CN111944049B - Slc12a9抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

Slc12a9抗体的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了SLC12A9抗体的制备方法及其应用，属于抗体制备技术领域。它解决了现有并未公开SLC12A9抗体的制备方法等问题，一种SLC12A9抗体的制备方法，包括如下步骤；S01：抗原的制备：目标多肽和载体蛋白结合形成多肽交联复合物；S02：制备抗体血清：将步骤S01中的多肽交联复合物制备成悬浮液，并对动物进行免疫，得到抗体血清；S03：抗体纯化：采用亲和层析的方法对抗体血清进行纯化，得到多克隆抗体。本发明多克隆抗体可以特异识别SLC12A9编码的Solutecarrierfamily12member9蛋白等优点。

Description

SLC12A9抗体的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于抗体制备技术领域，尤其是涉及SLC12A9抗体的制备方法及其应用。
背景技术
溶质载体(Solutecarrier，SLC)蛋白是一组跨膜转运蛋白，定位于细胞膜上，转运氨基酸、核苷酸、葡萄糖、无机离子、维生素等。
SLC蛋白与人类疾病密切相关，如：SLC22A4和SLC22A5与炎症性肠病有关，SLC2A9、SLC22A11、SLC22A12与痛风和尿酸水平相关，SLCO1B1和SLCO1B3影响胆红素水平，SLC4A7与血压升高相关。另外，SLC转运蛋白已被确认为药物的靶点，靶向SLC蛋白的药物研究近几年来也成为一大热点。
SLC12A9基因位于5号染色体，基因组长19040kb，有14个外显子，其转录本为19.040kb，编码914个氨基酸。SLC12A9介导细胞内外的钠离子、钾离子、氯离子的转运，与细胞内外的渗透压等密切相关，但其具体机制并不明确。有文献报道，SLC38A9与SLC12A9定位于溶酶体上，与自噬，线粒体自噬等生理过程密切相关。SLC12A9与肿瘤发生发展密切相关,具体机制仍需进一步阐明。目前，检测SLC12A9多采用荧光定量PCR法，但是该方法表征的是SLC12A9基因的mRNA水平，并不能直接对SLC12A9的蛋白表达水平进行表达，现有技术中，并未公开SLC12A9抗体的制备方法。因此，如何提供一种SLC12A9抗体的制备方法与应用是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种SLC12A9抗体的制备方法；本发明的第二个目的是提供一种SLC12A9抗体的应用。
本发明的第一个目的可通过下列技术方案来实现：一种SLC12A9抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤；
S01：抗原的制备：目标多肽和载体蛋白结合形成多肽交联复合物；
S02：制备抗体血清：将步骤S01中的多肽交联复合物制备成悬浮液，并对动物进行免疫，得到抗体血清；
S03：抗体纯化：采用亲和层析的方法对抗体血清进行纯化，得到多克隆抗体。
优选地，步骤S02中，将多肽交联复合物制备成悬浮液进行免疫的具体步骤为：首次免疫时，将多肽交联复合物和弗氏完全佐剂以体积比1:1混合乳化后，对动物进行注射，第二、三、四次免疫将多肽交联复合物和弗氏不完全佐剂以体积比1:1混合乳化后，对动物进行注射。
优选地，步骤S02中，从动物血清中制备抗体的具体步骤为：第一天进行首次免疫，首次免疫后第14天进行二次免疫，二次免疫到三次免疫间隔时间为7天；兔子三次免疫后第7天耳中动脉采集血清小样，7天后加免，第四次免疫完7天后采集全血。
优选地，目标多肽的序列信息为873-886aaLPRPPADPARYPRYC或669-683aaPRAPGSPRALNPQDYC。
优选地，步骤S01中，载体蛋白为血蓝蛋白或牛血清白蛋白。
优选地，步骤S01中，多肽交联复合物的具体步骤为：
(1)将载体蛋白溶解于EDTA水溶液得到载体蛋白溶液；
(2)将Sulfo-SMCC溶解于DMSO,之后加入PBS，得到Sulfo-SMCC溶液；
(3)将Sulfo-SMCC溶液加入到载体蛋白溶液中进行活化，接着用PBS对活化好的载体蛋白进行透析，得到多肽交联复合物。
本发明的第二个目的可通过下列技术方案来实现：采用上述方法制备得到的SLC12A9抗体在检测SLC12A9编码的蛋白中的应用。
采用上述方法制备得到的SLC12A9抗体在制备检测SLC12A9编码的蛋白试剂盒中的应用。
本发明的工作原理：SLC12A9抗体可以特异性识别SLC12A9编码的蛋白(即Solutecarrierfamily12member9蛋白)，通过设计多肽氨基酸序列，制备多肽交联复合物，然后和佐剂混合，对动物进行注射，得到抗体血清，最后纯化抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明的利用根据Solutecarrierfamily12member9蛋白设计得到多肽氨基酸序列，与载体蛋白交联后得到多肽交联复合物作为抗原，通过免疫动物获得抗血清，纯化后得到抗体，多克隆抗体可以特异识别SLC12A9编码的Solutecarrierfamily12member9蛋白。
附图说明
图1是本发明WB验证SLC12A9抗体在胃癌中表达情况图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例中的实验仪器和设备如表1所示，实验试剂如表2所示。
表1 主要实验仪器设备
Figure GDA0003087894980000021
Figure GDA0003087894980000031
表2 主要实验试剂
Figure GDA0003087894980000032
多肽的设计
根据SLC12A9基因编码的Solutecarrierfamily12member9蛋白设计两条多肽，并交联载体蛋白制备抗原。多肽的序列信息如表3所示。
表3 多肽序列信息表
Figure GDA0003087894980000041
抗原的制备
多肽偶联载体蛋白KLH
1、将20mgKLH(KeyholeLimpetHemocyanin，血蓝蛋白，购于市场)溶于2mL,5mM的EDTA水溶液中。
2、称取8mgSulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，购于市场)完全溶于50μLDMSO中，之后加入150μL1×PBS,混合均匀。
3、将Sulfo-SMCC溶液(步骤2中混合得到的溶液)逐滴加入到KLH溶液＝(步骤1混合得到的溶液)中，边加边轻轻摇晃(剧烈摇晃会产生沉淀)，室温放置1h。
4、将步骤3中活化好的KLH溶液放入透析袋中，透析夹夹好，于2L的1×PBS中，4℃冰箱磁力搅拌下透析1h。
5、更换新的2L的1×PBS透析2h，重复一次。将活化透析好的KLH置于15mL进口离心管中，并在管上标记上试剂名称、时间和浓度，4℃冰箱保存。
6、称取4mg多肽，溶于50μL的DMSO中，再加入200μL的1×PBS，快速混匀，随后按照多肽：KLH＝1mg：680μg的比例立即加入活化透析好的KLH，4℃冰箱过夜或者室温下反应2h。
7、将上述交联好的KLH-peptide交联复合物放入透析袋中，透析夹夹好，于4L的1×PBS中，4℃冰箱磁力搅拌下透析过夜。
8、将透析好的KLH-peptide取出到干净的1.5mL离心管中，按照免疫剂量进行分装，-20℃冰箱保存。
两条多肽都是偶联KLH用于免疫，偶联BSA是因为有些多肽直接包被检测的时候包被不上，需要偶联BSA用于检测。
多肽偶联载体蛋白BSA
1、将20mgBSA溶于2mL5mM的EDTA水溶液中。
2、称取5mgSulfo-SMCC完全溶于50μLDMSO中，之后加入150μL1×PBS，混合均匀。
3、将Sulfo-SMCC溶液(步骤2中混合得到的溶液)逐滴加入到BSA溶液(步骤1中混合得到的溶液)中，边加边轻轻摇晃，室温放置1h。
4、将步骤3中活化好的BSA溶液放入透析袋中，透析夹夹好，于2L的1×PBS中，4℃冰箱磁力搅拌下透析1h。
5、更换新的2L的1×PBS透析2h，重复一次。将活化透析好的BSA置于15mL进口离心管中，并在管上标记上试剂名称、时间和浓度，4℃冰箱保存。
6、称取1mg多肽，溶于50μL的DMSO中，再加150μL的1×PBS，快速混匀，随后加入100μL上述活化透析好的BSA溶液，4℃冰箱过夜或室温下反应2h。
7、将上述交联好的BSA-Peptide交联复合物于1.5mL离心管中，加1×PBS至1mL，标记好项目号、浓度和日期，交于检测组。
兔子免疫方案
1、动物选择：兔子采用新西兰白兔，体重2.5Kg左右青壮年。动物选择毛色要光泽，活动自如的健康动物。挑选好动物，先预养2周左右。目的是淘汰有些不合格的动物，使后期的实验能顺利进行。
2、实验前准备：兔子做好标记。编号为HAPM10107-1的多肽对应兔子的编号为5217和5218；编号为HAPM10107-2的多肽对应兔子的编号为5219和5220。每个多肽抗原免疫二只兔子，共四只兔子。
3、抗原准备：按照上述抗原的制备方法，制备得到抗原。
4、将抗原从-20度冰箱中拿出，常温溶解，避免反复冻融。并将注射器做好标记，写上项目号和动物号。
5、取抗原(抗原完全混匀)和佐剂,佐剂和抗原为1:1体积比抽取。首免(首次免疫)佐剂和抗原的混合液中，抗原浓度为1mg/ml,每只兔子注射抗原的剂量为0.5ml/只，二免-四免(二次免疫到四次免疫)抗原浓度减半，剂量不变。首免采用弗式完全佐剂，二-四免采用弗式不完全佐剂。抽取时，佐剂和抗原要充分混合均匀后。
6、二个注射器(一个注射器抽取有抗原，另一个注射器抽取有佐剂)用连接管对接后进行完全乳化，乳化标准为：乳化好的免疫原滴入37度水中不分散为合格。
7、免疫：兔子采用多点皮下注射，每点为0.2ml。
8、免疫时间：首免后第14天进行二免，二免到三免间隔时间为7天。兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后加免，加免完7天后可采集全血。兔子的免疫周期如表4所示。
表4 免疫周期
Figure GDA0003087894980000061
ELISA检测(间接法)
1、包板：用包被缓冲液(coatingbuffer:Na2CO3和NaHCO3缓冲液)将多肽稀释至1μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次。
2、封闭：每孔加60μl的1％BSA(TBST配制)进行封闭，置37℃孵育1小时。之后弃封闭液。
3、加样：加一定稀释的待检样品(把待检样品按照一定的比例进行稀释)，50μl于上述已封闭的反应孔。同时设置好阳性对照孔(阳性血清，来自杭州华安生物技术有限公司)与阴性对照孔(BSA)。置37℃孵育1小时，之后甩干孔中液体，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次。
4、加酶标抗体：将新鲜稀释的二抗-HRP(1:5K，用1％BSA进行稀释)，以50μl/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，之后甩干孔中液体，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次。
5、加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，置37℃反应5min。
6、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸90μl。
7、读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中(450nm)进行读数，保存数据，进行分析。血清ELISA的检测结果如表5和表6所示。
表5 血清ELISA检测
Figure GDA0003087894980000071
结论：5217、5218免疫血清合格(基于ELISA判断)。
定义：1:256000的OD450值为P值(阳性值)，BSA孔的OD450值为N值(阴性值)。
5217P/N＝(0.686+0.535)/2÷0.1＝6.1>2.1达到阳性合格标准。基础ELISA合格。
5218P/N＝(0.323+0.370)/2÷0.1＝3.5>2.1达到阳性合格标准。基础ELISA合格。
注：前面除以2指的是平行对照孔取平均值，后面除以0.1，这个0.1指的是阴性孔的本底读值，也就是N的值。
表6 血清ELISA检测
Figure GDA0003087894980000072
Figure GDA0003087894980000081
结论：5219、5220免疫血清合格(基于ELISA判断)。
定义：1:256000的OD450值为P值(阳性值)，BSA孔的OD450值为N值(阴性值)。
5219P/N＝(0.345+0.355)/2÷(0.137+0.130)/2＝2.6>2.1达到阳性合格标准。基础ELISA合格。
5220P/N＝(0.345+0.502)/2÷(0.147+0.163)/2＝2.7>2.1达到阳性合格标准。基础ELISA合格。
抗体纯化
1、将亲和层析柱依次用20mL纯水和1×PBS(pH7.4)，流速70mL/h充分清洗。
2、取待纯化的血清10mL于50mL离心管中，用孔径0.45μm，直径25mm微孔滤膜抽滤。
3、将抽滤过的血清样品以40mL/h流速上样，重复一次。
4、用20mL1×PBS(pH7.4)以70mL/h的流速清洗柱子，10min后连接蛋白检测仪，清洗过程中调节仪器透光率(T档)示数为100。
5、调节蛋白检测仪吸光率(1A档)示数为0，此时打开电脑桌面的HD-A电脑采集器，并将满屏量程调到5，用甘氨酸溶液(pH2.7，0.2M)以40mL/h的速度洗脱抗体，此时按下绿色的洗脱记录按钮开始洗脱，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体。
6、在抗体收集过程中以1M的碳酸氢钠及时调节抗体的pH值至7左右，并记录洗脱峰的最高峰值。
7、抗体收集完后，调节pH值至7左右，并记录洗脱的抗体体积，之后用纯净水冲洗连接收集器的橡胶管。
8、依次用20mL1×PBS和纯水以70mL/h的速度清洗亲和层析柱，之后加入20％乙醇，封口，4℃冰箱保存。
9、纯化后的抗体根据不同要求送检：ELISA，WB，ICC等。
用WB验证SLC12A9抗体在胃癌中表达情况，如图1所示，
对5220的血清样本进行纯化，成品抗体的ELISA检测结果如表7所示。
表7 成品抗体的ELISA检测结果
Figure GDA0003087894980000091
结论：5220纯化合格(基于ELISA判断)。
定义：1:64000的OD450值为P值(阳性值)，BSA孔的OD450值为N值(阴性值)。
5220P/N＝(0.303+0.349)/2÷0.1＝3.3>2.1达到阳性合格标准。基础ELISA合格。
注：前面除以2指的是平行对照孔取平均值，后面除以0.1，这个0.1指的是阴性孔的本底读值，也就是N的值。
成品抗体体积及浓度如表8所示。
表8 成品体积及浓度
兔子编号 抗体浓度(mg/ml) 抗体体积(ml)
5220 0.658 5.0
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

Claims (3)

1.一种SLC12A9抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤；
S01：抗原的制备：目标多肽和载体蛋白结合形成多肽交联复合物；
S02：制备抗体血清：将步骤S01中的多肽交联复合物制备成悬浮液，并对动物进行免疫，得到抗体血清；
S03：抗体纯化：采用亲和层析的方法对抗体血清进行纯化，得到多克隆抗体；
所述目标多肽为PRAPGSPRALNPQDYC；
所述载体蛋白为KLH，所述多肽交联复合物的制备方法为：
1）将20mg KLH溶于2mL ,5mM的EDTA水溶液中；
2）称取8mg Sulfo-SMCC完全溶于50μL DMSO中，之后加入150μL 1× PBS,混合均匀；
3）将步骤2中混合得到的溶液逐滴加入到步骤1混合得到的溶液中，边加边轻轻摇晃，室温放置1h；
4）将步骤3中活化好的溶液放入透析袋中，透析夹夹好，于2L的1× PBS中，4℃冰箱磁力搅拌下透析1h；
5）更换新的2L的1× PBS透析2h，重复一次；将活化透析好的KLH置于15mL进口离心管中，并在管上标记上试剂名称、时间和浓度，4℃冰箱保存；
6）称取4mg多肽，溶于50μL的DMSO中，再加入200μL的1× PBS，快速混匀，随后按照多肽：KLH＝1mg：680μg的比例立即加入活化透析好的KLH，4℃冰箱过夜或者室温下反应2h；
7）将步骤6中交联好的KLH-peptide交联复合物放入透析袋中，透析夹夹好，于4L的1×PBS中，4℃冰箱磁力搅拌下透析过夜；
将步骤7中透析好的KLH-peptide取出到干净的1.5mL离心管中，按照免疫剂量进行分装，-20℃冰箱保存。
2.根据权利要求1所述的SLC12A9抗体的制备方法，其特征在于，步骤S02中，将多肽交联复合物制备成悬浮液进行免疫的具体步骤为：首次免疫时，将多肽交联复合物和弗氏完全佐剂以体积比1:1混合乳化后，对动物进行注射，第二、三、四次免疫将多肽交联复合物和弗氏不完全佐剂以体积比1:1混合乳化后，对动物进行注射。
3.根据权利要求1所述的SLC12A9抗体的制备方法，其特征在于，步骤S02中，从动物血清中制备抗体的具体步骤为：第一天进行首次免疫，首次免疫后第14天进行二次免疫，二次免疫到三次免疫间隔时间为7天；兔子三次免疫后第7天耳中动脉采集血清小样，7天后加免，第四次免疫完7天后采集全血。
CN202010745807.3A 2020-07-29 2020-07-29 Slc12a9抗体的制备方法及其应用 Active CN111944049B (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Cloning and Functional Characterization of a Cation-Cl- Cotransporter-interacting Protein;Luc Caron;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20001013;第275卷(第41期);第32027-32036页 *
SLC12A9 Antibody;NOVUS biologicals;《NBP2-68858》;20190928;第1-6页，尤其是第5-6页 *

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