CN117603885B - 一种副干酪乳杆菌lp-116及其在制备调节肠道屏障受损产品中的应用 - Google Patents
一种副干酪乳杆菌lp-116及其在制备调节肠道屏障受损产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种副干酪乳杆菌LP‑116及其在制备调节肠道屏障受损产品中的应用，本发明从自然发酵的东北酸菜中分离筛选一株副干酪乳杆菌LP‑116，并通过体外实验检测了副干酪乳杆菌（活菌）和经过热灭活副干酪乳杆菌（后生元）菌粉对肠道屏障功能的调节影响，利用Caco‑2细胞建立肠上皮细胞模型并通过脂多糖LPS诱导炎症，申请人发现通过采用灭活副干酪乳杆菌LP‑116冻和灭活LGG益生菌冻干粉进行复配，可以有效改善经LPS诱导的Caco‑2细胞中紧密蛋白和炎症因子的表达。
Description
技术领域
本发明涉及微生物制剂技术领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌LP-116及其在制备调节肠道屏障受损产品中的应用。
背景技术
关于益生菌的共识定义在FAO/WHO（2001）发表过，益生菌是指“当摄入足够数量时，对宿主产生健康益处的活性微生物”。这一定义强调了益生菌必须满足其为“活”的要求。益生菌在早些年主要是以活菌的形式使用，但活菌制剂可能存在潜在的安全隐患，并且不能与抗生素混合使用，易受加工、储存以及动物消化道酸性环境等条件的影响而不稳定。随着人类对益生菌的研究范围和功能的扩大深入，研究者们发现不仅活菌能够发挥益生功能，有一些“非活菌”组分也表现出明显的促进健康的作用，如灭活的菌体细胞、菌体死亡后溶解释放的成分，以及细菌的代谢产物等，其中菌体成分包括脂磷壁酸、细胞表面蛋白、肽聚糖、荚膜多糖、菌毛、鞭毛等，代谢产物包括酶、多肽类、短链脂肪酸、胞外多糖等，这些具有促进健康功效的灭活菌和代谢物均属于“后生元”的范畴。为了统一后生元的定义，2021年5月，国际益生菌和益生元科学协会（ISAPP）发表了后生元（Postbiotics）的共识声明：后生元是指对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂。
人体肠道具有复杂的微环境，肠道屏障的存在有助于肠道结构的保存，而全世界有超过1000万人受到溃疡性结肠炎和克罗恩病的困扰。研究表明肠道菌群失调和肠道上皮屏障功能障碍与UC和CD的发生有直接关系，当肠道屏障受损时，局部免疫被激活，紧密连接（tight junction，TJ）蛋白结构发生改变，导致细胞因子失衡，介导肠道通透性降低，细胞间相互作用形成的TJ蛋白是肠上皮细胞的主要防御屏障；同时，肌球蛋白轻链激酶（myosinlight chain kinase，MLCK）与TJ蛋白相互作用，调节上皮细胞通透性，维持肠道功能的完整性；MLCK介导肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）磷酸化（p-MLC)，导致TJ蛋白的破坏和肠上皮细胞通透性的增加。既往研究表明，肠道屏障损伤可引起炎症和肠道高蠕动，进而导致炎症性肠病的发病，因此，保持肠道屏障的完整性至关重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌LP-116及其在制备调节肠道屏障受损产品中的应用。
为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种副干酪乳杆菌LP-116，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.26441，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，拉丁文名称为Lactobacillus paracasei。
本发明还提供一种调节肠道屏障受损的微生物制剂，包括副干酪乳杆菌LP-116和鼠李糖乳杆菌GG株（LGG益生菌）。
优选的，副干酪乳杆菌LP-116和鼠李糖乳杆菌GG株的重量比为1-3:1。
优选的，微生物制剂的活性成分为副干酪乳杆菌LP-116的灭活型菌体以及鼠李糖乳杆菌GG株的灭活型菌体。
优选的，所述微生物制剂为益生菌冻干粉，其中益生菌为副干酪乳杆菌LP-116和鼠李糖乳杆菌GG株；还包括益生元，其中益生元包括麦芽糊精、菊粉和低聚半乳糖。。
优选的，益生菌冻干粉和益生元的质量比为4-6:4-6。
优选的，麦芽糊精、菊粉和低聚半乳糖的质量比为1-2:1-2:1。
优选的，所述微生物的剂型包括片剂、口服液或胶囊剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从自然发酵的东北酸菜中分离筛选一株副干酪乳杆菌LP-116，并通过体外实验检测了副干酪乳杆菌（活菌）和经过热灭活副干酪乳杆菌（后生元）菌粉对肠道屏障功能的调节影响，利用Caco-2细胞建立肠上皮细胞模型并通过脂多糖（LPS）诱导炎症，申请人发现通过采用灭活副干酪乳杆菌LP-116和灭活鼠李糖乳杆菌GG株冻干粉进行复配，可以有效改善经LPS诱导的Caco-2细胞中紧密蛋白和炎症因子的表达。
附图说明
图1为副干酪乳杆菌LP-116的扫描电镜图；
图2为副干酪乳杆菌LP-116的24小时生长曲线图；
图3为微生物制剂对Caco-2细胞活性的影响图；
图4为微生物制剂对肠上皮屏障细胞间跨膜电阻和通透性影响图；
图5为微生物制剂对Caco-2细胞促炎症因子水平的影响图；
图6为微生物制剂对Caco-2细胞内目标蛋白表达水平影响图；
图7为微生物制剂的炎症因子及ZO-1、claudin-1、occludin基因表达图；
图8为微生物制剂1改善肠道损伤的效果图；
图9为微生物制剂1改善肠道炎症反应的效果图。
具体实施方式
以下通过具体较佳实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
需要说明的是，无特殊说明外，本发明中涉及到的化学试剂均通过商业渠道购买。
本发明提供的一种副干酪乳杆菌（LP-116），该菌菌株已于2023年1月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.26441，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，拉丁文名称为Lactobacillus paracasei。
本发明还提供了副干酪乳杆菌（LP-116）的分离纯化方法，按照以下步骤进行：
（一）样品采集
本发明所涉及的副干酪乳杆菌（LP-116）是从自然发酵的东北酸菜分离获得，采样地为黑龙江省绥化市。取新鲜发酵的酸菜汁水100 mL，加入900 mL无菌生理盐水（0.9%，w/v），充分混匀即获得采集样品。
（二）乳酸菌富集
按照1%（v/v）接种量，接种到10mL的MRS肉汤培养基富集培养，37℃严格厌氧培养48~72小时，得到培养液。
MRS肉汤配方（1L）：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾（K2HPO4）2.0g、柠檬酸三铵（C6H17N3O7）2.0g、乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g、硫酸锰（MnSO4·4H2O）0.05g、Tween-80 1mL加入去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装后于121℃高压灭菌15 min，待冷至常温。
（三）菌株分离
取培养液1 mL，加入9 mL无菌生理盐水（0.9%，w/v）稀释10倍，继续用生理盐水依次稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。吸取0.1 mL不同稀释比例的菌悬液，采用涂布法接种至CaCO3-MRS固体培养基，37℃严格厌氧培养48小时。
CaCO3-MRS固体培养基配方（1L）：在MRS肉汤基础上加入琼脂20.0 g，CaCO310 g，去离子水1 L搅拌加热煮沸至充分溶解，分装后于121℃高压灭菌15 min，待冷至60℃左右倒平板，备用。
待平板出现典型菌落后，挑取标准乳酸菌的菌落特征以及产生溶钙圈直径最大的单菌落，进行下一步菌株纯化。
（四）菌株纯化
将挑选出的单菌落进行连续培养三次，培养基内菌落形态一致，并且革兰氏染色为紫色，菌株细胞形态单一，即获得纯培养菌株，接种MRS液体培养基，37℃培养24小时。
（五）菌株保存
分别取900μL纯培养菌株和50％无菌甘油，置于细胞冻存管中充分混匀，-80℃冷冻保存，同时接种至MRS固体斜面培养基保存，送检并鉴定。
副干酪乳杆菌（LP-116）的细菌学特征
一、基本特征
副干酪乳杆菌（LP-116）的基本特征如表1所示：
表1：副干酪乳杆菌LP-116基本特征表
由表1可知，LP-116为革兰氏染色阳性、杆状、无芽孢、接触酶和氧化酶为阴性的菌株，其扫描电子显微镜图如图1所示。
二、生长曲线
LP-116菌株活化：将菌种从-80℃冰箱取出接种在MRS液体培养基中活化24小时，将活化菌株转接于相应MRS固体培养基，37℃恒温培养箱培养48小时，挑取单菌落接种于MRS液体培养基，继续37℃恒温培养18小时提高菌株活力，用于实验备用。
乳酸菌按1%（v/v）接种量接种在MRS肉汤培养基中，在37℃下培养24小时，每隔2小时测定菌液的OD 600值，以时间为横坐标，OD 600值及pH为纵坐标建立菌株的生长曲线。
三、分子生物学鉴定（16S rDNA）
（1）模板制备
取菌液溶于50 μl TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（货号：D304）中变性后离心取上清作为模板（Template DNA），反应条件：80℃，15 min。
（2）16s rDNA PCR扩增
使用TransGen的PCR扩增试剂2×TransTaq®High Fidelity（HiFi）PCR SuperMixI（货号：AS131），进行PCR扩增。
表2：PCR反应体系表
阴性对照使用1 μl的16S-free H2O替代模板DNA；阳性对照使用1 μl的某已知菌株16S rDNA替代模板DNA。
（3）16s rDNA测序
以1541R-new和27F为引物，使用ABI公司DNA测序仪（型号：3730XL）进行测序。
表3：16s rDNA测序相关引物信息表
将上述菌株进行分子生物学鉴定，副干酪乳杆菌LP-116的16S rDNA序列为SEQ IDNO:1，扩增得到16S rDNA序列长度为1454bp；其16S rDNA序列在NCBI中进行同源性比对后发现，该菌株与副干酪乳杆菌属具有100%同源性，结果显示该菌株属于副干酪乳杆菌属。
热灭活副干酪乳杆菌（后生元）菌粉的制备
采用MRS肉汤培养基培养副干酪乳杆菌LP-116，接种量为1%（v/v），培养时间24小时，培养完成后4℃、8000 r/min离心10 min，无菌蒸馏水冲洗菌体两次后重悬菌体，在100℃条件下灭菌30 min。
副干酪乳杆菌LP-116菌悬液灭活前后分别取样，用无菌生理盐水（0.9%）稀释涂布MRS固体培养基，在37℃恒温培养箱静止培养48 h进行平板计数，检测灭活效果。经热处理后的平板没有菌落长出，则表明灭活成功。
将灭活菌体悬液置于无菌平皿中于-40℃冷冻干燥并称重，热灭活副干酪乳杆菌（后生元）菌粉中副干酪乳杆菌个数为1012CFU/g。
微生物制剂的制备
鼠李糖乳杆菌GG株（LGG益生菌）购自科汉森（北京）贸易有限公司；
长双歧杆菌BL21购自微康益生菌（苏州）股份有限公司；
微生物制剂由50%益生菌冻干粉和50%益生元所组成，其中益生元包括麦芽糊精、菊粉和低聚半乳糖；
微生物制剂1：25%灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉（菌数为1012CFU/g）、25%灭活鼠李糖乳杆菌GG株冻干粉（菌数为1012CFU/g）、15%麦芽糊精、20%菊粉和15%低聚半乳糖。
微生物制剂2：25%灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉（菌数为1012CFU/g）、25%灭活长双歧杆菌BL21冻干粉（菌数为1012CFU/g）、15%麦芽糊精、20%菊粉和15%低聚半乳糖。
微生物制剂3：50%灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉（菌数为1012CFU/g）、15%麦芽糊精、20%菊粉和15%低聚半乳糖。
微生物制剂4：50%未灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉（菌数为1012CFU/g）、15%麦芽糊精、20%菊粉和15%低聚半乳糖。
本发明中所使用的试剂及材料如下：Caco-2人结直肠腺癌细胞株来源于武汉普普诺赛生命科技有限公司（中国）。脂多糖（LPS）和荧光素异硫氰酸酯（FITC）购自Sigma-Aldrich公司（美国）。其它细胞培养材料均购自上海逍鹏生物科技有限公司（中国），包括胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培养基、青霉素链霉素双抗、胰蛋白酶、Hanks'平衡盐溶液（HBSS）和磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）。内参β-actin（货号：66009-1-Ig），MyD88（货号：23230-1-AP），TLR4（货号：19811-1-AP），NF-κB p65（货号：10745-1-AP），Claudin-1（货号：13050-1-AP），Occludin（货号：27260-1-AP），ZO-1（货号：21773-1-AP），MLCK（货号：21642-1-AP），MLC（货号：10906-1-AP），HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（货号：SA00001-1），HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（货号：SA00001-2），CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（货号：SA00013-2），CoraLite594-conjugated GoatAnti-Rabbit IgG（货号：SA00013-4）购自proteintech Group生物技术有限公司（中国），Phospho-MLC（Thr18/Ser19）（货号：3674)和Phospho-NFκB p65（货号：Ser536）（3033）购自Cell Signaling Technology（美国）。
试验1：微生物制剂对Caco-2细胞活性的影响
Caco-2细胞培养过程如下：将细胞置于DMEM完全培养液（含10%胎牛血清、1%的双抗、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸）中，37℃、5% CO2培养箱中培养，每隔1-2天更换一次培养基，待细胞融合至90%时，用胰酶消化传代、并进行后续相关实验。
取对数生长期的Caco-2细胞按照1×105个/mL的密度接种于96孔板，每孔100 μL，置于37°C、5% CO2培养箱中培养至形成细胞单层，弃掉培养液，加入100 μL，1 μg/mL的微生物制剂和终浓度100 μg/mL LPS与细胞共孵育24 h后，弃掉培养液，DMEM冲洗一次，CCK-8法测定每孔的吸光值，并计算各孔的相对细胞活性（%）。
同时设置LPS组（只添加浓度100 μg/mL的LPS）和空白对照组（Control组，不添加微生物制剂和LPS）。
试验结果如图3所示，浓度为100 μg/mL的LPS在刺激24小时后可显著降低Caco-2细胞活力，活力降低至68.24％，通过添加灭活副干酪乳杆菌LP-116可有效地提高Caco-2细胞活力。同时，实验还发现灭活副干酪乳杆菌LP-116和灭活鼠李糖乳杆菌GG株复配（微生物制剂1），相比于灭活副干酪乳杆菌LP-116和灭活长双歧杆菌BL21复配（微生物制剂2），能明显提高Caco-2细胞活力接近20%。通过对比微生物制剂1与微生物制剂3缓解由LPS诱导Caco-2细胞凋亡能力发现，50%灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉并没有25%灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉+25%灭活鼠李糖乳杆菌GG株冻干粉缓解细胞毒性能力强，说明热灭活LP-116与热灭活鼠李糖乳杆菌GG株协同效果优于单独地热灭活LP-116冻干粉。
试验2：微生物制剂对肠上皮屏障细胞间跨膜电阻和通透性的影响
Caco-2细胞的培养和消化传代参照试验1中的步骤，以1×104cells/cm2的密度接种到12孔transwell（Corning, Lindfield, Sydney, Australia）细胞培养室中，培养21天，待Caco-2细胞完全分化且电阻值达到500 Ω/cm2以上时，可用于进一步的实验，LPS是革兰氏阴性菌的重要组成部分，可改变肠上皮细胞的通透性和电阻性，在transwell培养板中培养的Caco-2细胞构建细胞单层，可以通过LPS诱导进而建立肠屏障功能障碍模型，采用评估TEER值和FITC-葡聚糖转运，以确定微生物制剂是否可以改善由LPS引起的肠道屏障功能损伤。
取100μL浓度（终浓度1μg/mL）的微生物制剂加入到细胞单层黏膜侧，同时加入LPS（终浓度100 μg/mL）共同作用24 h，测定各孔的最终TEER值。此外，为了评价Caco-2细胞单层模型的紧密性和渗透性，将FITC-葡聚糖作为细胞转运标记物，加入100 μL的FITC-葡聚糖（终浓度为1 mg/mL）到细胞单层黏膜侧，置于37°C、5% CO2培养箱内孵育24小时。
同时设置LPS组（只添加浓度100 μg/mL的LPS）和空白对照组（Control组，不加微生物制剂和LPS），孵育完成后，分别移取各组细胞单层浆膜侧内100μL的培养液于黑色的96孔板中，快速置于酶标仪于激发波长为480 nm、发射波长为520 nm的条件下测定各组的荧光强度。
试验结果如图4所示，LPS组（100 μg/mL）的电阻值和通透性与Control组具有显著性差异（P<0.05），说明LPS可以明显引起Caco-2肠上皮屏障细胞损伤。相比较于LPS组，添加灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉的微生物制剂组可以不同程度地缓解由LPS诱导引起的肠屏障功能损伤。其中微生物制剂1缓解的效果最好，并与LPS组具有显著性差异（P<0.05）。通过比较4种微生物制剂缓解LPS诱导引起的肠屏障功能损伤能力来看，微生物制剂1的效果同样优于其它3种制剂，说明灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉与灭活鼠李糖乳杆菌GG株冻干粉进行复配后的益生效果优于单独作用。
试验3：微生物制剂对Caco-2细胞促炎症因子水平的影响
采用ELISA法对Caco-2细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平进行检测，取对数期Caco-2细胞接种于6孔板，每孔2×105个细胞，于37°C、5% CO2培养箱中培养细胞融合至90%，弃掉培养液后，取1000μL浓度（终浓度1μg/mL）的微生物制剂加入6孔板中，同时加入LPS（终浓度100μg/mL）共同作用24 h。
同时设置LPS组（只添加浓度100 μg/mL的LPS）和空白对照组（Control组，不加微生物制剂和LPS），取浆膜侧溶液按照试剂盒说明书流程进行操作后，使用酶标仪在450 nm下读OD值，根据产品说明书及实验数据制作标准曲线，用ELISA数据处理软件拟合标准曲线，同时计算各组中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量。
试验结果如图5所示，通过ELISA试剂盒检测诱导的Caco-2细胞单分子层中TNF-α、IL-1β、IL-6含量可知，LPS能够显著诱导Caco-2细胞分泌炎症因子（P<0.01）。结合LPS对照组、微生物制剂组和空白对照组可知，微生物制剂1-4组中的促炎因子分泌含量均低于LPS组，说明微生物制剂可有效缓解LPS诱导的炎症因子分泌，从而达到缓解炎症发生。通过分析对比微生物制剂之间促炎因子分泌情况，发现微生物制剂1组中的促炎因子分泌情况低于其他微生物制剂2~4，并且灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉与灭活鼠李糖乳杆菌GG株进行复配后（微生物制剂1）缓解Caco-2炎症发生的效果优于灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉与灭活BL21冻干粉复配（微生物制剂2）。
试验4：Western blot检测微生物制剂对Caco-2细胞内目标蛋白表达水平
采用Western blot法分析Caco-2细胞全蛋白中目标蛋白的表达，步骤如下：细胞培养和实验分组与试验3中一致，刺激完成后加入1.5 mL预冷的无菌PBS将细胞刮下收集至1.5 mL的EP管中，离心（8000 r/min，4°C）5 min后获得细胞沉淀，向各EP管中加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA（强）细胞裂解液，吹打均匀使细胞充***解后对目标蛋白的表达水平进行检测。
将含细胞裂解液的EP管放入离心机离心（12000 r/min，4°C）15 min后，移取各细胞蛋白上清液，BCA法确定各组蛋白浓度，分别移取等量蛋白的上清液与上样缓冲液，按照比例混合均匀，沸水浴5 min使蛋白充分变性，待样品冷却后，用移液器将混合液加入到各泳道进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，将带有目的蛋白的硝酸纤维膜放于5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，孵育各蛋白对应的一抗，4°C条件下过夜后，将一抗回收，同时将蛋白条带用TBST溶液室温下洗涤3次，用相应二抗室温下孵育蛋白条带1 h后，再用TBST溶液洗涤条带3次，将蛋白条带置于暗室进行化学发光、压片，X射线胶片曝光显影。
凝胶成像***采集图片结果，并用Image J软件计算各蛋白条带的灰度值，检测指标包括NF-κB信号通路中TLR-4、p-NFκB、NFκB和紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1、occludin以及MLCK、MLC和p-MLC蛋白水平。
试验结果如图6所示，参考图6（A）中Control组和LPS组可知，经LPS的刺激，Caco-2细胞内TLR4和p-NFκB蛋白的表达显著提高，说明LPS能够显著诱导Caco-2细胞提高TLR4和p-NFκB蛋白（P <0.05）。结合LPS组、微生物制剂组和Control组可知，微生物制剂1组中TLR-4和p-NFκB蛋白含量最低，表明微生物制剂1相比于其它制剂具有更好缓解由LPS引发的炎症。
参考图6（B），结合Control组和LPS组可知，LPS刺激Caco-2细胞内p-MLC和MLCK蛋白的表达显著提高（P <0.05）。结合LPS组、微生物制剂组和Control组可知，微生物制剂1组中p-MLC和MLCK蛋白含量最低，并且微生物制剂1在p-MLC蛋白含量显著低于其它3组微生物制剂，表明灭活副干酪乳杆菌LP-116与灭活鼠李糖乳杆菌GG株复配后的效果最好，降低了由LPS引发的炎症通路。
参考图6（C），结合Control组和LPS组可知，经LPS的刺激，Caco-2细胞内TJ蛋白的表达量降低，可见LPS能够抑制Caco-2细胞的TJ蛋白表达能力（P <0.05）。通过对比四种微生物制剂改善肠道屏障功能损伤能力发现，微生物制剂1~3组均能改善TJ蛋白，而微生物制剂4组改善效果最差，说明添加了灭活副干酪乳杆菌LP-116均能在不同程度下修复肠道屏障。此外，通过比较灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉分别与灭活鼠李糖乳杆菌GG株冻干粉和BL21冻干粉复配后的改善效果发现，LP-116冻干粉与灭活鼠李糖乳杆菌GG株冻干粉复配后具有较佳的改善效果。
试验5：实时荧光定量PCR检测炎症因子及ZO-1、claudin-1、occludin基因表达
采用实时荧光定量PCR检测炎症因子及ZO-1、claudin-1、occludin基因表达，步骤如下：细胞培养和实验分组与试验3中一致，刺激完成后加入1.5 mL预冷的无菌PBS将细胞刮下收集至1.5 mL的EP管中，离心（8000 r/min，4°C）5 min后获得细胞沉淀，加入500 μLTrizol裂解10 min，剧烈震荡后在室温条件下放置5 min以使核蛋白体完全解离，4℃的条件下以12,000 rpm离心10 min取上清；按照每1 mL Trizol加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s后室温下放置2~3 min，于4℃ 12000 rpm高速冷冻离心10~15 min，离心后将上层水相转移到干净的EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温放置10 min后离心弃上清，离心条件同上，用与Trizol使用量相同体积的75 %乙醇对沉淀进行洗涤，吹打至RNA沉淀轻轻悬浮，但不要吹散，4℃ 12000 rpm离心3 min，弃上清，注意不要丢失RNA沉淀，室温放置2~3 min，晾干，加入50 μL无酶水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-80℃，防止降解。
核酸定量仪测定OD值定量RNA浓度，用无酶水将各样品RNA稀释到同一浓度。按照康为试剂HiFiScript cDNA Synthesis Kit说明书配制反转录体系，去除基因组DNA条件为42℃孵育2 min，cDNA合成反应条件为42℃孵育15 min，85℃孵育5 min，反应结束后短暂离心于-20℃保存。
qPCR操作步骤按照康为试剂公司的UltraSYBR Mixture说明书进行荧光定量，扩增条件为预变性95°C 10 min，然后变性95°C 15 s和退火/延伸60°C 1 min进行40个循环，融解条件95°C 15s，60°C 1 min，95°C 15s，60°C 15s。首先用内参基因的Ct值对实验组（test）和对照组（control）的靶基因Ct值进行归一化；ΔCt test=实验组目的基因Ct值-实验组内参基因Ct值，ΔCt control=对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值，目的基因表达水平差异倍数=2-（ΔCt test-ΔCt control）。检测指标包括促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）以及ZO-1、claudin-1、occludin基因表达。
表4： RT-qPCR引物序列表
试验结果如图7所示，LPS组（100 μg/mL）的促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达量相比较于Control组显著提高（P<0.05）。相比较于LPS组，添加灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉的微生物制剂组可以不同程度地缓解由LPS诱导引起的促炎因子mRNA表达量。其中微生物制剂1缓解的效果最好，并与LPS组具有显著性差异（P<0.05）。通过比较4种微生物制剂缓解LPS诱导引起的肠屏障功能损伤能力（ZO-1、Occludin、Claudin-1）来看，微生物制剂1的效果同样优于其它3种微生物制剂，说明灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉与灭活鼠李糖乳杆菌GG株冻干粉进行复配后的益生效果优于单独作用。
试验6：免疫荧光观察TJ蛋白表达
取对数期Caco-2细胞，调整细胞浓度至1.0×104个/孔接种于24孔板培养皿中于37°C、5% CO2培养箱中培养细胞融合至80%。将终浓度1 μg/mL微生物制剂1和LPS刺激共同刺激Caco-2细胞24 h后，弃掉细胞培养液，PBS洗涤三次，4%多聚甲醛固定20 min，再用0.5%TritonX-100通透20 min，5% FBS溶液室温封闭15 min，按照1：100的比例配制ZO-1一抗溶液，4℃过夜；荧光二抗室温孵育1 小时，DAPI染核，室温10 min，甘油PBS封片观察、拍照。
试验结果如图8所示，LPS组（100μg/mL）能引起肠道损伤能力（ZO-1、Occludin、Claudin-1），而微生物制剂1的效果能改善这一现象，说明灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉与灭活鼠李糖乳杆菌GG株冻干粉进行复配后，有益于肠道屏障改善。
试验7：细胞内NF-κB p65核转位观察
倒置荧光显微镜下观察并记录NF-κB p65的入核情况。具体如下：取对数期Caco-2细胞，调整细胞浓度至1.0×103个/孔接种于24孔板培养皿中于37°C、5% CO2培养箱中培养细胞融合至80%，用1μg/mL微生物制剂1孵育细胞6 h，再用LPS刺激细胞24 h后，按照NF-κB检测试剂盒说明书步骤处理细胞，倒置荧光显微镜下观察并记录NF-κB p65的入核情况。
试验结果如图9所示，LPS组（100μg/mL）能加剧炎症反应，而微生物制剂1的效果能改善这一现象，进一步说明灭活副干酪乳杆菌LP-116冻干粉与灭活鼠李糖乳杆菌GG株冻干粉进行复配后的有益效果。
最后需要说明的是：以上实施例不以任何形式限制本发明。对本领域技术人员来说，在本发明基础上，可以对其作一些修改和改进。因此，凡在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围之内。
Claims (9)
1.一种副干酪乳杆菌LP-116，其特征在于，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.20266，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，拉丁文名称为Lactobacillus paracasei。
2.一种调节肠道屏障受损的微生物制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的副干酪乳杆菌LP-116和LGG益生菌。
3.根据权利要求2所述的调节肠道屏障受损的微生物制剂，其特征在于，副干酪乳杆菌LP-116和LGG益生菌的重量比为1-3:1。
4.根据权利要求2所述的调节肠道屏障受损的微生物制剂，其特征在于，微生物制剂的活性成分为副干酪乳杆菌LP-116的灭活型菌体以及LGG益生菌的灭活型菌体。
5.根据权利要求2所述的调节肠道屏障受损的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂为益生菌冻干粉，还包括益生元。
6.根据权利要求5所述的调节肠道屏障受损的微生物制剂，其特征在于，益生菌冻干粉和益生元的质量比为4-6:4-6。
7.根据权利要求5所述的调节肠道屏障受损的微生物制剂，其特征在于，所述益生元包括麦芽糊精、菊粉和低聚半乳糖。
8.根据权利要求7所述的调节肠道屏障受损的微生物制剂，其特征在于，麦芽糊精、菊粉和低聚半乳糖的质量比为1-2:1-2:1。
9.根据权利要求2所述的调节肠道屏障受损的微生物制剂，其特征在于，所述微生物的剂型包括片剂、口服液或胶囊剂。
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