JPH01144993A - ＨＢｓ抗原測定のための方法、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体および感作血球 - Google Patents

ＨＢｓ抗原測定のための方法、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体および感作血球

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JPH01144993A
JPH01144993A JP63193654A JP19365488A JPH01144993A JP H01144993 A JPH01144993 A JP H01144993A JP 63193654 A JP63193654 A JP 63193654A JP 19365488 A JP19365488 A JP 19365488A JP H01144993 A JPH01144993 A JP H01144993A
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monoclonal antibody
hbs
blood cells
sensitized
igm
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Akira Noto
野戸　章
Akihiko Sato
彰彦 佐藤
Kuniaki Nakajima
中島　久二瑛
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Shionogi and Co Ltd
Original Assignee
Shionogi and Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １呈上立上月量１ 本発明は、抗ＨＢｓモノクローナル抗体、固定血球への
抗ＨＢｓモノクローナル抗体の感作方法、抗ＨＢｓモノ
クローナル抗体感作血球、抗ＨＢｓモノクローナル抗体
感作血球を用いたＨＢｓ抗原の測定方法および抗ＨＢｓ
モノクローナル抗体感作血球を用いたＨＢＳ抗原の測定
における非特異反応を抑制するモノクローナル抗体およ
びその抑制方法に関する。
更困五弦碧 Ｂ型肝炎はＢ型肝炎ウィルスに起因する疾患であり、一
般に血液を介して感染する。また乳幼児が母子感染によ
って該ウィルスに感染する場合もある。感染した保菌者
の約９０％は発症しないが、保菌者の血液を介して他者
が該ウィルスに感染する危険性が有り、世界中でこの保
菌者は約２［２０００万人と推定されている。特にこの
保菌者の比率はアジアで高く、わが国における患者数は
約１００万人と推定されている。さらに、Ｂ型肝炎はき
らに重篤な肝硬変、肝癌へと移行する確率が高い。
以上のような状況により、Ｂ型肝炎患者またはその保菌
者の発見・診断および血液製剤中のＢ型肝炎ウィルスの
検出が重要となってきた。これらの検出にあたっては、
最近の細胞工学技術の発展に伴い、検体中のＢ型肝炎表
面抗原（ＨＢｓ）を抗ＨＢｓモノクローナル抗体を用い
て測定する方法が用いられるようになってきた。抗ＨＢ
ｓモノクローナル抗体としては、様々な種類の抗体が得
られており（例えば、特開昭５６−７３０２９、特開昭
６２−１００９８、特表昭５７−５０１４９３、特表昭
５８−５００３００など）、またそれらを赤血球に吸着
させた凝集試薬（例えば、特開昭５８−１２７１６７、
特開昭６Ｏ−３８６５６）や、それらを用いた測定法（
例えば、特表昭５７−５０１４９３、特表昭５８−５０
０３００など）も開発きれている。また、ＨＢｓに対す
るモノクローナル抗体を用いた診断キットが各社から発
売されている。
Ｌ記のような逆受身凝集反応においては、非特異的な凝
集が起こる場合があり、それを抑制する方法として、測
定対象の抗原と異なる抗原に対するモノクローナル抗体
を反応溶液中に添加する方法がある（特開昭６２−１５
４６４）。
また、逆受身凝集反応に用いる赤血球としてはヒツジや
ニワトリの固定血球が一般に用いられるが、この血球へ
のモノクローナル抗体の感作は主にタンニン酸法によっ
て行なわれていた。
発明が解決しようとする。　１、 現在までに様々な抗ＨＢｓモノクローナル抗体が製造き
れ、種々のＨＢｓ測定用キットが開発されてきているが
、さらに非特異反応が少く感度の高いものが待望されて
いた。
□　１．を　決するための手段 本発明のモノクローナル抗体は、常法に従い以下の様に
して調製できる。
まず、ＢＡＬＢ／ｃなどのマウスに目的とする抗原をフ
ロイントの完全アジュバントなどの免疫助剤と共に投与
し免疫し、免疫後牌臓細胞を取りたし、抗体産生細胞と
して細胞融合に供する。得られたマウス肺臓細胞は、牛
胎児血清（Ｆｅ２）を１０〜２０％程度添加したイーグ
ルＭＥＭ、ダルベツコ変法培地、ＲＰＭ１１６４０など
の培地に懸濁し、赤血球を破壊した後、ヒポキサンチン
−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（
ＨＧＰＲＴ−）あるいはチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ−
）の様な適切なマーカーを持つマウス骨髄腫細胞と融合
させる。融合剤としては、５０％のポリエチレングリフ
ール（ＰＥＧ）を加える。融合細胞はＨＡＴ（ヒポキサ
ンチン−アデニン−チミジン）培地に懸濁し、ＨＡＴ培
地の半量を交換しながら培養する。ハイブリドーマの形
成を確認した培養上清中の抗体価は、上記抗原を感作し
た固定血球を用いるＰＨＡ（受身凝集反応）によって測
定できる。凝集陽性を示したハイブリドーマは限界希釈
法に従いさらに数回クローニングし、目的の抗体を安定
に産生ずるハイブリドーマを得る。
目的のモノクローナル抗体は、得られたハイブリドーマ
をｉｎ　　ｖ（ｔｒｏまたはｉｎ　　ｖｉｖＯで培養し
て製造される。ｉｎ　　ｖ（ｔｒｏにおいては上記のよ
うな一般的に使用される培地に懸濁して数日培着し培養
上清から目的の抗体を得る。ｉｎ　　ｖｆｖｏにおいて
は、マウスなどの哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを
接種し、１０〜２０日後に腹水を採取して目的のモノク
ローナル抗体を得る。
この様にして得られた培養上清または腹水からの目的の
モノクローナル抗体の精製は、硫安分画、ＤＥＡＥセフ
ァロースカラム、ハイドロキシアパタイトカラム、プロ
ティンＡアフィニティーカラムなどの通常使用される精
製法を適宜組み合わせて行なう。
本発明においては、上記の方法に従い多種の抗ＨＢｓモ
ノクローナル抗体を得た。その内から、以下に示す方法
に従いＨＢｓを測定する際に、非特異反応が少なく感度
の高い凝集試薬を提供するモノクローナル抗体ＨＢｓ２
２Ｂ７．１８Ｅ９および８Ｃ１を得た。以下の実施例に
示すように、いかなる抗ＨＢｓモノクローナル抗体でも
非特異反応が少なく感度の高い凝集試薬を提供するもの
では無く、即ち、これらのモノクローナル抗体は、特に
非特異反応が少なく感度の高いＨＢｓ測定を可能にする
有用なモノクローナル抗体である。
同様に、本発明で得られた抗ムンプスウィルスモノクロ
ーナル抗体ＭＰＶ１０Ｇ３および抗ヒトＩｇＭモノクロ
ーナル抗体１０Ｃ９は、以下に示すＨＢｓの測定方法に
おいて、特に非特異反応を抑制するモノクローナル抗体
として有用である。
さらに、本発明は、ＨＢｓ抗原を免疫原として得られた
抗ＨＢｓモノクローナル抗体を血球に感作する方法およ
び該感作血球を用いたＨＢｓ抗原の測定方法を提供する
。
本発明で使用する血球は、ニワトリ血球が望ましい。ニ
ワトリ血球は、有核細胞であり、哺乳類の細胞に比べて
大きく沈降速度が速いため、凝集反応試薬に用いれば約
１時間で判定可能であり、ヒツジなどの哺乳類血球の２
時間に比べ、操作性に優れている。また、ヒト血清中の
ＨＢｓ抗原を測定する際には、ヒト血清中に異種血球に
対する凝集因子（異種凝集素）が存在し、凝集反応試薬
と非特異的に反応する。ニワトリ血球は、ヒツジ、ガチ
ョウなどの血球に比べて、ヒト血清中に含まれる異種凝
集素との反応が弱く、偽陽性となる非特異凝集反応が少
ないなどの利点がある。
本発明で使用する血球は、溶血を防ぐためにグルタルア
ルデヒドやホルマリンで固定化することが望ましく、特
にグルタルアルデヒドが好ましい。ホルマリンで固定化
した場合には、血球どうしが凝集することがある。血球
を固定化するためのグルタルアルデヒド濃度は、血球の
量に比例して調節する。５％濃度の血球を用いる場合に
は、最終グルタルアルデヒド濃度を０．０５〜０．２％
にｙ４整し、室温で１〜２時間反応させれば、固定が完
了する。１０％濃度の血球を用いる場合には、５％濃度
の血球を用いた場合の倍量のグルタルアルデヒドを用い
ればよい、但し、血球濃度を３０％以上にすると、非特
異的な血球の凝集が起こり、好ましくない、安定で凝集
塊のない固定化血球を作製するためには、約５〜７．５
％濃度の血球を用いて固定化すれはよい。グルタルアル
デヒドの濃度は、０．０５％以下でも反応時間を長くす
れば固定できるが、１時間程度で操作性良く固定するた
めには、０．１％前後が良い。また、０．２％以−ヒで
も、反応時間を短くして固定化することができるが、時
間による固定の進行が速く、固定しすぎて凝集塊を作り
易く、安定して固定血球を作製するのは困難である。
得られた固定血球へのモノクローナル抗体の感作は、塩
化クロム法によって行なえば良い。従来のタンニン酸法
では、特にＩ　ｇ　Ｇ　ｌクラスの吸着が悪く、ＩｇＧ
１．やＩｇＭに関しても塩化クロム法を用いた方が感度
が高い、該感作は、１〜５％濃度の固定血球に対して、
５〜１０００μｇ　／　ｍｌのモノクローナル抗体と５
〜６００μｇ　／　ｍ　１の塩化クロムの存在下に行な
えば良い、好ましくは約２，５％濃度の固定血球に対し
て、１０〜５００１１８／ｍ！のモノクローナル抗体と
１０〜３００μｇ　／　ｍ　ｌの塩化クロムの存在下に
感作を行なえば、高感度の感作血球が得られる。固定血
球の、４１度を変化きせる場合には、モノクローナル抗
体および塩化クロムの濃度を固定血球濃度の変化に比例
させて増減すれば良い。２種以上の抗体を感作する場合
には、上記操作を繰り返して行なえばよい。本明細書中
の固定血球の濃度は生血球相当分の％（Ｖ／Ｖ）で示さ
れている。
上記の塩化クロム法によって、１８Ｍクラスの抗ＨＢｓ
モノクローナル抗体を血球に感作すると従来よりも高感
度のＨＢｓ抗原測定試薬が得られる。しかし、ＩｇＭは
一般に感度は高いものの、非特異反応が多いという欠点
を有する。逆に、ＩｇＧは、感度はＩｇＭはど高くはな
いが特異性が高い。そこで、きらに該血球にＩｇＧクラ
スの抗ＨＢｓモノクローナル抗体を感作すると、従来よ
りも高感度で非特異反応の少ない測定試薬が得られた。
さらに非特異反応を減少させるためには、ＩｇＧクラス
の抗ＨＢｓモノクローナル抗体を数種類使用して、Ｉｇ
ＭおよびＩｇＧで感作した数種の感作血球を用いれば良
い。本発明によれば、ＨＢｓ８Ｃ１（ＩｇＧ）およびＨ
Ｂｓ２２Ｂ７（ＩｇＭ）で二重感作した血球およびＨＢ
ｓ１８Ｅ９（ＩｇＧ）およびＨＢｓ２２Ｂ７で二重感作
した血球を混合して用いて目的の凝集試薬を得た。
非特異反応を減少きせるためには、また、感作に用いた
ＩｇＭをグルタルアルデヒドや熱などによって変性した
ものを、反応液中に加えれば良い。さらに、感作に用い
たものとは異なる、変性または未変性のＩｇＧおよびＩ
ｇＭを加えるとさらに非特異反応が抑制される。本発明
においては、グルタルアルデヒド変性ＨＢｓ２２Ｂ７、
さらに所望により未変性ＨＩｇＭ１０Ｃ９および熱変性
ＭＰＶ１０Ｇ３を反応溶液中に加えることにより非特異
反応を抑制することができた。添加量は、反応を阻害し
ない程度に多い方が好ましいが、それぞれ１〜１００μ
Ｋ　／　ｍ　１程度になるよう添加すれば非特異反応抑
制効果が得られる。
上記方法を組み合わせれば、非常に高感度でかつ極めて
特異的にＨＢｓ抗原を測定することができる。
（以下余白） 医」Ｕｌｌ １、免疫原の調製　（表１参照） ＨＢｓ抗原陽性血清を硫安４５％で塩析し、ＨＢｓ抗原
を沈殿させた（回収率８５％）。このＨＢｓａｌｌｌｋ
５０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ５，５６）で透析後
間バッファーで平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−
４Ｂカラムにかけ、非吸着画分を集めた（回収率４９％
）、ついでＨＢＳ抗原画分を８０ｍＭクエン酸バッファ
ーで平衡化したＣＭセファロースＣＬ−４Ｂカラムにか
け非吸着画分を集めた（回収率３７％）、この両分をＰ
ＢＳで透析後、ヤギ抗ヒト血清１８Ｇセファロースカラ
ムに通し、ヒト血清成分を吸着除去して、素通り画分を
部分精製ＨＢｓ抗原（回収率３０％）とし、ＢＡＬＢ／
ｅマウスへの免疫原とした。
ｉ、マウス肺臓細胞の調製 部分精製ＨＢｓＡｇ１００μｇとフロイント完全アジュ
バントの混合物０．２ｍｌをＢＡＬＢ／Ｃマウスの背皮
下に投与し、以後ＨＢｓＡｇのみ（１００μｇ）を２週
問おきに３〜５回背皮下に投恨して、最終免疫の３日後
に肺臓細胞をマウスから取りだし、細胞動台に供した。
ｉ、ハイブリドーマの調製 マウス肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞ＳＰ２１０−Ａｇ１
４（ＳＦ３）を常法により融合袴せた。
マウス肺臓細胞を取りだし、１５％牛脂児血清（Ｆｅ２
）添加ＲＰＭ１１６４０培地１０ｍ１に懸濁し、遠心（
２００ｘ　ｇ、　５分間）後、細胞を適量の０．１７Ｍ
塩化アンモニウムで処理して、含まれる赤血球を破壊し
た後、Ｆｅ２を含まないＲＰＭ１１６４０培地５ｍｌに
懸培地５ゥｌじＦｅ２を含まない培地５ｍｌに懸濁した
ＳＰ２細胞を、肺臓細胞の１１５量加え、良く混合した
後遠心（２００×ｇ１５分間）してＲＰＭＩ培地を除き
、３７℃に加温したｌ１１１１の５０％ポリエチレング
リコール４．０００　　（ＲＰＭ１１６４０培地と等量
混合）を徐々に加え、良く攪拌して細胞を融合させた・
融合後、１５％ＦＣ８添加ＲＰＭ１１６４０培地を徐々
に加え、細胞を遠心（２００Ｘ　ｇ、５分間）洗浄して
ポリエチレングリフールを除いた後、ＨＡＴ（ヒボキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン）培地に懸濁し、９
６穴平底マイクロプレートに１ウエルあたりの肺臓細胞
数が約５×１０６個／２００μｌとなるように蒔き込ん
だ。培養開始後４〜５日目に各ウェルの半量のＨＡＴ培
地を交換し、９〜１３日目にハイブリドーマのコロニー
形成を確認して、培養上清のＨＢｓ抗体価をＰＨＡＭ集
試薬（エーザイ、ＰＨＡ法エーザイキット）で測定した
。培養上清２５μＩを生理食塩水１００ＩＩＩで５倍に
希釈後、その５μｍをとり、キット添付の希釈液５０ｔ
ｔｌおよび抗原感作血球２５μｌを加えて混合し、凝集
陽性を示したウェルを抗ＨＢｓ抗体産生ハイブリドーマ
を含むものとした。
ＨＢｓ抗体産生ハイブリドーマを限界希釈法により３回
クローニングし、安定な抗ＨＢｓモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマを２６株得た。
得られたハイブリドーマは９０％ＦＣ３，１０％ジメチ
ルスルホキシド中に懸濁し、−８０°Ｃ庫および液体窒
素中に保存した。
■、モ・ツクローナル抗体の製造 ８Ｊ！ｌ令以上のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にブリス
クン（２，６，１０，１４−テトラメゾルーペンタデカ
ン）０．２５ｍ１を投与し、３〜１４日後に、ＰＢＳ懸
濁液としたハイブリドーマ１×１０１個（１ｍｌ）を腹
腔内に投与した。投与１０〜２０日後に貯留した腹水を
採取した。腹水中にはＰＨＡ抗体価で４万〜５１２万倍
の抗ＨＢｓモノクローナル抗体が含まれていた。腹水の
採取量はＢＡＬＢ／Ｃマウス−匹あたり１〜５ｍｌであ
った。
Ｖ、モノクローナル抗体のアイソタイプおよび該モノク
ローナル抗体の認識するＨＢｓ抗原のサブタイプ 分離確立した２６種のハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体のアイソタイプを以下の様にして同定した
。
免疫グロブリンのアイソタイプはＨＢｉ抗体産生ハイブ
リドーマの培養上清および精製モノクローナル抗体（後
述）をヒツジ抗マウス免疫グロブリンＭ、Ｇ、Ａ％Ｇ１
、Ｇ８いＧｏ、Ｇ８、におよび入鎖面清とアガロースゲ
ル内で反応させ沈降線の生成により確認するオフタロ二
−二重免疫拡散法により同定した。この時、培養上清と
各血清とは１：１の比で反応きせることにより、精製モ
ノクローナル抗体は１０”に適当に希釈することにより
、明瞭な沈降線が観察された。
モノクローナル抗体の認識するＨＢｓ抗原のサブタイプ
を決定するために、まずサブタイプ既知ＨＢｓ抗原（ａ
ｄｒ、　ａｄｗ、ａｙｒ、　ａｙｗ　）とのオフタロ二
−二重免疫拡散法により、各抗原を認識するモノクロー
ナル抗体２２Ｂ７（抗ａ）、１１Ｆ１（抗ａｒ）、５Ａ
５（抗ｄ）、１８Ｅ９（抗ｄ）を得た。このサブタイプ
既知モノクローナル抗体で感作したニワトリ血球とのＲ
ＰＨＩ法により、各モノクローナル抗体の認識するＨＢ
ｓ抗原のサブタイプを決定した。即ち、ＨＢｓ抗ｙｉ、
陽性血清（抗原価２５６倍）を２〜２５６倍まで２倍段
階希釈した後、抗ＨＢｓモノクローナル抗体（抗体価１
０００倍）２５μｌを各ウェルに加え、３７℃で１時間
中和反応を行なわせ、ついで抗ａ（２２Ｂ７）、抗５ｒ
（ＩＩＦＩ）、抗ｄ（５Ａ５）、抗ｄ（１８Ｅ９）抗体
感作ニワトリ固定血球を２５μｌ各ウエルに添加し、混
和後、室温に４０〜６０分間静置して凝集像を観察した
。ＨＢｓＦＪ′Ｌｇと各モノクローナル抗体感作血球と
の凝集反応を２管以上阻止した場合を陽性とし、感作に
用いたモノクローナル抗体と同じサブタイプを認識して
いると判定した。
■、モノクローナル抗体の精製 免疫グロブリンクラスＩｇＧ＋に属するモノクローナル
抗体はプロティンＡアフィニティークロマト法により精
製した。
腹水を遠心後、０．４５μｍメンプラン濾過した後、１
００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ９２）に透析し、同バ
ッファーで平衡化したプロティンＡセファロースカラム
にか（す、吸着したＩｇＧ１を０．１Ｍ酢酸、０．１４
Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出し、直ちに２Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ９，０）を適量加えて中和した後、ＰＢ
Ｓで透析して精製モノクローナル抗体（ＩｇＧ＋）とし
た。
ＩｇＧ、、クラスのモノクローナル抗体は、腹水を遠心
濾過後、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８，２）に
透析し、以下ＩｇＧ、と同様に操作して精製モノクロー
ナル抗体とした。
ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体は、ハイドロキシア
パタイトクロマト法で精製した。腹水を遠心濾過して不
溶物を除いた後、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６，
８）に透析し、同バッファーで平衡化したハイドロキシ
アパタイトカラムに吸着させた。吸着したＩｇＭを、リ
ン酸濃度をステップワイズにあげて溶出しく０．２〜０
．４Ｍ）、溶出液をＰＢＳで平衡化したセファデックス
Ｇ２５カラムに通してバッファーをＰＢＳに交換し、精
製モノクローナル抗体（Ｉ　ｇＭ）とした。
■１等電点の測定 上記精製モノクローナル抗体のうち、１４種について等
電点を測定した。
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体の等電点は薄層ポリ
アクリルアミドゲル等電点電気泳動法により、ＩｇＭク
ラスのモノクローナル抗体の等電点は薄層アガロース等
電点電気泳動法により測定した。
（１）薄層ポリアクリルミドゲル等電点電気泳動アンフ
オラインＦＡＧプレート（ＬＫＢ社、ｐＨ３，５〜９．
５）の陽極に１Ｍリン酸、陰極に１Ｍ水酸化ナトリウム
を浸した電極濾紙をセットした。プレート上にＩｇＧク
ラスのモノクローナル抗体を含ませたサンプルアプリケ
ーター濾紙をセットし、定電力３０Ｗ１温度１０℃で１
．５時間泳動した。泳動終了後、ゲルプレートを固定液
０につけ、６０分間放置後、ゲル表面を脱色液０ですす
ぎ、６０℃の染色液０中で１０分間染色した。ついでゲ
ルを脱色液中に移し、余分の染色液を脱色後、ゲルをグ
リセリン保存液噛に６０分間浸し、室温で一夜乾燥後、
プラスチックシートをかぶせて保存した。
モノクローナル抗体の等電点は、同時に泳動したキャリ
ブレーション用ｐ！既知タンパクの泳動距離を基準にし
て求めた。
率固定液：メタノール　１５０ｍ１ 蒸留水　３５０ｍ１ スルホサリチル酸　１７．２５　ｇ トリクロロ酢酸　５７．５　ｇ 染色液：コマジ−ブリリアントブルー Ｒ２５００，１１５ｇ 脱色液　１００ｍ１ 脱色液：エタノール　５００ｍ１ 酢＃１６０ｍ１ 蒸留水を加え全量を２Ｌとする 保存液：グリセリン　５０ｍ１ 脱色液　５００ｍ１ （２）７ンフオライン・アガロース・プレート（ＬＫＢ
社、ｐＨ３，５〜９，５）の陽極側に０゜５Ｍ酢酸、陰
極側に０．５Ｍ塩化ナトリウムを含ませた電極用濾紙を
置き、プレート上にモノクローナル抗体を含ませたアプ
リケーター濾紙を置き、初期電圧を５ｏｏｖにセットし
、定電圧で３０分間泳動する（１０°Ｃ）、泳動後、ア
ガロースゲルを固定液０に１０分間浸し、ついでエタノ
ールに１０分間浸す、ゲルをドライヤーで乾燥後染色液
０に５分間浸し、ついで脱色液０で余分の脱色液を除く
。脱色後、ゲルを乾燥し、保存する。
モノクローナル抗体の等電点は同時に泳動したキャリブ
レーション用ｐｔ既知タンパクの泳動距離を基準にして
求めた。
本固定液ニトリクロロ酢酸　１００ｇ スルホサリチル酸　１０ｇ 蒸留水　１０１００Ｏ 染色液二コマジ−ブリリアントブルー Ｒ２５０１，５ｇ 脱色液　３００ｍ１ 脱色液：９５％エタノール　３５０ｍｌ氷酢酸　１００
ｍ１ 蒸留水で１０１００Ｏとする 以北の結果を表２に示す。
表２　モノクローナル抗体の性質 ７２　（［き）　モノクローナル抗体の性質ｉ　モノク
ローナル抗体感作血球によるＨＢｓ抗凍０検出 得られたモノクローナル抗体の内、１２種についてＨＢ
ｓ抗原の検出感度を測定した。
（１〉ニワトリ固定血球の調整 ニワトリ固定血球を６００ｇで５分間遠心後、ト清を捨
て、生理食塩水に浮遊させ、６００ｇで５分間遠心して
上清を捨てる。この操作を３回繰り返した後、血球を５
　（Ｖ／Ｖ）％になるようにＰＢＳに浮遊させ、１〜１
．２％（Ｖ／Ｖ、ＰＢＳ）グルタルアルデｈドを１７１
０量加え、室温で１〜２時間ゆっくり混和して固定する
。固定後、血球を蒸留水で５回遠心洗浄（６００ｇ、５
分）し、５％濃度にした後、アジ化ナトリウムを０．１
％量加え、冷蔵庫内に保存する。
（２）モノクローナル抗体感作血球のｙ４！！ニワトリ
固定血ｆｆ　（５Ｖ／Ｖ％）２ｍｌを生理食塩水で３回
遠心洗浄（６００ｇ、５分）し、これに抗ＨＢｓモノク
ローナル抗体（２５〜５００μｇ／　ｍ　ｌ　）の生理
食塩水２ｍｌを等量混合し、ついで塩化クロムを終濃度
２５〜２００μｇ　／　ｍ　ｌになるように加え、室温
で２時間緩やかに攪拌しながら感作する。感作後、０．
５％ＢＳＡ／ＰＢＳで５回遠心洗浄（６００ｇ、５分）
し、最後に感作血球をＯ，Ｓ％ＢＳＡ／ＰＢＳ１６ｍｌ
に浮遊してモノクローナル抗体感作血球とした。
表３に感作血球のＨＢｓ抗原検出感度を示した。
（以下余白） 以上の様に、モノクローナル抗体ＨＢ　ｓ　１８　Ｅ９
、ＨＢｓ８Ｃ１、ＨＢｓ２２Ｂ７を用いた場合、最も検
出感度が高く非特異反応が少ない。
該抗ＨＢｓ抗体産生ハイブリドーマは、英国Ｐｏｒｔｏ
ｎ　Ｄｏｗｎ、　５ａｌｉｓｂｕｒｙ　Ｗｉｌｔｓｈｉ
ｒｅ　ＳＦ３０ＪＧのＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａａ　
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ＡａＬｍａｌ　　
Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅｓ）にブダペスト条約に基づき
寄託きれている。受託番号および受託日は下記のとおり
である。
（以下余白） 天」目１至 １、免疫原の調製 ヒトブール血清１００ｍ１を、遠心Ｃ２０００ｇ、１０
分）、０．４５ｄ−メンプラン濾過後１００ｍＭリン酸
バッファ（ｐ［，８）に透析し同バッファでｖ漸化した
ハイドａキシアパタイトカラムに吸着させた。吸着した
ｆｇＭをリン酸濃度をステップ・フイズにあげて溶出し
く０．２〜０．４Ｍ）、１ｉＪｆ液をＰＢＳで平衡化し
たセブアデンクス０２５カラムに通してバッファをＰＢ
Ｓに交換し精製ＩｇＭとした 表４　　　ヒトＩｇＭの精製 タンパクはＬｏｗｒｙ　らの方法（Ｊ、　　Ｒｉｏｔ、
　Ｃｈｅｍ、、１９３２６５−２７５（１９７１）によ
り測定した。
ｉ、ｈト１８Ｍ感作血球の調製 抗ヒトＩｇＭ抗体検出試薬として１で精製したヒトＩｇ
Ｍをニワトリ固定血球に感作し、　　ＰＨＡ法試薬を調
製した。
（１）ニワトリ固定血球の調製 ニアトリ保存血液を６００ｇ５分間遠心後上清をすて、
生理食塩水に浮遊させ６００ｇ５分間遠心し℃上清をす
てる。この操作を３回繰り返した後血球を５’／ｖ％に
なるようにＰＢＳに浮遊させ、１　”　１．２％（’／
ｖ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　）　クル９ル”Ｉルテヒドを１八、量
加え室温で１〜２時間ゆっくり混和して固定する。固定
後、血球を蒸留水で５回遠心洗浄（６００ｇ、５分）し
、５ｖ／ｖ％濃度にした後ＮａＮ５を０．１％量加え、
冷蔵庫内に保存する。
（クヒトＩｇＭ感作ニアトリ固定血球の調製ニワトリ固
定血球（５’／Ｖ％）２ａ＋１をＰＢＳで２回遠心・洗
浄（６００ｇ、５分）し、ＰＢＳで４１の懸濁液とする
。これをタンニンｍｃ５ｍｇ／ｄｉ）ＰＢＳ溶液と等量
混合し、３７℃で１０分間ゆるく攪拌しながらタンニン
酸処理する。タンニン酸処理血球をＰＢＳで２回遠心洗
／＄（６００ｇ、５分）後ＰＢ５８ｍｌの懸濁液とし、
精製ヒト　Ｉ　　ｇＭ（１００μｇ／ｍｌ　　ＰＢ　　
Ｓ　、　ｐ）１６．２　　）　溶液を等篭加えて室温で
２時間攪拌する。ついでグルタルアルデヒドを０．００
１％量加え、さらに室温で１時間攪拌する。０．５％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳ　　で５回遠心洗浄（６００ｇ、５分）ｔ
、１６ｍ１の懸濁液にしてヒトＩｇＭ感作血球とした。
−、マウス肺臓細胞の調製 ＢＡＬＢ／ｃ　７ウスに精製ＩｇＭ　　１００μｇとフ
ロイント完全アジュバントの混合物０　、２　ｍｌを背
皮下に投与し以後１８Ｍのみ（５０ｔｔｇ）を２週問お
きに３回〜５回背皮下に投与して最終免疫の３日後に肺
臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に供した。
■、ハイブリドーマの調製 マウス肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞ＳＰ２１０−Ａｇ１
４（ＳＦ３）を常法により融合させた。
マウス肺臓細胞を取り出し、１５％ＦＣ８添加ＲＰＭＩ
　　１８４０培地１０ｍ１懸瀾液とし２００×ｇ、５分
間遠心後細胞を適量の０．１７ＭＮＨ４Ｃｌで処理して
、含まれる赤血球を破壊した後、ＦＣＳを含まないＲＰ
ＭＩ　　１６４０培地５ｍｌに懸濁した。同じＦＣＳを
含まない培地５ｍｌに懸濁したＳＰ２細胞を、上記の方
法で作製した肺臓細胞の１八Ｉ加え、良く混合した後、
２００Ｘｇ、５分間遠心してＲＰＭＩ　　１６４０培地
を除き、３７°Ｃに加温した５０％ポリエチレングリフ
ール４．０００１ｍｌ（ＲＰＭＩ　　１６４０培地と等
量混合）を徐々に加え、良く攪拌して細胞を融合させた
。融合後、１５％ＦＣ３添加ＲＰＭＩ　　１６４０培地
を徐々に加λ９、細胞を２００Ｘｇ、５分間遠心洗浄し
てポリエチレングリフールを除いた後、ＨＡＴ（ハイポ
キサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地に懸濁し
９６穴平底マイクロプレートに１ウエルあたりの肺臓細
胞数が約５ｘｉｏ’個／２００μｍとなるようにまきこ
んだ、培養開始４〜５日目に各ウェルのＨＡＴ培地の半
量を交換し９〜１３日目にハイブリドーマのコロニー形
成を確認して培養上清の抗ＩｇＭ抗体価をｉで得たＰ）
ｔＡ凝集試薬で測定した。
培養上清１０μｍをＰＢＳ　　２００μｍで２０倍に希
釈後、その２５μｍをとりヒトＩｇＭ感作血球２５μｍ
を加えて混合し、凝集陽性を示したウェルを抗ヒトＩｇ
Ｍ抗体産生ハイブリドーマを含むものとした。抗ヒトＩ
ｇＭ抗体産生ハイブリドーマを限界希釈法により３回ク
ローニングし安定な抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマを５株得た。得られたハイブリドーマ
は９０％ＦＣ５，１０％ジメチルスルホキシド中に懸ｌ
開し、−８０℃庫および液体窒素中に保存した。
そのうちの１株をＨＩｇＭ１０Ｃ９と命名した。
該抗ヒトＩｇＭ抗体産生ハイブリドーマＨ１８ＭＩ　Ｏ
Ｃ９は、１９８７年３月１９日から英国Ｐｏｒｔｏｎ　
Ｄｏｗｎ、　５ａｌｉｓｂｕｒｙ　Ｗｉｌｔｓｈｉｒａ
　ＳＦ３０ＪＧのＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌＣｕ
ｌｔｕｒｅｓ）にブダペスト条約に基づき受託番号８７
０３１９０３として寄託されている。
Ｖ、モノクローナル抗体の製造 ８週令以上のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にプリスタン
（２、６、１０、１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｐｅ
ｎｔａｄｅｃａｎａ）０．２５ｍ１を投与し、３〜１４
日後に、ＰＢＳ懸濁液としたハイブリドーマｌＸ１０’
個（１ｍｌ）を腹腔内に投与した。投与後１０〜２０日
後に貯留した腹水を採取した。腹水中にはＰＨＡ抗体価
で１６万〜６４万の抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体が
含まれていた。腹水の採取量はＢＡＬＢ／ｃマウス−匹
あたり１〜５ｍｌであった。
■、モノクローナル抗体の性質 分離・確立したハイブリドーマＨＩｇＭ１０Ｃ９の産生
するモノクローナル抗体の性質を表５に示した。
免疫グロブリンのアイソタイプは抗ヒトＩｇＭ抗体産生
ハイブリドーマの培養上清をヒツジ抗マウス免疫グロブ
リンＭ、Ｇ、Ａ、Ｇ１．Ｇｓ−Ｇｓｂ−Ｇｓ。
におよびλ鎖血清とアガロースゲル内で反応させ沈降線
の生成により確認するオフタロ二−二重免疫拡散法によ
り同定した。
モノクローナル抗体と免疫グロブリンとの反応は市販の
精製ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧおよびヒトＩｇＡ（カッペ
ル社）をニワトリ固定血球にタンニン酸法で感作したＰ
ＨＡ試薬（ｉ、ヒトＴｇＭ感作血球の調製参照）により
確認した。
（以下余白） ・等電点の測定 モノクローナル抗体の等電点は薄層アガロース等１点寛
気泳動法により測定した。
アンフオライン・アガロース・プレート（ＬＫＢ社、ｐ
Ｈ３，５〜９．５）の陽極側に０．５Ｍ酢酸、陰極側に
０゜５Ｍ塩化ナトリウムを含ませた電極用濾紙を置き、
プレート上にモノクローナル抗体を含ませたアプリケ−
タル濾紙を置き、初期電圧を５００ｖにセットし、定電
圧で３０分間泳動する（１０℃）。泳動後、アガロース
ゲルを固定液１に１０分間浸し、ついでエタノールに１
０分間浸す、ゲルをドライヤーで乾燥後染色液１に５分
間浸し、ついで脱色液９で余分の染色液を除く、脱色後
、ゲルを乾燥し、保存した。
モノクローナル抗体の等電点は同時に泳動したキャリブ
レーション用ｐｔ既知タンパクの泳動距離を基準にして
求めた。
本固定液ニトリクロロ酢酸　１００ｇ スルホサリチル酸　ＩＱｇ 蒸留水　１０１００Ｏ 染色液：コマジ−ブリリアントブルー Ｒ２５０１，５ｇ 脱色液　３００ｍ１ 脱色液＝９５％エタノール　３５０ｍ１氷酢酸　１００
ｍ１ 蒸留水で１０１００Ｏとする ｉ、モノクローナル抗体の精製 抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体ｌ（ＩｇＭ１０Ｃ９は
、ハイドロキシアパタイトクロマト法で精製した。腹水
を遠心濾過して不溶物を除いた後、０．１Ｍリン酸バッ
ファー（ｐＨ６，８）に透析し、同バッファーで平衡化
したハイドロキシアパタイトカラムに吸着させた。吸着
したＩｇＭを、リン＃濃度をステップワイズにあげて溶
出しく０．２〜０．４Ｍ）、溶出液をＰＢＳで平衡化し
たセファデックスＧ２Ｓカラムに通してバッファーをＰ
ＢＳに交換し、精製モノクローナル抗体（ＩｇＭ）とし
た。
（以下余白） 実施例３ 抗ムンプスウィルスモノクローナル抗体書、免疫原の調
製 （１）ムンプスウィルス粗ＨＡ抗原液の調製ムンプスウ
ィルス（ＥＸＣＨ−２）をＶｅｒｏ細胞（ＦｌｏｗＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　）で培養し産生され
たＨＡ抗原を精製してＨＡ抗原とした。Ｖｅｒｏ細胞５
Ｘ１０７個をローラーボトルに蒔きこみ、５％Ｃ３（子
牛血清）添加ＭＥＭ培地で回転培養（０，３ｒｐｍ。
３７℃）し単層にした。このＶｅｒｏ細胞にムンブスウ
イＪｌ−スＥＸＣＨ−２をＭ、　Ｏ，１，−０，００１
〜０．１テ感染きｔｔ２％Ｃ８添加ＭＥＭ培地で５〜７
日間培養し、ＣＰＥ（細胞変性効果）が１００％認めら
れた時点で細胞を集めてＰＢＳ浮遊液とし、超音波処理
Ｃ１０ＫＨｚ、２．ＩＡ、１０分）後、細胞の残渣を遠
心（６０００ｇ、２０分）して除き、上清を粗ＨＡ抗原
液とした。
（りＨＡ抗原の不活化 粗ＨＡ抗原液に１％量ｗａｅｎ　８０水溶液を１／、１
加え室温で５分間強く振盪する。ついで１八量の〉エチ
ルエーテルを加え４℃で１５分間強く振盪する。この液
を１．６００ｇ、２０分間遠心し、エーテル層を吸引除
去する。水層に適量のチッ素を通し残存するエーテルを
とばして不活化粗ＨＡ抗原液とした。
（３）ガチョウ固定血球の調製 ガブーヨウ保存血液を６００ｇ５分間遠心後上清をすて
、生理食塩水に浮遊させ６００ｇ５分間遠心して洗浄し
た。この洗浄操作を３回くり返した後血球を５ｖ／ｖ％
になるようにＰＢＳに浮遊移せ、１２％（ｖ／ｖＰＢｓ
）グルタルアルデヒドを１八。１加え室温で１〜２時間
ゆっくり混和して固定する。固定後、血球を蒸留水で５
回遠心洗浄（６００ｇ、５分）　Ｌ、　１０　ｖ／Ｖ％
濃度にした後ＮａＮ、を０．１％量加え、冷蔵庫内に保
存した。
（４）　ＨＡ抗原の精製 不活化粗ＨＡ抗原液にガチョウ固定血球１００ｍ１を加
え、４℃−夜ゆるく攪拌してＨＡ抗原を、血球に吸着さ
せた。未吸着のタンパクは４℃で３回遠心除去（６００
ｇ；、５分）後、血球をＰＢＳ５０ｍｌに浮遊許せ３７
℃で３時間放置し、ＨＡ抗ｊ東を血球から遊離させ、遠
心した上清を精製ムンゾスウィｆレスＨＡ抗原とした（
ＨＡ価３８４倍、タンパク４２０μｇ／　ｍｌ　）。
■、ムンプスウィルスＨＡ抗原感作血球の調製（１）ニ
ワトリ固定血球の調製 、−′ノｈ　ＩＪ保存血球を６００ｇ５分間遠心後、上
清をすて、生理食塩水に浮遊きせ６００ｇ５分間遠心し
て上ｌ＾をすてる。この操作を３回くり返した後血球を
５ｖ／ｖ％になるようにＰＢＳに浮遊さけ、１〜１．２
％（ｖ／ｖＰＢＳ）グルタルアルデヒドを１八。１加え
、室温で１〜２時間ゆっくり混和して固定する。固定後
、血球を蒸留水で５回遠心洗７１１（６００ｇ、５分）
し５ｖ／ｖ％濃度にした後ＮａＮ、を０．１％量加え、
冷蔵庫内に保存する。
（２）ムンプスウィルスＨＡ抗原感作ニワトリ固定血球
の調製（ＰＨＡ凝集法試薬） ニワトリ固定血球（５ｖ／ｖ％）２ｍ１をＰＢＳで２回
遠心・洗浄（６００ｇ、５分）し、ＰＢＳで４ｍｌの懸
濁液とする。この固定血球とタンニン酸（５ｍｇ／ｄｉ
）　Ｐ　Ｂ　Ｓ溶液とを等量混合し、３７°Ｃで１０分
間ゆるく攪拌しながらタンニン酸処理する。タンニン酸
処理血球をＰＢＳで２回遠心洗浄（６００ｇ、５分）後
ＰＢ３８ｍｌの懸濁液とし、精製ムンプスウィルスＨＡ
抗原（１００μｇ／ｍｌＰＢＳ、ｐＨ８，２）溶液を等
１加えて室温で２時間攪拌する。０．５％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓで５回遠心洗４（６００ｇ、５分）１，１６ｍ１の懸
濁液にしてムンクスウイルスＨＡ抗原感作血球とした。
鍔、マウス肺臓細胞の調製 ムンプスウィルスＨＡ抗！　１００８ｇとフロイント完
全アジュバントの混合物０．２ｍｌをＢＡＩ。
Ｂ／ｃ　　マウスの背皮下に投与し、以後ＨＡ抗原のみ
（５０μｇ）を２週問おきに３回〜５回背皮下に投与し
て最終免疫の３日後に肺臓細胞をマウスから取り出し、
細砲融合番こ供した。
■、ハイブリドーマの調製 マウス肺臓！ｍ胞とマウス骨髄腫細胞ＳＰ　２１０−Ａ
ｇ１４　（ＳＦ３）を常法により融合させた。マウス肺
臓細胞を取り出し、１５％ＦＣ３添加ＲＰＭＩ１６４０
培地１０ｍ１懸濁液とし２００ｇ、５分間遠心後、細胞
を適量の０．１７Ｍ　ＮＨ，Ｃ１で処理して、含まれる
赤血球を破壊した後、Ｆｅ２を含まない培地５ｍｌに懸
濁したＳＰ２細胞を、肺臓細胞の１八景加え、良く混合
した後、２００Ｘｇ、５分間遠心してＲＰＭＩ　　１６
４０培地を除き、３７℃に加温した５０％ポリエデレン
グリコール４．０００１　ｍｌ（ＲＰＭＩ　１６４０培
地と等量混合）を徐々に加え、良く攪拌して細胞を融合
させた。融合後、１５％ＦＣ５添加ＲＰＭＩ　　１６４
Ｇ培地を徐々に加え、細胞を２００Ｘｇ、５分間遠心洗
浄してポリエチレングリコールを除いた後、ＨＡＴ（ハ
イポキサンチン、アミノプテリン、デミジン）培地に懸
濁し９６穴平底マイクロプレートに１ウエルあたりの肺
臓細胞数が約５Ｘ１０”個／２００μｍとなるようにま
きこんだ、培養開始４〜５日間に各ウェルの半量のＨＡ
Ｔ培地を交換し９〜１３日目にハイブリドーマのコロニ
ー形成を確認して培養上清の抗ムンプスウィルス抗体価
をｉで調製したＰＨＡ凝集試薬で測定した。培養土ｌ青
１０μｍを２％Ｃ８添加ＰＢＳ１００μｍに加えて１１
倍希釈後、２５μｍをとり、ムンプスウィルスＨＡ抗原
感作血球２５μｍを加えて混合し、凝集陽性を示したウ
ェルを、抗ムンプスウィルス抗体産生ハイブリドーマを
含むものとした。抗ムンプスウィルス抗体産生ハイブリ
ドーマを限界希釈法により３回クローニングし安定な抗
ムンプスウィルスモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マを６株得た。得られたハイブリドーマは９０％ＦＣ８
，１０％ジメチルスルホキサイド中に懸濁し、−８０℃
庫および液体窒素中に保存した。そのうち１株をＭＰＶ
１０Ｇ３．！：全命名た。
該抗ムンプスウィルス抗体産生ハイブリドーマＭＰＶＩ
　ＯＧ３は、１９８７年３月１９日から英国Ｐｏｒｔｏ
ｎ　Ｄｏｗｎ、　５ａｌｉｓｂｕｒｙ　５Ｊｉｌｔｓｈ
ｉｒｅ　ＳＦ３０ＪＧのＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１
ｌＣｕｌｔｕｒｅｓ　）にブリペスト条約に基づき受託
番号８７０３１９０２として寄託されている。
替、モノクローナル抗体の製造 ８週令以上のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にブリスタン
（２、６、１０、１４−ｔ＠ｔｒａｍａｔｈｙｌ−ｐｅ
ｎｔａｄｅｃａｎｅ）　０　、２５　ｍｌを投与し、３
〜１４日後にＰＢＳＱｆＩ４液としたバイブリドーマ　
ｌＸ１０ゝ個（１ｍｌ）を腹腔内に投与した。投与後１
０〜２０日後に貯留した腹水を採取した。腹水中にはＰ
ＨＡ抗体価で２５万倍の抗ムンプスウィルスモノクロー
ナル抗体が含まれていた。腹水の採取量はＢＡＬＢ／ｅ
マウス−匹あたり１〜５ｍｌであった。
ψ、モノクローナル抗体の性質 分離・確立したモノクローナル抗体ＭＰＶＩ　ＯＧ３の
性質を表６に示した。
免疫グログリンのアイソタイプは抗ムンプスウィルス抗
体産生ハイブリドーマの培養上清とヒツジ抗マウス免疫
グロブリンＭ、Ｇ、Ａ、Ｇ、、、Ｃ８５、Ｇ　ｍ、抗に
および入鎖血清とをアガロース・ゲル内で反応させ沈降
線の生成により確認するオフタロ二−二重免疫拡散法に
より同定した。
（以下余白） 表６ モノクローナル抗体はムンプスウィルスＥＸＣＨ−２株
のＨＡ抗原と良く反応するが、Ｅｎｄｅｒｓ株のＨＡ抗
原との反応は弱かった。またムンプスウィルスＣＦ抗原
とは反応しなかった。
・等電点の測定 モノクローナル抗体・の等電点は薄層ポリアクリルアミ
ドゲル等電点電気泳動法により測定した。
アンフオラインＦＡＧプレート（ＬＫＢ社、州３．５〜
９．５）の陽極に１Ｍリン酸、陰極にＩ　Ｍ　ＮａＯＨ
をひたした電極濾紙をセットした。プレート上にＩｇＧ
クラスのモノクローナル抗体を含ませたサンプル・アプ
リケーター濾紙をセットし定電力３０Ｗ、温度１０℃で
１．５時間泳動した。泳動終了後ゲル・プレートを固定
液につけ６０分間放置後ゲル表面を脱色液ですすぎ、６
０℃の染色液中で１０分間染色した。ついでゲルを脱色
液中にうつし余分の染色液を脱色後、ゲルをグリセリン
保存液に６０分間浸し、室温で一夜乾燥後プラスチック
シートをかぶせて保存した。
モノクローナル抗体の等電点は、同時に泳動したキャリ
ブレーション用ｐ１既知タンパクの泳動距離を基準にし
て求めた。
固定液：メタノール　１５０ｍ１ 蒸留水　３５０ｍ１ スルホサリチル酸　１７．２５　ｇ トリクロロ酢酸　５７．５　ｇ 染色液：コマジ−ブリリアントブルーＲ２５００，１１
５ｇ 脱色液　１００ａ＋１ 脱色液：エタノール　５００ｍ１ 酢酸　Ｊ、８０ｍ１ 蒸留水を加え、全量を２２とする 保存液：グリセリン　５０ｍ１ 脱色液　５００ｍ１ ｉ、モノクローナル抗体の精製 免疫グロブリン・クラスＩｇＧ＋に属する抗ムンプスウ
ィルスモノクローナル抗体ＭＰＶ１０Ｇ３はプロティン
Ａアフィニテイクロマト法により精製した。腹水を遠心
後、０．４５μｍメンプラン濾通した後、１００ｍＭリ
ン酸バッファｐＨ９，２に透析し、同バッファで平衡化
したプロティンＡセファロースカラムにかけ、吸着した
ＩｇＧ、を、０．１Ｍ酢酸、０．１４ＭＮａＣ１溶液で
溶出し、ただちに２Ｍトリス−塩酸バッファｐＨ９，０
を適量加えて中和した後、ＰＢＳで透析して精製モノク
ローナル抗体（ＥｇＧ＋）とした。
（以下余白） 衷ＪＩｉ玉 ニワトリ保存血液を、生理食塩水で３〜５回遠心洗浄（
１，５０Ｏｒｐｍ、５分）し、血清成分、白血球を除去
する。得られた赤血球を約７゜５　％　（Ｗ／Ｖ）にＰ
ＢＳに浮遊きせる。１．５％グルタルアルデートを約７
．５％赤血球の１０分の１１′添加し、室温で１．５時
間スターラーでゆっくり混和する６反応後、蒸留水で５
回以上遠心洗浄（同」二）Ｌ、、０．１％アジ化ナトリ
ウムを含む蒸省水に約１０％になるよう浮遊させる。抗
体感作時まで４°Ｃで保存する。この固定赤血球は約２
年間保存できる。
グルタルアルデヒドによる固定以外に、ホルマリン固定
を実施したが、固定後、血球どうしが凝集し、使用でき
なかった。
ｌ皇皇潴二至ｊヱｌΣ−ナル抗イ本止 ５％ニワトリ固定血球を生理食塩水（０，８５％）で遠
心洗浄（２，００Ｏｒｐｍ、５分）し、１２５〜５００
１１　ｇ　／　ｍ　＋のモノクローナル抗体ＨＢ　８１
１　Ｆ　１　（ＩｇＧｓ−）を等量混合する。さらに、
１２．５〜１５０Ｉ１８／ｍｌになるように塩化クロム
を添加し、室温で２時間、スターラーでゆっくり混合す
る０反応後、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで５回遠心洗浄（
２，００Ｏｒｐｍ、５分）し、未吸着の抗体を除去し、
抗体感作血球を作成した。
得られた抗体感作血球のＨＢｓ抗原の最小検出感度を測
定した結果を以下に示す。
（以下余白） 以上のように、ＩｇＧタイプ、特にＩｇＧ、、タイプの
モノクローナル抗体を感作する場合には、２．５％固定
赤血球に対し、５０〜１５０μｇ／ｍｌの塩化クロムの
存在下に、５０〜２５０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗
体を感作すれば、感度が高く非特異反応も少ない感作血
球が作成できた。
同様にして、ＨＢｓ２２Ｂ？（ＩｇＭ）を固定血球に感
作し、その検出感度を測定した結果を次に示す。
（以下余白） 以上のように１８Ｍタイプのモノクローナル抗イ本も塩
化クロム法によって感作すれば、高感度の感作血球を作
製できる。
以上の通り、２５％固定血球に対して、１０〜３００　
Ｉ１８／ｍｌの塩化クロムの存在下に、１０〜５００　
Ｉ１８／ｍｌのモノクローナル抗体を感作すれば高感度
の感作血球を作製できる。
タンニン酸法との比較 モノクローナル抗体ＨＢ　ｓ　１８　Ｅ　９　（ＩｇＧ
、）、ＨＢ　ｓ　１１　Ｆ　１　（ＩｇＧｚ−）および
ＨＢ　ｓ　２２　Ｂ　７（ＩｇＭ）をタンニン酸法によ
り感作した。５％のニワトリ固定血球をＰＢＳで２回遠
心洗浄（２゜０００ｒｐｍ、５分）した後、５ｍｇ／ｍ
ｌのタンニン酸と等量混合し、３７°Ｃの水浴中で、１
０分間反応させる。ＰＢＳで２回洗浄した後、ｐＨ６，
４のＰＢＳに２．５％になるように浮遊させ、１００μ
ｇ／ｍｌのモノクローナル抗体と等量混合する。
室温で２時間、スターラーでゆっくり混和し、モノクロ
ーナル抗体を血球に吸着させる。遠心洗浄して未吸着の
抗体を除去して抗体感作血球を得た。得られたタンニン
酸法による抗体感作血球と、上記の塩化クロム法（塩化
クロム濃度１００μｇ／ｍｌ、抗体濃度２００　ｔｔｇ
／ｍｌ）によって得られた抗体感作血球のＨＢｓ抗原最
少検出感度を比較した。
以上のとおり、固定血球にモノクローナル抗体を感作す
る時は、従来のタンニン酸法よりも塩化クロム法が好ま
しく、より高感度の抗体感作血球が得られた。
兆丑」」聾釦ユａ１ ５％のニワトリ固定血球を１００μｓ／ｍｌの塩化クロ
ム中で１００μｇ　／　ｍ　＋の抗ＨＢｓモノクローナ
１しＩｇＧ（ＨＢｓ８Ｃ１またはＨＢｓ１８Ｅ９）と等
量混合し、室温で１時間反応させ、抗体を血球に感作し
た。さらに、塩化クロムと抗ＨＢｓモノクローナルＩｇ
Ｍ（ＨＢｓ２２Ｂ７）を、それぞれ２５μｇ／ｍｌ、２
０μｓ／ｍ＋になるように混合し、さらに１時間反応許
せた。この血球を、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで５回遠心
洗ｈｃ２．００Ｏｒｐｍ、５分）して、０．５％に浮遊
して、抗ＨＢｓモノクローナル抗体感作血球とした。
被検血清（ＨＢｓＢｓ抗性陰性販のＲ−ＰＨＡ試薬で測
定）１８０検体を用意した。０．２５％ＢＳＡ−ＰＢＳ
を、マイクロプレートに２５μｍつつ分注し、これに上
記の血清５μ！を加え、さらに上記で作成した感作血球
を５０μｌ加え１時間後の凝集像を観察した。すると、
１８０検体中８８検体中で完全凝集、４２検体で弱凝集
が見られ、非特異反応がかなり強いことがわかった。
上記の０．２５％ＢＳＡ−ＰＢＳに感作に用いたモノク
ローナルＩｇＭ（ＨＢｓ２２Ｂ７）をグルタルアルデヒ
ドで変性させたものを１０〜１００μｍ１　／　ｍ　１
添加した０、ｌ：記の１８０検体について同様に非特異
反応の出現の有無を調べたところ、非特異反応は８８検
体から３９検体に減少した。
さらに、抗ＨＢｓ抗原活性の無い、ヒトＩｇＭに対する
モノクローナルＩｇＭ（ＨＩｇＭ１０Ｃ９）を１０〜ｔ
ｏｏμｇ／ｍｌを添加すると、非特異反応は２３検体に
減少した。
続いて、熱処理（６０℃、３０分）した抗ムンプスモノ
クローナル抗体ＭＰＶ１０Ｇ３（ＩｇＧ、）を１０〜１
００μｓ／ｍ＋添加したところ強弁特異検体は２３検体
から１３検体に減少した。
モノクローナルＩｇＭ（ＨＢｓ２２Ｂ７）はＨＢｓ抗体
活性があるため、そのまま添カロするとＨＢｓＭ厘を中
和してしまい、キットの感度を低下させる。そのため、
変性させて抗体活性を失わせたものを添加する必要があ
る。変性法として、グルタルアルデヒド処理、２−メル
カプトエタノール処理および加熱（６５℃）の方法を用
いたが、グルタルアルデヒド０．０１〜０．１％の濃度
で処理して変性させるとＨＢｓ抗体活性がなくなるもし
くは低くなり、かつ、非特異反応抑制効果があった。他
の２−メルカプトエタノールおよび加熱処理は、抗体活
性がなくなると同時に非特異反応抑制効果もなくなり、
有効な方法ではなかった。
反応液中に添加するＩ　ｇ　Ｇ　＋に関しては、熱変性
のものと未変性のものとを比較したが、リウマチ因子陽
性検体に対する非特異反応に関しては、熱変性したもの
の方が、非特異反応抑制効果が大きかった。
旦ｍ装置Ｚ ５％のニワトリ固定血球を１００μｇ／ｍｌの塩化クロ
ム中で１００μｇ　／　ｍ　１の抗ＨＢｓモノクローナ
ルＩｇＧ（ＨＢｓ８Ｃ１またはＨＢｓ１８Ｅ９）と等量
混合し、室温で１時間反応させ、抗体を血球に感作した
。さらに、２５μｇ　／　ｍ　１の塩化クロムと２０μ
ｇ　／　ｍ　ｌの抗ＨＢｓモノクローナルｉｇＭ（２２
Ｂ７）を混合し、きらに１時間反応させた。この血球を
、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで５回遠心洗浄し、０．５％
に浮遊して、ＨＢｓ８Ｃ１およびＨＢｓ２２Ｂ７感作血
球とＨＢｓ１８Ｅ９およびＨＢｓ２２Ｂ７感作血球を得
た。
上記の０．２５％ＢＳＡ−ＰＢＳに感作に用いたモノク
ローナル抗体ＨＢｓ２２Ｂ７をグルタルアルデヒドで変
性させたものとモノクローナル抗体ＨＩ　ｇＭｌ　０Ｃ
９をそれぞれ２５μｇ／ｍｌに、モノクローナル抗体Ｍ
ＰＶ１０Ｇ３を熱変性させたものを５０μｇ　／　ｍ　
１に添加した。
上記反応液２５μ！をマイクロプレートに移し、検体５
μｌを加えた。そこへさらに、８Ｃ１／２２Ｂ７感作血
球５０μＩ、１８Ｅ９／２２Ｂ７感作血球５０μ１１ま
たは８　Ｃ１／２２　Ｂ　７感作血球と１８Ｅ９／２２
Ｂ７感作血球を当量混合したもの５０μｌを加え、１時
間後の凝集像を観察した。その結果を次に示す。
上記のように、何れの場合に於ても良好な感度が得られ
非特異反応も少ないが、２種の異なる感作血球を用いれ
ば非特異反応がさらに抑制された。
２種の異なる感作血球を用いる場合には、８Ｃ１／２２
Ｂ７と１８Ｅ９／２２Ｂ７の組合わせが最も良好であっ
た。
ｉ里五皇１ 従来のキットにおいては非特異反応が多い為に検体血清
をあらかじめ２００倍程に希釈する必要があったが、本
発明に従いＨＢｓ抗原を測定する場合には、６倍程度の
希釈でよく、高感度で非特異反応の少ないＨＢｓ抗原の
測定が可能になった。
特許出願人　塩野義製薬株式会社 ｒ　〜　　） 代　理　人　弁理士　潮１）雄−フ　　−し−〜−−Ｊ

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）抗ＨＢｓモノクローナル抗体ＨＢｓ８Ｃ１、ＨＢ
    ｓ１８Ｅ９またはＨＢｓ２２Ｂ７。
  2. （２）ハイブリドーマＨＢｓ８Ｃ１が産生し、ＨＢｓの
    ｄ抗原を認識し、ＩｇＧ＿１／κに属する請求項１に記
    載のモノクローナル抗体ＨＢｓ８Ｃ１。
  3. （３）ハイブリドーマＨＢｓ１８Ｅ９が産生し、ＨＢｓ
    のｄ抗原を認識し、ＩｇＧ＿１／κに属する請求項１に
    記載のモノクローナル抗体ＨＢｓ１８Ｅ９。
  4. （４）ハイブリドーマＨＢｓ２２Ｂ７が産生し、ＨＢｓ
    のａ抗原を認識し、ＩｇＭ／κに属する請求項１に記載
    のモノクローナル抗体ＨＢｓ２２Ｂ７。
  5. （５）抗ＨＢｓモノクローナル抗体を感作した血球を用
    いる逆受身凝集反応において、グルタルアルデヒドで変
    性された後反応溶液中に添加され、該反応の非特異反応
    を抑制することを特徴とする請求項４に記載のモノクロ
    ーナル抗体ＨＢｓ２２Ｂ７。
  6. （６）抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体ＨＩｇＭ１０Ｃ
    ９。
  7. （７）ハイブリドーマＨＩｇＭ１０Ｃ９が産生し、Ｉｓ
    Ｍ／κに属する請求項６に記載のモノクローナル抗体Ｈ
    ＩｇＭ１０Ｃ９。
  8. （８）抗ＨＢｓモノクローナル抗体を感作した血球を用
    いる逆受身凝集反応において、反応溶液中に添加され、
    該反応の非特異反応を抑制することを特徴とする請求項
    ６に記載のモノクローナル抗体ＨＩｇＭ１０Ｃ９。
  9. （９）抗ムンプスウイルスモノクローナル抗体ＭＰＶ１
    ０Ｇ３。
  10. （１０）ハイブリドーマＭＰＶ１０Ｇ３が産生し、Ｉｇ
    Ｇ＿１／κに属する請求項９に記載のモノクローナル抗
    体ＭＰＶ１０Ｇ３。
  11. （１１）抗ＨＢｓモノクローナル抗体を感作した血球を
    用いる逆受身凝集反応において、反応溶液中に熱変性後
    添加され、該反応の非特異反応を抑制することを特徴と
    する請求項９に記載のモノクローナル抗体ＭＰＶ１０Ｇ
    ３。
  12. （１２）請求項１に記載の抗ＨＢｓモノクローナル抗体
    ＨＢｓ８Ｃ１を産生するハイブリドーマＨＢｓ８Ｃ１。
  13. （１３）請求項１に記載の抗ＨＢｓモノクローナル抗体
    ＨＢｓ１８Ｅ９を産生するハイブリドーマＨＢｓ１８Ｅ
    ９。
  14. （１４）請求項１に記載の抗ＨＢｓモノクローナル抗体
    ＨＢｓ２２Ｂ７を産生するハイブリドーマＨＢｓ２２Ｂ
    ７。
  15. （１５）請求項６に記載の抗ヒトＩｇＭモノクローナル
    抗体ＨＩｇＭ１０Ｃ９を産生するハイブリドーマＨＩｇ
    Ｍ１０Ｃ９。
  16. （１６）請求項９に記載の抗ムンプスウイルスモノクロ
    ーナル抗体ＭＰＶ１０Ｇ３を産生するハイブリドーマＭ
    ＰＶ１０Ｇ３。
  17. （１７）抗ＨＢｓモノクローナル抗体を塩化クロムの存
    在下に固定血球に感作することを特徴とする抗ＨＢｓモ
    ノクローナル抗体の感作方法。
  18. （１８）５〜６００μｇ／ｍｌの塩化クロムの存在下に
    、１〜５％濃度の固定血球に対して、５〜１０００μｇ
    ／ｍｌの抗ＨＢｓモノクローナル抗体を感作することを
    特徴とする請求項１７に記載の感作方法。
  19. （１９）該固定血球がグルタルアルデヒド固定ニワトリ
    赤血球である請求項１７または１８に記載の感作方法。
  20. （２０）抗ＨＢｓモノクローナルＩｇＧおよび抗ＨＢｓ
    モノクローナルＩｇＭを、請求項１７〜１９のいずれか
    に記載の方法に従い、固定血球へ二重感作したことを特
    徴とする抗ＨＢｓモノクローナル抗体感作固定血球。
  21. （２１）該抗ＨＢｓモノクローナルＩｇＭがＨＢｓ２２
    Ｂ７であり、該抗ＨＢｓモノクローナルＩｇＧがＨＢｓ
    ８Ｃ１またはＨＢｓ１８Ｅ９であることを特徴とする請
    求項２０に記載の固定血球。
  22. （２２）該固定血球がグルタルアルデヒド固定ニワトリ
    赤血球である請求項２０または２１に記載の固定血球。
  23. （２３）抗ＨＢｓモノクローナル抗体を感作した固定血
    球を用いる逆受身凝集反応において、反応溶液中に感作
    に用いた抗ＨＢｓモノクローナル抗体を変性させて添加
    し、所望により、さらにＨＢｓ以外の抗原に対する１種
    以上の変性または未変性のモノクローナル抗体を添加す
    ることを特徴とする非特異反応の抑制方法。
  24. （２４）該抗ＨＢｓモノクローナル抗体がＩｇＭに属す
    ることを特徴とする請求項２３に記載の抑制方法。
  25. （２５）該抗ＨＢｓモノクローナル抗体がＨＢｓ２２Ｂ
    ７であり、グルタルアルデヒドで変性したＨＢｓ２２Ｂ
    ７を該反応液中に添加することを特徴とする請求項２３
    に記載の抑制方法。
  26. （２６）該固定血球に感作する抗ＨＢｓモノクローナル
    抗体がＩｇＧおよびＩｇＭであり、該ＩｇＭを変性させ
    て反応液中に添加することを特徴とする請求項２３に記
    載の抑制方法。
  27. （２７）該ＩｇＧがＨＢｓ８Ｃ１および／またはＨＢｓ
    １８Ｅ９であり該ＩｇＭがＨＢｓ２２Ｂ７であり、グル
    タルアルデヒドで変性させたＨＢｓ２２Ｂ７を反応液中
    に添加することを特徴とする請求項２６に記載の抑制方
    法。
  28. （２８）該固定血球を２種用いることを特徴とする請求
    項２３に記載の抑制方法。
  29. （２９）該固定血球がＨＢｓ８Ｃ１およびＨＢｓ２２Ｂ
    ７で感作した固定血球およびＨＢｓ１８Ｅ９およびＨＢ
    ｓ２２Ｂ７で感作した固定血球であり、グルタルアルデ
    ヒドで変性させたＨＢｓ２２Ｂ７を反応液中に添加する
    ことを特徴とする請求項２８に記載の抑制方法。
  30. （３０）該ＨＢｓ以外の抗原に対するモノクローナル抗
    体がＩｇＧおよび／またはＩｇＭであることを特徴とす
    る請求項２３に記載の抑制方法。
  31. （３１）該ＨＢｓ以外の抗原に対するモノクローナル抗
    体が抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体および／または抗
    ムンプスウイルスモノクローナル抗体であることを特徴
    とする請求項２３に記載の抑制方法。
  32. （３２）該ＨＢｓ以外の抗原に対するモノクローナル抗
    体が未変性のＨＩｇＭ１０Ｃ９および／または熱変性し
    たＭＰＶ１０Ｇ３であることを特徴とする請求項２３に
    記載の抑制方法。
  33. （３３）反応溶液中にそれぞれのモノクローナル抗体を
    １〜１００μｇ／ｍｌとなるよう添加することを特徴と
    する請求項２３に記載の抑制方法。
  34. （３４）該固定血球がグルタルアルデヒド固定ニワトリ
    赤血球であることを特徴とする請求項２３に記載の抑制
    方法。
  35. （３５）該感作が請求項１７〜１９のいずれかに記載の
    方法でなされることを特徴とする請求項２３に記載の抑
    制方法。
  36. （３６）抗ＨＢｓモノクローナル抗体を感作した固定血
    球を用いる逆受身凝集反応において、請求項２０〜２２
    のいずれかに記載の固定血球を用い、請求項２３〜３５
    のいずれかに記載の方法により該反応中の非特異反応を
    抑制することを特徴とするＨＢｓ抗原の測定方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997007400A1 (fr) * 1995-08-21 1997-02-27 Teikoku Seiyaku Kabushiki Kaisha Reactif permettant d'etudier l'agglutination d'un virus et materiel destine a l'etude du virus
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