CN109055417B - 一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶q10中的应用 - Google Patents

一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶q10中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶Q10中的应用。具体地，本发明提供一种外源导入编码全局调控蛋白irrE的基因来构建重组微生物的方法，该重组微生物适用于发酵法生产辅酶Q10，特别适用于生产氧化型辅酶Q10。本发明的重组微生物具有抗逆性，对包括高渗透压和高氧化还原电位在内的恶劣环境具有较好的耐受性，因此可以显著提高辅酶Q10，特别是氧化型辅酶Q10的产量。

Description

一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶Q10中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组微生物及其在生产辅酶Q10中的应用。
背景技术
辅酶Q10(CoQ10)又名泛醌、癸烯醌，化学名称为2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯苯醌。辅酶Q10的生物活性来自于其醌环的氧化还原特性及其侧链的理化性质，它是细胞自身产生的天然抗氧化剂和细胞代谢激活剂，其具有抗氧化、消除自由基、提高机体免疫力、抗衰老等功能，临床上广泛应用于各类心脏病、癌症、糖尿病、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗，而且在食品、化妆品及抗衰老保健品方面也有很多的应用。
微生物发酵法是目前辅酶Q10的主要生产方式。利用微生物发酵法生产辅酶Q10，无论是从产品的质量还是安全性方面，都有较大的竞争优势，适用于大规模的工业化生产。但在微生物生长或增殖过程中，尤其是在工业发酵环境下通常会遭遇各种恶劣环境的外部压力。例如发酵环境中渗透压、pH、溶氧、营养物质等条件存在一定的波动性。微生物的生长受其影响，具有不易掌控的特性，辅酶Q10的生产也具有不稳定性。同时受发酵环境限制，工业生产中的生物量难以进一步提高。因此有必要提高辅酶Q10生产菌对恶劣环境的耐受能力，从而进一步提高辅酶Q10的产量。
已报道的辅酶Q10发酵相关技术的研究主要集中在通过基因工程技术改造来提高辅酶Q10的生产水平，或通过菌种诱变处理、单一因素优化调整实验来考察其对产物合成的影响，也有的专利文献报道采用通过发酵过程中关键参数的在线控制来优化发酵过程。这些研究和技术虽然也起到一定的作用，但都未从根本上提高辅酶Q10生产菌对恶劣环境的耐受能力，从而达到提高产能的目的。
如专利文献1提出通过调节氧消耗速率(溶氧)和电导率(补加营养素速率)协同控制辅酶Q10的发酵过程；专利文献2则以发酵过程中的菌体形状为判断依据来调节工艺参数；专利文献3通过改造类红球细菌来提高微生物合成辅酶Q10的能力。这些工艺共同的特点是生产出的辅酶Q10都是氧化型辅酶Q10和还原型辅酶Q10的混合物，且还原型辅酶Q10的比例相对高。特别是专利文献4所述的工艺，在发酵结束后，微生物产出的辅酶Q10中还原型辅酶Q10的含量在70％以上。
专利文献5中公开了一种氧化型辅酶Q10的发酵生产方法。该专利通过在Q10合成积累阶段的后期调控氧化还原电势ORP，使菌株生产出高含量的氧化型辅酶Q10，其中氧化型辅酶Q10的含量为96％以上，但该方法未解决高氧化还原电位对生产菌株的氧化胁迫所导致的菌体内代谢产物积累、菌体生长受到抑制等问题。
现有技术文献
专利文献1：CN105420417A
专利文献2：CN104561154A
专利文献3：CN103509729B
专利文献4：US7910340B2
专利文献5：CN108048496A
发明内容
发明要解决的问题
为解决上述辅酶Q10的发酵过程中，尤其是氧化型辅酶Q10的发酵过程中存在的问题，提高辅酶Q10生产菌对恶劣环境的耐受性，本发明构建了一种重组微生物，通过外源导入编码全局调控蛋白irrE的基因，从而提高辅酶Q10生产菌对恶劣环境的耐受性，适用于发酵法生产辅酶Q10，特别适用于生产氧化型辅酶Q10。
所述重组微生物具有抗逆性，对包括高渗透压和高氧化还原电位在内的恶劣环境具有较好的耐受性。通过过表达如SEQ ID NO：1所示的编码全局调控蛋白irrE的基因可以很好地改善辅酶Q10发酵过程中微生物的这些性能。
全局调控蛋白irrE作为激活生物体内相关重要基因的开关，在DNA损伤修复和保护辐射胁迫反应的途径中起到中心调控作用。外源导入编码全局调控蛋白irrE的基因可以提高微生物对渗透压、氧化、辐射和热等多种胁迫的耐受性，一方面延长了菌种的对数生长期，促进了生物量的进一步积累，另一方面使得菌种在发酵过程中保持旺盛的生长和代谢活力，从而提高辅酶Q10的产量，尤其是提高氧化型辅酶Q10的产量。
优选的，本发明还可以通过启动子替换，将重组载体上的控制编码全局调控蛋白irrE的基因表达的启动子敲除后***其他不同的启动子，进一步调控编码全局调控蛋白irrE的基因的表达。
所***的启动子优选为SEQ ID NO：2所表示的渗透压调控型启动子proPB。该启动子的初始表达强度较低，但其表达强度会随着渗透压的升高而变强。从而使得全局调控蛋白irrE的表达量随着渗透压的升高而增加，提高微生物对不同强度的胁迫压力的耐受性。
用于解决问题的方案
本发明提供一种用于生产重组微生物的方法，所述方法包括如下步骤：
a.从含有编码全局调控蛋白irrE的基因的亲本菌株中克隆得到所述的编码全局调控蛋白irrE的基因；
b.将所述的编码全局调控蛋白irrE的基因连接到载体上，构建含有所述编码全局调控蛋白irrE的基因的重组载体；
c.将重组载体导入宿主细胞中从而得到所述的重组微生物。
上述本发明方法中，所述步骤b包括通过启动子替换，将重组载体上的控制编码全局调控蛋白irrE的基因表达的启动子敲除后***其他不同的启动子，进一步调控编码全局调控蛋白irrE的基因的表达。
上述本发明方法中，所述步骤b***的启动子使用诱导型启动子，优选渗透压调控型启动子proPB，所述渗透压调控型启动子proPB从包含SEQ ID NO：2的至少70个连续核苷酸的部分核苷酸序列的多核苷酸分子或多核苷酸序列获得，优选包含至少100个连续核苷酸，更优选包含至少150个连续核苷酸，最优选包含SEQ ID NO：2的完整核苷酸序列。所述多核苷酸序列与SEQ ID NO：2具有至少60％的同源性，优选至少80％的同源性，更优选至少90％的同源性，优选所述渗透压调控型启动子proPB为SEQ ID NO：2所表示的核苷酸序列。所述渗透压调控型启动子proPB分离自细菌，优选为埃希氏菌属(Escherichia)，更优选为大肠杆菌(Escherichia coli)。
上述本发明方法中，所述步骤b的载体选自pBR322及其衍生物、pACYC177、pACYC184及其衍生物、RK2、pBBR1MCS-2、粘粒载体及其衍生物，优选pBBR1MCS-2。
上述本发明方法中，所述步骤a包括根据SEQ ID NO：1所示的DNA序列设计引物，以从所述亲本菌株中提取的基因组DNA为模板，采用PCR法合成所述编码全局调控蛋白irrE的基因。
上述本发明方法中，所述步骤a中编码全局调控蛋白irrE的基因从包含SEQ IDNO：1的至少100个连续核苷酸的部分核苷酸序列的多核苷酸分子或多核苷酸序列获得，优选包含至少300个连续核苷酸，更优选包含至少600个连续核苷酸，最优选包含SEQ ID NO：1的完整核苷酸序列。所述多核苷酸序列与SEQ ID NO：1具有至少60％的同源性，优选至少80％的同源性，更优选至少90％的同源性，优选所述编码全局调控蛋白irrE的基因为SEQID NO：1所表示的核苷酸序列。所述亲本菌株为细菌，优选为异常球菌属(Deinococcus)，更优选选自由耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、沙漠异常球菌(Deinococcusdeserti)、戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)、解蛋白异常球菌(Deinococcusproteolyticus)组成的组，最优选为耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)。
上述本发明方法中，所述步骤c的导入方式选自转化、转导、接合转移和电穿孔，所述宿主细胞选自细菌或真菌，优选为红细菌属的细菌，更优选为类球红细菌。优选所述步骤c包括将步骤b得到的重组载体转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞，再通过接合转移导入宿主细胞，得到遗传稳定的重组微生物。
本发明还提供一种重组微生物，其至少含有上述编码全局调控蛋白irrE的基因和渗透压调控型启动子proPB。
本发明还提供一种生产辅酶Q10的方法，其包括使用上述方法生产重组微生物，以及使用上述重组微生物生产辅酶Q10。
本发明还提供一种生产氧化型辅酶Q10的方法，其包括使用上述方法生产重组微生物，以及使用上述重组微生物生产氧化型辅酶Q10。
发明的效果
本发明人经过潜心研究，令人惊异地发现，经编码全局调控蛋白irrE的基因导入和启动子替换构建的重组微生物，尤其是重组的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)具有抗逆性，对包括高渗透压和高氧化还原电位在内的恶劣环境具有较好的耐受性，一方面延长了菌种的对数生长期，促进了生物量的进一步积累，另一方面使得菌种在发酵过程中保持旺盛的生长和代谢活力。
此外，现有氧化型辅酶Q10的直接生产工艺中，发酵后期在胞内累积大量的氧化型辅酶Q10，菌体本身承受的氧化胁迫较强。本申请的重组微生物增强了菌体对氧化胁迫的耐受性，显著提高了氧化型辅酶Q10的效价，有助于提高其在辅酶Q10总量中的比例。
此外，本申请在上述重组微生物的构建中还发现，将控制编码全局调控蛋白irrE的基因表达的启动子替换为proPB启动子之后，可以通过渗透压的变化来调控全局调控蛋白irrE的表达，阶段性地提高了辅酶Q10生产菌的抗逆性，满足发酵过程不同阶段中菌体对恶劣环境耐受性的需要，进而促进辅酶Q10的生产，特别是氧化型辅酶Q10的生产。
附图说明
图1为原始质粒pBBR1MCS-2的图谱。
图2为重组质粒pBBR1MCS-2-G-proPB-IrrE的图谱。
图3为含有编码全局调控蛋白irrE的基因但未进行渗透压调控型启动子proPB替换的重组微生物RSP-CE的电泳图。
图4为含有编码全局调控蛋白irrE的基因且进行渗透压调控型启动子proPB替换的重组微生物RSP-BE的电泳图。
具体实施方式
1、生产辅酶Q10的微生物
本发明通过外源导入编码全局调控蛋白irrE的基因来构建重组微生物，从而提高辅酶Q10生产菌对恶劣环境的耐受性，适用于发酵法生产辅酶Q10，特别适用于生产氧化型辅酶Q10。
本发明的编码全局调控蛋白IrrE的基因，可以从编码全局调控蛋白irrE的多核苷酸分子获得，并且包含SEQ ID NO：1的至少100个连续核苷酸的部分核苷酸序列。优选地，包含SEQ ID NO：1的至少300个或更优选地，至少600个连续核苷酸的部分核苷酸序列，最优选的是包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO：1表示从耐辐射异常球菌中分离出的irrE的完整核苷酸序列。
所述的编码全局调控蛋白IrrE的基因，也可以从编码全局调控蛋白irrE的较长的多核苷酸序列获得。此类多核苷酸可以例如分离自细菌。优选地，它们是从属于异常球菌属(Deinococcus)的细菌中分离出来的，所述细菌包括但不限于耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、沙漠异常球菌(Deinococcus deserti)、戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)、解蛋白异常球菌(Deinococcus proteolyticus)。
当此类多核苷酸从较长的多核苷酸序列获得时，确定此类多核苷酸序列与SEQ IDNO：1之间的同源性是可能的。在此种情况下，优选地，选择具有至少100个连续核苷酸的区域，将来自其它多核苷酸的相应的片断与其进行比较。当多核苷酸序列与可从SEQ ID NO：1获得的相应片断具有例如60个相同的核苷酸时(通过对100个连续的核苷酸进行比较)，那么同源性就是60％。优选地，本发明的部分多核苷酸序列与SEQ ID NO：1具有至少80％的同源性，更优选地，至少90％的同源性。为确定同源性，使用例如至少100个连续核苷酸的片断，优选地，至少300个连续核苷酸的片断，更优选地，至少500个连续核苷酸的片断。
本领域技术人员了解下述事实：多肽中的某些片断是生物学功能所必需的。但是，存在有其它区域，其中氨基酸可被***、缺失或被其它氨基酸取代，优选是与被代替的氨基酸相似的那些氨基酸取代。
进一步地，本发明的目的是提供一种适用于生产高含量氧化型辅酶Q10的微生物。专利文献5公开了一种通过控制发酵液的ORP来提高微生物产出的辅酶Q10中氧化型辅酶Q10含量的发酵方法。该公开文本通过引用并入本文。
我们发现，在合适的培养条件下，具有抗逆性的微生物可用于进一步优化对高含量氧化型辅酶Q10的直接生产。
术语“直接生产”、“直接发酵”、“直接转化”等意指微生物能通过一个或多个生物转化步骤将某底物转化为特定的产物，而无需任何额外的化学转化步骤，例如，将提取得到的还原型辅酶Q10进一步氧化成氧化型辅酶Q10。
2、生产辅酶Q10的重组微生物的制备方法
本发明人对生产辅酶Q10的微生物进行基因工程改造，以优化对辅酶Q10的生产。
本发明的用于生产辅酶Q10的重组微生物的制备包括以下步骤：
a.从含有编码全局调控蛋白irrE的基因的亲本菌株中克隆得到所述的编码全局调控蛋白irrE的基因；
b.将所述的编码全局调控蛋白irrE的基因连接到载体上，构建含有所述编码全局调控蛋白irrE的基因的重组载体；
c.通过适于将载体导入宿主细胞中的方法，例如，转化、转导、接合转移和/或电穿孔，构建重组微生物，其含有编码全局调控蛋白irrE的基因，所述宿主细胞由此变成了本发明的重组生物。
所述步骤a中，在从含有编码全局调控蛋白irrE的基因的菌株中分离所述的编码全局调控蛋白irrE的基因时，可通过如下示例性的方法：
(i)通过本领域内已知的方法，使用基于本文公开的DNA序列设计的引物，通过PCR获得目的基因。
(ii)用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。
(iii)通过本领域内已知的方法，例如DNA合成仪来合成目的基因。
一旦获得携带有所需基因的克隆，就可以通过本领域公知的方法测定目标基因的核苷酸序列。
所述步骤b中，在对双链DNA的克隆中，可以使用一系列宿主/克隆载体的组合。用于在E.coli中表达本发明的基因(即irrE基因)的优选载体可以选自任何通常用于E.coli中的载体，例如pBR322或其衍生物(例如pUC18和pBluescriptII(Stratagene CloiningSystems,Calif.,USA))、pACYC177和pACYC184及其衍生物和来自广宿主范围质粒的载体，例如RK2和pBBR1MCS-2。用于在类球红细菌中表达本发明的核苷酸序列的优选载体选自可在类球红细菌以及优选的克隆生物(例如E.coli)中复制的任何载体。优选的载体是广宿主范围载体，例如，粘粒载体(例如pVK100)及其衍生物和pBBR1MCS-2。可通过使用本领域公知的任何方法，例如，转化、转导、接合转移或电穿孔，在考虑宿主细胞和载体性质的情况下，将此类载体转移至优选的宿主中。
使用本领域公知的方法，可将本发明提供的irrE基因/核苷酸序列连接到合适的载体上，所述载体含有在宿主细胞中可操作的调控序列，例如，启动子、核糖体结合位点和转录终止子，以产生重组载体。
所述步骤b中，还可以通过启动子替换，将重组载体上的控制编码全局调控蛋白irrE的基因表达的启动子敲除后***其他不同的启动子，进一步调控编码全局调控蛋白irrE的基因的表达。所***的启动子可以为组成型启动子或诱导型启动子：例如，基因的原始启动子，抗生素抗性基因的启动子，渗透压调控型启动子，温度诱导型启动子，E.coli的beta半乳糖苷酶(lac)、trp、tac、trc启动子和可在宿主细胞中发挥功能的任何启动子。优选地，所述的启动子为诱导型启动子，特别是渗透压调控型启动子，更优选地，为渗透压调控型启动子proPB。
所述的渗透压调控型启动子proPB，可以从渗透压调控型启动子proPB的多核苷酸分子获得，并且包含SEQ ID NO：2的至少70个连续核苷酸的部分核苷酸序列。优选地，包含SEQ ID NO：2的至少100个连续核苷酸的部分核苷酸序列，更优选地包含至少150个连续核苷酸的部分核苷酸序列。最优选地包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO：2表示从大肠杆菌中分离出的proPB启动子的完整核苷酸序列。
所述的渗透压调控型启动子proPB，也可以从含有渗透压调控型启动子proPB的较长的多核苷酸序列获得。此类多核苷酸可以例如分离自细菌，优选为埃希氏菌属(Escherichia)，更优选为大肠杆菌(Escherichia coli)。当此类多核苷酸从较长的多核苷酸序列获得时，确定此类多核苷酸序列与SEQ ID NO：2之间的同源性是可能的。此处同源性的定义与前述SEQ ID NO：1的同源性定义相同。优选地，本发明的部分多核苷酸序列与SEQID NO：2具有至少80％的同源性，更优选地，至少90％的同源性。为确定同源性，使用例如至少100个连续核苷酸的片断，优选地，至少200个连续核苷酸的片断。
为进行表达，其它调控元件，例如，在宿主细胞中(将在其中导入编码序列，以提供本发明的重组细胞)可操作的Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGAGG等，包括在宿主细胞中可操作的天然和合成的序列)以及转录终止子(反向重复结构，包括任何天然的和合成的序列)，可以与上述启动子一起使用。
所述步骤c中，为构建携带有重组载体的重组微生物，可使用多种基因转移方法，例如转化、转导、接合转移或电穿孔。用于构建重组细胞的方法可以选自分子生物学领域公知的方法，例如，传统的转化***可用于大肠杆菌。转导***也可用于大肠杆菌，接合转移***可广泛用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，例如，大肠杆菌和类球红细菌。CN103509816B公开了一种接合转移法，接合可发生于例如液体培养基中或固体培养基表面上。可向用于接合转移的受体中加入选择性标记，例如，通常选择卡那霉素的抗性。天然的抗性也可使用，例如，可将对萘啶酮酸的抗性用于类球红细菌。
本发明还涉及包含所述多核苷酸的重组载体，优选能在合适的宿主细胞中发挥功能的重组载体。
本发明可使用本领域常规用于辅酶Q10生产的微生物，包括细菌、酵母、霉菌中的任意一种，对其采用本领域公知的基因工程技术手段后可得到上述本发明的重组微生物。所述微生物具体包括例如土壤杆菌属(Agrobacterium)、土壤单胞菌属(Agromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红酵母属(Rhodotorula)、根单胞菌属(Rhizomonas)、红菌属(Rhodobium)、红游动菌属(Rhodoplanes)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)等微生物，优选根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacience)、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、寡养土壤单胞菌(Agromonas oligotrophica)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、微小红酵母(Rhodotorula minuta)、血色红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、荚膜红细菌(Phodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)等，进一步优选为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
因此，本发明还涉及如上所述的宿主细胞，其中具有包含所述多核苷酸的重组载体。基因工程改造后的此类宿主细胞被称为重组宿主细胞或重组微生物。
3、微生物发酵生产辅酶Q10
本发明的生产辅酶Q10的微生物的发酵方法，其特征在于使用了上述重组微生物进行发酵生产。由于本发明的重组微生物可以提高微生物对渗透压、氧化、辐射和热等多种胁迫的耐受性，因此与现有技术中的辅酶Q10的发酵方法相比，一方面延长了菌种的对数生长期，促进了生物量的进一步积累，另一方面菌种生长和代谢旺盛，显著提高了辅酶Q10的效价。本发明方法使用重组微生物生产辅酶Q10的发酵工艺条件可参考专利文献1。具体方法如下：
在辅酶Q10生产菌株的发酵过程中，氧消耗速率稳定在30～150mmol/L·h之间，同时电导率稳定在5.0～30.0ms/cm之间，以促进菌体生长和辅酶Q10合成的启动并积累。作为优选，在辅酶Q10生产菌株的发酵过程中，控制氧气消耗速率在30～90mmol/L·h。作为优选，在辅酶Q10生产菌株的发酵过程中，控制发酵液的电导率10～20ms/cm。
本发明的辅酶Q10的发酵生产方法中，所述的氧消耗速率通过搅拌转速和空气流量进行调节，所述的电导率通过流加补料或分批补料的方式进行调节。其中，流加补料或分批补料时所用的补料液的配方如下：以一升补料液计，酵母粉8～12g，(NH4)2SO45～10g，MgSO41～2g，NaCl 3～6g，KH2PO42～4g，K2HPO42～4g，CaCl21～2g，生物素0.013～0.025g，pH值7.0，补料培养基电导率为13.5～23ms/cm。
本发明的辅酶Q10的发酵生产方法中，不仅可以使用类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)RSP-BE，还可以使用其经物理或化学诱变方法选育的菌株、或者基因工程方法改造的菌株。
本发明方法使得辅酶Q10的效价为至少1000mg/L，优选为至少2000mg/L，更优选为至少3000mg/L。辅酶Q10的效价指的是单位体积发酵液中辅酶Q10含量。
由上述可知，即使使用本领域常规的辅酶Q10的发酵方法，本发明的重组微生物在提高辅酶Q10效价方面也具有明显的优势。因此，本发明的重组微生物适合于本领域常规的辅酶Q10的发酵工艺。
4、微生物发酵生产高含量氧化型辅酶Q10
如前所述，与现有技术相比，本发明的重组微生物的改进还在于，可进一步提高氧化型辅酶Q10的产量。
本发明方法通过使用特定的重组微生物，可显著增强对包括高渗透压和高氧化还原电位在内的恶劣环境的耐受性，消除氧化型辅酶Q10的发酵生产方法中高氧化还原电位对菌体的不利影响，进一步发挥氧化压力对菌体生产辅酶Q10的促进作用，提高氧化型辅酶Q10的效价。本发明方法使用重组微生物发酵生产氧化型辅酶Q10的发酵工艺条件可参考专利文献5，具体方法如下：
一种氧化型辅酶Q10的发酵生产方法，其中，在发酵过程中辅酶Q10合成积累阶段控制发酵液的ORP；优选地，在发酵过程中辅酶Q10合成积累阶段的中后期控制发酵液的ORP；还优选的，在发酵过程中辅酶Q10合成积累阶段的后期控制发酵液的ORP。在生产菌株的发酵过程中控制发酵液的氧化还原电势ORP为-50～300mV，优选控制发酵液的氧化还原电势ORP为50～200mV。
上述的发酵生产方法中，在所述发酵过程中控制所述发酵液的电导率为5.0～30.0ms/cm；优选地，在菌体生长阶段，控制氧消耗速率在30～150mmol/(L·h)之间，并控制所述发酵液的电导率在5.0～30.0ms/cm之间；还优选地，在辅酶Q10合成积累阶段，控制氧消耗速率在60～120mmol/(L·h)之间，并控制所述发酵液的电导率在8.0～15.0ms/cm之间。
上述的发酵生产方法中，通过下述方式的至少一种来控制发酵液的氧化还原电势ORP：控制所述发酵液的溶氧、和控制所述发酵液的pH；优选将控制所述发酵液的溶氧的方式、与控制所述发酵液的pH的方式结合。
上述的发酵生产方法中，通过下述方式的至少一种来控制所述发酵液中的溶氧：控制发酵罐的单位体积搅拌输入功率、控制单位体积发酵液空气进气流量、和控制发酵罐的内部压力；优选将上述方式的两种以上结合来控制所述发酵液中的溶氧。
上述的发酵生产方法中，在辅酶Q10合成积累阶段，所述发酵罐的单位体积搅拌输入功率优选为0.25～0.50kw/m3、所述单位体积发酵液空气进气流量优选为1.0～15.0vvm、和/或所述发酵罐的内部压力优选为0.05～0.3MPa；更优选地，所述发酵罐的单位体积搅拌输入功率为0.30～0.40kw/m3，所述单位体积发酵液空气进气流量为5.0～8.0vvm，和/或所述发酵罐的内部压力为0.08～0.15MPa。
上述的发酵生产方法中，在辅酶Q10合成积累阶段，通过将所述发酵液的pH控制为3.5～6.0来控制所述发酵液的pH；优选地，通过将所述发酵液的pH控制为4.0～5.0来控制所述发酵液的pH；还优选地，通过加入酸或加入碱的方式来控制所述发酵液的pH；进一步优选地，通过分阶段或持续加入所述酸或所述碱的方式来控制所述发酵液的pH。
上述的发酵生产方法中，所述酸为有机酸或无机酸、和/或所述碱为有机碱或无机碱；优选地，所述酸为磷酸、盐酸、硫酸、乳酸、丙酸、柠檬酸、和草酸中的一种或两种以上，和/或优选所述碱为氨水、氢氧化钠、和液氨中的一种或两种以上；更优选地，所述酸为磷酸、乳酸、或柠檬酸，和/或所述碱为氨水、或液氨。
上述的发酵生产方法中，不仅可以使用类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)RSP-BE，还可以使用其经物理或化学诱变方法选育的菌株、或者基因工程方法改造的菌株。
上述的发酵生产方法中，所述辅酶Q10为高含量氧化型辅酶Q10；并优选氧化型辅酶Q10的含量为96％以上，更优选97％以上，最优选为99％以上。
上述的发酵生产方法中，所述氧化型辅酶Q10的效价为至少1000mg/L，优选为至少2000mg/L，更优选为至少3000mg/L。氧化型辅酶Q10的效价指的是单位体积发酵液中氧化型辅酶Q10含量。
上述的发酵生产方法获得的氧化型辅酶Q10可用于制备各类食品，包括功能性营养食品、特殊的健康食品，还可用于制备营养增补剂、营养品、动物药材、饮料、饲料、化妆品、药品、药剂和预防性药物。
下面结合附图和实施例详细描述本发明，本发明不限于此。
实施例
本申请实施例中重组微生物的构建包括如下基本操作。
本发明所使用的培养基为如下：
斜面培养基的配方为(100ml)：酵母提取物0.8g，FeSO40.01g，K2HPO4 0.13g，CoCl20.003g，NaCl 0.2g，MnSO4 0.0001g，MgSO4 0.025g，葡萄糖0.3g，维生素B1 0.1μg，维生素K0.1μg，维生素A 0.15μg，琼脂粉1.5g，pH调节为7.2。
种子培养液的配方为(100ml)：(NH4)2SO40.25g，玉米浆0.05g，酵母提取物0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖0.3g，K2HPO4 0.05g，KH2PO4 0.05g，MgSO4 0.1g，FeSO4 0.01g，CoCl20.003g，MnSO4 0.0001g，CaCO30.8g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A0.15μg，pH调节为7.2。
发酵培养液的配方为(100ml)：(NH4)2SO4 0.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖4g，KH2PO40.15g，味精0.3g，MgSO4 0.63g，玉米浆0.4g，FeSO4 0.12g，CoCl2 0.005g，CaCO3 0.6g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg，pH 调节为7.2。
效价的测定如下：
样品制备：氮气氛围下，取发酵液1ml至10ml离心管中，加入180μl的1mol/L的HCl，混合均匀，静置3～5min，然后放置92℃水浴下加热30min；离心去上清，加入8ml浸提液(乙酸乙酯：乙醇＝5：3)，浸提2h，HPLC反相测试。高效液相色谱条件：C18柱：150mm×4.6mm，流动相为甲醇：异丙醇＝75：25(以体积计)，流量1.00ml/min，检测波长：275nm，进样量40μl。保留时间12min。
氧化型辅酶Q10的含量测定如下：
样品制备：氮气氛围下，取发酵液1ml至10ml离心管中，加入180μl的1mol/L的HCl，混合均匀，静置3～5min，然后放置92℃水浴下加热30min；离心去上清，加入8ml浸提液(乙酸乙酯：乙醇＝5：3)，浸提2h，HPLC反相测试。高效液相色谱条件：柱：YMC-Pack 250mm×4.6mm，流动相为甲醇/正己烷＝85：15(以体积计)，流量1mL/min，检测波长：275nm，进样量40μl。保留时间：还原型辅酶Q10为13.5min，氧化型辅酶Q10为22.0min。
生物量的测定如下：取10ml发酵液，称重，加入2mol/L的盐酸溶液，调节pH至4.0左右，80℃保温20min，离心弃上清，水洗，离心弃上清，60℃烘干20小时，称重，计算每kg发酵液中的菌体含量。
残糖的测定可采用本领域公知的技术手段，例如使用葡萄糖分析仪测定的方法。溶磷的测定可采用本领域公知的技术手段，例如钼蓝比色法。
实施例1编码全局调控蛋白irrE的基因的扩增与重组载体的构建
提取耐辐射异常球菌基因组(试剂来自上海生物工程有限公司Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒)，提取过程按照试剂盒所附说明书进行。
根据SEQ ID NO：1所示DNA序列，用Primer5引物设计软件设计得到上游引物irrE-F：5′-ccgGAATTCGTGCCCAGTGCCAACGTCAGCCCCCCTTG-3′(下划线处为EcoRI酶切位点)SEQ IDNo.3，下游引物irrE-R：5′-cgcGGATCCTCACTGTGCAGCGTCCTGCGGCTCGTC-3′(下划线处为BamHI酶切位点)SEQ ID No.4。
以耐辐射异常球菌中提取的基因组DNA为模板，使用高保真酶PrimeSTAR(购自大连宝生物公司)和引物SEQID No.3和4，采取PCR法合成全局调控蛋白irrE的基因，采用如下标准反应体系：
GC缓冲液 25μl
水 16μl
dNTP 4μl
上游引物 1.5μl(10μM)
下游引物 1.5μl(10μM)
耐辐射异常球菌基因组DNA 1.5μl
PrimeSTAR酶 0.5μl
合计 50μl
扩增程序为：30个循环，每个循环包含98℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸1分钟。
将PCR产物取出进行PCR纯化(试剂来自Axygen PrepPCR清洁试剂盒)，纯化过程按照试剂盒所附说明书进行，并得到PCR纯化产物。
按照Takara公司内切酶标准体系进行酶切。标准体系为：
EcoRI 1μl
BamHI 1μl
10×buffer 3μl
PCR纯化产物 25μl
合计 30μl
EcoRI 1μl
BamHI 1μl
10×buffer 3μl
pBBR1MCS-2质粒 25μl
合计 30μl
将酶切产物取出进行凝胶回收(试剂来自Axygen PrepDNA凝胶回收试剂盒)，回收过程按照试剂盒所附说明书进行，并得到回收的基因片段。
按照Takara公司T4连接酶说明书，按照标准体系，取凝胶回收得到的irrE基因5.5μl，凝胶回收得到的质粒pBBR1MCS-23μl，T4连接酶0.5μl，T4连接酶BUFFER 1μl混合，22℃水浴连接60分钟，获得重组质粒pBBR1MCS-2-irrE。
实施例2渗透压调控型启动子proPB的替换
通过热激法将重组载体pBBR1MCS-2-irrE转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，将能在含有50μg/ml的卡那霉素的LB平板培养基上生长的菌落在该LB平板培养基上连续培养，得到遗传稳定的重组大肠杆菌。
提取遗传稳定的重组大肠杆菌的质粒(试剂来自AxyPrep质粒DNA小量试剂盒)，提取过程按照试剂盒所附说明书进行。
利用引物irrE-F和irrE-R进行PCR验证，得到大约1.0kb的片段，表明编码全局调控蛋白irrE的基因已成功导入到重组大肠杆菌中。
设计上游引物lac-F：5′-GCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCG-3′(下划线处为同源序列)SEQ ID No.5，下游引物lac-R：5′-CTCATTAGGCACCCCAGGCTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTC-3′(下划线处为同源序列)SEQ ID No.6。
以通过PCR验证的重组大肠杆菌的质粒DNA为模板，用Takara公司(大连宝生)的高保真酶primeSTAR和推荐的体系，利用引物SEQID No.5和6，通过环状PCR法进行扩增，采用标准反应体系：
GC缓冲液 12.5μl
水 7μl
dNTP 2μl
上游引物 1.0μl(10μM)
下游引物 1.0μl(10μM)
重组大肠杆菌质粒DNA 1.0μl
PrimeSTAR酶 0.5μl
合计 25μl
扩增程序为：20个循环，每个循环包含98℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸6分钟。
将PCR产物取出进行PCR纯化(试剂来自Axygen PrepPCR清洁试剂盒)，纯化过程按照试剂盒所附说明书进行，并得到PCR纯化产物。
通过热激法将PCR纯化产物转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，将能在含有50μg/ml的卡那霉素的LB平板培养基上生长的菌落在该LB平板培养基上连续培养，得到遗传稳定的重组大肠杆菌。
提取遗传稳定的重组大肠杆菌的质粒(试剂来自AxyPrep质粒DNA小量试剂盒)，提取过程按照试剂盒所附说明书进行，得到敲除了lac启动子的重组质粒pBBR1MCS-2-G-irrE。
通过上海生物工程公司对质粒的测序验证，证明lac启动子已经敲除，并且irrE基因序列准确。提取大肠杆菌基因组(试剂来自上海生物工程有限公司Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒)，提取过程按照试剂盒所附说明书进行。
设计上游引物proPB-F：5′-ccgCTCGAGCATGTGTGAAGTTGATCACAAATTT-3′(下划线处为XhoI酶切位点)SEQ ID No.7，下游引物proPB-R：5′-cccAAGCTTGAGTTGGCCCATTTCCGCAAACG-3′(下划线处为HindIII酶切位点)SEQ ID No.8。
以大肠杆菌中提取的基因组DNA为模板，使用高保真酶PrimeSTAR(购自大连宝生物公司)、引物SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，采取PCR法合成全局调控蛋白irrE基因，采用如下标准反应体系：
GC缓冲液 25μl
水 16μl
dNTP 4μl
上游引物 1.5μl(10μM)
下游引物 1.5μl(10μM)
大肠杆菌基因组DNA 1.5μl
PrimeSTAR酶 0.5μl
合计 50μl
扩增程序为：30个循环，每个循环包含98℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸1分钟。
将PCR产物取出进行PCR纯化(试剂来自Axygen PrepPCR清洁试剂盒)，纯化过程按照试剂盒所附说明书进行，并得到PCR纯化产物。
按照Takara公司内切酶标准体系进行酶切。标准体系为：
XhoI 1μl
HindIII 1μl
10×buffer 3μl
PCR纯化产物 25μl
合计 30μl
Figure BDA0001779472560000191
将酶切产物取出进行凝胶回收(试剂来自Axygen PrepDNA凝胶回收试剂盒)，回收过程按照试剂盒所附说明书进行，并得到回收的基因片段。
按照Takara公司T4连接酶说明书，按照标准体系，取凝胶回收得到的proPB序列5.5μl，凝胶回收得到的质粒pBBR1MCS-2-G-irrE 3μl，T4连接酶0.5μl，T4连接酶BUFFER 1μl混合，22℃水浴连接60分钟，获得重组质粒pBBR1MCS-2-G-proPB-irrE，如图2所示。
实施例3含有编码全局调控蛋白irrE的基因和渗透压调控型启动子proPB的重组 微生物的构建
通过热激法将重组载体pBBR1MCS-2-G-proPB-irrE转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞，将能在含有50μg/ml的卡那霉素的LB平板培养基上生长的菌落在该LB平板培养基上，得到重组大肠杆菌。挑取重组大肠杆菌提基因组，利用引物proPB-F和irrE-R进行PCR验证，得到大约1.2kb的片段，表明proPB启动子和编码全局调控蛋白irrE的基因已成功导入到重组大肠杆菌中，并通过上海生物工程公司的测序验证，证明序列与NCBI上序列一致。
通过接合转移将重组大肠杆菌中的重组载体pBBR1MCS-2-G-proPB-irrE导入至类球红细菌中，将能在含有50μg/ml的萘啶酮酸和卡那霉素的平板培养基上生长的类球红细菌在该平板培养基上连续转接三代，得到遗传稳定的重组类球红细菌RSP-BE。
挑取重组类球红细菌提基因组，利用引物proPB-F和irrE-R进行PCR验证，得到大约1.2kb的片段，表明proPB启动子和编码全局调控蛋白irrE的基因已成功导入到重组类球红细菌RSP-BE中。
在上述重组微生物的构建过程中，重组载体转化到大肠杆菌S17-1的具体操作为如下：
取出大肠杆菌S17-1感受态管，冰浴10分钟后加入重组质粒pBBR1MCS-2-G-proPB-irrE，冰浴20分钟，热激90秒，冰浴5分钟，加入600μl LB液体培养基。37℃培养45分钟后5000rpm离心5分钟，弃500μl上清液，将剩余液体涂布到含有卡那霉素的平板培养基上。
接合转移的具体操作为如下：
接种类球红细菌于含10ml液体培养基的试管中，于30℃、200rpm下培养50h。
32小时后接种已转化大肠杆菌S17-1的阳性克隆至LB培养液中，于37℃、200rpm下过夜培养。15小时后转接大肠杆菌S17-1，每管5ml LB培养基加入100μl菌液，并加入5μl卡那霉素，放入37℃摇床培养。培养3～4小时后，取4ml类球红细菌菌液和2ml大肠杆菌菌液，分装至2ml离心管中，每管1ml，5000rpm离心5分钟。分别弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体，5000rpm离心5分钟。分别弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体。按类球红细菌和大肠杆菌的比例为100：50，100：100的比例混匀菌液，在LB平板中央贴滤膜(0.22μm)，并将混合菌液浇注于滤膜中心区域，将LB平板小心移至32℃培养箱中培养过夜。
用镊子将滤膜转移至2mL EP管中，再用500μl LB液体培养基将滤膜上的菌体冲洗下来并吹散，分装涂布到平板培养基上，每板350μl菌液，放入32℃培养箱中培养72小时。
接合转移后检验是否为阳性克隆：
挑取2～5个生长良好的菌落培养48～60小时，转接，再培养2～4小时后按照Axygen质粒提取试剂盒说明书操作步骤提取质粒。取1支离心管，加入步骤2提取获得的质粒34μl，XhoI和BamHI各加入1μl，加入4μl BUFFER。放入37℃水浴酶切1.5小时。酶切后进行电泳检测，电泳显示在1.2kb左右处有明显条带，与预期相符。割胶回收后将得到的DNA片段进行测序验证，证实为阳性克隆。
经此方法得到的菌株进行菌种保藏，该菌为类球红细菌，拉丁文学名为Rhodobacter sphaeroides；命名为RSP-BE菌株，于2018年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.15927。
实施例4使用重组微生物发酵生产辅酶Q10
选择在平板上培养7天左右的重组类球红细菌RSP-BE单菌落，对应挑入小试管斜面培养基中培养，用无菌水洗涤培养好的斜面，制成菌浓为108～109个细胞每毫升的菌悬液；将制好的菌悬液按2％的接种量接种到种子培养基中进行种子培养，其中的培养基为100ml，32℃，转速180rpm，培养22～26小时。
将种子培养后得到的类红球细菌菌株CGMCC No.15927以10％的接种量接种到10L发酵罐中。接种量可为本领域中的常规含量，例如，1～30％、优选2.5～20％，还优选5～15％，可根据需求对该接种量进行调整。
种子液在10L发酵罐中开始发酵，发酵温度为31℃，罐内压力为0.03Mpa，供氧采取分阶段控制策略。在0～24小时控制搅拌转速500rpm，空气流量6L/min，随着菌体增长，OUR缓慢进入稳定，到达50mmol/L·h，该阶段菌体还处在指数生长期，供氧已成为限制生长的条件，通过提高搅拌转速和通气量来改善供氧水平，24～36小时OUR维持在60mmol/L·h，36～60小时OUR维持在70mmol/L·h，以促进菌体的生长，60小时以后，该阶段菌体逐渐进入稳定期，菌体数量不再增长，辅酶Q10快速合成积累，逐渐降低供氧以维持较高的辅酶Q10比生产速率，60～90小时OUR维持在90mmol/L·h，90～100小时OUR维持在80mmol/L·h，100小时以后OUR维持在60mmol/L·h。
发酵过程中补料工艺控制：除了按照本领域公知在发酵工艺中根据残糖和溶磷补加葡萄糖和磷酸二氢钾外，本发明在电导率下降到15.0ms/cm时，开始流加补料培养基，补料培养基配方为每升补料液中酵母粉12g，(NH4)2SO4 10g，MgSO4 2g，NaCl 6g，KH2PO4 4g，K2HPO4 4g，CaCl2 2g，生物素0.025g，pH值7.0，控制培养基的加入速率使电导率维持在15ms/cm范围内，全程残糖维持在2.0％。110小时结束发酵后，取部分发酵液，惰性气体气氛下提取检测，测得效价为3637mg/L，生物量为125g/kg。
实施例5使用重组微生物发酵生产氧化型辅酶Q10
选择在平板上培养7天左右的重组类球红细菌RSP-BE单菌落，对应挑入小试管斜面培养基中培养，用无菌水洗涤培养好的斜面，制成菌浓为108～109个细胞每毫升的菌悬液；将制好的菌悬液按2％的接种量接种到种子培养基中进行种子培养，其中的培养基为100ml，32℃，转速180rpm，培养22～26小时。
将由种子培养后得到的类红球细菌菌株CGMCC No.15927以10％的接种量接种至10L发酵罐中。接种量可为本领域中的常规含量，例如，1～30％、优选2.5～20％，还优选5～15％，可根据需求对该接种量进行调整。
种子液在10L发酵罐中开始发酵，发酵温度为30℃，发酵罐单位体积发酵液空气进气流量控制为0.4vvm，单位体积搅拌输入功率控制为0.1kw/m3，罐压0.02MPa，控制氧消耗速率为50mmol/(L·h)，控制发酵液电导率为12ms/cm，pH值控制为7.0左右。
补料培养基为每升补料液中含酵母粉12g、(NH4)2SO4 10g、MgSO4 2g、NaCl 6g、KH2PO4 4g、K2HPO4 4g、CaCl2 2g、生物素0.025g，pH值调节为7.0。
15小时后，增加供氧，发酵罐单位体积发酵液空气进气流量控制为0.6vvm，单位体积搅拌输入功率控制为0.2kw/m3，罐压0.04MPa，氧消耗速率上升到70mmol/(L·h)后保持平稳，发酵液电导率控制为12ms/cm，pH值控制为7.0，继续发酵，此时发酵处于菌体生长阶段。
20小时后，再次增加供氧，发酵罐单位体积发酵液空气进气流量控制为0.8vvm，单位体积搅拌输入功率控制为0.2kw/m3，罐压0.05MPa，氧消耗速率上升到90mmol/(L·h)后保持平稳，发酵液电导率控制为12ms/cm，pH值控制为7.0，继续发酵，此时发酵处于菌体生长阶段。
10小时后，氧消耗速率维持在70mmol/(L·h)左右，发酵液电导率控制为12ms/cm，pH控制为6.0左右，继续发酵，此时发酵处于辅酶Q10合成积累阶段前期。
20小时后，此时发酵效价增涨趋于平衡，发酵进入辅酶Q10合成积累阶段后期。控制发酵罐单位体积发酵液空气进气流量控制为6.0vvm，单位体积搅拌输入功率控制为0.3kw/m3，罐压0.1MPa，通过持续加入磷酸，在2h左右将pH值调节到4.0左右，控制发酵液电导率为12ms/cm，继续发酵；稳定后发酵液ORP值维持在100～200mv之间。
15小时后，停止发酵，取部分发酵液，惰性气体气氛下提取检测，效价为3533mg/L，氧化型辅酶Q10：还原型辅酶Q10为99.3:0.7，生物量为123g/kg。
比较例1未进行渗透压调控型启动子proPB替换的重组微生物的构建
将实施例1构建的重组载体pBBR1MCS-2-irrE不进行渗透压调控型启动子proPB的替换，参照实施例3，将其转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞，并在含有卡那霉素的LB培养基上培养24h，得到重组大肠杆菌。挑取重组大肠杆菌提取质粒，利用引物irrE-F和irrE-R进行PCR验证，得到大约1.0kb的片段，表明编码全局调控蛋白irrE的基因已成功导入大肠杆菌S17-1中。
通过接合转移将所得重组大肠杆菌S17-1中的重组载体pBBR1MCS-2-irrE导入至类球红细菌，用含有萘啶酮酸和卡那霉素的平板培养基进行培养，得到重组类球红细菌RSP-CE。利用引物irrE-F和irrE-R进行PCR验证后，得到大约1.0kb的片段，表明编码全局调控蛋白irrE的基因已成功导入类球红细菌RSP-CE中。
比较例2重组微生物在辅酶Q10发酵中的对比
参照实施例4的发酵方法对类球红细菌原始菌株、重组类球红细菌RSP-BE和RSP-CE进行发酵，发酵结果如下：
菌株类型 辅酶Q10效价 生物量
原始菌株 2975mg/L 110g/kg
RSP-CE 3276mg/L 119g/kg
RSP-BE 3510mg/L 123g/kg
比较例3重组微生物在氧化型辅酶Q10发酵中的对比
参照实施例5的发酵方法对类球红细菌原始菌株、重组类球红细菌RSP-BE和RSP-CE进行发酵，发酵结果如下：
Figure BDA0001779472560000241
比较例3的结果显示，由于发酵生产过程中高氧化还原电位对菌体的不利影响，类球红细菌原始菌株发酵得到的氧化型辅酶Q10的效价及相对于还原型辅酶Q10的比例偏低。由于编码全局调控蛋白irrE的基因在DNA损伤修复和保护辐射胁迫反应的途径中起到中心调控作用，因此外源导入编码全局调控蛋白irrE的基因可以提高微生物对恶劣环境的耐受性，包括对渗透压、氧化、辐射和热等多种胁迫的耐受性，有利于菌种生长和代谢活力以及生物量的提高，在一定程度上提高了氧化型辅酶Q10的效价及相对比例。但由于未经渗透压调控型启动子proPB替换，重组类球红细菌菌株RSP-CE与重组类球红细菌菌株RSP-BE相比，发酵液检测得到的效价偏低。由此可知，渗透压调控型启动子proPB可根据实际发酵环境的条件变化有效调控irrE的表达，从而提高辅酶Q10生产菌对不同强度的胁迫压力的耐受能力。
产业上的可利用性
本发明提供的用于发酵法生产辅酶Q10的重组微生物由于包含编码全局调控蛋白irrE的基因，因此可以提高微生物对渗透压、氧化、辐射和热等多种胁迫的耐受性，不仅延长了菌种的对数生长期，促进了生物量的进一步积累，而且在发酵过程中保持菌种旺盛的生长和代谢活力，从而提高辅酶Q10的产量，尤其是提高氧化型辅酶Q10的产量。因此由该基因构建的重组微生物可有利提高产辅酶Q10的效价，特别是可显著提高氧化型辅酶Q10的含量。因此，通过本发明方法构建的重组微生物在工业化生产辅酶Q10具有广阔的应用前景。
序列表
<110> 浙江新和成股份有限公司
黑龙江新和成生物科技有限公司
上虞新和成生物化工有限公司
浙江大学
<120> 一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶Q10中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgcccagtg ccaacgtcag ccccccttgc ccctctgggg taaggggcgg ggggatgggg 60
ccaaaagcta aagctgaagc ctccaagccc cacccccaaa tccctgttaa gctcccattc 120
gtgaccgccc ccgacgccct cgccgccgcc aaagccagga tgcgcgacct ggcggcggcc 180
tacgtggcgg ccctgcccgg acgcgacacc cacagcctga tggcgggggt gcccggcgta 240
gacctcaaat tcatgccgct cggctggcgc gacggggcgt tcgaccccga gcacaacgtc 300
atcctcatca actcggcggc ccgccccgaa cgccagcgct tcaccctcgc ccacgaaatc 360
gggcacgcga ttttactcgg cgacgacgac ctgctctccg acatccacga cgcctacgag 420
ggcgagcggc tcgaacaggt catcgaaacg ctgtgcaacg tggcggcggc ggcgattttg 480
atgcccgaac ccgtcatcgc ggaaatgctg gaacgcttcg gccccaccgg gcgcgccctc 540
gccgaactcg ccaagcgggc cgaagtcagc gcgtcgtcgg cgctctacgc cctgaccgag 600
cagaccccgg tgcccgtcat ctacgcggtc tgtgcgccgg gcaagcctcc gcgtgagcag 660
gccgcaagcg acgaggacgc tggcccaagc acagaaaaag tcctgacggt ccgcgccagc 720
agctcgacgc ggggcgtcaa gtacaccctg gcgagcggca cgccggtacc cgccgaccac 780
ccggcggcgc ttgccctcgc cacgggcatg gaagtgcgcg aggaaagcta cgtgcccttt 840
cgctcgggcc ggaaaatgaa ggcggaggtg gacgcctacc cgtcgcgcgg catcgtggcc 900
gtcagtttcg agttcgaccc cgcccgcctg ggccgcaagg acagcgagca ggccgaccgg 960
gacgagccgc aggacgctgc acagtga 987
<210> 2
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtgtgaagt tgatcacaaa tttaaacact ggtagggtaa aaaggtcatt aactgcccaa 60
ttcaggcgtc aactggtttg attgtacatt ccttaaccgg agggtgtaag caaacccgct 120
acgcttgtta cagagattgc atcctgcaat tcccgctccc cttttgcggc cgtcgcgctg 180
atttttctgg cgtttgcgga aatgggccaa 210
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggaattcg tgcccagtgc caacgtcagc cccccttg 38
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcggatcct cactgtgcag cgtcctgcgg ctcgtc 36
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cg 42
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcattaggc accccaggct gtggaattgt gagcggataa caatttc 47
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgctcgagc atgtgtgaag ttgatcacaa attt 34
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccaagcttg agttggccca tttccgcaaa cg 32

Claims (17)

1.一种生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述方法使用重组微生物，所述重组微生物含有编码全局调控蛋白irrE的基因和渗透压调控型启动子proPB，所述编码全局调控蛋白irrE的基因为SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列，所述渗透压调控型启动子proPB为SEQ IDNO：2所表示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述重组微生物的制备包括如下步骤：
a.从含有编码全局调控蛋白irrE的基因的亲本菌株中克隆得到所述编码全局调控蛋白irrE的基因；
b.将所述的编码全局调控蛋白irrE的基因连接到载体上，构建含有所述编码全局调控蛋白irrE的基因的重组载体，
其中，通过启动子替换，将所述重组载体上的控制所述编码全局调控蛋白irrE的基因表达的启动子敲除后***所述渗透压调控型启动子proPB，进一步调控所述编码全局调控蛋白irrE的基因的表达；
c.将所述重组载体导入宿主细胞中从而得到所述重组微生物。
3.根据权利要求1或2所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述渗透压调控型启动子proPB分离自细菌。
4.根据权利要求3所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述细菌为埃希氏菌属(Escherichia)。
5.根据权利要求3所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。
6.根据权利要求2所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述步骤b的载体选自pBR322、pACYC177、pACYC184、RK2、pBBR1MCS-2、粘粒载体。
7.根据权利要求6所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述步骤b的载体为pBBR1MCS-2。
8.根据权利要求2所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述步骤a包括根据SEQ IDNO：1所示的DNA序列设计引物，以从所述亲本菌株中提取的基因组DNA为模板，采用PCR法合成所述编码全局调控蛋白irrE的基因。
9.根据权利要求2所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述亲本菌株为细菌。
10.根据权利要求9所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述细菌为异常球菌属(Deinococcus)。
11.根据权利要求10所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述细菌选自由耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、沙漠异常球菌(Deinococcus deserti)、戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)、解蛋白异常球菌(Deinococcus proteolyticus)组成的组。
12.根据权利要求11所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述细菌为耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)。
13.根据权利要求2所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述步骤c的导入方式选自转化、转导、接合转移或电穿孔，所述宿主细胞选自细菌或真菌。
14.根据权利要求13所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述细菌为红细菌属的细菌。
15.根据权利要求14所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述红细菌属的细菌为类球红细菌。
16.根据权利要求2所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述步骤c包括将步骤b得到的重组载体转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞，再通过接合转移导入宿主细胞，得到遗传稳定的重组微生物。
17.一种生产氧化型辅酶Q10的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1至16中任一项所述的方法制备重组微生物，以及使用所述重组微生物生产所述氧化型辅酶Q10。
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