RU2803350C1 - Штамм бактерий Bifidobacterium longum 174 для приготовления регион-специфичных пробиотических препаратов для профилактики и персонализированного лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта у жителей Карачаево-Черкесской республики и/или для обогащения традиционного кисломолочного напитка "Гыпы айран" на основе индигенных кефирных зерен - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и состоит в изоляции из кишечника жителей конкретного этно-географического сообщества (Карачаево-Черкесская республика) штамма бактерий Bifidobacterium longum 174, который может быть использован для приготовления регион-специфичных пробиотиков для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта у жителей Карачаево-Черкесской республики, а также для обогащения традиционного кефирного напитка «Гыпы айран» на основе индигенных кефирных зерен. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии.

Заявляемый штамм выделен у жителя конкретного географического сообщества; может использоваться для приготовления регион-специфичных пробиотиков для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта у жителей Карачаево-Черкесской республики.

Уровень техники

Современные представления о составе кишечной микробиоты и о ее влиянии микрофлоры на здоровье человека основаны преимущественно на исследованиях части населения Европы и Северной Америки. Тем не менее, эти данные не могут быть напрямую экстраполированы на лиц из других популяций. Даже среди хорошо изученных человеческих когорт, наряду с данными микробиома требуется учитывать персонализированные характеристики индивидуума, такие как место проживания и этническая принадлежность для более точной диагностики и лечения различных заболеваний, в частности заболеваний желудочно-кишечного тракта. Так, крупномасштабные исследования показали обширную персонализацию таксономического состава кишечного микробиома [Gaulke, C.A.,2018]. Также известно, что состав кишечной микробиоты у лиц различного этнического происхождения - голландцев, ганцев, марокканцев, турок, африканских и южноазитских суринамцев, проживающих в одном городе в Голландии, имеет характерные этнические профили, несмотря на длительное пребывание в одинаковых условиях окружающей среды, в частности были выявлены повышенные уровни бифидобактерий в определенных этногруппах. Этническая принадлежность при этом объясняет гораздо больше различий в составе микробиома между индивидуумами, чем любая другая характеристика, учитываемая в рамках указанного исследования [Deschasaux M.,2018; Deschasaux M.,2019].

Кроме того, известны существенные различия в таксономическом составе микробиоты жителей Соединенных Штатов Америки различной этнической принадлежности - азиатов, афроамериканцев, латиноамериканцев, европейцев, что также демонстрирует необходимость учета этнического разнообразия как в исследованиях микробиоты, так и в разработке методов пробиотической терапии заболеваний желудочно-кишечного тракта [Brooks, A. W.,2018].

Также выявлены существенные различия микробиомов, очевидно связанные с географией при исследовании фекальной микробиоты индейцев из Амазонии, Венесуэлы и жителей сельских общин Малави, исторически проживающих компактно в определенных географических условиях и использующих относительно однообразную диету, [Yatsunenko T. et al., 2012]. Известно, что этнo-зависимое разнообразие микробиоты кишечника прослеживается у младенцев еще до введения прикорма [Jia Xu et.al., 2020]. Выраженные различия в составе кишечных микробных сообществ обнаружены между датчанами и жителями Индии [Camila Alvares-Silva et.al., 2021]. Установлено, что в странах с высоким этническим разнообразием, таких как Малайзия, различия в кишечной микробиоте между этническими группами также сохраняются, и несмотря на географическое разделение в течение длительного времени, и состав микробиоты мигрантов имеет общие черты с населением в стране происхождения [Jacky Dwiyanto et.al., 2021].

Таким образом, таксономический состав кишечного микробиома связан как с этнической принадлежностью, так и с географическим местоположением индивидуума. Эта связь определенным образом должна быть учтена на разработку препаратов, основанных на нормальных представителях микробиома человека для использования в качестве групп-персонализированной пробиотической терапии.

Бифидобактерии являются одними из основных представителей нормальной микробиоты кишечника человека [Turroni, 2009], и наряду с лактобациллами, наиболее часто используются как пробиотические микроорганизмы. Согласно общепринятому определению, пробиотики - это живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах благоприятное действие на организм хозяина [Hill C. et al., ,2016]. В качестве важнейших характеристик эффективного пробиотического микроорганизма рассматриваются, в частности, его способность к адгезии на клетках организма-хозяина, что является первым и важнейшим этапом колонизации, а также способность ингибировать условно-патогенные и патогенные микроорганизмы [Shokryazdan P.,2017]. Тем не менее, в связи с тем, что существующие пробиотики , использующие экзогенные бифидобактерии (патент РФ WO2009051510A1, МПК С12N11/14, опубл.2009-94-23) в отличии от собственных штаммов (аутоштаммов), как правило, неспособны к длительной колонизации кишечника конкретного человека, успешная пробиотикотерапия требует длительного приема пробиотиков в высоких дозах. В то же время, штаммы бифидобактерий, характерные для конкретной этно-географической группы, которая имеет собственные особенности питания, условия окружающей среды, исторически сформировавшиеся генетические особенности будут в большей степени соответствовать организму человека, проживающего в конкретном регионе и относящемуся к конкретной этнической группе, и, соответственно, обладать более высоким пробиотическим потенциалом.

В СССР был предложен способ коррекции микрофлоры кишечника с использованием аутоштаммов лактобацилл [Коршунов В.М.,Синицына Н.А.,Пинегин Б.В. Способ лечения дисбактериоза// Патент РФ№ SU1286212]. Также, в дальнейшем, был разработан способ получения аутопробиотика на основе анаэробного консорциума бактерий для персональной коррекции дисбиотических нарушений [Суворов А.Н., Ермоленко Е.И, Котылева М.П., Цапиева А.Н. Способ получения аутопробиотика на основе анаэробного консорциума бактерий//Патент РФ RU2734896C2]; способ получения аутопробиотика с повышенной физиологической активностью [Денисов Д.Е., Кузнецова Т.Н. Способ получения аутобпробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии //Патент РФ RU 2580002 C1], способ получения персонифицированного аутопробиотического продукта [Симаненков В.И., и др. Способ получения персонифицированного аутопробиотического продукта в виде молочнокислой закваски на основе аутоштаммов лактобактерий и способ лечения синдрома раздраженной кишки, сопровождающегося дисбиозом кишечника, полученным персонифицированным аутопробиотическим продуктом// Патент РФ RU2013120765А]. Известна также композиция с различными вариантами лактобацилл, обеспечивающая персонализацию коррекции дизбактериоза кишечника [Алешкин В.А., и др. Композиция для коррекции дисбактериоза кишечника //Патент РФ RU2431492С1] и пробиотическая композиция для групп людей объединенных по группам крови [Probiotics compound for crowds with blood tуpes of A,B, and method and application of probiotics compound //Патент CN105105115A]. Известны метод и системы персонализации пробиотических препаратов на основании оценки семейной, генетической, географической/этнической информации о пациенте [Michael F.Roizen, Mehmet C.Oz. Methods and Systems for improving human health using targeted probiotics//Патент US20090287506A1].

Карачаево-Черкесская республика - регион Северного Кавказа на юге Европейской части России. Большую часть населения составляют коренное население - карачаевцы и черкесы, которые в основном продолжают поддерживать традиционный образ жизни в сельской местности и диетические привычки. В частности, сохраняется у карачаевцев сохраняется обильное употребление традиционных кисломолочных напитков - айрана и кефира («Гыпы айран»). Кефир готовится на основе аутохтонных кефирных зерен, состоящих из дрожжей и молочнокислых бактерий рода Lactobacillus [Хаджиева,2008]. Возрастающий потребительский спрос на более натуральную и полезную пищу, интерес к пребиотикам и пробиотикам активно популязируют национальные кисломолочные напитки. Инновации в этом сегменте имеют благоприятные перспективы [Батдыева,2019].

В исследованиях микрофлоры кишечника жителей КЧР были обнаружены значительные различия в составе видового уровня микрофлоры по сравнению с жителями Европейской России. В частности, наблюдались повышенные уровни Butyricimonas, а также наличие некоторых редких видов Lactobacillus и Prevotella. Были обнаружены штаммы Lactobacillus ruminis, которые раньше не считались характерными для микрофлоры кишечника человека. Семь бактериальных штаммов представляли новые, ранее неизвестные виды нормальных анаэробных бактерий кишечника, родов Dialister, Butyricimonas, Collinsella, Prevotella и Ruminococcus [Katchieva et al.,2018].

Также, обнаружены различия в видовом составе бифидобактерий между жителями КЧР и жителями г. Москвы. Хотя в обоих случаях наиболее часто встречающимся видом являлся Bifidobacterium longum, у жителей КЧР достоверно чаще выделялись штаммы B. adolescentis. Штаммы B. catenulatum и B. angulatum выделялись только у жителей КЧР, тогда как B. dentium, B. pseudocatenulatum, B. animalis и B. bifidum выделялись только у жителей Москвы. Кроме того, только у жителей КЧР выявлены штаммы бифидобактерий, по всей вероятности, принадлежащие к «редким» видам, не идентифицированным с помощью метода MALDI-TOF [Айбазова и др.,2019].

Раскрытие сущности изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида Bifidobacterium longum 174 с высокой адгезивной способностью к клеткам жителей Карачаево-Черкесской республики, выраженной антагонистической активностью в отношении условно-патогенных бактерий, быстро размножающегося на искусственных питательных средах.

Штамм Bifidobacterium longum 174 выделен из содержимого кишечника здорового человека-жителя КЧР и депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии «ГКПМ - ОБОЛЕНСК» под № В-9674.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве биологически активных добавок, бактериальных препаратов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, кисломолочных продуктов и т.п. средств, содержащих бифидобактерии. Кроме того, штамм Bifidobacterium longum 174 может быть использован для обогащения традиционного кефирного напитка («Гыпы айран») на основе индигенных кефирных зерен. Штамм Bifidobacterium longum 174 антагонистически активен по отношению к условно-патогенным микроорганизмам обладает высокой адгезивной способностью к клеткам жителей Карачаево-Черкесской республики. Это позволяет использовать его в качестве биологически активного компонента в составе пробиотических средств для групп-персонализированной профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта у конкретного этно-географического сообщества - жителей Карачаево-Черкесской Республики.

Для проведения первичного отбора были использованы 18 штаммов кишечных бифидобактерий, выделенных у жителей КЧР, и идентифицированных как Bifidobacterium longum. Данный вид является наиболее часто встречающимся у жителей КЧР. Выделение бактерии: свежий кал клинически здорового лица, после сбора анамнеза и проведения дополнительных обследований подвергался последовательному десятикратному разведению в физиологическом растворе. Посев проводили на чашки Петри с плотной средой Бифидум-агар (Оболенск). Чашки помещали в анаэростат на 48 часов анаэробно с использованием анаэростатов АЭ-01 и газпакетов Анаэрогаз (НИКИ МЛТ, Пенза). После инкубации производили подсчет выросших колоний, изучали морфологию колоний выросших на агаре, проводили бактериоскопическое исследование типичных колоний и пересевали их для выделения чистых культур. Для идентификации бактерии использовали метод времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией-ионизацией при содействии матрицы (MatrixAssisted Laser Desorption / Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS) [Chaplin et al.,2015]. Штаммы предварительно готовили путем смешивания биоматериала на подложке масс-спектрометра из колонии бактерий и специальную матрицу (2',5' дигидроксибензойная кислота). Каждый образец помещали на определенную секцию планшета. После этого образец помещали в прибор и подвергали воздействию наносекундных лазерных импульсов. На основании базы данных программного обеспечения прибора (MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Германия)) штамм Bifidobacterium longum 174 был идентифицирован с точностью 99,9%.

Для выявления штаммов Bifidobacterium longum, наиболее характерных для жителей КЧР, был проведен генетический анализ с использованием метода VNTR [Matamoros et al.,2011], позволивший выявить несколько групп генетически сходных штаммов, т.е. обладающих близкими VNTR-профилями. Наиболее часто встречающийся профиль был обнаружен у 8 штаммов.

Как наиболее перспективный региональный пробиотик из указанных 8 штаммов в дальнейшем был отобран штамм Bifidobacterium longum 174 на основании наивысшей способности к адгезии на эритроцитах доноров из КЧР, а также широкого спектра антагонистической активности против набора индикаторных условно-патогенных бактерий с использованием метода отсроченного антагонизма.

Морфологические свойства. При культивировании на плотной среде Бифидум-агар в анаэробных условиях образует круглые колонии, непрозрачные, блестящие, с ровными краями, без пигмента, диаметр составляет 2-3 мм; колонии имеют слегка выпуклый профиль, с плотной среды легко снимаются петлей. В жидкой питательной среде в анаэробных условиях растут по всей высоте объема, образуя рыхлый осадок. В мазках клетки имеют вид беспорядочно расположенных, грамположительных, полиморфных, с Y-образно раздвоенными концами (редко), и булавовидными вздутиями. Спор и капсул не образует, неподвижен. Каталаз-негативный.

Культуральные особенности. Является облигатным анаэробом; растет на чашках Петри с плотной средой, в высоком столбике агара в пробирке, и в пробирках с жидкой средой. Оптимальная температура выращивания 37-38°С, в анаэробных условиях. Рост штамма Bifidobacterium longum 174 при культивировании в жидких питательных средах MRS и Бифидум-среде после инкубации при 37°С в течении 18 часов анаэробно достигал значений OD600 5,17±1,02 и 3,57±0,38, соответственно.

Физиолого-биохимические свойства штамма. Для изучения ферментативного профиля использовали тест-наборы для изучения ферментативной активности (API 50 CHL system (bioMerieux)) с оценкой по изменению цвета среды: при ферментации сахаров желтое окрашивание - положительно, фиолетовое окрашивание - отрицательно. Положительный результат выявлен в отношении лактозы, ксилозы, глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннозы, арабинозы, раффинозы, рибозы, инулина, сорбита, маннита, отрицательный - рамнозы.

Изучение антагонистической активности. Для количественной оценки антагонистической активности штамма использовали модификацию метода отсроченного антагонизма [Muriana et al., 1987]. Для изучения антагонистической активности штамма Bifidobacterium longum 174 в качестве индикаторных штаммов использовали штаммы Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumonia. В качестве питательной среды для бифидобактерий использовали агаризованную среду Бифидум агар (ФБУН «ГНЦ ПМБ», Оболенск); для культивирования штаммов индикаторных культур использовали среду ГРМ (ФБУН «ГНЦ ПМБ», Оболенск). Чашки с выросшими колониями бифидобактерий перегружали покровным агаром, содержащим 0,05 мл ночной культуры индикаторного штамма, инкубировали при 37°С 18 часов и измеряли диаметры зон задержки роста индикаторных штаммов вокруг колоний бифидобактерий. При изучении антагонистической активности штамма Bifidobacterium longum 174 выявлено, что штамм активно штамм подавляет рост ряда условно-патогенных бактерий in vitro (табл.1).

Таблица 1
Индикаторная культура	Радиус зон задержки вокруг роста вокруг колоний штамма бифидобактерий, (Среднее±SD*, мм)
Staphylococcus aureus	19,9±2
Escherichia coli	26,5±1,5
Pseudomonas aeruginosa	20,5±2
Enterococcus faecalis	29,1±1,8
Klebsiella pneumonia	25,2±1
Shigella flexneri	29,5±1
* SD - среднеквадратичное отклонение

Таким образом штамм Bifidobacterium longum 174 активно подавляет рост ряда условно-патогенных бактерий in vitro.

Адгезивные способности Bifidobacterium longum 174 на эритроцитах крови доноров - жителей Карачаево-Черкесской республики. Для исследования адгезивной активности применяли пробирочный / развернутый метод определения адгезии микробов к эритроцитам - метод Брилиса [Брилис,1986]. Использовали для исследования адгезивных свойств суточные культуры штаммов, выращенные на скошенной питательной среде. Суточную культуру штаммов смывали забуференным физиологическим фосфатным раствором, затем дважды отмывали с помощью центрифугирования 1500 об./мин. в течении 10 мин. в аналогичном 0,1 % фосфатно-солевом буфере с pH 7,2. Готовили суспензию из взвеси бактерий с концентрацией 1 млрд.т./мл. Гепаринизированную (0,03 мл гепарина (5000 ед./1 мл) на 5 мл крови) эритроциты человека отмывали дважды 0,1 % фосфатно-солевым буфером при 300 об/мин. Кровь отбирали из локтевой вены у доноров - жителей Карачаево-Черкесской республики, не имеющих в анамнезе хронических воспалительных заболеваний и острых заболеваний кишечника, заболеваний со стороны сердечно-сосудистой и кровеносной системы. Затем готовили 1% взвесь эритроцитов (концентрация около 100 мл клеток/мл). Суспензию бактерий эритроцитов смешивали в разных объемах (по 0,5 мл) в пробирке. Смесь инкубировалась при 37 градусах Цельсия 30 минут при встряхивании. На обезжиренном стекле готовили мазок, высушивали на воздухе, фиксировали в спирту 10 минут и окрашивали по Граму. Микроскопически подсчитывали количество микробных клеток, адгезировавшихся на 50 эритроцитах. В последующем вычисляли индекс адгезии микроорганизмов, как среднее количество микробных клеток на одном, участвующем в адгезивном процессе эритроците:

ИАМ = (СПА х 100%) / К.

где: СПА - средний показатель адгезии - среднее количество микроорганизмов прикрепленных к одному эритроциту

К - % эритроцитов, имеющих на своей поверхности адгезированные микроорганизмы

Микроорганизмы считали:

- неадгезивными при ИАМ от 1,00 до 1,75;

- низкоадгезивными - от 1,76 до 2,49;

- среднеадгезивными - от 2,50 до 3,99;

- высокоадгезивными > 4,00.

Штамм является высокоадгезивным - индекс адгезии 7,3±0,25. Для контроля использовали кишечный штамм Bifidobacterium longum 44 [Chaplin,2015], ранее выделенный у жителя г. Москвы. Индекс адгезии составил 3,49±0,14 для штамма Bifidobacterium longum 44. Таким образом, штамм Bifidobacterium longum 174, обладает более высокой адгезивной способностью к клеткам доноров - жителей Карачаево-Черкесской республики, чем штамм, выделенный у жителя г. Москвы и использованный для контроля.

При изучении спектра чувствительности к антибиотикам, установлено, что штамм Bifidobacterium longum 174 чувствителен к бензилпенициллину, амоксициллину, оксациллину, цефазолину, цефтриаксону, эритромицину, кларитромицину, тетрациклину, устойчив к гентамицину, ципрофлоксацину.

Осуществление изобретения

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Использование штамма Bifidobacterium longum 174 для получения бактерийных препаратов.

Культуру штамма Bifidobacterium longum 174 вносят в питательную среду Бифидум-среду, культивируют при температуре 37-38°С до получения биомассы бактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁹ в 1 мл (18-20 часов анаэробно). К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда). Данную суспензию разливают в пенициллиновые пузырьки, замораживают при температуре не менее - 20°С и лиофилизируют . Полученный бактерийный препарат содержит после повторного разведения водой до предыдущего объёма не менее 10⁸ живых клеток бифидобактерий.

Пример 2. Обогащение традиционного кисломолочного напитка «Гыпы-айран» на основе индигенных кефирных зерен штаммом Bifidobacterium longum 174.

В пастеризованное коровье молоко температурой 37°С инокулируют индигенные кефирные зерна из расчета 5-10г. зерен:300 мл молока. Выдерживают при температуре 18-21°С, в течение 18-24 ч., в стеклянной или деревянной посуде, без крышки, помешивая каждые три часа.

Культуры Bifidobacterium longum 174 выращивают и лиофилизируют как описано выше, в Лиофилизированные культуры растворяют стерильной водой до первоначального обьема и вносят в свежеприготовленный односуточный кефирный напиток («Гыпы айран») до достижения концентрации живых бактерий в количестве 10⁷КОЕ/ мл.

Cписок литературы

1. Gaulke, C.A., Sharpton, T.J. The influence of ethnicity and geography on human gut microbiome composition. Nat Med 24, 1495-1496 (2018). https://doi.org/10.1038/s41591-018-0210-8

2. Deschasaux M, Bouter KE, Prodan A, et al. Depicting the composition of gut microbiota in a population with varied ethnic origins but shared geography. Nat Med. 2018;24(10):1526-1531. doi:10.1038/s41591-018-0160-1

3. Deschasaux M, Zwinderman K, Nieuwdorp M. Origine ethnique et composition du microbiote intestinal How the gut microbiota composition relates to the ethnic background. Med Sci (Paris). 2019;35(5):401-404. doi:10.1051/medsci/2019089

4. Brooks, A. W., Priya, S., Blekhman, R., & Bordenstein, S. R. (2018). Gut microbiota diversity across ethnicities in the United States. PLoS biology, 16(12), e2006842. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006842

5. Yatsunenko, Tanya et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature vol. 486,7402 222-7. 9 May. 2012, doi:10.1038/nature11053

6. Jia Xu et.al. Ethnic diversity in infant gut microbiota is apparent before the introduction of complementary diets. Gut Microbes.2020.11(5):1362-1373

7. Jacky Dwiyanto et.al. Geographical separation and ethnic origin influence the human gut microbial composition: a meta-analysis from a Malaysian perspective. Microb Genom.2021;7(8):000619

8. Camila Alvares-Silva et.al. Trans-ethnic gut microbiota signatures of type 2 diabetes in Denmark and India. Genome Med.2021;13(1):37.

9. Hill C., Guarner F., Reid G. et al. Expert consensus document. The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2014. Vol. 11. Р.506-514.

10. Shokryazdan P, Faseleh Jahromi M, Liang JB, Ho YW. Probiotics: From Isolation to Application. J Am Coll Nutr. 2017 Nov-Dec;36(8):666-676. doi: 10.1080/07315724.2017.1337529. Epub 2017 Sep 22.

11. Katchieva, P., Kafarskaia, L., Chaplin, A., Efimov, B., Sokolova, S., and Smeianov, V. The composition of fecal microbiota in the residents of Karachay-Cherkessia. Gut Health, Microbiota & Probiotics. Harvard Medical School. Boston, USA, 2018.

12. Айбазова Д.И., Соколова С.Р., Пеков Ж.Ж., Катчиева П.Х. Особенности видового состава бифидобактерий и лактобацилл в составе микробиоты кишечника жителей Карачаево-Черкесской республики. Материалы международной конференция «Ломоносов-2019». МГУ, г. Москва.2019.

13. Matamoros S, Savard P, Roy D. Genotyping of Bifidobacterium longum subsp. longum strains by multilocus variable number of tandem repeat analysis. J Microbiol Methods. 2011; 87: 378-80. doi: 10.1016/j.mimet.2011.10.005 PMID: 22019451

14. Брилис, В. И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В. И. Брилис, Т. А. Брилене, Х. Б. Ленцнер, А. А. Ленцнер // Лабораторное дело. - 1986. - № 4. - С. 210-212.

15. Chaplin A.V., Efimov B.A., Smeianov V.V. с соавт. Intraspecies Genomic Diversity and Long-Term Persistence of Bifidobacterium longum. PLoS One. 2015. Vol. 10. P. e0135658.

16. Muriana P.M., Klaenhammer T.R. Conjugal Transfer of Plasmid-Encoded Determinants for Bacteriocin Production and Immunity in Lactobacillus acidophilus 88. Appl Environ Microbiol. 1987. Vol.53. № 3. P.553-560.

17. Turroni F., et.al. Exploring the diversity of the bifidobacterial population in the human intestinal tract. Applied and environmental microbiology. 2009. 75(6).Р.1534-1545

18. Хаджиева М.Х. Традиционная система питания карачаевцев и балкарцев в XIX-XXвв.:автореферат дис…кандидата исторических наук.-Нальчик,2008.-13 с.

19. Батдыева О.С., Батдыев Ч.М., Храмцов А.Г. Терминологические особенности трендов национальных кисломолочных напитков при разработке инновационных технологий производства функциональных напитков. Сборник материалов ХVI Международной научно-практической конференции. «Пища. Экология.Качество»Том 1. Алтайский государственный университет (Барнаул).-2019.- С.105-108.

Claims (2)

1. Штамм бактерий Bifidobacterium longum 174, депонированный в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии «ГКПМ - ОБОЛЕНСК» под N В-9674, обладающий выраженными адгезивными и антагонистическими свойствами, в качестве регион-специфичного пробиотического микроорганизма для жителей Карачаево-Черкесской республики.

2. Применение штамма по п. 1 для обогащения традиционного кефирного напитка «Гыпы айран» на основе индигенных кефирных зерен.