工程菌株和实施例4所得酿酒酵母基因工程菌株合成塔格糖研究。
摇瓶发酵如下：
1）一级种的制备：分别取实施例3所得枯草芽孢基因工程菌株和实施例4所得酿酒酵母基因工程菌株单菌落在10 mL LB/YPD 液体培养基37℃/30oC、200 rpm培养过夜，所得的菌种为一级种。
2）二级种的制备：一级种接种于1 L的LB /YPD液体培养基，同时添加高浓度为1%的葡萄糖和1%半乳糖，于30oC，200 rpm 培养3-5天，取样，HPLC法检测生成的塔格糖产量，结果分别记录于表7-8。
表7. 实施例3所得枯草芽孢杆菌基因工程菌合成塔格糖研究
。
表8. 实施例4所得酿酒酵母基因工程菌合成塔格糖研究
。
表7和表8数据说明：含有醇脱氢酶突变体基因的枯草芽孢杆菌基因工程菌、酿酒酵母基因工程菌具有提高的合成塔格糖活性。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的范围。
Claims (7)
1.含有醇脱氢酶突变体基因的基因工程菌，其特征在于，由醇脱氢酶突变体基因构建入宿主细胞获得，所述宿主细胞选自芽孢杆菌或酿酒酵母，所述醇脱氢酶突变体选自氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的PDH酶具有如下突变中的一种D36A/I37R、D36G/I37R、D36R/I37R、D36H/I37R、D36K/I37R、D36I/I37R、D36F/I37R、A14T/D36A/I37R、或A14T/D36G/I37R，或氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的GDH醇脱氢酶发生如下突变：E42A。
2.如权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1.构建PDH突变体/或GDH突变体的构建体或重组表达载体；
步骤2.将步骤1所得构建体或重组表达载体导入宿主细胞中，构建工程化宿主细胞。
3.如权利要求2所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌情况下，包括如下步骤：
步骤1. 根据醇脱氢酶及其突变体的基因序列，合成突变体PDH 、PDH1、PDH2、PDH3、PDH4、PDH5、PDH6、PDH7、PDH8、 PDH 9或GDH、GDH1的基因；
步骤2. 将步骤1合成的基因分别连接于pMA5质粒上，转化大肠杆菌感受态，获得重组表达质粒pMA5-XR，pMA5-PDH 、pMA5-PDH1、pMA5-PDH2、pMA5-PDH3、pMA5-PDH4、pMA5-PDH5、pMA5-PDH6、pMA5-PDH7、pMA5-PDH8、pMA5-PDH9 和pMA5-GDH、 pMA5-GDH1；
步骤3. 将步骤2所得重组质粒转化到枯草芽孢杆菌中。
4.如权利要求2所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞为酿酒酵母情况下，包括如下步骤：
步骤1. 根据醇脱氢酶及其突变体的基因序列，合成突变体PDH 、PDH1、PDH2、PDH3、PDH4、PDH5、PDH6、PDH7、PDH8、 PDH 9或GDH、GDH1的基因；
步骤2. 将步骤1合成的基因分别连接于BYg质粒上，转化大肠杆菌感受态，获得重组表达质粒BYg-iXiP、BYg-iXiP1、BYg-iXiP2、BYg-iXiP3、 BYg-iXiP4、 BYg-iXiP5、 BYg-iXiP6、 BYg-iXiP7、 BYg-iXiP 8、BYg-iXiP9和BYg-iXiG、BYg-iXiG1；
步骤3. 将步骤2所得重组质粒转化到酿酒酵母中。
5.如权利要求1所述基因工程菌在合成塔格糖方面的应用。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，依赖NADP+辅因子将半乳糖醇氧化为塔格糖。
7.如权利要求5所述应用，其特征在于，底物选自乳糖来源的半乳糖。
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