CN117580953A - 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 - Google Patents
一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
一种能够抑制载脂蛋白C3(APOC3)基因表达的siRNA,包含正义链和反义链,所述正义链和反义链分别由包含由19个修饰或未修饰的核苷酸组成的核苷酸序列I或核苷酸序列II,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区,所述核苷酸序列II至少部分地与APOC3基因表达的mRNA中的一段核苷酸序列反向互补;按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II的第3‑6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸。所述的siRNA以及包含该siRNA的药物组合物和siRNA缀合物可以有效治疗和/或预防与APOC3基因表达相关的疾病或病症,并具有显著降低的脱靶效应。
Description
本公开涉及一种具有降低的脱靶效应的、能够抑制载脂蛋白C3(APOC3)基因表达的核酸和含有该核酸的组合物与缀合物。本公开还涉及这些核酸、组合物与缀合物的制备方法和用途。
血脂异常,又称高脂血症,是脂肪代谢或运转异常,使血浆脂质高于正常值的一种全身性疾病,正严重威胁着全球患者的健康。载脂蛋白C3(APOC3)在脂质代谢中具有重要的作用,携带有APOC3突变基因的人血液循环中APOC3的表达量下降46%,血浆内甘油三酯水平较普通人下降39%。因此,使用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)从基因水平沉默基因表达,阻断APOC3,无疑是治疗与APOC3相关的血脂异常的理想手段。近年来,在用于抑制APOC3基因表达的siRNA成药方面取得了相当程度的进展。
在siRNA的成药研究中,脱靶效应是与毒性相关的重要副作用之一。目前,许多在临床前药学研究中显示出优异药学活性的siRNA由于其脱靶效应产生的毒性而难以用于实际的药物研发。而期望用于制备实际应用于患者的药物的理想的siRNA无疑应具有低的毒性,包括低的由脱靶效应导致的毒性。因此,在本领域中如何获得具有低脱靶效应的siRNA仍需进一步深入探索。
发明内容
为了开发一种具有显著降低的脱靶效应、能够抑制APOC3基因的siRNA,发明人出人意料地发现,在序列特定位置处具有稳定化修饰核苷酸的siRNA显示出比对应位置不具有稳定化修饰核苷酸的siRNA显著更低的脱靶效应。进一步地,某些在序列特定位置处具有稳定化修饰核苷酸的siRNA在具有显著更低的脱靶效应的同时,还显示出和不具有稳定化修饰核苷酸的siRNA未明显降低或相当的APOC3基因抑制活性。因此,发明人作出如下发明。
在一方面,本公开提供了一种siRNA,所述siRNA包含反义链和正义链,所述正义链包含核苷酸序列I,所述反义链包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸均为修饰或未修饰的核苷酸,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区,所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补,所述第一段核苷酸序列为APOC3基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少一个为稳定化修饰核苷酸,所述稳定化修饰核苷酸指核苷酸的核糖2'位羟基被稳定化修饰基团取代的核苷酸,与相应位置的核苷酸为未修饰的核苷酸的siRNA相比,包含所述稳定化修饰核苷酸的siRNA的热稳定性增加,并且所述稳定化修饰基团的空间位阻大于2'-O-甲基。
在另一方面,本公开还提供了一种药物组合物,该药物组合物含有本公开提供的siRNA以及药学上可接受的载体。
在又一方面,本公开还提供了一种siRNA缀合物,所述siRNA缀合物含有本公开提供的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团,所述缀合基团包含接头和药学上可接受的靶向基团,并且,所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接,每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体。
在又一方面,本公开还提供了本公开的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防与APOC3基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的药物中的用途。
在又一方面,本公开还提供了一种治疗和/或预防与APOC3基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的方法,所述方法包括向有需要的受试者给予本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物。
在又一方面,本公开还提供了一种抑制细胞中APOC3基因表达水平的方法,所述方法包括将有效剂量的本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物与所述细胞接触。
另外,本公开还提供了一种试剂盒,所述试剂盒包含本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文,其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物具有良好的稳定性,具有低的脱靶效应,并具有好的APOC3基因表达抑制活性,并显示出较好的降低血脂的效果。具体说明如下。
第一,本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物可在体外或体内具有更低的脱靶效应和/或由于脱靶效应导致的毒性反应。特别是,与参比siRNA缀合物相比,给予本公开的siRNA缀合物的小鼠显示出显著更低的血生化结果和明显的毒性优势。例如,在以100mg/kg剂量给予本公开的siRNA缀合物的小鼠中,血生化指标显著降低,与空白对照组相比无明显异常;并且与参比siRNA缀合物相比,给予了本公开siRNA缀合物的小鼠没有出现中度以上的炎性细胞浸润和坏死,在组织病理学中显示出显著更低的毒性反应。又例如,即使在300mg/kg的高剂量下,血清ALT与空白对照组相比也没有显著差别,并且与给予了参比缀合物的小鼠中6只均在组织病理切片中显示出炎性细胞浸润相比,施用了本公开的缀合物的小鼠仅有3只出现炎性细胞浸润,出现炎性细胞浸润的小鼠数量明显降低。又例如,本公开的siRNA缀合物具有低的脱靶效应,在体外sicheck***中,本公开的siRNA缀合物显示出优异的目标序列在靶抑制活性,IC50值为4.50pM-11.3pM,同时,在全部测试siRNA浓度范围内对脱靶目标序列的抑制率均不足50%,表现出低的脱靶效应。又例如,在以300mg/kg的高剂量在连续三周内每周给予本公开的siRNA缀合物的小鼠中,血清ALT和AST浓度与空白对照组水平相当;进一步地,在病理切片中,给予本公开的siRNA缀合物的小鼠中在肝脂肪变性和炎症方面同样显示出与空白对照组相接近的反应,没有显著异常,表 明本公开的siRNA缀合物具有很低的肝毒性。
第二,本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物在体内外实验中显示出优异的APOC3基因表达调节活性。例如,本公开提供的siRNA缀合物在体外sicheck***中显示出很高的目标序列抑制活性,IC
50在6.89-8.55pM之间,同时,与不包含稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物具有接近的目标序列抑制活性。又例如,本公开提供的siRNA缀合物在体外sicheck***中有很高的目标序列抑制活性。在0.01nM的低浓度下,至少有38.92nM的目标序列表达抑制率,最高可达67.54%;在0.1nM的浓度下,目标序列表达抑制率可达84.73-89.35%。同时,与不包含稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相比,具有接近或未显著降低的目标序列抑制活性水平。
第三,本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物在体内表现出较好的血脂TG降低效果。例如,在给药后不同时间点,本公开的siRNA缀合物能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平,并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相近或未显著降低的血脂水平降低效果。特别是,在3mg/kg的剂量下,本公开的siRNA缀合物在长达50天的全部给药时间内始终显示出很高的血脂TG降低效果,最高抑制率可达90.2%。又例如,在给药后不同时间点,本公开的siRNA缀合物能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平,并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相近的血脂水平降低效果。特别是,在3mg/kg以及1mg/kg的剂量下,本公开的siRNA缀合物在长达50天的全部给药时间内始终显示出很高的血脂TG降低效果,最高抑制率可达92.0%。又例如,在给药后不同时间点,不同浓度的本公开的siRNA缀合物均能够降低小鼠血清中的TG水平,特别是,在9mg/kg的给药剂量下,仅给药一次,本公开的siRNA缀合物就能在64天的长时间内始终保持TG水平抑制率大于50%,且抑制率最高可达89.5%,显示出优异的血脂抑制能力。又例如,在给药后不同时间点,本公开的siRNA缀合物能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平。并且在实验期间的43天时间内始终保持较高的抑制效果;特别是,3mg/kg剂量的本公开的siRNA缀合物均显示出优异的小鼠血脂抑制效果,血清TG的 最大抑制率均高于88%;血清CHO的最大抑制率为51.18%-57.41%。又例如,在给药后不同时间点,本公开的siRNA缀合物能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平,并且在实验期间的22天时间内始终保持较高的抑制效果,并且显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相近的血脂水平降低效果。
由此说明,本公开提供的siRNA、药物组合物以及siRNA缀合物能够在具有显著更低的脱靶效应以及由于脱靶效应引起的毒性反应,特别是肝毒性反应的同时,还在体内外有效抑制APOC3基因的表达,并显示出良好的降低血脂的活性,因此可在具有显著更高的安全性的同时,有效治疗和/或预防由APOC3基因表达的mRNA水平相关的疾病症状,特别是血脂异常,具有良好的应用前景。
图1A和图1B分别是连续三周内每周给予300mg/kg本公开的siRNA缀合物或PBS后,小鼠血清中ALT和AST浓度的散点图。
图2是共转染包含目标序列的质粒和siRNA缀合物或参比siRNANC后,体外sicheck***中目标序列相对表达水平的柱状图。
图3A和图3B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物、参比siRNA缀合物或PBS后,血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。
图4A和图4B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物、参比siRNA缀合物或PBS后,血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。
图5A和图5B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物或PBS后,血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。
图6为显示给予不同浓度的本公开的siRNA缀合物或PBS后,血清TG水平随时间变化的折线图。
图7A和图7B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物或PBS后,血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。
图8A和图8B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物、参比siRNA缀合物或PBS后,血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处 所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开,并不用于限制本公开。
在本公开中,如无其他说明,APOC3 mRNA或“APOC3基因表达的mRNA”是指具有如Genbank注册号NM_000040.3所示序列的mRNA,APOC3基因是指转录上述APOC3 mRNA的基因。
定义
在上文及下文中,如无特别说明,大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成;小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸;小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸;小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接;P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸,在一些实施方式中,P1是表示具体修饰的VP、Ps或P,其中,字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate,E-VP)修饰的核苷酸,字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸,大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。
在上文及下文中,所述“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸,“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸,但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid,简称BNA)或无环核苷酸。所述“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在本文的上下文中,表述“互补”或“反向互补”可互相替代使用,并具有本领域技术人员周知的含义,即,在双链核酸分子中,一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中,嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对;嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配 对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对,以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时,两条链被认为是彼此相互补的,以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地,“错配”在本领域中意指在双链核酸中,对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中,如无特别说明,“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配;“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配;“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
在上文及下文中,特别是在描述本公开的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的制备方法时,除非特别说明,所述核苷单体(nucleoside monomer)是指,根据欲制备的siRNA或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序,亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体(unmodified or modified RNA phosphoramidites,有时RNA phosphoramidites也称为Nucleoside phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。
本领域技术人员将理解的是,对于包含一个或多个取代基的任何基团,这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的,“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链,所述数量通常为1至20个碳原子,例如1至10个碳原子,如1至8个或1至6个碳原子。例如,C
1-C
6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时,旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式;因此,例如,“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基;“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集,指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的,“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基,所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一 分子氢而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于:乙烯基;丙烯基,如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基;丁烯基,例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中,烯基基团具有2到20个碳原子,而在其他实施方式中,具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集,指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的,“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基,所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两分子氢而获得的。典型的炔基基团包括但不限于:乙炔基;丙炔基,如丙-1-炔-1-基,丙-2-炔-1-基;丁炔基,例如丁-1-炔-1-基,丁-1-炔-3-基,丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中,炔基具有2到20个碳原子,而在其他实施方式中,具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的一个子集,指的是与炔基相同、但有两个连接点的残基。
如本文所使用的,“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基,例如,甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个,或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的,“芳基”是指通过从环碳原子中除去氢原子而衍生自芳香族单环或多环烃环***形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环***仅含有氢和6至18个碳原子的碳,其中所述环***中的至少一个环是完全不饱和的,即,包含根据Hückel理论的环状、离域的(4n+2)π-电子体系。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的子集,指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。
“杂芳基”指由3-至18-元芳香环自由基衍生而成的基团,包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的,杂芳基可以是单环、双环、三环或四环***,其中环***中的至少一个环是完全不饱和的,即,包含根据Hückel理论的环状离域(4n+2)π-电子 体系。杂芳基包括稠环或桥环***。在一些实施方式中,杂芳基中的杂原子是氧化的杂原子。在一些实施方式中,杂芳基中包含一个或多个氮原子。在一些实施方式中,杂芳基中的氮原子中的一个或多个是季铵化的氮原子。杂芳基通过任何环原子附着至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于:氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并***基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基(5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、***基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻 吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说,保护基团使化学官能度对特定的反应条件不敏感,并且可以在分子中的该官能度上添加以及去除,而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人,Tetrahedron 1992,48,2223-2311,以及Greeneand Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,Chapter 2,2d ed,John Wiley&Sons,New York,1991中,以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方式中,保护基团在碱性条件下稳定,但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中,本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方式中,本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4',4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受试者”一词,如本文所使用的,指任何动物,例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如,恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、兔、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的,“治疗”指的是获得有益的或期望的结果的方法,包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外,治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状,从而在受试者中观察到改善而获得,尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的“预防”指获得有益或期望的结果的方法,包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”,可将双链siRNA、药物组合物或siRNA缀合物给予有罹患特定疾病风险的受试者,或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者,即便可能该疾病的诊断尚未作出。
本公开的siRNA
在一方面,本公开提供了一种具有较高的APOC3基因抑制活性、且 具有低的脱靶效应的siRNA。
本公开的siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元,本领域技术人员公知,所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基,再次不再赘述。
本公开的siRNA包含正义链和反义链,所述正义链包含核苷酸序列I,所述反义链包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸为修饰的或未修饰的核苷酸,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区,所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补,所述第一段核苷酸序列为APOC3基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列;按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列2的第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸,所述稳定化修饰核苷酸指核苷酸的核糖2'位羟基被稳定化修饰基团取代的核苷酸,与相应位置的核苷酸为未修饰的核苷酸的siRNA相比,包含所述稳定化修饰核苷酸的siRNA的热稳定性增加,并且所述稳定化修饰基团的空间位阻大于2'-O-甲基。
在一些实施方式中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的第3个或第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。在一些实施方式中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的第3-9个核苷酸中不超过2个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。通过对特定位置处稳定化修饰核苷酸的个数进行限定,本公开的siRNA可获得最佳的药学活性与低脱靶效应的平衡,同时还具有优异的稳定性。在一些实施方式中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的第3个和/或第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。在一些实施方式中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的第3个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。在一些实施方式中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。
本公开的siRNA中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中第3-9个核苷酸之外的核苷酸均不是稳定化修饰核苷酸。若核苷酸序列II中在第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸的同时, 在第3-9个核苷酸之外包含稳定化修饰核苷酸,可能会显著影响该siRNA的目标序列表达水平的调节能力。
在一些实施方式中,“siRNA的热稳定性增加”是指所述siRNA的热解离温度(Tm)升高。在一些实施方式中,“双链siRNA的热稳定性增加”是指所述siRNA的Tm升高至少0.05℃,在一些实施方式中指升高0.1-6℃,在一些实施方式中指Tm升高0.5-4℃。不受理论解释限制地,通过在特定位置包含稳定化修饰核苷酸,本公开的siRNA中反义链与APOC3基因表达的mRNA结合能力基本不受影响,而与脱靶目标mRNA之间的结合显著降低,从而降低甚至消除脱靶效应。
在一些实施方式中,每个所述稳定化修饰基团独立地具有-X-R所示的结构,其中,X为O、NR'、S或SiR'
2;R是C
2-C
6烷基、取代的C
2-C
6烷基、C
6-C
8芳基、取代的C
6-C
8芳基中的一种,每个R'独立地是H、C
1-C
6烷基、取代的C
1-C
6烷基、C
6-C
8芳基、取代的C
6-C
8芳基中的一种,所述取代的C
2-C
6烷基、取代的C
6-C
8芳基或取代的C
1-C
6烷基指C
2-C
6烷基、C
6-C
8芳基或C
1-C
6烷基中的一个或多个氢原子被取代基团取代而形成的基团,所述取代基团选自以下取代基中的一种或多种:C
1-C
3烷基、C
6-C
8芳基、C
1-C
3烷氧基、卤素、氧亚基和硫亚基。注意的是,本公开并非旨在涵盖全部符合上述结构的修饰基团,而仅涉及哪些能够实现siRNA热稳定性增加的稳定化修饰基团,在一些实施方式中,每个所述稳定化修饰基团独立地选自2'-O-甲氧基乙基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-O-2-N-甲基氨基-2-氧亚基乙基、2'-O-2-N,N-二甲基氨基乙基、2'-O-3-氨基丙基和2'-O-2,4-二硝基苯基中的一种。在一些实施方式中,每个所述稳定化修饰基团均为2'-O-甲氧基乙基。
在一些实施方式中,本公开的具有稳定化核苷酸的siRNA可以是以下第一种、第二种、第三种siRNA,在下文中分别对每一种siRNA进行说明。
第一种siRNA
在一些实施方式中,本公开的siRNA是第一种siRNA。其中,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸差异,且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列 长度相等,且不多于3个核苷酸差异:
5'-CAAUAAAGCUGGACAAGAZ
1-3'(SEQ ID NO:1);
5'-Z
2UCUUGUCCAGCUUUAUUG-3'(SEQ ID NO:2),
其中,Z
1为A,Z
2为U;
并且,所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z
1的核苷酸Z
3,所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z
2的核苷酸Z
4,所述Z
4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。其中,每个U可任意地被T替换。在本公开的上文与下文中,“位置对应”是指从核苷酸序列相同端起算,处于核苷酸序列中相同的位置。例如,核苷酸序列I的3'端第一个核苷酸是位置对应于SEQ ID NO:1的第1个核苷酸的核苷酸。
在一些实施方式中,所述正义链仅包含核苷酸序列I,所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异,和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z
4位置处的差异,且Z
4选自A、G或C。在一些实施方式中,所述核苷酸差异为Z
4位置处的差异,且Z
4选自A、G或C。在一些实施方式中,Z
3是与Z
4互补的核苷酸。这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脱靶效应,而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补;所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个碱基的错配;所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个碱基的错配;所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
在一些实施方式中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II的第2-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-18位的核苷酸完全 反向互补。在一些实施方式中,所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补,或者按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向,所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配,可在保持低的脱靶效应的同时,进一步提升本公开的siRNA的目标基因表达抑制活性。
在一些实施方式中,核苷酸序列I是如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,核苷酸序列II是如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列:
5'-CAAUAAAGCUGGACAAGAZ
3-3'(SEQ ID NO:3);
5'-Z
4UCUUGUCCAGCUUUAUUG-3'(SEQ ID NO:4),
其中,Z
3选自A、U、G或C,Z
4是与Z
3互补的核苷酸;在一些实施方式中,Z
3为A,Z
4为U。
并且,所述正义链和反义链长度相同或不同,所述正义链的长度为19-23个核苷酸,所述反义链的长度为19-26个核苷酸,这样,本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中,所述siRNA正义链和反义链的长度比为19/21、21/23或23/25。
在一些实施方式中,所述正义链还含有核苷酸序列III,所述反义链还含有核苷酸序列IV,所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰,所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自为1-4个核苷酸,所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III长度相等,并且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III实质上反向互补或完全反向互补,所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端,所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端。并且,所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补,该第二段核苷酸序列是指和APOC3基因表达的mRNA中与前述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基为C,所述核苷酸序列IV的碱基为G;所述第二段核苷酸序列的碱基是C;此时,正义链和反义链的长度比为20/20;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为CC,所述核苷酸序列IV的碱基组成为GG;所述第二段核苷酸序列的组成为CC;此时,正义链和反义链的长度比为21/21;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为UCC,所述核苷酸IV的碱基组成为GGA;所述第二段核苷酸序列的组成为UCC;此时,正义链和反义链的长度比为22/22;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为CUCC,所述核苷酸IV的碱基组成为GGAG;所述第二段核苷酸序列的碱基组成为CUCC;此时,正义链和反义链的长度比为21/21。
在一些实施方式中,核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补,因此,给出了核苷酸序列III的碱基组成,核苷酸序列IV的碱基组成也就确定了。
第二种siRNA
在一些实施方式中,本公开的siRNA是第二种siRNA。其中,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸差异,且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸差异:
5'-UUAAAAGGGACAGUAUUCZ
5-3'(SEQ ID NO:45);
5'-Z
6GAAUACUGUCCCUUUUAA-3'(SEQ ID NO:46),
其中,Z
5为U,Z
6为A;
并且,所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z
5的核苷酸Z
7,所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z
6的核苷酸Z
8,所述Z
8是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列。其中,每个U可任意地被T替换。
在一些实施方式中,所述正义链仅包含核苷酸序列I,所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异,和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z
8位置处的差异,且Z
8选自U、G或C。在一些实施方式中,所述核苷酸差异为Z
8位置处的差异,且Z
8选自U、G或C。在一些实施方式中,Z
7是与Z
8互补的核苷酸。这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脱靶效应,而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补;所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个碱基的错配;所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个碱基的错配;所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
在一些实施方式中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II的第2-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-18位的核苷酸完全反向互补。在一些实施方式中,所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补,或者按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向,所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配,可在保持低的脱靶效应的同时,进一步提升本公开的siRNA的目标基因表达抑制活性。
在一些实施方式中,核苷酸序列I是如SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列,核苷酸序列II是如SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列:
5'-UUAAAAGGGACAGUAUUCZ
7-3'(SEQ ID NO:47);
5'-Z
8GAAUACUGUCCCUUUUAA-3'(SEQ ID NO:48),
其中,Z
7选自A、U、G或C,Z
8是与Z
7互补的核苷酸;在一些实施方式中,Z
7为U,Z
8为A。
并且,所述正义链和反义链长度相同或不同,所述正义链的长度为19-23个核苷酸,所述反义链的长度为19-26个核苷酸,这样,本公开提 供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中,所述siRNA正义链和反义链的长度比为19/21、21/23或23/25。
在一些实施方式中,所述正义链还含有核苷酸序列III,所述反义链还含有核苷酸序列IV,所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰,所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自为1-4个核苷酸,所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III长度相等,并且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III实质上反向互补或完全反向互补,所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端,所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端。并且,所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补,该第二段核苷酸序列是指和APOC3基因表达的mRNA中与前述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基为C,所述核苷酸序列IV的碱基为G;所述第二段核苷酸序列的碱基是C;此时,正义链和反义链的长度比为20/20;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为GC,所述核苷酸序列IV的碱基组成为GC;所述第二段核苷酸序列的组成为GC;此时,正义链和反义链的长度比为21/21;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为UGC,所述核苷酸IV的碱基组成为GCA;所述第二段核苷酸序列的组成为GCA;此时,正义链和反义链的长度比为22/22;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为UUGC,所述核苷酸IV的碱基组成为GCAA;所述第二段核苷酸序列的碱基组成为GCAA;此时,正义链和反义链的长度比为21/21。
在一些实施方式中,核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补,因此,给出了核苷酸序列III的碱基组成,核苷酸序列IV的碱基组成也就确定了。
第三种siRNA
在一些实施方式中,本公开的siRNA是第二种siRNA。其中,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸差异,且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸差异:
5'-GGACAGUAUUCUCAGUGCZ
9-3'(SEQ ID NO:105);
5'-Z
10GCACUGAGAAUACUGUCC-3'(SEQ ID NO:106),
其中,Z
9为U,Z
10为A;
并且,核苷酸序列I中包含位置对应于Z
9的核苷酸Z
11,所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z
10的核苷酸Z
12,所述Z
8是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列。其中,每个U可任意地被T替换。
在一些实施方式中,所述正义链仅包含核苷酸序列I,所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异,和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z
12位置处的差异,且Z
12选自G、C或U。在一些实施方式中,所述核苷酸差异为Z
12位置处的差异,且Z
12选自G、C或U。在一些实施方式中,Z
11是与Z
12互补的核苷酸。这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脱靶效应,而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补;所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个碱基的错配;所述实质上反向互补 是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个碱基的错配;所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
在一些实施方式中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II的第2-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-18位的核苷酸完全反向互补。在一些实施方式中,所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补,或者按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向,所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配,可在保持低的脱靶效应的同时,进一步提升本公开的siRNA的目标基因表达抑制活性。
在一些实施方式中,核苷酸序列I是如SEQ ID NO:107所示的核苷酸序列,核苷酸序列II是如SEQ ID NO:108所示的核苷酸序列:
5'-GGACAGUAUUCUCAGUGCZ11-3'(SEQ ID NO:107);
5'-Z12GCACUGAGAAUACUGUCC-3'(SEQ ID NO:108),
其中,Z
11选自A、U、G或C,Z
12是与Z
11互补的核苷酸;在一些实施方式中,Z
11为U,Z
12为A。
并且,所述正义链和反义链长度相同或不同,所述正义链的长度为19-23个核苷酸,所述反义链的长度为19-26个核苷酸,这样,本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中,所述siRNA正义链和反义链的长度比为19/21、21/23或23/25。
在一些实施方式中,所述正义链还含有核苷酸序列III,所述反义链还含有核苷酸序列IV,所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰,所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自为1-4个核苷酸,所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III长度相等,并且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III实质上反向互补或完全反向互补,所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端,所述核苷酸序列IV连接在所述核苷 酸序列II的3'末端。并且,所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补,该第二段核苷酸序列是指和APOC3基因表达的mRNA中与前述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些实施方式中,所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基为C,所述核苷酸序列IV的碱基为G;所述第二段核苷酸序列的碱基是C;此时,正义链和反义链的长度比为20/20;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为AG,所述核苷酸序列IV的碱基组成为CU;所述第二段核苷酸序列的组成为AG;此时,正义链和反义链的长度比为21/21;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为AAG,所述核苷酸IV的碱基组成为CUU;所述第二段核苷酸序列的组成为AAG;此时,正义链和反义链的长度比为22/22;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为AAAG,所述核苷酸IV的碱基组成为CUUU;所述第二段核苷酸序列的碱基组成为AAAG;此时,正义链和反义链的长度比为21/21。
在一些实施方式中,核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补,因此,给出了核苷酸序列III的碱基,核苷酸序列IV的碱基也就确定了。
以下,对于核苷酸序列V、siRNA中的核苷酸修饰以及修饰序列的描述适用于上述本公开的siRNA,例如第一种siRNA、第二种siRNA或第三种siRNA。即如果没有特指,下面对siRNA的描述应视为对上述本公开的siRNA,例如第一种siRNA、第二种siRNA和第三种siRNA逐一进行了描述。例如,如不特别指明具体的siRNA,“所述siRNA还含有核苷酸序列V”的意思是“本公开的siRNA,例如上述第一种siRNA、第二种siRNA或第三种siRNA还含有核苷酸序列V”。
在一些实施方式中,所述正义链和反义链长度不同,所述反义链还含有核苷酸序列V,核苷酸序列V的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰核苷酸,核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸,连接在所述反义链的3'末端,构成反义链的3'突出端。 由此,本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/20、19/21、19/22、20/21、20/22、20/23、21/22、21/23、21/24、22/23、22/24、22/25、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中,所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸,由此,本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/21、21/23或23/25。
所述核苷酸序列V中的每一个核苷酸可以是任意的核苷酸,为了便于合成并节约成本,所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dTdT)、连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸(UU);或者,为了提高siRNA反义链与靶mRNA的亲和力,核苷酸序列V与第三段核苷酸序列完全反向互补,所述第三段核苷酸序列是指APOC3基因表达的mRNA中与第一段核苷酸序列或第二段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列V相等的核苷酸序列。因此,在一些实施方式中,本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23,此时,本公开的siRNA具有更好的mRNA沉默活性。
在一些实施方式中,对于所述第一种siRNA,所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,所述第三段核苷酸序列的碱基组成是CC;所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列,所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列:
5'-CAAUAAAGCUGGACAAGAZ
3-3'(SEQ ID NO:5);
5'-Z
4UCUUGUCCAGCUUUAUUGGG-3'(SEQ ID NO:6),
或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列,所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列:
5'-CCCAAUAAAGCUGGACAAGAZ
3-3'(SEQ ID NO:7);
5'-Z
4UCUUGUCCAGCUUUAUUGGGAG-3'(SEQ ID NO:8),
其中,所述Z
4是反义链5'末端的第一个核苷酸,Z
3选自A、U、G或C,并且Z
4是与Z
3互补的核苷酸。
在一些实施方式中,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列,所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列:
5'-CAAUAAAGCUGGACAAGAA-3'(SEQ ID NO:9);
5'-UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGG-3'(SEQ ID NO:10),
或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列,所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列:
5'-CCCAAUAAAGCUGGACAAGAA-3'(SEQ ID NO:11);
5'-UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGGAG-3'(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方式中,对于所述第二种siRNA,所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列,所述第三段核苷酸序列的碱基组成是GC。所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列,所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列:
5'-UUAAAAGGGACAGUAUUCZ
7-3'(SEQ ID NO:49);
5'-Z
8GAAUACUGUCCCUUUUAAGC-3'(SEQ ID NO:50),
或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列,所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列:
5'-GCUUAAAAGGGACAGUAUUCZ
7-3'(SEQ ID NO:51);
5'-Z
8GAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA-3'(SEQ ID NO:52),
或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列,所述反义链含有如SEQ ID NO:149所示的核苷酸序列:
5'-UUAAAAGGGACAGUAUUCZ
7-3'(SEQ ID NO:49);
5'-Z
8GAAUACUGUCCCUUUUAAUU-3'(SEQ ID NO:149),
或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列,所述反义链含有如SEQ ID NO:150所示的核苷酸序列:
5'-GCUUAAAAGGGACAGUAUUCZ
7-3'(SEQ ID NO:51);
5'-Z
8GAAUACUGUCCCUUUUAAGCUU-3'(SEQ ID NO:150),
其中,所述Z
8是反义链5'末端的第一个核苷酸,Z
7选自A、U、G或C,并且Z
8是与Z
7互补的核苷酸。
在一些实施方式中,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列,所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列:
5'-UUAAAAGGGACAGUAUUCU-3'(SEQ ID NO:53);
5'-AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC-3'(SEQ ID NO:54),
或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列,所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列:
5'-GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU-3'(SEQ ID NO:55);
5'-AGAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA-3'(SEQ ID NO:56)。
在一些实施方式中,对于所述第三种siRNA,所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列,所述第三段核苷酸序列的碱基组成是AG。所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:109所示的核苷酸序列,所述反义链含有如SEQ ID NO:110所示的核苷酸序列:
5'-GGACAGUAUUCUCAGUGCZ
11-3'(SEQ ID NO:109);
5'-Z
12GCACUGAGAAUACUGUCCCU-3'(SEQ ID NO:110),
或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:111所示的核苷酸序列,所述反义链含有如SEQ ID NO:112所示的核苷酸序列:
5'-AGGGACAGUAUUCUCAGUGCZ
11-3'(SEQ ID NO:111);
5'-Z
12GCACUGAGAAUACUGUCCCUUU-3'(SEQ ID NO:112),
其中,所述Z
12是反义链5'末端的第一个核苷酸,Z
11选自A、U、G或C,并且Z
12是与Z
11互补的核苷酸。
在一些实施方式中,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:113所示的核苷酸序列,所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:114所示的核苷酸序列:
5'-GGACAGUAUUCUCAGUGCU-3'(SEQ ID NO:113);
5'-AGCACUGAGAAUACUGUCCCU-3'(SEQ ID NO:114),
或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:115所示的核苷酸序列,所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:116所示的核苷酸序列:
5'-AGGGACAGUAUUCUCAGUGCU-3'(SEQ ID NO:115);
5'-AGCACUGAGAAUACUGUCCCUUU-3'(SEQ ID NO:116)。
如前所述,本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸,在一些实施方式中,本公开的siRNA中的部分或全部核苷酸为修饰的核苷酸,核苷酸基团上的这些修饰不会导致本公开的siRNA抑制APOC3基因表达的功能明显削弱或丧失。
在本公开的上下文中,所使用的的术语“修饰的核苷酸”是指核苷 酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物,或者核苷酸上的碱基是经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致siRNA抑制基因表达的功能明显削弱或丧失。例如,可以选择J.K.Watts,G.F.Deleavey,and M.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008,13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。
在一些实施方式中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸,如果不是所述稳定化修饰核苷酸的话,为2'-氟代修饰的核苷酸。在一些实施方式中,所述核苷酸序列II中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸;按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸,如果不是所述稳定化修饰核苷酸的话,为2'-氟代修饰的核苷酸,所述核苷酸序列II中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸的一种。在一些实施方式中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸。在一些实施方式中,所述核苷酸序列I中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸;按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸,所述核苷酸序列I中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸的一种。本公开的siRNA通过具有上述修饰,能够实现基因表达调节活性和体内稳定性的良好平衡。
在本公开的上下文中,“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸,其具有以下式(7)所示的结构。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸、或核苷酸类似物。在一些实施方式中,每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
这些核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的,这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在一些实施方式中,2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸 (2'-OMe),如式(8)所示。在一些实施方式中,2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH
2)如式(9)所示。在一些实施方式中,2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(10)所示:
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸,但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。在一些实施方式中,核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid,简称BNA)或无环核苷酸。
BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸。在一些实施方式中,BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等,其中,LNA如式(12)所示,ENA如式(13)所示,cET BNA如式(14)所示:
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方式中,无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA),其中,UNA如式(15)所示,GNA如式(16)所示:
上述式(15)和式(16)中,R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物。在一些实施方式中,异核苷酸可以是碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物,如式(17)或(18)所示。
上述式(17)-式(18)化合物中,Base表示核酸碱基,例如A、U、G、C或T;R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中,核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中,每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸,在上文和下文中,所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中,“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2’-氟代核糖基的核苷酸”意义相同,均指核苷酸的2'-羟基被氟取代,而形成的具有如式(7)所示结构的化合物;“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2’-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同,均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代而形成的具有如式(8)所示结构的化合物。
在一些实施方式中,本公开的包含稳定化修饰核苷酸的siRNA是具有以下修饰的siRNA:按照5'末端到3'末端的方向,在所述正义链中, 所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸,所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸;在所述反义链中,所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸,所述反义链中第3位或第5位的核苷酸为稳定化修饰核苷酸,所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
具有上述修饰的siRNA不仅成本低,而且可使血液中的核糖核酸酶不易切割核酸,由此增加核酸的稳定性,使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。同时,上述修饰降低了siRNA的脱靶效应并未显著降低siRNA的抑制性能。
在一些实施方式中,本公开提供的siRNA为siAPOC3a1-M1、siAPOC3a1-M2、siAPOC3a2-M1、siAPOC3a2-M2、siAPOC3b1-M1、siAPOC3b1-M2、siAPOC3b2-M1、siAPOC3b2-M2、siAPOC3b3-M1、siAPOC3b3-M2、siAPOC3b4-M1、siAPOC3b4-M2、siAPOC3c1-M1、siAPOC3c1-M2、siAPOC3c2-M1和siAPOC3c2-M2中的一种
在一些实施方式中,本公开提供的siRNA的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基。在一些实施方式中,具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基;在一些实施方式中,所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(1)所示结构的硫代磷酸酯基:
这种修饰能稳定siRNA的双链结构,保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
在一些实施方式中,本公开提供的siRNA中,硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处:正义链或反义链任意一端的第 一个和第二个核苷酸之间;正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间;或上述的任意组合。在一些实施方式中,硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中,硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中,硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处:
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间;
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间;
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间;
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间;
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间;
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间;
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间;以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
在一些实施方式中,本公开提供的siRNA为表1a-1c中列出的siAPOC3a1-M1S、siAPOC3a1-M2S、siAPOC3a2-M1S、siAPOC3a2-M2S、siAPOC3b1-M1S、siAPOC3b1-M2S、siAPOC3b2-M1S、siAPOC3b2-M2S、siAPOC3b3-M1S、siAPOC3b3-M2S、siAPOC3b4-M1S、siAPOC3b4-M2S、siAPOC3c1-M1S、siAPOC3c1-M2S、siAPOC3c2-M1S和siAPOC3c2-M2S中的一种。
在一些实施方式中,所述siRNA反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
常用的所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸是本领域技术人员所公知的,如5'-磷酸核苷酸可具有如下结构:
再如,Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开了如下4种5'-磷酸类似物修饰 的核苷酸:
其中,R选自H、OH、甲氧基、氟;Base表示核酸碱基,选自A、U、C、G或T。
在一些实施方式中,5'-磷酸核苷酸为式(2)所示的含有5'-磷酸修饰的核苷酸,5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为含有乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate,E-VP)修饰的核苷酸,如式(3)所示,或者为硫代磷酸酯修饰的核苷酸,如式(5)所示。
在一些实施方式中,本公开的siRNA为以下表1a-表1c中列出的siAPOC3a1-M1P1、siAPOC3a1-M2P1、siAPOC3a2-M1P1、siAPOC3a2-M2P1、siAPOC3a1-M1SP1、siAPOC3a1-M2SP1、siAPOC3a2-M1SP1、siAPOC3a2-M2SP1、siAPOC3b1-M1P1、siAPOC3b1-M2P1、siAPOC3b2-M1P1、siAPOC3b2-M2P1、siAPOC3b1-M1SP1、siAPOC3b1-M2SP1、siAPOC3b2-M1SP1、siAPOC3b2-M2SP1、siAPOC3b3-M1P1、siAPOC3b3-M2P1、siAPOC3b4-M1P1、siAPOC3b4-M2P1、siAPOC3b3-M1SP1、siAPOC3b3-M2SP1、siAPOC3b4-M1SP1、siAPOC3b4-M2SP1、siAPOC3c1-M1P1、siAPOC3c1-M2P1、siAPOC3c2-M1P1、siAPOC3c2-M2P1、siAPOC3c1-M1SP1、siAPOC3c1-M2SP1、siAPOC3c2-M1SP1和siAPOC3c2-M2SP1中的一种。
本公开的发明人意外发现,本公开提供的siRNA不仅具有显著增强的血浆和溶酶体稳定性,显著低的脱靶效应,还保留很高的基因抑制活性。
本公开提供的siRNA可以通过本领域常规的siRNA制备方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中,固相合成已经有商业化订制 服务。可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中,制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。
药物组合物
本公开提供了一种药物组合物,所述药物组合物含有如上所述的siRNA作为活性成分和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体,例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles,如基于Fe
3O
4或Fe
2O
3的纳米粒)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine),PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer,PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate),PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate),PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。
在一些实施方式中,所述药物组合物中,对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求,在一些实施方式中,siRNA与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500),在一些的实施方式中,上述重量比为1:(1-50)。
在一些实施方式中,所述药物组合物中,还可以包含药学上可接受的其它辅料,该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如,所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液,例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准,所述保护剂的含量可以为0.01-30重量%。
所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压,本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。在一些实施方式中,所述药物组合物所制成的制剂在给药过程中的剂量会因给药方式的不同而发生调整。
在一些实施方式中,所述药物组合物可以为液体制剂,例如注射液;也可以为冻干粉针剂,实施给药时与液体辅料混合,配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药,也可以但不限于通过喷雾给药到肺部、或通过喷雾经肺部给药到其它脏器组织(如肝脏)、或通过口咽吸入、或鼻腔给药等方式递送所述药物组合物。在一些实施方式中,所述药物组合物用于喷雾给药。
在一些实施方式中,所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方式中,所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中,所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于中国专利申请CN103380113A(通过引用的方式将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。
在一些实施方式中,所述有机胺可为中国专利申请CN103380113A中描述的如式(201)所示的化合物或其药学上可接受的盐:
其中:
X
101和X
102各自独立地是O、S、N-A或C-A,其中A是氢或C
1-C
20烃链;
Y
101和Z
101各自独立地是C=O、C=S、S=O、CH-OH或SO
2;
R
101、R
102、R
103、R
104、R
105、R
106和R
107各自独立地是氢,环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团,环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团,被取代的或未被取代的、支链或直链酰基,被取代的或未被取代的、支链或直链芳基,被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基;
x是1-10的整数;
n是1-3的整数,m是0-20的整数,p是0或1;其中,如果m=p=0,则R
102是氢;
并且,如果n或m中的至少一个是2,那么R
103和在式(201)中的氮形成如式(202)或式(203)所示的结构:
其中,g、e和f各自独立地是1-6的整数,“HCC”代表烃链,且每个*N代表式(201)中的氮原子。
在一些实施方式中,R
103是多胺。在其它实施方式中,R
103是缩酮。在一些实施方式中,在式(201)中的R
101和R
102中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基,所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子,诸如8至约18个碳原子,和0至4个双键,诸如0至2个双键。
在一些实施方式中,如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值,那么R
103可以是下述式(204)-式(213)中的任一个:
其中,式(204)-式(213)中,g、e和f各自独立地是1-6的整数,每个“HCC”代表烃链,且每个*显示R
103与在式(201)中的氮原子的 可能连接点,其中在任意*位置上的每个H可以被替换以实现与在式(201)中的氮原子的连接。
其中,式(201)所示化合物可以根据中国专利申请CN103380113A中的描述制备。
在一些实施方式中,所述有机胺为如式(214)所示的有机胺和/或如式(215)所示的有机胺:
所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物;
所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰胺-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
在一些实施方式中,所述药物组合物中,所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80):(19.7-80):(0.3-50),例如可以为(50-70):(20-40):(3-20)。
在一些实施方式中,由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成 的药物组合物颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径,通常为约40nm至约135nm,更通常地,该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm,例如,该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。
在一些实施方式中,由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物中,siRNA与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内,例如,本公开的siRNA与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。
在一些实施方式中,所述药物组合物在销售时各组分可以独立存在,在使用时可以液体制剂的形式存在。在一些实施方式中,本公开提供的siRNA与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备,只是用本公开提供的siRNA替代现有siRNA即可;在一些实施方式中,可以按照如下方法制备:
将有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液;醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL,例如可以为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇,诸如在室温附近为液体的醇,例如,乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200,聚乙二醇300,聚乙二醇400中的一种或多种,例如可以为乙醇。
将本公开提供的siRNA溶解于缓冲盐溶液中,得到siRNA水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M,例如可以为0.1-0.2M,调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5,例如可以为5.0-5.2,缓冲盐溶液的用量使siRNA的浓度不超过0.6mg/mL,例如可以为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种,例如可以为醋酸钠和/或醋酸钾。
将脂质溶液和siRNA水溶液混合,将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟,例如可以为5-30分钟,得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和siRNA水溶液的体积比为1:(2-5),例如可以为1:4。
将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释,去除杂质,除菌,得到本公开提供的药物组合物,其理化参数为pH值为6.5-8,包封率不低于80%,粒径为40-200nm,多分散指数不高于0.30,渗透压为250-400mOsm/kg;例如理化参数可以为pH值为7.2-7.6,包封率不低于90%,粒径为60-100nm,多分散指数不高于0.20,渗透压为300-400mOsm/kg。
其中,浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法,例如可以使用切相流***、中空纤维柱,在100K Da条件下超滤,超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法,例如可以在0.22μm滤器上过滤除菌。
siRNA缀合物
本公开提供了一种siRNA缀合物,所述siRNA缀合物含有本公开提供的siRNA,以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。在一些实施方式中,所述缀合基团包含接头和药学上可接受的靶向基团和/或递送辅助基团,并且,所述siRNA、所述接头和所述靶向基团或者所述递送辅助基团依次共价或非共价连接,每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体,每个递送辅助基团选自能够增加所述siRNA缀合物在递送目标器官或组织中的生物相容性的基团。
在本公开的上下文中,除非另有说明,“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接;相应地,“缀合”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地,“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。siRNA缀合物应根据上下文,理解为多个siRNA缀合物的总称或者某个化学式所表示的siRNA缀合物。在本公开的上下文中,“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至siRNA,最终形成本公开的siRNA缀合物的特定化合物。
一般来说,所述缀合基团包含药学上可接受的至少一个靶向基团和任选的接头(linker),并且,所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次连接。在一些实施方式中,所述靶向基团为1-6个。在一些实施方式中,所述靶向基团为2-4个。所述siRNA分子可以非共价或共价缀合至所述缀合基团,例如可以共价缀合至所述缀合基团。siRNA与缀合基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3'端或5'端,也可在反义链的5'端,还可以在siRNA的内部序列中。在一些实施方式中,所述siRNA与缀合基团的缀合位点在siRNA正义链的3'末端。
在一些实施方式中,所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2'-位羟基或者碱基上。在一些实施方式中,所述缀合基团还可以连接在3'-位羟基上,此时核苷酸之间采用2'-5'磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在siRNA链的末端时,所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上;当缀合基团连接在siRNA的内部序列时,所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可以参考文献:Muthiah Manoharan et.al.siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7.
靶向基团可经由合适的接头与siRNA分子相连,本领域技术人员可以根据靶向基团的具体类型选择合适的接头。这些接头、靶向基团的种类以及与siRNA的连接方式可参见WO2015006740A2的公开内容,通过引用的方式将其整体内容并入本文。
在一些实施方式中,所述靶向基团可以是siRNA给药领域常规使用的配体,例如WO2009082607A2中描述的各种配体,以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
在一些实施方式中,至少一个或每个所述靶向基团选自能够和表达所述APOC3基因的细胞表面受体结合的配体。
在一些实施方式中,至少一个或每个所述靶向基团选自能够和哺乳动物肝实质细胞表面受体(ASGPR)结合的配体。在一些实施方式中, 每个所述靶向基团独立地为与哺乳动物肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体亲和的配体。在一些实施方式中,每个所述靶向基团独立地为去唾液酸糖蛋白或糖。在一些实施方式中,每个所述靶向基团独立地为去唾液酸糖蛋白,例如去唾液酸血清类枯蛋白(asialoorosomucoid,ASOR)或去唾液酸始球蛋白(asialofetuin,ASF)。在一些实施方式中,每个所述靶向基团独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-三氟乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺、N-异丁酰半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一种。在一些实施方式中,至少一个或每个所述靶向基团为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺。
在一些实施方式中,本公开的siRNA缀合物中的接头具有如式(301)所示的结构:
其中,k为1-3的整数;
L
A具有如式(302)所示的包含酰胺键的结构,L
B具有如式(303)所示的包含N-酰基吡咯烷的结构,含有羰基和氧原子,L
C为基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的连接基团;
其中,n
302、q
302和p
302各自独立地为2-6的整数,可选地,n
302、q
302和p
302各自独立地为2或3;n
303为4-16的整数,可选地,n
303为8-12的整数,
表示基团共价连接的位点。
所述接头中,每个L
A分别与一个所述靶向基团通过醚键连接,并通过L
C部分中羟基的氧原子与L
C部分形成醚键而连接;L
B通过式(303)中的羰基与L
C部分中氨基的氮原子形成酰胺键而连接,并通过式(303)中的氧原子与所述siRNA通过氧原子形成磷酸酯键或硫代磷酸酯键相连接。
在一些实施方式中,本公开提供的siRNA缀合物具有如式(305)所示的结构:
其中,Nu表示本公开提供的siRNA。
在一些实施方式中,本公开的siRNA缀合物中的接头具有式(306)所示的结构:
其中,n
306为0-3的整数,每个p
306独立地为1-6的整数,
表示基团共价连接的位点;所述连接基团通过由*标出的氧原子与所述靶向基团形成醚键连接;所述连接基团由#标出的氧原子中的至少一个与所述siRNA形成磷酸酯键或硫代磷酸酯键而连接,其余由#标出的氧原子与氢原子连接形成羟基,或者与C
1-C
3烷基连接形成C
1-C
3烷氧基;
在一些实施方式中,本公开的siRNA缀合物具有如式(307)所示的结构:
其中,Nu表示本公开提供的siRNA。
在一些实施方式中,本公开的siRNA缀合物具有式(308)所示的结构:
其中,
n1为选自1-3的整数,n3为选自0-4的整数;
每个m1、m2或m3各自独立地为选自2-10的整数;
R
10、R
11、R
12、R
13、R
14或R
15各自独立地为H,或选自于由以下基团所组成的组:C
1-C
10烷基、C
1-C
10卤代烷基以及C
1-C
10烷氧基;
R
3具有式A59所示的结构:
其中,E
1为OH、SH或BH
2,Nu表示本公开提供的siRNA;
R
2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基,其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换:C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)
2、C
2-C
10亚烯基、C
2-C
10亚炔基、C
6-C
10亚芳基、C
3-C
18亚杂环基和C
5-C
10亚杂芳基;并且其中R
2可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基:C
1-C
10烷基、C
6-C
10芳基、C
5-C
10杂芳基、C
1-C
10卤代烷基、-OC
1-C
10烷基、-OC
1-C
10烷基苯基、-C
1-C
10烷基-OH、-OC
1-C
10卤代烷基、-SC
1-C
10烷基、-SC
1-C
10烷基苯基、-C
1-C
10烷基-SH、-SC
1-C
10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH
2、-C
1-C
10烷基-NH
2、-N(C
1-C
10烷基)(C
1-C
10烷基)、-NH(C
1-C
10烷基)、-N(C
1-C
10烷基)(C
1-C
10烷基苯基)、-NH(C
1-C
10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO
2H、-C(O)O(C
1-C
10烷基)、-CON(C
1-C
10烷基)(C
1-C
10烷基)、-CONH(C
1-C
10烷基)、-CONH
2、-NHC(O)(C
1-C
10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C
1-C
10烷基)C(O)(C
1-C
10烷基)、-N(C
1-C
10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C
1-C
10烷基、-C(O)C
1-C
10烷基苯基、-C(O)C
1-C
10卤烷基、-OC(O)C
1-C
10烷基、 -SO
2(C
1-C
10烷基)、-SO
2(苯基)、-SO
2(C
1-C
10卤代烷基)、-SO
2NH
2、-SO
2NH(C
1-C
10烷基)、-SO
2NH(苯基)、-NHSO
2(C
1-C
10烷基)、-NHSO
2(苯基)和-NHSO
2(C
1-C
10卤代烷基);
每个L
1独立地是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基,其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换:C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)
2、C
2-C
10亚烯基、C
2-C
10亚炔基、C
6-C
10亚芳基、C
3-C
18亚杂环基和C
5-C
10亚杂芳基;并且其中,L
1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基:C
1-C
10烷基、C
6-C
10芳基、C
5-C
10杂芳基、C
1-C
10卤代烷基、-OC
1-C
10烷基、-OC
1-C
10烷基苯基、-C
1-C
10烷基-OH、-OC
1-C
10卤代烷基、-SC
1-C
10烷基、-SC
1-C
10烷基苯基、-C
1-C
10烷基-SH、-SC
1-C
10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH
2、-C
1-C
10烷基-NH
2、-N(C
1-C
10烷基)(C
1-C
10烷基)、-NH(C
1-C
10烷基)、-N(C
1-C
10烷基)(C
1-C
10烷基苯基)、-NH(C
1-C
10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO
2H、-C(O)O(C
1-C
10烷基)、-CON(C
1-C
10烷基)(C
1-C
10烷基)、-CONH(C
1-C
10烷基)、-CONH
2,-NHC(O)(C
1-C
10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C
1-C
10烷基)C(O)(C
1-C
10烷基)、-N(C
1-C
10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C
1-C
10烷基、-C(O)C
1-C
10烷基苯基、-C(O)C
1-C
10卤烷基、-OC(O)C
1-C
10烷基、-SO
2(C
1-C
10烷基)、-SO
2(苯基)、-SO
2(C
1-C
10卤代烷基)、-SO
2NH
2、-SO
2NH(C
1-C
10烷基)、-SO
2NH(苯基)、-NHSO
2(C
1-C
10烷基)、-NHSO
2(苯基)和-NHSO
2(C
1-C
10卤代烷基);
表示基团共价连接的位点;
M
1表示靶向基团,其定义和可选择的范围与上述相同。在一些实施方式中,每个M
1独立地选自对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体中的一种。
技术人员会理解的是,尽管为了方便起见,L
1被定义为线性烷基,但是它可能不是线性基团或者名称不同,例如由于上述替换和/或置换而产生的胺或烯基。为了本公开内容的目的,L
1的长度是连接两个附着点的链中的原子数。为此目的,将替换所述直链亚烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)计为一个原子。
当M
1为对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体时,在一些实施方式中,n1可以是1-3的整数,n3可以是0-4的整数,保证所述缀合物中M
1配体的个数至少为2;在一些实施方式中,n1+n3≥2,这样可以使得M
1配体的个数至少为3,使得M
1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合,进而促进所述缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明,当M
1配体的个数大于3个时,M
1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显,因此,从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑,在一些实施方式中,n1为1-2的整数,n3为0-1的整数,且n1+n3=2-3。
在一些实施方式中,m1、m2和m3独立地选自2-10的整数时,可以使多个M
1配体之间的空间位置适合M
1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体的结合,为了使本公开提供的缀合物更为简单,更容易合成和/或降低成本,在一些实施方式中,m1、m2和m3各自独立地为2-5的整数,在一些实施方式中,m1=m2=m3。
本领域技术人员可以理解,当R
10、R
11、R
12、R
13、R
14和R
15各自独立地选自H、C
1-C
10烷基、C
1-C
10卤代烷基、以及C
1-C
10烷氧基中的一种时,不会改变本文公开的缀合物的性质,均可以实现本公开的目的。在一些实施方式中,R
10、R
11、R
12、R
13、R
14和R
15各自独立地选自H、甲基和乙基。在一些实施方式中,R
10、R
11、R
12、R
13、R
14和R
15均为H。
根据本公开提供的siRNA缀合物,R
3为式A59所示结构的基团,其中,E
1为OH、SH或BH
2,基于制备原料易获取性的考虑,在一些实施方式中,E
1为OH或SH。
在一些实施方式中,R
2的选择是为了实现与含氮骨架上的N与A59的连接。在本公开的上下文中,“含氮骨架”是指连接有R
10、R
11、R
12、R
13、R
14和R
15的碳原子与N互相连接的链状结构。因此,R
2可以是任何能够以适当方式将A59基团连接至含氮骨架上的N的连接基团。在一些实施方式中,在通过固相合成的工艺制备本公开的siRNA缀合物的情况下,R
2基团中需要同时含有与含氮骨架上的N连接的连接位点和与R
3中的P相连接的连接位点。在一些实施方式中,R
2中所述与含氮骨架上的N连接的位点与N形成酰胺键,所述与R
3上的P连接的位点与P 形成磷酸酯键。在一些实施方式中,R
2是B5、B6、B5’或B6’:
其中,
表示基团共价键连接的位点。
q
2的取值范围可以是1-10的整数,在一些实施方式中,q
2为1-5的整数。
L
1的作用是将M
1配体与含氮骨架上的N连接,为本公开的siRNA缀合物提供靶向功能。在一些实施方式中,L
1选自式A1-A26基团中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中,L
1选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一种或多种的连接组合;在一些实施方式中,L
1选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合;在一些实施方式中,L
1选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合。
在一些实施方式中,L
1的长度可以为3-25个原子,3-20个原子、4-15个原子或5-12个原子。在一些实施方式中是,L
1的长度为3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个原子。
在一些实施方式中,j1为2-10的整数,在一些实施方式中,j1为3-5的整数。在一些实施方式中,j2为2-10的整数,在一些实施方式中,j2为3-5的整数。R’为C1-C4的烷基,在一些实施方式中,R’为甲基、乙 基和异丙基中的一种。Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种,在一些实施方式中,Ra为A27或A28。Rb为C1-C5的烷基,在一些实施方式中,Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。在一些实施方式中,在式A1-A26中各自对j1、j2、R’、Ra、Rb进行选择,以实现M
1配体与含氮骨架上的N连接,并使M
1配体之间的空间位置更适合M
1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合。
在一些实施方式中,本公开的siRNA缀合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的结构:
在一些实施方式中,式A59中的P可以连接到siRNA序列中任何可能的位置,例如,式A59中的P可以连接到siRNA正义链或反义链的任何一个核苷酸上;在一些实施方式中,式A59中的P连接到siRNA正义链的任何一个核苷酸上。在一些实施方式中,式A59中的P连接到siRNA正义链或反义链的端部;在一些实施方式中,式A59中的P连接到siRNA正义链的端部。所述端部指所述正义链或所述反义链中从其一端起算的前4个核苷酸。在一些实施方式中,式A59中的P连接到siRNA正义链或反义链的末端;在一些实施方式中,式A59中的P连接到siRNA正义链的3'末端。在连接至siRNA的正义链的上述位置的情况下,本公开提供的缀合物进入细胞后,在解旋时,可以释放出单独的siRNA反义链,以通过RNAi机制抑制靶基因表达。
式A59中的P可以连接到siRNA中的核苷酸上任何可能的位置,例如,核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上。在一些实施方式中,式A59中的P可通过形成磷酸二酯键连接至所述siRNA中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些实施方式中,式A59中的P连接在siRNA正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上,或者式A59中的P通过取代siRNA正义链中的一个核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接,或者式A59中的P通过取代siRNA正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢与核苷酸连接。
在一些实施方式中,本公开的siRNA缀合物包含的siRNA可以是例如表1a、1b或1c中列出的任何一种siRNA。包含这些siRNA的siRNA缀合物表现出低的脱靶效应和高的APOC3基因表达的mRNA抑制活性。
表1a本公开的第一种siRNA序列
表1b本公开的第二种siRNA序列
表1c本公开的第三种siRNA序列
其中,大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成;小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸;小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸;下划线标出的大写字母
S表示该字母
S左侧相邻的一个核苷酸为稳定化修饰核苷酸;小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接;P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。在一些实施方式中,
S是表示具体的稳定化修饰例如
moe,其中,下划线标出的字母组合
moe表示在该字母组合
moe左侧相邻的一个核苷酸为具有2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。在一些实施方式中,P1是表示具体修饰的VP、Ps或P,其中,字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate,E-VP)修饰的核苷酸,字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸,大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。另外,上述表1a-1c中所列的序列中的每个U 可任意地被T替换,不会对siRNA的活性或脱靶效应产生明显影响。
本公开siRNA缀合物的制备
上述siRNA缀合物可以通过现有技术中已经详细描述的方法进行合成。例如,WO2015006740A2中详细描述了多种siRNA缀合物的制备方法。也可以通过本领域技术人员熟知的方式,获得本公开的siRNA缀合物。如WO2014025805A1中记载了式(305)所示结构的制备方法,Rajeev等人在ChemBioChem 2015,16,903-908中描述了式(307)所示结构的制备方法。中国专利申请CN110959011A也详细公开了制备式(308)所示的siRNA缀合物的方法。以引用的方式将上述文献内容整体并入本文。
本公开的siRNA缀合物也可以与药学上可接受的其它辅料联用,该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种,详情可参见上文关于本公开的药物组合物的描述。
本公开的siRNA、药物组合物及siRNA缀合物的应用
在一些实施方式中,本公开提供了本公开的siRNA,和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防与APOC3基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的药物的用途。在一些实施始终,所述与APOC3基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状是血脂异常。在一些实施方式中,所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
在一些实施方式中,本公开提供了一种治疗和/或预防与APOC3基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的方法,所述方法包括向有需要的受试者给予本公开的siRNA,和/或药物组合物,和/或siRNA缀合物。在一些实施方式中,所述与APOC3基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状是血脂异常。在一些实施方式中,所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
在一些实施方式中,本公开还提供了一种抑制细胞中APOC3基因表达水平的方法,所述方法包括将有效剂量的本公开的siRNA,和/或药物组合物和/或siRNA与所述细胞接触。
通过将本公开提供的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物给予有 需要的受试者,可以通过对基因表达进行调控的机制达到预防和/或治疗由细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的目的。因此,本公开提供的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物可用于预防和/或治疗所述病理状况或疾病、或用于制备用于预防和/或治疗本文所述病理状况或疾病的药物。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径,将siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言,局部给药导致与受试者整个身体相比将更多siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物递送至特定位点;而全身给药导致将所述siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物递送至受试者的基本整个身体。考虑到本公开旨在提供预防和/或治疗由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的手段,在一些实施方式中为能够将药物递送至肝脏的给药方式。
可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药,所述途径包括但不仅限于:口服或胃肠外途径,如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每三周、每个月或每年1次或多次。
本公开所述的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物的使用剂量可为本领域常规的剂量,所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效,例如测定LD50(使50%的群体致死的剂量)和ED50(在量反应中指能引起50%最大反应强度的剂量,在质反应中,指引起50%实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物时,例如,对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J或C3H/HeNCrlVr小鼠,以所述siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物中的siRNA的量计:对于siRNA与药学上可接受的缀合分子形成的siRNA 缀合物,其siRNA用量可以为0.001-100mg/kg体重,在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重,在进一步的实施方式中为0.05-20mg/kg体重,在更进一步的实施方式中为0.1-15mg/kg体重,在又进一步的实施方式中为0.1-10mg/kg体重。在给予本公开所述的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物时,可优选上述用量。
另外,通过将本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物导入特定基因异常表达的细胞,还可以通过基因表达调控的机制达到抑制细胞中该特定基因的表达这一目的。在一些实施方式中,所述细胞为肝细胞。在一些实施方式中,所述肝细胞可以是选自Hep3B、HepG2、Huh7等肝癌细胞系的细胞或分离的原代肝细胞,在一些实施方式中为原代肝细胞。
采用本公开提供的方法抑制特定基因在细胞中表达,所提供的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物中的siRNA的用量是本领域技术人员根据期望获得的效果容易确定的。例如,在一些实施方式中,所提供的siRNA缀合物中的siRNA用量是这样的量:其足以减少靶基因的表达,并导致在靶细胞表面处1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化,所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部还是全身等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
试剂盒
本公开提供了一种试剂盒,所述试剂盒包含本公开提供的siRNA、、药物组合物和/或siRNA缀合物。
在一些实施方式中,本文所述的试剂盒可在一个容器中提供siRNA、药物组合物和/或缀合物。在一些实施方式中,本文所述的试剂盒可包含一个提供药学上可接受的赋形剂的容器。在一些实施方式中,所述试剂盒中还可包含其它成分,如稳定剂或防腐剂等。在一些实施方式中,本文所述的试剂盒可在不同于提供本文所述siRNA、药物组合物和/或缀合物的容器以外的其它容器中包含至少一种其它治疗剂。在一些实施方式 中,所述试剂盒可包含用于将siRNA、药物组合物和/或缀合物与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分(若有的话)进行混合的说明书。
在本公开的试剂盒中,所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和/或缀合物,和/或药学上可接受的辅料可以任何形式提供,例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中,所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和/或缀合物和任选的药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中,可在本公开的试剂盒中提供无菌水。
下面将通过实施例来进一步说明本公开,但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例
除非特别说明,以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品,所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照Molecular Cloning(Cold SP1ring Harbor LBboratory Press(1989))所记载的方法进行。
制备例1-7本公开提供的siRNA缀合物的合成
按照CN110959011A制备例1所述的制备方法,制备获得了以下表2中的缀合物1-7,区别仅在于,各siRNA缀合物中含有的siRNA的正义链和反义链分别如表2中所示;对于核酸序列中具有;按照以下表2中编号为缀合物1-缀合物7的siRNA的核酸序列,分别合成siRNA的正义链和反义链。使用超纯水(Milli-Q超纯水仪,电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将各siRNA缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL(以siRNA计)后,利用液质联用仪(LC-MS,Liquid Chromatography-Mass SP1ectrometry,购于Waters公司,型号:LCT Premier)进行分子量检测。实测值与理论值一致,说明所合成的缀合物1-7是目标设计的双链核酸序列。各个siRNA缀合物分别具有式(403)所示的结构,并且该siRNA缀合物包含的siRNA分别具有表2中缀合物1-7所对应的siRNA序列。例如,缀合物5的分子量(mw)正义链理论值:7581.42;实测值7581.22,反义链理论值:6948.55;实测值:6948.72,实测值与理论值相符,表明该缀合物具有式(403)所示的结构,并且该缀合物具有表2中缀合物5所对应的siRNA 序列。
表2 siRNA缀合物中的siRNA序列
其中,大写字母C、G、U、A、T表示核苷酸的碱基组成;小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸;小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸;下划线 标出的字母组合
moe表示该字母组合moe左侧相邻的一个核苷酸为核糖2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸;小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接;P表示该字母P右侧的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。
对比制备例1-3参比siRNA缀合物的合成
按照CN110959011A制备例1所述的制备方法,制备获得了以下表2中编号为参比缀合物1-3的参比siRNA缀合物,区别仅在于,各参比siRNA缀合物中含有的siRNA的正义链和反义链分别如表2中所示;按照以下表2中编号为参比缀合物1-3的siRNA的核酸序列,分别合成siRNA的正义链和反义链。使用超纯水(Milli-Q超纯水仪,电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将各参比siRNA缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL(以siRNA计)后,利用液质联用仪(LC-MS,Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,购于Waters公司,型号:LCT Premier)进行分子量检测。实测值与理论值一致,说明所合成的参比缀合物1-3分别具有目标设计的双链核酸序列。各参比siRNA缀合物具有式(403)所示的结构,并且所包含的siRNA分别具有表2中参比缀合物1-3所对应的siRNA序列,这些siRNA序列中不包含稳定化修饰核苷酸。
对比制备例4参比siRNA NC的合成
按照WO2019105418(A1)中制备例1记载的方法,通过固相合成方法合成了以下参比siRNANC,区别仅在于,使用DEPC水溶解等摩尔相互互补的如SEQ ID NO:161所示的正义链和如SEQ ID NO:162所示的反义链,随后退火得到参比siRNA NC:
5’-UmsUmsCmUmCmCmGfAfAfCmGmUmGmUmCmAmCmGmUm-3’
(SEQ ID NO:161);
5’-AmsCfsGmUmGmAfCmAmCmGmUmUmCmGfGmAfGmAmAmsCmsUm-3’
(SEQ ID NO:162)。
制备例8-14本公开提供的siRNA的合成
按照WO2019105418(A1)中制备例1记载的方法,通过固相合成方法分别合成表2中所列的siRNA序列,区别仅在于,使用DEPC水溶解 等摩尔表2中相互互补的正义链和反义链,随后退火得到本公开提供的siRNA1-siRNA7,其序列如表2所示。
对比制备例4-10
按照和制备例8-14中相同的方法,制备得到参比siRNA-参比siRNA7。
实验例1 siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果
将缀合物1、缀合物2和参比缀合物1分别用PBS溶解为10mg/ml的溶液(以siRNA缀合物计)。将ICR小鼠(雌雄各半,18-22g重,5-6周龄,购自于斯贝福公司)随机分组,每组6只小鼠(雌雄各半),分别编号。以颈背部皮下注射的方式,向每只小鼠分别给予上述siRNA缀合物溶液,给药体积均为10mL/kg,作为测试组;另外向一组小鼠中的每只分别给予PBS,给药体积均为10mL/kg,作为空白对照组。
以给药时间点作为第1天计算,在第8天对测试组和空白对照组的每只小鼠进行眼眶采血,采血量为0.6mL,采血后在37℃下孵育60min后,在4℃下,3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA,意大利)检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度。结果参见表1的记载。
进一步地,在第8天采血后,处死小鼠并进行剖检,在10%中性缓冲***固定液中保存并制作病理切片。对病理切片中,肝脂肪变性和炎症的严重程度进行评价分级。
表1给予siRNA缀合物的小鼠中血生化结果
实验组 | 参比缀合物1 | 缀合物1 | 缀合物2 |
剂量 | 100mg/kg | 100mg/kg | 100mg/kg |
ALT | 420% | 116% | 118% |
AST | 126% | - | 32% |
表1中,%及前面的数字代表小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度与空白对照组血清中浓度的差值,与空白对照组血清中浓度的百分比。例如,表1中的420%代表以100mg/Kg给予了参比缀合物1的小鼠体内的丙氨酸氨基转移酶的浓度比空白对照组高出420%。
从表1中的结果可知,与空白对照相比,给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物1的小鼠显示出明显的血生化指标变化,ALT的浓度升高了420%,AST的浓度升高了126%。给予本公开的siRNA缀合物1或2的小鼠中,ALT的浓度只分别升高了116%和118%,AST的浓度只升高了32%,显示出显著降低的血生化指标。
病理切片的结果显示,与空白对照相比,给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物1的6只小鼠,有1只出现中度肝细胞炎症反应,具体表现为其肝小叶可见弥漫性少量炎性细胞浸润,肝窦中纤维细胞弥漫性增生,有3只出现轻度肝细胞炎症反应,局部肝小叶中可见炎性细胞小灶状浸润,1只出现局部肝小叶炎性坏死,个别肝细胞点状坏死。而给予本公开的缀合物1的小鼠中,仅有2只小鼠显示出轻度肝细胞炎症反应,表现为少量炎性细胞浸润,没有中度以上的炎症反应和坏死。给予本公开的缀合物2的小鼠中,仅有1只小鼠显示出轻度肝细胞炎症反应,没有中度以上的炎症反应和坏死。与参比缀合物1相比,缀合物1和2表现出显著更低的毒性反应。
上述结果表明,与参比缀合物相比,本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应,因此在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出显著更高的安全性,具有优异的开发前景。
实验例2 siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果
将缀合物6、缀合物7和参比缀合物3分别用PBS溶解为10mg/ml和30mg/ml的溶液(以siRNA缀合物计)。将ICR小鼠(雌雄各半,18-22g重,5-6周龄,购自于斯贝福公司)随机分组,分别编号。对于每一浓度的每一缀合物,分组为2周组和4周组两组动物,每组6只小鼠(雌雄各半)。以颈背部皮下注射的方式,向每只小鼠分别给予上述siRNA缀合物溶液,给药体积均为10mL/kg,作为测试组;另外向2组小鼠中的每只分别给予PBS,给药体积均为10mL/kg,分别作为空白对照组的2周组或4周组。
以给药时间点作为第1天计算,在第15天后,处死300mg/kg浓度 缀合物2周组的6只小鼠并进行剖检,分别在10%中性缓冲***固定液中保存并制作病理切片。在第29天分别对测试组和空白对照组的4周组中的6只小鼠进行眼眶采血,采血量均为0.6mL,采血后在37℃下孵育60min后,在4℃下,3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA,意大利)检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度,并与空白对照组进行对照,结果参见表2的记载。对病理切片中,炎性细胞浸润和肝细胞坏死的严重程度进行评价分级,并作相对比较。
表2给予siRNA缀合物的小鼠中血生化结果
表2中,F代表雌性小鼠,%及前面的数字代表小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度与空白对照组血清中浓度的差值,与空白对照组血清中浓度的百分比。例如,表2中的F:212%代表以300mg/Kg给予了参比缀合物3的雌性小鼠体内的丙氨酸氨基转移酶的浓度比空白对照组高出212%。
从表2的结果可知,与空白对照相比,给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物3的小鼠显示出明显的血生化指标变化,在300mg/Kg的高剂量下,雌性小鼠体内ALT和AST的浓度分别升高了212%和36%。相同剂量下,给予本公开的缀合物7的雌性小鼠体内ALT和AST的浓度分别升高了130%和32%,相较于参比缀合物3,ALT的浓度明显下降;给予本公开的缀合物6的小鼠体内均未发现ALT和AST浓度升高,相较于参比缀合物3,血生化指标变化程度显著下降。
病理切片的结果显示,与空白对照相比,给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物3的小鼠显示出明显的肝炎症反应,6只小鼠均出现炎性细胞浸润。而给予缀合物6的小鼠中仅有3只小鼠显示出炎性细胞浸润。给予缀合物7的小鼠中仅有3只出现炎性细胞浸润。与参比缀合物 相比,本公开的缀合物在组织病理学方面出现炎性细胞浸润的小鼠数量也显著减少。
上述结果表明,与参比缀合物相比,本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应,因此在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出显著更高的安全性,具有优异的开发前景。
实验例3 siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果
按照实验例2的方法,对siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果进行了验证,区别仅在于,使用缀合物3和参比缀合物2进行试验,每一缀合物分别用PBS溶解为10mg/ml的溶液(以siRNA缀合物计),2周组和4周组(在表19中分别标记为D15组和D29组)每组各3只小鼠,均为雄性。即,测试了100mg/kg剂量下,缀合物13和参比缀合物2在小鼠中的毒性效果。
表3给予siRNA缀合物的小鼠中血生化结果
表3中,%及前面的数字代表小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度与空白对照组血清中浓度的差值,与空白对照组血清中浓度的百分比。
由表3的结果可知,与空白对照相比,给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物2的小鼠显示出明显的血生化指标变化,在给药后第15天,血清中ALT和AST的浓度分别升高了71%和54%,在给药后第29天,血清中ALT和AST的浓度分别升高了118%和94%。而以相同剂量给予缀合物3的小鼠中未见血清中ALT和AST浓度升高。本公开的缀合物3显示出显著更低的血生化指标。
病理切片的结果显示,与空白对照相比,给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物2的小鼠中,有1只在组织病理学结果中表现出重度肝细胞变性,具体表现为广泛可见肝细胞肿胀,胞质疏松淡染,部分肝细胞伴有空泡变性,胞质内可见微小的圆形空泡,有2只表现出中度肝细胞变性,具体表现为大量至广泛肝细胞胞质疏松,部分肝细胞伴有空泡变性,胞质内可见微小的圆形空泡。给予本公开的siRNA缀合物3的小鼠中,有3只显示出轻度肝细胞变性,发生胞质疏松的肝细胞数量更少。和参比缀合物相比,在组织病理学中肝细胞变性程度明显降低,显示出显著更低的毒性反应。
上述结果表明,与参比缀合物相比,本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应,因此在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出显著更高的安全性,具有优异的开发前景。
实验例4 siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果
将缀合物3和缀合物5分别用PBS溶解为30mg/ml的溶液(以siRNA缀合物计)。将ICR小鼠(雌雄各半,18-22g重,5-6周龄,购自于斯贝福公司)随机分组,每组10只小鼠(雌雄各半),分别编号。以颈背部皮下注射的方式,向每只小鼠分别给予上述siRNA缀合物溶液,给药体积均为10mL/kg,作为测试组;另外向一组小鼠中的每只分别给予PBS,给药体积均为10mL/kg,作为空白对照组。
以首次给药时间点作为第1天计算,在第8天和15天分别对每只小鼠重复给药,所使用的siRNA缀合物溶液(或PBS)浓度和给药体积与首次给药相同。在第16天对测试组和空白对照组的每只小鼠进行眼眶采血,采血量为0.6mL,采血后在37℃下孵育60min后,在4℃下,3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA,意大利)检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度。结果参见图1A、图1B。
图1A、图1B分别是连续三周内每周给予300mg/kg本公开的siRNA缀合物或PBS后,小鼠血清中ALT和AST浓度的散点图。由图1A和图 1B可见,与空白对照组相比,给予本公开的siRNA缀合物后,血清ALT和AST浓度与空白对照组水平相当,表明本公开的siRNA缀合物具有很低的肝毒性。
进一步地,在采血后,处死小鼠并进行剖检,在10%中性缓冲***固定液中保存并制作病理切片。并作相对比较。病理切片显示,给予本公开的siRNA缀合物3或缀合物5的小鼠,在肝脂肪变性和炎症方面均显示出与空白对照组相接近的反应,没有显著异常。同样表明本公开的siRNA缀合物具有很低的肝毒性。
上述结果表明,本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应,因此在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出显著更高的安全性,具有优异的开发前景。
实验例4 siRNA缀合物在体外sicheck***中的抑制活性
本实验例中,采用体外sicheck***,检测了缀合物1、缀合物2、缀合物3、缀合物4、缀合物6、缀合物7、参比缀合物1、参比缀合物2、参比缀合物3或参比siRNANC在体外sicheck***中对目标序列的抑制活性。
[1]构建检测质粒
采用psiCHECK
TM-2(Promega
TM)质粒构建了检测质粒,所述质粒中含有一个目标序列1,即siRNA靶序列。对于待测siRNA缀合物,目标序列1如下所示:
该目标序列1是所检测的siRNA靶向的人APOC3基因表达的mRNA中的一段核苷酸序列,因此各siRNA缀合物对目标序列1的抑制效果可反映所检测的siRNA缀合物中siRNA的APOC3基因表达的抑制能力。将目标序列1及其互补序列克隆到psiCHECK
TM-2质粒的Xho I/Not I位点。
[2]转染
在添加有20%的胎牛血清(FBS,Hyclone公司)及0.2体积%的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin,Gibco,Invitrogen公司)的DMEM完全培养基(Hyclone公司)中,于37℃在含5%CO
2/95%空气的培养箱中培养HEK293A细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)。
将HEK293A细胞以8×10
3细胞/孔接种于96孔板中,16小时后细胞生长密度达到70-80%时,吸尽培养孔中H-DMEM完全培养基,每孔加入80μL Opti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5小时。
用DEPC化水将上述检测质粒稀释成200ng/μL的检测质粒工作液;用DEPC化水将下面的siRNA缀合物中的每一个或者参比siRNA NC分别配制成10nM、3nM、1nM共3种不同浓度(以siRNA计)的siRNA缀合物工作液或参比siRNA NC工作液,所用siRNA缀合物分别为上述制备获得的缀合物1、缀合物2、缀合物3、缀合物4、缀合物6、缀合物7、参比缀合物1、参比缀合物2、参比缀合物3。
对于每一siRNA缀合物或参比siRNA NC,分别配制1A1-1A3溶液,每份1A1-1A3溶液依次分别含有上述3个浓度的siRNA缀合物工作液或参比siRNANC工作液1μL、检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
配制1B溶液,每份1B溶液含有0.2μL Lipofectamine
TM2000和10μL Opti-MEM培养基。
配制1C溶液,每份1C溶液含有检测质粒工作液0.05μL(含检测质 粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
分别将一份1B溶液与得到的一份每个siRNA缀合物或参比siRNA NC的1A1-1A3溶液混合,分别在室温下孵育20min,得到每个siRNA缀合物或参比siRNA NC的转染复合物1X1-1X3。
将一份1B溶液与一份1C溶液混合,在室温下孵育20min,得到空白转染复合物1X4
在培养孔中,分别加入每一siRNA缀合物或参比siRNA NC的转染复合物1X1-1X3,均匀混合,加入量为20μL/孔,得到每个siRNA缀合物或参比siRNA NC终浓度分别约为0.1nM、0.03nM和0.01nM(以siRNA计)的转染复合物,每个siRNA缀合物或参比siRNA NC的转染复合物1X1-1X3分别转染3个培养孔,得到含siRNA缀合物或参比siRNA NC的共转染混合物,记为测试组。
对于每一siRNA缀合物或参比siRNA NC,在另外3个培养孔中,分别加入转染复合物1X4,加入量为20μL/孔,得到不含siRNA的转染混合物,记为空白对照组。
分别将含siRNA的共转染混合物和不含siRNA的共转染混合物在培养孔中转染4小时后,每孔补加100μL含20%FBS的H-DMEM完全培养基。将96孔板置于CO
2培养箱继续培养24小时。
[3]检测
吸去培养孔中的培养基,每孔加入150μL的
Luciferase试剂与H-DMEM混合溶液(体积比1:1),充分混匀,室温孵育10min后,转移120μL混合液到96孔酶标板上,使用Synergy II多功能酶标仪(BioTek公司)读取96孔酶标板上各培养孔中Firefly的化学发光值(Fir);再向96孔酶标板上每孔加入60μL
Stop&
试剂,充分混匀,室温孵育10min后,按照读取Fir的排布方式,使用酶标仪读取96孔酶标板上各培养孔中Renilla的化学发光值(Ren)。
计算96孔酶标板上每孔发光比值Ratio=Ren/Fir,各测试组或对照组的发光比值Ratio(测试)或Ratio(对照)为三个培养孔Ratio的平均值;以对照组的发光比值为基准,对各测试组的发光比值进行归一化,获得 Ratio(测试)/Rati(对照)的比值R,以此表示Renilla报告基因的相对表达水平,即残留活性。各siRNA缀合物或参比siRNA NC对目标序列1的抑制率=(1-R)×100%。
各siRNA缀合物或参比siRNA NC的目标序列1抑制效果参见图2。图2是共转染包含目标序列1的质粒和待测siRNA缀合物或参比siRNA NC后,体外sicheck***中目标序列1相对表达水平的柱状图。进一步地,各siRNA缀合物或参比siRNA NC对目标序列1的表达抑制率总结于表3中。
表4体外sicheck***中目标序列1的表达抑制率
根据图2和表4的结果可知,本公开提供的siRNA缀合物在体外sicheck***中有很高的目标序列抑制活性。在0.01nM的低浓度下,至少有38.92nM的目标序列1表达抑制率,最高可达67.54%;在0.1nM的浓度下,目标序列1表达抑制率至少为84.73%,最高可达89.35%。同时,与不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物1、参比缀合物2或参比缀合物3具有接近的目标序列抑制活性水平。
实验例6 siRNA缀合物在体外sicheck***中的抑制活性
本实验例中,采用体外sicheck***,检测了缀合物6、缀合物7或参比缀合物3在体外sicheck***中对目标序列的抑制活性。
根据Kumico Ui-Tei et.al.,Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution:modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect.Nucleic Acids Research,2008.36(7),2136-2151描述的方法,构建检测质粒,将所述检测质粒与待测缀合物共转染至HEK293A细胞中,通过双萤光素酶报告基因的表达水平,来反映siRNA的目标序列抑制活性。具体步骤如下:
[1]构建检测质粒
采用psiCHECK
TM-2(Promega
TM)质粒构建了检测质粒,所述质粒中含有一个目标序列2,即siRNA缀合物靶序列。对于待测siRNA缀合物,目标序列2如下所示:
TTGCTTAAAAGGGACAGTATTCTCAGTGCTCTCCTACC
(SEQ ID NO:164)
该目标序列2是所检测的siRNA缀合物中反义链的完全互补序列,因此各siRNA缀合物对目标序列1的抑制效果可反映所检测的siRNA缀合物的目标基因表达的抑制能力。将目标序列2及其互补序列克隆到psiCHECK
TM-2质粒的Xho I/Not I位点。
[2]转染
在添加有20%的胎牛血清(FBS,Hyclone公司)及0.2体积%的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin,Gibco,Invitrogen公司)的DMEM完全培养基(Hyclone公司)中,于37℃在含5%CO
2/95%空气的培养箱中培养HEK293A细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)。
将HEK293A细胞以8×10
3细胞/孔接种于96孔板中,16小时后细胞生长密度达到70-80%时,吸尽培养孔中H-DMEM完全培养基,每孔加入80μL Opti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5小时。
用DEPC化水将上述检测质粒稀释成200ng/μL的检测质粒工作液;用DEPC化水将表4中的每一个siRNA缀合物分别配制成1.00μM、0.330μM、0.110μM、0.0370μM、0.0123μM、0.00412μM、0.00137μM、0.000457μM、0.000152μM、0.0000508μM和0.0000169μM(以siRNA缀合物中的siRNA量计)共11个不同浓度的siRNA缀合物工作液。所用siRNA缀合物分别为上述制备获得的缀合物6、缀合物7和参比缀合物3。
对于每一siRNA缀合物,分别配制2A1-2A11溶液,每份2A1-2A11 溶液依次分别含有上述11个浓度的siRNA工作液1μL、检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
配制2B溶液,每份2B溶液含有0.2μL Lipofectamine
TM2000和10μL Opti-MEM培养基。
配制2C溶液,每份2C溶液含有检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
分别将一份2B溶液与得到的一份每个siRNA缀合物的2A1-2A11溶液混合,分别室温下孵育20min,得到每个siRNA缀合物的转染复合物2X1-2X11。
将一份2B溶液与一份2C溶液混合,分别室温下孵育20min,得到空白转染复合物2X12
在培养孔中,分别加入每一siRNA缀合物的转染复合物2X1-2X11,均匀混合,加入量为20μL/孔,得到每个siRNA缀合物终浓度分别约为0.01μM、0.0033μM、0.0011μM、0.00037μM、0.000123μM、0.0000412μM、0.0000137μM、0.00000457μM、0.00000152μM、0.000000508μM和0.000000169μM(以siRNA缀合物中的siRNA量计)的转染复合物,每个siRNA缀合物的转染复合物2X1-2X11分别转染3个培养孔,得到含siRNA缀合物的共转染混合物,记为测试组。
对于每一siRNA缀合物,在另外3个培养孔中,分别加入转染复合物2X12,加入量为20μL/孔,得到不含siRNA缀合物的转染混合物,记为空白对照组。
分别将含siRNA缀合物的共转染混合物和不含siRNA缀合物的共转染混合物在培养孔中转染4小时后,每孔补加100μL含20%FBS的H-DMEM完全培养基。将96孔板置于CO
2培养箱继续培养24小时。
[3]检测
吸去培养孔中的培养基,每孔加入150μL的
Luciferase试剂与H-DMEM混合溶液(体积比1:1),充分混匀,室温孵育10min后,转移120μL混合液到96孔酶标板上,使用Synergy II多功能酶标仪(BioTek公司)读取96孔酶标板上各培养孔中Firefly的化学发光值(Fir);再向 96孔酶标板上每孔加入60μL
Stop&
试剂,充分混匀,室温孵育10min后,按照读取Fir的排布方式,使用酶标仪读取96孔酶标板上各培养孔中Renilla的化学发光值(Ren)。
计算96孔酶标板上每孔发光比值Ratio=Ren/Fir,各测试组或对照组的发光比值Ratio(测试)或Ratio(对照)为三个培养孔Ratio的平均值;以对照组的发光比值为基准,对各测试组的发光比值进行归一化,获得Ratio(测试)/Ratio(对照)的比值R,以此表示Renilla报告基因的相对表达水平,即残留活性。siRNA对目标序列的抑制率=(1-R)×100%。
依据转染了不同浓度的待测siRNA后,HEK293A细胞中Renilla的相对残留活性,利用Graphpad 5.0软件的非线性回归分析功能拟合log(inhibitor)vs.response—Variable slope(four parameters)剂量-效应曲线。
根据拟合的剂量-效应曲线对应的函数,计算待测siRNA靶向目标序列的IC
50值,所述函数如下,
式中:
Y是比值R,即Renilla的相对残留活性,
X为转染siRNA浓度的对数值,
Bot是稳态期底部的Y值,
Top是稳态期顶部的Y值,
X'是当Y在底部到顶部之间一半时对应的X值,而HillSlope则是曲线在X'处的斜率。
由该剂量-效应曲线和对应的函数,确定当Y=50%时对应的X
50值,计算获得各siRNA的IC
50值=10^X
50(nM),IC
50值总结于表5中。
表5 siRNA缀合物在pscheck***中的IC
50
缀合物编号 | IC 50 |
缀合物6 | 8.55pM |
缀合物7 | 6.89pM |
参比缀合物3 | 6.68pM |
由表5的结果可知,本公开的siRNA缀合物在体外sicheck***中有很高的目标序列抑制活性,IC
50在6.89-8.55pM之间。同时,与其余 序列相同、但不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物3具有接近的目标序列抑制活性。
实验例7 siRNA缀合物在体外sicheck***中的抑制活性
按照实验例6的方法,测试了缀合物3和缀合物6在体外sicheck***中的脱靶序列抑制活性。区别仅在于,以缀合物3或缀合物6代替所测试的siRNA缀合物进行检测;对于缀合物6,所使用的目标序列是目标序列2,或分别采用如下所示的目标序列3-5代替目标序列2;对于缀合物3,所使用的目标序列是目标序列2,或分别采用如下所示的目标序列6-8代替目标序列2:
目标序列3:
TAGGCCCCTTTCAAGTATTCT(SEQ ID NO:165)
目标序列4:
AGAATACTGTCCCTTTTAAGC(SEQ ID NO:166)
目标序列5:
CTCCGCAGTGAAATTTTAAGC(SEQ ID NO:167)
目标序列6:
CTTTCACTGCGGATCAGTGCT(SEQ ID NO:168)
目标序列7:
AGCACTGAGAATACTGTCCCT(SEQ ID NO:169)
目标序列8:
CTACAGTCTCCGCCTGTCCCT(SEQ ID NO:170)
其中,目标序列2中包含缀合物3和缀合物6中siRNA反义链的完全互补序列,因此缀合物3或6对目标序列2抑制的效果可反映缀合物3或6的ApoC3 mRNA抑制活性;目标序列3中包含与缀合物6中siRNA反义链部分互补的序列、目标序列4中包含缀合物6中siRNA正义链的完全互补序列,目标序列5中包含与缀合物6中siRNA正义链部分互补的序列,因此缀合物6对目标序列3、4或5的抑制效果可反映脱靶效应的程度。即,抑制效果越高,缀合物6越可能发生脱靶。类似地,目标序列6中包含与缀合物3中siRNA反义链部分互补的序列、目标序列7中包含缀合物3中siRNA正义链的完全互补序列,目标序列8中包含与 缀合物3中siRNA正义链部分互补的序列,因此缀合物3对目标序列6、7或8的抑制效果可反映脱靶效应的程度。即,抑制效果越高,缀合物3越可能发生脱靶。
其结果,体外sicheck***中,缀合物6对目标序列2的抑制IC50为11.3pM,对目标序列3、4或5在全部测试siRNA浓度范围内抑制率均不足50%,即,均未发生脱靶;缀合物3对目标序列2的抑制IC50为4.50pM,对目标序列6、7或8在全部测试siRNA浓度范围内抑制率均不足50%,即,均未发生脱靶。
可见,在体外sicheck***中,本公开的siRNA缀合物显示出优异的目标序列在靶抑制活性,IC50值为4.50pM-11.3pM;同时,本公开的siRNA缀合物具有低的脱靶效应。
实验例8 siRNA缀合物在体外sicheck***中的抑制活性
按照实验例6的方法,测试了缀合物5在体外sicheck***中的抑制活性,区别仅在于,以缀合物5代替所测试的siRNA缀合物进行检测。其结果,缀合物5在体外sicheck***中显示出高的目标序列抑制活性,IC
50为49.8pM。
实验例9 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对血脂的降低效果
选取血清TG含量>2mmol/L的人APOC3转基因小鼠Tg(APOC3)3707Bres(购自美国Jackson实验室)进行随机分组,每组6只,雌雄各半。分别向每组小鼠给予缀合物6、参比缀合物3以及PBS空白对照。所有动物根据体重计算药量,采用皮下注射方式单次给药,各siRNA缀合物的给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg小鼠体重,给药体积为5ml/kg。各siRNA缀合物分别以PBS水溶液提供,根据给药剂量和给药体积,换算出缀合物应配制的浓度。向另外1组小鼠中的每一只给予1×PBS,给药体积为5ml/kg,作为空白对照组。
以给药时间点记为第1天,在第1、9、15天分别对小鼠眼眶静脉丛取血,每次100μL。采血后在室温下放置30min后,在4℃下,3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA,意大利)检测血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的 含量。
标准化的血脂水平=(给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100%。
血脂水平的抑制率=(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100%。
其中,血脂是指总胆固醇(CHO)或甘油三酯(TG)。
图3A和图3B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物、参比siRNA缀合物或PBS后,血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。进一步地,各时间点的血清TG抑制率和血清CHO抑制率归纳于以下表6A和表6B中:
表6A siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清TG抑制率
表6B siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清CHO抑制率
图3A、图3B以及表6A、6B的结果表明,在给药后不同时间点,缀合物6能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平,并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比缀合物3相比下降不超过11%的血脂水平降低效果。
实验例10 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对血脂的降低效果
用实验例9的方法考查本公开的缀合物7在小鼠体内对血脂的降低效果。区别仅在于,分别向每组小鼠给予缀合物7、参比缀合物3以及PBS空白对照。所有动物根据体重计算药量,采用皮下注射方式单次给 药,各siRNA缀合物的给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg和1mg/kg小鼠体重,给药体积为5ml/kg。以给药时间点记为第1天,在第1、9、15、22、29、36、50天分别对小鼠眼眶静脉丛取血。
图4A和图4B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物、参比siRNA缀合物或PBS后,血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。进一步地,各时间点的血清TG抑制率和血清CHO抑制率归纳于以下表7A和表7B中:
表7A siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清TG抑制率
表7B siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清CHO抑制率
图4A、图4B以及表7A、7B的结果表明,在给药后不同时间点,缀合物7能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平,并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比缀合物3相比持平甚至更优秀的血脂水平降低效果。特别是,在3mg/kg的剂量下,缀合物7在长达50天的全部给药时间内始终显示出很高的血脂TG降低效果,最高抑制率可达90.2%。
实验例11 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对血脂的降低效果
按照实验例9的方法,检测了siRNA缀合物在小鼠体内对血脂的降低效果,区别仅在于,所使用的siRNA缀合物为缀合物3或缀合物4。结果如图9A和图9B所示。
图9A和图9B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物或PBS后,血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。进一步地,各时间点的血清TG抑制率和血清CHO抑制率归纳于以下表8A和表8B中:
表8A siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清TG抑制率
表8B siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清CHO抑制率
图5A、图5B以及表8A、8B的结果表明,在给药后不同时间点,缀合物3和缀合物4能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平。特别是,在3mg/kg以及1mg/kg的剂量下,缀合物4在长达50天的全部给药时间内均始终显示出很高的血脂TG降低效果,最高抑制率可达92.0%。
实验例12 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对血脂的降低效果
按照实验例9的方法,检测了siRNA缀合物在小鼠体内对血脂的降低效果,区别仅在于,所使用的siRNA缀合物为缀合物3,各siRNA缀合物的给药剂量(以siRNA的量计)为9mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.25mg/kg、0.1mg/kg或0.05mg/kg小鼠体重,给药体积为5ml/kg。各siRNA缀合物分别以PBS水溶液提供,根据给药剂量和给药体积,换算出缀合物应配制的浓度。以给药时间点记为第1天,在第1、8、15、22、29、36、43、50、57和64天分别对小鼠眼眶静脉丛取血检测血清中TG水平。结果如图6所示。
图6为显示给予不同浓度的缀合物3或PBS后,血清TG水平随时 间变化的折线图。进一步地,各时间点的血清TG抑制率归纳于以下表9中:
表9 siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清TG抑制率
图6和表9的结果表明,在给药后不同时间点,不同浓度的缀合物3均能够降低小鼠血清中的TG水平,特别是,在9mg/kg的给药剂量下,仅给药一次,本公开的siRNA缀合物就能在64天的长时间内始终保持TG水平抑制率大于50%,且抑制率最高可达89.5%,显示出优异的血脂抑制能力。
实验例13 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对血脂的降低效果
选取血清TG含量>2mmol/L的人APOC3转基因小鼠Tg(APOC3)3707Bres(购自美国Jackson实验室)进行随机分组,每组8只,雌雄各半。分别向每组小鼠给予缀合物3、缀合物5以及PBS空白对照。所有动物根据体重计算药量,采用皮下注射方式单次给药,各siRNA缀合物的给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg和1mg/kg小鼠体重,给药体积为5ml/kg。各siRNA缀合物分别以PBS水溶液提供,根据给药剂量和给药体积,换算出缀合物应配制的浓度。向另外1组小鼠中的每一只给予1×PBS,给药体积为5ml/kg,作为空白对照组。
以给药时间点记为第1天,在第1、8、15、22、29、36、43天分别对小鼠眼眶静脉丛取血,每次100μL。采血后在室温下放置30min后,在4℃下,3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA,意大利)检测血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的含量。
标准化的血脂水平=(给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100%。
血脂水平的抑制率=(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100%。
其中,血脂是指总胆固醇(CHO)或甘油三酯(TG)。
图7A和图7B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物或PBS后,血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。进一步地,给予本公开的siRNA缀合物后,各时间点的小鼠血清TG抑制率和血清CHO抑制率归纳于以下表10A和表10B中:
表10A siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清TG抑制率
表10B siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清CHO抑制率
分析图7A、图7B以及表10A、表10B的结果可知,在给药后不同时间点,缀合物3和缀合物5能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平。并且在实验期间的43天时间内始终保持较高的抑制效果。特别是,3mg/kg剂量的缀合物3和缀合物5均显示出优异的小鼠血脂抑制效果,血清TG的最大抑制率均高于88%;血清CHO的最大抑制率分别为51.18%和57.41%。上述结果表明,本公开的siRNA缀合物能够在长时间内有效降低血脂水平,在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出优异的开发前景。
实验例14 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对血脂的降低效果
选取血清TG含量>2mmol/L的人APOC3转基因小鼠Tg(APOC3)3707Bres(购自美国Jackson实验室)进行随机分组,每组6只,雌雄各半。分别向每组小鼠给予缀合物1、缀合物2、参比缀合物1以及PBS空白对照。所有动物根据体重计算药量,采用皮下注射方式单次给药,各siRNA缀合物的给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg和1mg/kg小鼠体重,给药体积为5ml/kg。各siRNA缀合物分别以PBS水溶液提供,根据给药剂量和给药体积,换算出缀合物应配制的浓度。向另外1组小鼠中的每一只给予1×PBS,给药体积为5ml/kg,作为空白对照组。
以给药时间点记为第1天,在第1、8、15、22天分别对小鼠眼眶静脉丛取血,每次100μL。采血后在室温下放置30min后,在4℃下,3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA,意大利)检测血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的含量。
标准化的血脂水平=(给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100%。
血脂水平的抑制率=(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100%。
其中,血脂是指总胆固醇(CHO)或甘油三酯(TG)。
图8A和图8B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物、参比siRNA缀合物或PBS后,血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。进一步地,给予本公开的siRNA缀合物后,各时间点的小鼠血清TG抑制率和血清CHO抑制率归纳于以下表11A和表11B中:
表11A siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清TG抑制率
表11B siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清CHO抑制率
图8A、图8B以及表11A、表11B的结果表明,在给药后不同时间点,缀合物1和缀合物2能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平。并且在实验期间的22天时间内始终保持较高的抑制效果,并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比缀合物1相近的血脂水平降低效果。
特别是,3mg/kg剂量的缀合物1和缀合物2均显示出优异的小鼠血脂抑制效果,血清TG的最大抑制率均高于92%;血清CHO的最大抑制率分别为57.5%和54.9%。上述结果表明,本公开的siRNA缀合物能够在长时间内有效降低血脂水平,在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出优异的开发前景。
实验例15双链热解离温度Tm的测定
用1XPBS缓冲液将上述制备的siRNA1-siRNA7和参比siRNA1-参比siRNA7中的每一个分别配制为0.02mg/mL的溶液,作为供试品溶液。在配备有热式程序的Agilent cary300 UV分光光度计上的10mm路径长度石英比色皿中加入供试品溶液,在260nm波长下监测温度-吸光率曲线,其中加热速率为0.5℃/min,自20.0℃起始升温至95℃。双链热解离温度Tm按照分光光度计说明书由温度-吸光率曲线的一阶导数计算获得。Tm值结果如以下表12所示:
表12双链热解离温度Tm
siRNA | Tm(℃) | 参比siRNA | Tm(℃) | ΔTm(℃) |
siRNA1 | 80.97 | 参比siRNA1 | 78.06 | 2.91 |
siRNA2 | 80.02 | 参比siRNA2 | 78.12 | 1.90 |
siRNA3 | 79.07 | 参比siRNA3 | 76.32 | 2.75 |
siRNA4 | 80.17 | 参比siRNA4 | 77.98 | 2.19 |
siRNA5 | 78.22 | 参比siRNA5 | 76.26 | 1.96 |
siRNA6 | 89.26 | 参比siRNA6 | 87.93 | 1.33 |
siRNA7 | 90.07 | 参比siRNA7 | 87.98 | 2.09 |
其中,参比siRNA1-参比siRNA7依次为和siRNA1-siRNA7具有相同的碱基序列,但是在siRNA1-siRNA7中具有稳定化修饰的核苷酸的位置处为不具有任何修饰的核苷酸的siRNA:
ΔTm值(待测siRNA)=Tm(siRNA)-Tm(参比siRNA)。
根据表12的结果可知,与相同位置为未修饰的核苷酸的情况相比,本公开的包含稳定化修饰核苷酸的双链寡核苷酸及其缀合物具有更高的双链热解离温度,双链热解离温度升高至少1.33℃,其中升高最多的是siRNA1,其相较于参比siRNA升高了2.91℃。
以上详细描述了本公开的一些实施方式,但是,本公开并不限于上述实施方式中的具体细节,在本公开的技术构思范围内,可以对本公开的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是,在上述一些实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本公开的思想,其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (51)
- 一种siRNA,所述siRNA包含正义链和反义链,所述正义链包含核苷酸序列I,所述反义链包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸为修饰或未修饰的核苷酸,所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区,所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补,所述第一段核苷酸序列为载脂蛋白C3基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸,所述稳定化修饰核苷酸指核苷酸的核糖2'位羟基被稳定化修饰基团取代的核苷酸,与相应位置的核苷酸为未修饰的核苷酸的siRNA相比,包含所述稳定化修饰核苷酸的siRNA的热稳定性增加,并且所述稳定化修饰基团的空间位阻大于2'-O-甲基。
- 如权利要求1所述的siRNA,其中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的第3个或第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。
- 如权利要求1或2所述的siRNA,其中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的第3-9个核苷酸中不超过2个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。
- 如权利要求1-3中任意一项所述的siRNA,其中,所述siRNA的热稳定性增加是指所述siRNA的Tm升高,Tm为siRNA的双链热解离温度。
- 如权利要求4述的siRNA,其中,所述siRNA的热稳定性增加是指所述siRNA的Tm升高至少0.05℃。
- 如权利要求4所述的siRNA,其中,所述siRNA的热稳定性增加是指所述siRNA的Tm升高0.1-6℃。
- 如权利要求4所述的siRNA,其中,所述siRNA的热稳定性增加是指所述siRNA的Tm升高0.5-4℃。
- 如权利要求1-7中任意一项所述的siRNA,其中,每个所述稳定化修饰基团独立地具有-X-R所示的结构,其中,X为O、NR'、S或SiR' 2;R是C 2-C 6烷基、取代的C 2-C 6烷基、C 6-C 8芳基、取代的C 6-C 8芳基中的一种,每个R'独立地是H、C 1-C 6烷基、取代的C 1-C 6烷基、C 6-C 8芳基、取代的C 6-C 8芳基中的一种,所述取代的C 2-C 6烷基、取代的C 6-C 8芳基或取代的C 1-C 6烷基是指C 2-C 6烷基、C 6-C 8芳基或C 1-C 6烷基中的一个或多个氢原子被取代基取代而形成的基团,所述取代基选自以下取代基中的一种或多种:C 1-C 3烷基、C 6-C 8芳基、C 1-C 3烷氧基、卤素、氧亚基和硫亚基
- 如权利要求8所述的siRNA,其中,每个所述稳定化修饰基团独立地选自2'-O-甲氧基乙基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-O-2-N-甲基氨基-2-氧亚基乙基、2'-O-2-N,N-二甲基氨基乙基、2'-O-3-氨基丙基和2'-O-2,4-二硝基苯基中的一种。
- 如权利要求9所述的siRNA,其中,每个所述稳定化修饰基团为2'-O-甲氧基乙基。
- 如权利要求1-10中任意一项所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸差异,且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸差异:5'-CAAUAAAGCUGGACAAGAZ 1-3'(SEQ ID NO:1);5'-Z 2UCUUGUCCAGCUUUAUUG-3'(SEQ ID NO:2),其中,Z 1为A,Z 2为U,所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z 1的核苷酸Z 3,所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z 2的核苷酸Z 4,所述Z 4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸;或者,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸差异,且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸差异:5'-UUAAAAGGGACAGUAUUCZ 5-3'(SEQ ID NO:45);5'-Z 6GAAUACUGUCCCUUUUAA-3'(SEQ ID NO:46),其中,Z 5为U,Z 6为A,所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z 5的核苷酸Z 7,所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z 6的核苷酸Z 8,所述Z 8是所述反义链5'末端的第一个核苷酸;或者,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸差异,且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸差异:5'-GGACAGUAUUCUCAGUGCZ 9-3'(SEQ ID NO:105);5'-Z 10GCACUGAGAAUACUGUCC-3'(SEQ ID NO:106),其中,Z 9为U,Z 10为A,所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z 9的核苷酸Z 11,所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z 10的核苷酸Z 12,所述Z 8是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
- 如权利要求11所述的siRNA,其中,所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列;或者,所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列;或者,所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列。
- 如权利要求11或12所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异,和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异;或者,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异,和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异;或者,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异,和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示 的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
- 如权利要求13所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z 4位置处的差异,且Z 4选自A、G或C;或者,所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z 8位置处的差异,且Z 8选自G、C或U;或者,所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z 12位置处的差异,且Z 12选自G、C或U。
- 如权利要求11-14中任意一项所述的siRNA,其中,所述Z 3是与Z 4互补的核苷酸;或者所述Z 5是与Z 6互补的核苷酸;或者所述Z 8是与Z 7互补的核苷酸。
- 如权利要求1-15中任意一项所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列II与所述第一段核苷酸序列基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补;所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个碱基的错配;所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个碱基的错配;所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
- 如权利要求16所述的siRNA,其中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II的第2-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-18位的核苷酸完全反向互补。
- 如权利要求17所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补,或者按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向,所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。
- 如权利要求1-18中任意一项所述的siRNA,其中,所述正义链 和反义链长度相同或不同,所述正义链的长度为19-23个核苷酸,反义链的长度为19-26个核苷酸;并且所述核苷酸序列I是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,所述核苷酸序列II是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列:5'-CAAUAAAGCUGGACAAGAZ 3-3'(SEQ ID NO:3);5'-Z 4UCUUGUCCAGCUUUAUUG-3'(SEQ ID NO:4),其中,Z 3选自A、U、G或C,Z 4是与Z 3互补的核苷酸;或者,所述核苷酸序列I是SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列,所述核苷酸序列II是SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列:5'-UUAAAAGGGACAGUAUUCZ 7-3'(SEQ ID NO:47);5'-Z 8GAAUACUGUCCCUUUUAA-3'(SEQ ID NO:48),其中,Z 7选自A、U、G或C,Z 8是与Z 7互补的核苷酸;或者,所述核苷酸序列I是SEQ ID NO:107所示的核苷酸序列,所述核苷酸序列II是SEQ ID NO:108所示的核苷酸序列:5'-GGACAGUAUUCUCAGUGCZ 11-3'(SEQ ID NO:107);5'-Z 12GCACUGAGAAUACUGUCC-3'(SEQ ID NO:108),其中,Z 11选自A、U、G或C,Z 12是与Z 11互补的核苷酸。
- 如权利要求19所述的siRNA,其中Z 3为A,Z 4为U;或者Z 7为U,Z 8为A;或者Z 11为U,Z 12为A。
- 如权利要求1-20中任意一项所述的siRNA,其中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸,如果不是所述稳定化修饰核苷酸的话,为2'-氟代修饰的核苷酸。
- 如权利要求21所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列II中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸;按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸;按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸,如果不是所述稳定化修饰核苷酸的话,为2'-氟代修饰的核苷酸,所述核苷酸序列II中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种。
- 如权利要求1-22中任意一项所述的siRNA,其中,按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸。
- 如权利要求23所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列I中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸;按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸。
- 如权利要求24所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列I中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸;按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸,所述核苷酸序列I中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种。
- 如权利要求1-25中任意一项所述的siRNA,其中,所述正义链还含有核苷酸序列III,所述反义链还含有核苷酸序列IV,所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰,所述核苷酸序列III的长度为1个、2个、3个或4个核苷酸,所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III长度相等,并且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III实质上反向互补或完全反向互补,所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端,所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端,并且所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补,该第二段核苷酸序列是指和APOC3基因表达的mRNA中与第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
- 如权利要求26所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸的差异,并且,所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基为C,所述核苷酸序列IV的碱基为G;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为CC,所述核苷酸序列IV的碱基组成为GG;或者,所述核苷酸序列III和IV 的长度均为3个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为UCC,所述核苷酸IV的碱基组成为GGA;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为CUCC,所述核苷酸IV的碱基组成为GGAG。
- 如权利要求27所述的siRNA,其中,所述第二段核苷酸序列的长度为1个、2个、3个或4个核苷酸,并且碱基组成分别为C、CC、UCC或CUCC。
- 如权利要求26所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸的差异,并且,所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基为C,所述核苷酸序列IV的碱基为G;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为GC,所述核苷酸序列IV的碱基组成为GC;或者所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为UGC,所述核苷酸序列IV的碱基组成为GCA;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成为UUGC,所述核苷酸序列IV的碱基组成为GCAA。
- 如权利要求29所述的siRNA,其中,所述第二段核苷酸序列的长度为1个、2个、3个或4个核苷酸,并且碱基组成分别为C、GC、GCA或GCAA。
- 如权利要求26所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列长度相等,且不多于3个核苷酸的差异,并且,所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基是G,所述核苷酸序列IV的碱基是C;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成是AG,所述核苷酸序列IV的碱基组成是CU;或者,所述核苷酸序列III和IV 的长度均为3个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成是AAG,所述核苷酸序列IV的碱基组成是CUU;或者,所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸,所述核苷酸序列III的碱基组成是AAAG,所述核苷酸序列IV的碱基组成是CUUU。
- 如权利要求31所述的siRNA,其中,所述第二段核苷酸序列的长度为1个、2个、3个或4个核苷酸,并且碱基组成分别为G、AG、AAG或AAAG。
- 如权利要求1-32中任意一项所述的siRNA,其中,所述siRNA还含有寡核苷酸序列V,所述寡核苷酸序列V的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰核苷酸,所述核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸,连接在所述反义链的3'末端,从而构成所述反义链的3'突出端。
- 如权利要求33所述的siRNA,其中,所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸,并且按照5'末端到3'末端的方向,所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸、连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸、或者与第三段核苷酸序列完全反向互补,所述第三段核苷酸序列是指APOC3基因表达的mRNA中与第一段核苷酸序列或第二段核苷酸序列相邻、并且长度与所述核苷酸序列V相等的核苷酸序列。
- 如权利要求34所述的siRNA,其中,所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,所述第三段核苷酸序列的碱基组成是CC;或者,所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列,所述第三段核苷酸序列的碱基组成是GC;或者,所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列,所述第三段核苷酸序列的碱基组成是AG。
- 如权利要求1-35中任意一项所述的siRNA,其中,所述siRNA 的正义链含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列,所述反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列:5'-CAAUAAAGCUGGACAAGAZ 3-3'(SEQ ID NO:5);5'-Z 4UCUUGUCCAGCUUUAUUGGG-3'(SEQ ID NO:6),其中,所述Z 4是反义链5'末端的第一个核苷酸,Z 3选自A、U、G或C,并且Z 4是与Z 3互补的核苷酸;或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列,所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列:5'-CCCAAUAAAGCUGGACAAGAZ 3-3'(SEQ ID NO:7);5'-Z 4UCUUGUCCAGCUUUAUUGGGAG-3'(SEQ ID NO:8),其中,所述Z 4是反义链5'末端的第一个核苷酸,Z 3选自A、U、G或C,并且Z 4是与Z 3互补的核苷酸;或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列,所述反义链含有如SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列:5'-UUAAAAGGGACAGUAUUCZ 7-3'(SEQ ID NO:49);5'-Z 8GAAUACUGUCCCUUUUAAGC-3'(SEQ ID NO:50),其中,所述Z 8是反义链5'末端的第一个核苷酸,Z 7选自A、U、G或C,并且Z 8是与Z 7互补的核苷酸;或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列,所述反义链含有如SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列:5'-GCUUAAAAGGGACAGUAUUCZ 7-3'(SEQ ID NO:51);5'-Z 8GAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA-3'(SEQ ID NO:52),其中,所述Z 8是反义链5'末端的第一个核苷酸,Z 7选自A、U、G或C,并且Z 8是与Z 7互补的核苷酸;或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列,所述反义链含有如SEQ ID NO:149所示的核苷酸序列:5'-UUAAAAGGGACAGUAUUCZ 7-3'(SEQ ID NO:49);5'-Z 8GAAUACUGUCCCUUUUAAUU-3'(SEQ ID NO:149),其中,所述Z 8是反义链5'末端的第一个核苷酸,Z 7选自A、U、G或C,并且Z 8是与Z 7互补的核苷酸;或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:所示的核苷酸序列, 所述反义链含有如SEQ ID NO:150所示的核苷酸序列:5'-GCUUAAAAGGGACAGUAUUCZ 7-3'(SEQ ID NO:51);5'-Z 8GAAUACUGUCCCUUUUAAGCUU-3'(SEQ ID NO:150),其中,所述Z 8是反义链5'末端的第一个核苷酸,Z 7选自A、U、G或C,并且Z 8是与Z 7互补的核苷酸;或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:109所示的核苷酸序列,所述反义链含有如SEQ ID NO:110所示的核苷酸序列:5'-GGACAGUAUUCUCAGUGCZ 11-3'(SEQ ID NO:109);5'-Z 12GCACUGAGAAUACUGUCCCU-3'(SEQ ID NO:110),其中,所述Z 12是反义链5'末端的第一个核苷酸,Z 11选自A、U、G或C,并且Z 12是与Z 11互补的核苷酸;或者,所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:111所示的核苷酸序列,所述反义链含有如SEQ ID NO:112所示的核苷酸序列:5'-AGGGACAGUAUUCUCAGUGCZ 11-3'(SEQ ID NO:111);5'-Z 12GCACUGAGAAUACUGUCCCUUU-3'(SEQ ID NO:112),其中,所述Z 12是反义链5'末端的第一个核苷酸,Z 11选自A、U、G或C,并且Z 12是与Z 11互补的核苷酸。
- 如权利要求1-36中任意一项所述的siRNA,其中,每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸、或核苷酸类似物中的一种。
- 如权利要求1-37中任意一项所述的siRNA,其中,每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸,所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
- 如权利要求1-38所述的siRNA,其中,所述siRNA为siAPOC3a1-M1、siAPOC3a1-M2、siAPOC3a2-M1、siAPOC3a2-M2、siAPOC3b1-M1、siAPOC3b1-M2、siAPOC3b2-M1、siAPOC3b2-M2、siAPOC3b3-M1、siAPOC3b3-M2、siAPOC3b4-M1、siAPOC3b4-M2、siAPOC3c1-M1、siAPOC3c1-M2、siAPOC3c2-M1和siAPOC3c2-M2中的 一种。
- 如权利要求1-38中任意一项所述的siRNA,其中,所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的至少1个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基,所述具有修饰基团的磷酸酯基存在于由以下位置组成的组中的至少一处:所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间;所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间;所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间;所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间;所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间;所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间;所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间;以及所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
- 如权利要求40所述的siRNA,其中,所述siRNA为siAPOC3a1-M1S、siAPOC3a1-M2S、siAPOC3a2-M1S、siAPOC3a2-M2S、siAPOC3b1-M1S、siAPOC3b1-M2S、siAPOC3b2-M1S、siAPOC3b2-M2S、siAPOC3b3-M1S、siAPOC3b3-M2S、siAPOC3b4-M1S、siAPOC3b4-M2S、siAPOC3c1-M1S、siAPOC3c1-M2S、siAPOC3c2-M1S和siAPOC3c2-M2S中的一种。
- 如权利要求1-38和40中任意一项所述的siRNA,其中,所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
- 如权利要求42所述的siRNA,其中,所述siRNA为siAPOC3a1-M1P1、siAPOC3a1-M2P1、siAPOC3a2-M1P1、siAPOC3a2-M2P1、siAPOC3a1-M1SP1、siAPOC3a1-M2SP1、siAPOC3a2-M1SP1、siAPOC3a2-M2SP1、siAPOC3b1-M1P1、siAPOC3b1-M2P1、siAPOC3b2-M1P1、siAPOC3b2-M2P1、 siAPOC3b1-M1SP1、siAPOC3b1-M2SP1、siAPOC3b2-M1SP1、siAPOC3b2-M2SP1、siAPOC3b3-M1P1、siAPOC3b3-M2P1、siAPOC3b4-M1P1、siAPOC3b4-M2P1、siAPOC3b3-M1SP1、siAPOC3b3-M2SP1、siAPOC3b4-M1SP1、siAPOC3b4-M2SP1、siAPOC3c1-M1P1、siAPOC3c1-M2P1、siAPOC3c2-M1P1、siAPOC3c2-M2P1、siAPOC3c1-M1SP1、siAPOC3c1-M2SP1、siAPOC3c2-M1SP1和siAPOC3c2-M2SP1中的一种。
- 一种药物组合物,该药物组合物含有权利要求1-43中任意一项所述的siRNA以及药学上可接受的载体。
- 一种siRNA缀合物,所述siRNA缀合物含有权利要求1-43中任意一项所述的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团,所述缀合基团包含接头和药学上可接受的靶向基团,并且,所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接,每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体。
- 权利要求1-43中任意一项所述的siRNA、和/或权利要求44所述的药物组合物和/或权利要求45所述的siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防与APOC3基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的药物中的用途。
- 如权利要求46所述的用途,其中所述与APOC3基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状是血脂异常。
- 一种治疗和/或预防与APOC3基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的方法,所述方法包括向有需要的受试者给予权利要求1-43中任意一项所述的siRNA,和/或权利要求44所述的药物组合物和/或权利要求45所述的siRNA缀合物。
- 如权利要求48所述的方法,其中,所述与APOC3基因表达的 mRNA水平相关的疾病或症状是血脂异常。
- 一种抑制细胞中APOC3基因表达水平的方法,所述方法包括将有效剂量的权利要求1-43中任意一项所述的siRNA,和/或权利要求44所述的药物组合物和/或权利要求45所述的siRNA缀合物与所述细胞接触。
- 一种试剂盒,所述试剂盒包含权利要求1-43中任意一项所述的siRNA,和/或权利要求44所述的药物组合物和/或权利要求45所述的siRNA缀合物。
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