CN116375774A - 缀合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

一种用于与活性剂例如寡核苷酸形成缀合物的化合物，该化合物具有如式(321)所示的结构。本公开还提供了相应的缀合物。本公开的缀合物能够特异性地靶向肝细胞，从而有效解决寡核苷酸药物的体内递送的相关问题，毒性低，并在保持所递送的寡核苷酸高度稳定的同时，还具有优异的递送效率；
Figure DDA0004119470680000011

Description

缀合物及其制备方法和用途
本申请是申请日2018年11月29日、申请号201880049520.8、发明名称为“缀合物及其制备方法和用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本公开涉及药物领域，具体而言涉及一种用于通过与活性药物形成缀合物来递送活性药物的化合物及其制备方法和用途。本公开还涉及由该化合物形成的缀合物。
背景技术
递送***是小核酸药物开发中的关键技术之一，一种小核酸递送***是针对肝细胞的靶向缀合递送技术。
发明内容
根据本发明的一方面，本公开提供了一种化合物，该化合物具有式(321)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000011
其中：
n1为1-3的整数，n3为0-4的整数；
每个m1、m2和m3各自独立地为2-10的整数；R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基和C1-C10烷氧基；
R4为能够通过共价键与活性药物或活性剂结合的基团；
每个L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个S1独立地为M1，其中任何活性羟基，如果有的话，都被羟基保护基团保护；
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。
在一些实施方式中，每个L1独立地选自于由基团A1-A26及其任意组合所组成的组：
Figure BDA0004119470660000021
Figure BDA0004119470660000031
Figure BDA0004119470660000032
以及/>
Figure BDA0004119470660000033
其中，每个j1独立地为1-20的整数；
每个j2独立地为1-20的整数；
每个R’独立地为C1-C10烷基；
每个Ra独立地选自于由A27-A45及其任意组合所组成的组：
Figure BDA0004119470660000034
Figure BDA0004119470660000041
每个Rb独立地为C1-C10烷基；
Figure BDA0004119470660000042
表示基团连接至分子其余部分的位点；
在本发明的一个方面，本公开提供了一种缀合物，该缀合物具有式(1)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000043
其中：
n1为1-3的整数，n3为0-4的整数；
m1、m2和m3各自独立地为2-10的整数；
R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
R3为活性药物；
R2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于由以下所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，R2任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个L1独立地为长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个M1选自能够和细胞表面受体结合的配体之一。
在一些实施方式中，每个L1独立地选自于由基团A1-A26及其任意组合所组成的组：
Figure BDA0004119470660000061
Figure BDA0004119470660000071
以及/>
Figure BDA0004119470660000072
其中，每个j1独立地为1-20的整数；
每个j2独立地为1-20的整数；
每个R’独立地为C1-C10烷基；
每个Ra独立地选自式A27-A45基团及其任意组合：
Figure BDA0004119470660000073
Figure BDA0004119470660000081
每个Rb独立地为C1-C10烷基；
Figure BDA0004119470660000082
表示基团连接至分子其余部分的位点。
在本发明的一个方面，本文提供了一种本文公开的缀合物在用于制备治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状态或疾病的药物中的应用。
在本发明的一个方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者中因肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状态或疾病的方法，该方法包括向受试者给予有效剂量的本文公开的缀合物。
在本发明的一个方面，本文提供了一种抑制在肝细胞中特定基因的表达的方法，该方法包括和本文公开的缀合物接触。
在本发明的一个方面，本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本文公开的缀合物。
不受限制地，本公开的一些以及其他技术方案示于以下段落1至段落112中：
段落1：一种化合物，所述化合物具有式(321)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000083
其中，
n1为1-3的整数，n3为0-4的整数；
每个m1、m2和m3各自独立地为2-10的整数；
每个R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基和C1-C10烷氧基；
R4为能够通过共价键与活性药物或活性剂结合的基团；
每个L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个S1独立地为M1，其中任何活性羟基，如果有的话，都被羟基保护基团保护；
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。
段落2：根据段落1所述的化合物，其中，每个L1独立地选自于由基团A1-A26及其任意组合所组成的组：
Figure BDA0004119470660000091
Figure BDA0004119470660000101
其中，每个j1独立地为1-20的整数；
每个j2独立地为1-20的整数；
每个R’独立地为C1-C10烷基；
每个Ra独立地选自于由基团A27-A45及其任意组合所组成的组：
Figure BDA0004119470660000102
/>
Figure BDA0004119470660000111
每个Rb独立地为C1-C10烷基；
Figure BDA0004119470660000112
表示基团连接至分子其余部分的位点。
段落3：根据段落2所述的化合物，其中，L1选自于由基团A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13及其连接组合所组成的组。
段落4：根据段落3所述的化合物，其中，L1为基团A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合。
段落5：根据段落4所述的化合物，其中，L1为基团A1、A8和A10中至少2个的连接组合。
段落6：根据段落1-5中任意一项所述的化合物，其中，L1的长度为3-25个原子，其中所述L1的长度指L1中由与含氮骨架中的N原子连接的原子到与S1连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数。
段落7：根据段落6所述的化合物，其中，L1的长度为4-15个原子。
段落8：根据段落1所述的化合物，其中，j1为2-10的整数，j2为2-10的整数，R’为C1-C4烷基，Ra选自于由A27、A28、A29、A30和A31所组成的组，Rb为C1-C5烷基。
段落9：根据段落8所述的化合物，其中，j1为3-5的整数，j2为3-5的整数，R’为甲基、乙基或异丙基，Ra为A27或A28，Rb为甲基、乙基、异丙基或丁基。
段落10：根据段落1所述的化合物，其中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3。
段落11：根据段落1所述的化合物，其中，每个m1、m2和m3各自独立地为2-5的整数。
段落12：根据段落11所述的化合物，其中，m1＝m2＝m3。
段落13：根据段落1所述的化合物，其中，受保护的羟基具有YCOO-结构，其中每个Y独立地选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基和C6-C10芳基，其任选地具有一个或多个取代基，所述取代基选自于由卤素取代基和C1-C6烷基所组成的组。
段落14：根据段落13所述的化合物，其中，每个Y独立地选自于由以下基团所组成的组：甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基和C1-C6烷基苯基。
段落15：根据段落1所述的化合物，其中，每个M1独立地为糖。
段落16：根据段落1所述的化合物，其中，每个M1独立地为单糖、二糖、三糖或多糖。
段落17：根据段落1所述的化合物，其中，至少一个M1为经修饰的。
段落18：根据段落1所述的化合物，其中，每个M1独立地选自于由以下所组成的组：D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖和L-4-硫代核糖。
段落19：根据段落18所述的化合物，其中，至少一个M1为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。
段落20：根据段落18所述的化合物，其中，每个M1都是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。
段落21：根据段落1所述的化合物，其中，每个S1独立地为基团A46-A54中的一种：
Figure BDA0004119470660000131
段落22：根据段落21所述的化合物，其中，S1为A49或A50。
段落23：根据段落21或22所述的化合物，其中，Y为甲基。
段落24：根据段落求1所述的化合物，其中，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地为H、甲基或乙基。
段落25：根据段落1所述的化合物，其中，R4是能够通过磷酸二酯键连接到寡核苷酸的基团。
段落26：根据段落1所述的化合物，其中，R4包括第1官能团，所述第1官能团可以与寡核苷酸或核苷酸上的基团反应以形成磷酸酯键。
段落27：根据段落26所述的化合物，其中，R4还包括第2官能团，所述第2官能团能够和羟基基团或氨基基团形成共价键，或者为通过与羟基基团或氨基基团形成的共价键而连接于分子其余部分的固相载体。
段落28：根据段落26所述的化合物，其中，所述第1官能团为亚磷酰胺、羟基或受保护的羟基。
段落29：根据段落26所述的化合物，其中，所述第2官能团为亚磷酰胺、羧基或羧酸盐。
段落30：根据段落27所述的化合物，其中，所述固相载体通过磷酸酯键、羧酸酯键和/或酰胺键连接于分子的其余部分。
段落31：根据段落30所述的化合物，其中，所述固相载体为树脂。
段落32：根据段落28所述的化合物，其中，所述羧酸盐为带有金属阳离子、铵盐、三级胺或季铵离子的羧酸盐。
段落33：根据段落32所述的化合物，其中，所述羧酸盐为三乙胺羧酸盐或N,N-二异丙基乙胺羧酸盐。
段落34：根据段落26所述的化合物，其中，R4包括羟基、-ORk或者由式(C3)所示的基团：
Figure BDA0004119470660000141
其中，Rk为羟基保护基团，
Figure BDA0004119470660000142
表示基团连接至分子其余部分的位点。
段落35：根据段落27所述的化合物，其中，R4包括由式(C1)、(C2)、(C3)、(C1’)或(C3’)表示的基团：
Figure BDA0004119470660000151
式中，q1为1-4的整数，X为O或NH，M+为阳离子，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体，
Figure BDA0004119470660000152
表示基团连接至分子其余部分的位点。
段落36：根据段落26或27所述的化合物，其中，R4具有由式(B9)、(B10)、(B11)、(B12)、(B9’)、(B10’)、(B11’)或(B12’)表示的结构：
Figure BDA0004119470660000153
Figure BDA0004119470660000161
其中，q1为1-4的整数，q2为1-10的整数，X为O或NH，M+为阳离子，SPS表示固相载体，Rk为羟基保护基团，
Figure BDA0004119470660000162
表示基团连接至分子其余部分的位点。
段落37：根据段落36所述的化合物，其中，q2为1-5的整数；q1为1或2。
段落38：根据段落26所述的化合物，其中，该化合物具有式(403)-(442)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000163
/>
Figure BDA0004119470660000171
/>
Figure BDA0004119470660000181
/>
Figure BDA0004119470660000191
/>
Figure BDA0004119470660000201
/>
Figure BDA0004119470660000211
/>
Figure BDA0004119470660000221
/>
Figure BDA0004119470660000231
/>
Figure BDA0004119470660000241
/>
Figure BDA0004119470660000251
/>
Figure BDA0004119470660000261
/>
Figure BDA0004119470660000271
其中，X为O或NH，M+为阳离子，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体。段落39：根据段落34-38中任一项所述的化合物，其中，M+为碱金属阳离子、铵阳离子、三级胺形成的阳离子或季铵阳离子，Rk为三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-双甲氧基三苯甲基或4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基，SPS表示树脂。
段落40：根据段落1所述的化合物，其中，所述受体为肝细胞表面受体。
段落41：根据段落1所述的化合物，其中，所述受体为哺乳动物细胞表面的受体。
段落42：根据段落1所述的化合物，其中，所述受体为人肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体。
段落43：一种缀合物，所述缀合物具有式(1)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000281
其中，
n1为1-3的整数，n3为0-4的整数；
每个m1、m2和m3各自独立地为2-10的整数；
每个R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基和C1-C10烷氧基；
R3为活性药物；
R2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，R2任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个L1独立地是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个M1选自能够和细胞表面受体结合的配体之一。
段落44：根据段落43所述的缀合物，其中，每个L1独立地选自于由基团A1-A26及其任意组合所组成的组：
Figure BDA0004119470660000291
/>
Figure BDA0004119470660000301
其中，每个j1独立地为1-20的整数；
每个j2独立地为1-20的整数；
每个R’独立地为C1-C10烷基；
每个Ra独立地选自于由A27-A45及其任意组合所组成的组：
Figure BDA0004119470660000302
/>
Figure BDA0004119470660000311
每个Rb独立地为C1-C10烷基；
Figure BDA0004119470660000312
表示基团连接至分子其余部分的位点。
段落45：根据段落43所述的缀合物，其中，L1选自于由基团A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13及其连接组合所组成的组。
段落46：根据段落45所述的缀合物，其中，L1为基团A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合。
段落47：根据段落46所述的缀合物，其中，L1为基团A1、A8和A10中至少2个的连接组合。
段落48：根据段落43-47中任一项所述的缀合物，其中，L1的长度为3-25个原子。
段落49：根据段落48所述的缀合物，其中，L1的长度为4-15个原子。
段落50：根据段落43所述的缀合物，其中，j1为2-10的整数，j2为2-10的整数，R’为C1-C4烷基，Ra选自A27、A28、A29、A30和A31，Rb为C1-C5烷基。
段落51：根据段落50所述的缀合物，其中，j1为3-5的整数，j2为3-5的整数，R’为甲基、乙基或异丙基，Ra为A27或A28，Rb为甲基、乙基、异丙基或丁基。
段落52：根据段落43所述的缀合物，其中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3。
段落53：根据段落43所述的缀合物，其中，m1、m2和m3各自独立地为2-5的整数。
段落54：根据段落53所述的缀合物，其中，m1＝m2＝m3。
段落55：根据段落43所述的缀合物，其中，每个M1独立地为糖。
段落56：根据段落43所述的缀合物，其中，每个M1独立地为单糖、二糖、三糖或多糖。
段落57：根据段落43所述的缀合物，其中，至少一个M1为经修饰的。
段落58：根据段落43所述的缀合物，其中，每个M1独立地选自于由以下所组成的组：D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖和L-4-硫代核糖。
段落59：根据段落58所述的缀合物，其中，至少一个M1为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
段落60：根据段落58所述的缀合物，其中，每个M1均为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
段落61：根据段落43所述的缀合物，其中，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地为H、甲基或乙基。
段落62：根据段落43所述的缀合物，其中，R3包括功能性寡核苷酸。
段落63：根据段落62所述的缀合物，其中，R3为具有式A59所示结构的基团：
Figure BDA0004119470660000331
其中，E1为OH、SH或BH2，Nu为功能性寡核苷酸。
段落64：根据段落63所述的缀合物，其中，R2连接到R3上的P原子。
段落65：根据段落63所述的缀合物，其中，R2与R3中的P原子形成磷酸酯键。
段落66：根据段落43所述的缀合物，其中，R2为B5、B6、B5’或B6’：
Figure BDA0004119470660000332
其中，
Figure BDA0004119470660000333
表示基团连接至分子其余部分的位点，q2为1-10的整数。
段落67：根据段落66所述的缀合物，其中，所述缀合物具有式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)或(22)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000334
/>
Figure BDA0004119470660000341
/>
Figure BDA0004119470660000351
/>
Figure BDA0004119470660000361
/>
Figure BDA0004119470660000371
/>
Figure BDA0004119470660000381
段落68：根据段落63所述的缀合物，其中，所述功能性寡核苷酸选自于由以下所组成的组：小干扰RNA、微小RNA、抗微小RNA、微小RNA拮抗剂、微小RNA模拟物、诱饵寡核苷酸、免疫刺激物、G-四极子、可变剪接体、单链RNA、反义核酸、核酸适配体、茎环RNA、mRNA片段、激活RNA或DNA。
段落69：根据段落68所述的缀合物，其中，所述功能性寡核苷酸为单链寡核苷酸或者双链寡核苷酸。
段落70：根据段落69所述的缀合物，其中，所述功能性寡核苷酸为单链寡核苷酸，式A59中的P原子连接到所述单链寡核苷酸的末端区域，所述单链寡核苷酸的末端区域指最靠近所述单链寡核苷酸一端的4个核苷酸。
段落71：根据段落70所述的缀合物，其中，式A59中的P原子连接到所述单链寡核苷酸的末端。
段落72：根据段落71所述的缀合物，其中，式A59中的P原子连接到所述单链寡核苷酸的3'末端。
段落73：根据段落69所述的缀合物，其中，所述功能性寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述式A59中的P原子连接到所述双链寡核苷酸的末端区域，所述双链寡核苷酸的末端区域指最靠近所述正义链或所述反义链一端的4个核苷酸。
段落74：根据段落73所述的缀合物，其中，式A59中的P原子连接到所述正义链或所述反义链的末端。
段落75：根据段落74所述的缀合物，其中，式A59中的P原子连接到所述正义链的3'末端。
段落76：根据段落69-75中任一项所述的缀合物，其中，式A59中的P原子通过磷酸二酯键连接至所述功能性寡核苷酸中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。
段落77：根据段落69和73-75中任一项所述的缀合物，其中，所述双链寡核苷酸为siRNA。
段落78：根据段落77所述的缀合物，其中，所述siRNA中的每个核苷酸独立地为修饰或未修饰的核苷酸；所述siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为19个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成双链互补区；所述核苷酸序列2与第一段核苷酸序列至少部分互补，所述第一段核苷酸序列为靶mRNA中的一段核苷酸；所述靶mRNA指在肝细胞中异常表达的基因的mRNA。
段落79：根据段落78所述的缀合物，其中，所述靶mRNA为对应于ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV或HCV的mRNA。
段落80：根据段落79所述的缀合物，其中，所述靶mRNA选自乙型肝炎病毒的mRNA、血管生成素样蛋白3基因转录的mRNA或者载脂蛋白C3基因转录的mRNA。
段落81：根据段落78所述的缀合物，其中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列2与核苷酸序列B长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列B为与所述第一段核苷酸序列完全反向互补的核苷酸序列。
段落82：根据段落81所述的缀合物，其中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B不多于1个核苷酸差异。
段落83：根据段落81或82所述的缀合物，其中，所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B之间的核苷酸差异包括按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一个核苷酸Z'位置上的差异。
段落84：根据段落83所述的缀合物，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1上最后的核苷酸Z是与Z'互补的核苷酸。
段落85：根据段落78所述的缀合物，其中，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互补、基本上完全反向互补或完全反向互补。
段落86：根据段落78所述的缀合物，其中，所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4；所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度相等且均为1-4个核苷酸；所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端；所述核苷酸序列4与第二段核苷酸序列互补；所述第二段核苷酸序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列；并且所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4基本上完全反向互补或完全反向互补。
段落87：根据段落78或86所述的缀合物，其中，所述siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端。
段落88：根据段落87所述的缀合物，其中，所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'到3'的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与第三段核苷酸序列互补；所述第三段核苷酸序列指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列或所述第二段核苷酸序列相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。
段落89：根据段落78-82、84-86和88中任一项所述的缀合物，其中，所述正义链或反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。
段落90：根据段落89所述的缀合物，其中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸；所述非氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，核苷酸类似物为能够替换核酸上核苷酸的基团，并具有与腺嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸或胸腺嘧啶核苷酸中任何一个不同的结构。
段落91：根据段落90所述的缀合物，其中，正义链和反义链均包含氟代修饰的核苷酸和非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸存在于核苷酸序列1和核苷酸序列2中，所述核苷酸序列1中氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1的第7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列2中氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
段落92：根据段落91所述的缀合物，其中，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列1的第7、8和9位或者第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸。
段落93：根据段落90或92所述的缀合物，其中，所述核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自于由以下所组成的组：2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸和2'-脱氧核苷酸(DNA)；所述核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA。
段落94：根据段落93所述的缀合物，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，其中所述甲氧基修饰的核苷酸指所述核苷酸中核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
段落95：根据段落89所述的缀合物，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
段落96：根据段落95所述的缀合物，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有式(201)所示结构的硫代磷酸酯基：
Figure BDA0004119470660000421
段落97：根据段落95所述的缀合物，其中，所述siRNA中，硫代磷酸酯连接存在于以下至少一处：
所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
段落98：根据段落89、90或95所述的缀合物，其中，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
段落99：根据段落98所述的缀合物，其中，所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为式(202)-式(206)之一表示的核苷酸：
Figure BDA0004119470660000422
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团，Base表示选自A、U、C、G和T的碱基。
段落100：根据段落99所述的缀合物，其中，所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为由式(202)、式(203)或式(205)表示的核苷酸。
段落101：根据段落43-100中任一个所述的缀合物在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
段落102：根据段落101所述的用途，其中，所述特定基因选自于由以下基因所组成的组：乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因和载脂蛋白C3基因。
段落103：根据段落101所述的用途，其中，所述疾病选自于由以下疾病所组成的组：慢性肝病、肝炎、肝纤维化、肝增生性疾病和血脂异常。
段落104：根据段落103所述的用途，其中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
段落105：一种治疗在有需要的受试者中由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的段落43-100中任一项所述的缀合物。
段落106：根据段落105所述的方法，其中，所述特定基因选自于由以下基因所组成的组：乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因和载脂蛋白C3基因。
段落107：根据段落105所述的方法，其中，所述疾病选自于由以下疾病所组成的组：慢性肝病、肝炎、肝纤维化、肝增生性疾病和血脂异常。
段落108：根据段落107所述的方法，其中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
段落109：一种抑制肝细胞中特定基因表达的方法，所述方法包括将段落43-100中任一项所述的缀合物与所述肝细胞进行接触。
段落110：根据段落109所述的方法，其中，所述特定基因为ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV或HCV。
段落111：根据段落110所述的方法，其中，所述特定基因选自于由以下基因所组成的组：乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因和载脂蛋白C3基因。
段落112：一种试剂盒，所述试剂盒包含段落43-100中任一项所述的缀合物。
本公开的其他特征和优点将在后文予以详细说明。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
附图说明
所附的权利要求中详细的阐述了本发明的新颖特征，本发明的特点和优点将通过以下阐述了说明性实施方案的详细描述以及附图得到更好的理解，这些说明性实施方案利用本发明的原理，其中附图为：
图1A和1B示出了siRNA缀合物在体外Tritosome中的稳定性试验的半定量结果。
图2A和2B示出了测试siRNA缀合物在体外人血浆中的稳定性试验的半定量结果。
图3A和3B示出了测试siRNA缀合物在体外猴血浆中的稳定性试验的半定量结果。
图4-11为示出以下PK/TK血浆浓度或组织浓度的经时代谢曲线：10mg/kg剂量下，缀合物24在大鼠血浆中(图4)；10mg/kg剂量下，缀合物24在大鼠肝和肾中(图5)；50mg/kg剂量下，缀合物24在大鼠血浆中(图6)；50mg/kg剂量下，缀合物24在大鼠肝和肾中(图7)；10mg/kg剂量下，缀合物25在大鼠血浆中(图8)；10mg/kg剂量下，缀合物25在大鼠肝和肾中(图9)；50mg/kg剂量下，缀合物25在大鼠血浆中(图10)；50mg/kg剂量下，缀合物25在大鼠肝和肾中(图11)。
图12A，12B，12C和12D分别示出了缀合物24抑制GSCM表达的IC50值的测定，分别对照GSSM、PSCM和PSSM。
图13-15示出了本公开的缀合物在体内对HBV mRNA的抑制作用。
图16示出了本公开的缀合物对HBV转基因小鼠血清中HBsAg表达的随时间变化的抑制作用。
图17示出了本公开的缀合物对HBV转基因小鼠血清中HBV DNA表达的随时间变化的抑制作用。
图18示出了本公开的缀合物25对HBV转基因小鼠血清中HBsAg表达的随时间变化的抑制作用。
图19示出了本公开的缀合物对M-Tg模型中HBsAg表达的随时间变化的抑制作用。
图20示出了本公开的缀合物对M-Tg模型中HBsAg表达的随时间变化的抑制作用。
图21示出了本公开的缀合物对1.28copy HBV-Tg模型中HBsAg表达的随时间变化的抑制作用。
图22-24示出了本公开的缀合物对靶mRNA相对于脱靶mRNA的抑制作用。
图25-27示出了本公开的缀合物在体内对HBV mRNA的抑制作用。
图28示出了本公开的缀合物对HBV转基因小鼠血清中HBsAg表达的随时间变化的抑制作用。
图29示出了本公开的缀合物对HBV转基因小鼠血清中HBsAg表达的随时间变化的抑制作用。
图30示出了本公开的缀合物在第85天时对HBV mRNA的体内抑制作用。
图31示出了缀合物43对HBV转基因小鼠血清中HBsAg表达的随时间变化的抑制作用。
图32示出了缀合物43对HBV转基因小鼠血清中HBV DNA表达的随时间变化的抑制作用。
图33和34示出了缀合物167在人源和鼠源溶酶体裂解液中的稳定性。
图35示出了缀合物168在1.28copy HBV-Tg模型中对HBsAg表达的随时间变化的抑制作用。
图36示出了缀合物168在1.28copy HBV-Tg模型中对HBeAg表达的随时间变化的抑制作用。
图37示出了缀合物168在1.28copy HBV-Tg模型中对HBV DNA表达的随时间变化的抑制作用。
图38A和38B示出了在第14天和第28天时的ANGPTL mRNA表达的抑制率。
图39A和39B示出了本公开的缀合物对血脂的抑制率，以血清中的总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)表示。
图40A和40B示出了缀合物115对血脂的随时间变化的抑制率，以血清总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)表示。
图41A和41B示出了缀合物115和111对血脂的随时间变化的抑制率，以血清总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)表示。
图42A、42B、42C和42D示出了缀合物111在不同剂量下对血脂的随时间变化的抑制率，以血清总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)表示。
图43A和43B示出了缀合物25和169对血脂的随时间变化的抑制率，以血清总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)表示；图43C示出了ANGPTL mRNA表达的抑制率。
图44A示出了在第14天时，肝中APOC3表达的抑制率，图44B和44C示出了不同剂量的缀合物144对血脂的抑制率，以血清总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)表示。
图45A和图45B示出了不同剂量的缀合物170对血脂的抑制率，以血清总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)表示。
图46A、46B、46C和46D示出了本公开的缀合物对血脂的抑制率，以血清总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)表示。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，而不旨在在任何方面限制本公开。
定义
在本公开的上下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U和A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，尤指乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以VP表示)、5'-磷酸核苷酸(以下实施例中以P表示)或5'-硫代磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以Ps表示)。
在本公开的上下文中，表述“互补”或“反向互补”可互相替代使用，并具有本领域中众所周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(G)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(C)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是互补的，链的碱基序列可从其互补链的序列推断出来。与此相应地，“错配”指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补配对的形式存在。
在本公开的上下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指两段核苷酸序列中存在不多于3个的碱基错配；“基本上完全反向互补”是指两段核苷酸序列中存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”指两段核苷酸序列中不存在碱基错配。
在本公开的上下文中，一条核苷酸序列与另外一条核苷酸序列之间的“核苷酸差异”指核苷酸序列间相同位置的核苷酸的碱基发生了改变，例如，在第二序列中核苷酸碱基为A，而在第一序列相同位置处的碱基为U、C、G或者T的情况下，认为两序列之间在该位置处存在核苷酸差异。在一些实施方式中，以无碱基核苷酸或者核苷酸类似物代替某位置的核苷酸时，也认为在该位置处存在核苷酸差异。
在本公开文中，特别是在描述制备本公开所述的缀合分子或siRNA缀合物的方法时，除非另有说明，核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的RNA序列，所述“未修饰或修饰RNA亚磷酰胺(unmodified or modified RNA phosphoramidite)”，分别用于所谓的固相亚磷酰胺合成，固相亚磷酰胺合成是本领域合成RNA众所周知的方法。在文中其他地方RNA亚磷酰胺也被称为核苷亚磷酰胺(nucleoside phosphoramidite)。本公开所使用的核苷单体均可商购得到。
如本文所使用的，不介于两个字母之间或两个符号之间的短横(“-”)是用于指示取代基连接点。例如：-C1-C10烷基-NH2通过C1-C10烷基而连接。
如本文所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或状况发生的情况和不发生的情况。例如，“任选地取代的烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”。本领域技术人员会理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不旨在引入空间上不现实、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，通常为1至20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一分子氢而获得的。该基团关于双键可以为顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两分子氢而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的子集，指的是与炔基相同、但有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指通过从环碳原子上去除氢原子而衍生自芳香族单环或多环烃环***的基团。所述芳香族单环或多环烃环***仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环***中的至少一个环是完全不饱和的，即，其包含根据Hückel理论的环状、离域的(4n+2)π-电子体系。芳基包括但不限于诸如苯基、芴基和萘基的基团。亚芳基是芳基的子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“环烷基”是指非芳香族碳环，其通常具有3至7个环碳原子。环可以是饱和的，或具有一个或多个碳-碳双键。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基，以及桥联和笼状环基团，如降冰片烷(norbornane)。
如本文所使用的，“卤素取代基”或“卤素”指氟代、氯代、溴代和碘代，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
如本文所使用的，“卤代烷基”是指指定数量的碳原子被一个或多个、直至最大允许数量的卤素原子取代的如上述所定义的烷基。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。
“杂环基”是指稳定的3至18元非芳香族环基，其包含2-12个碳原子和选自氮、氧和硫的1-6个杂原子。除非说明书中另有说明，否则杂环基是单环、双环、三环或四环***，可包括稠环或桥环***。杂环基中的杂原子可以任选地被氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂环基是部分饱和或完全饱和的。杂环基可以通过任何环原子连接至分子的其余部分。此类杂环基的实例包括但不限于：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫酰基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧杂哌嗪基、2-氧杂哌啶基、2-氧杂吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫酰基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫杂吗啉基、1-氧代硫吗啉基和1,1-二氧代硫吗啉基。
“杂芳基”指由3至18元芳香族环自由基衍生的基团，其包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环***，其中环***中的至少一个环是完全不饱和的，即，其包含根据Hückel理论的环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环***。杂芳基中的杂原子被任选地氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂芳基通过任何环原子连接至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基、1,4-苯并二噁烷基、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并***基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基、5,6-二氢苯并[h]噌啉基、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基、萘啶基、1,6-萘啶酮基、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基、噁唑基、氧杂环丙烷基、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、***基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基和苯硫基(即噻吩基)。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能团对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能团上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版，第二章，John Wiley&Sons，New York，1991中，其各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本发明的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”、“减轻”或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在患者中观察到改善而获得，尽管患者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的，“防止”和“预防”可互换使用。这些术语指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将缀合物或组合物给予有罹患特定疾病风险的患者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
缀合分子
在一个方面，本文公开了一种用于递送活性剂或活性药物的缀合分子。在一些实施方式中，本文公开的缀合分子用于组织特异性靶向。在一些实施方式中，本文公开的缀合分子与细胞表面受体结合。为此目的，任何细胞表面受体或生物标志物或其一部分都被认为是合适的。在一些实施方式中，本文公开的缀合分子特异性地结合到特定组织的特有受体，从而实现组织特异性靶向。在一些实施方式中，本文公开的缀合分子特异性靶向肝细胞表面受体，从而特异性靶向肝组织。在一些实施方式中，本文公开的缀合分子特异性靶向肝细胞特有的细胞表面受体。在一些实施方式中，本文公开的缀合分子特异性靶向肝表面的去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)。
如本文所使用的，“活性剂”和“活性药物”可互换使用，都是指能够通过本文公开的缀合分子递送的分子。在一些实施方式中，活性剂为期望递送到肝细胞的试剂。这些试剂为本领域技术人员所熟知的，包括但不限于功能性核苷酸，如功能性寡核苷酸，特别是本文公开的那些。
在一些实施方式中，本公开提供了一种缀合分子，该缀合分子具有式(321)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000511
其中：
n1为1-3的整数，n3为0-4的整数；
m1、m2和m3各自独立地为2-10的整数；R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基和C1-C10烷氧基；
R4为能够通过共价键与活性药物或活性剂结合的基团；
每个L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个S1独立地为M1，其中任何活性羟基，如果有的话，都被羟基保护基团保护；
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。
在一些实施方式中，n1可为1-3的整数，n3可为0-4的整数，从而保证所述缀合分子中至少存在2个S1基团；在一些实施方式中，n1+n3≥2，这样可以使得由该缀合分子形成的缀合物中，M1配体的个数可以至少为3，从而使得M1配体与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，这可以促进缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M1配体的个数大于3个时，M1配体与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一些实施方式中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3。
在一些实施方式中，当m1、m2和m3各自独立地选自2-10的整数时，认为可能使得由该缀合分子形成的缀合物中，多个M1配体之间的空间位置适合M1配体与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的结合，为了使本公开提供的缀合分子更为简单，更容易合成和/或降低成本，根据本公开的一些实施方式，m1、m2和m3各自独立地为2-5的整数，在一个实施方式中，m1＝m2＝m3。
本领域技术人员可以理解，当R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基和C1-C10烷氧基时，不改变本公开提供的缀合分子的性质，均可实现本公开的目的。在一些实施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立的选自H、甲基或乙基。在一些实施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15均为H。
R4为能够结合到通过本公开的缀合分子递送的活性剂的基团。在一些实施方式中，R4为能够结合到待通过本公开的缀合分子递送的寡核苷酸的基团。在一些实施方式中，R4为能够通过共价键与寡核苷酸结合的基团。在一些实施方式中，R4为能够通过磷酸二酯键与寡核苷酸结合的基团。在一些实施方式中，R4选择为实现与含氮骨架上的N原子的连接，并且为合成寡核苷酸缀合物提供合适的反应位点。在本公开的上下文中，“含氮骨架”是指链结构，其中连接有R10、R11、R12、R13、R14和R15的碳原子与N原子互相连接。在一些实施方式中，R4可为能够以适当方式连接至含氮骨架上的N原子的基团。在一些实施方式中，R4包含连接于含氮骨架上的N原子的位点以及可经反应而通过磷酸二酯键缀合至寡核苷酸的任意官能团。
在一些实施方式中，R4含有能够与寡核苷酸或核苷酸上的基团反应形成磷酸酯键的第1官能团，和能够与羟基或氨基形成共价键的第2官能团，或者含有由所述共价键连接的固相载体。在一些实施方式中，第1官能团为亚磷酰胺、羟基或被保护的羟基。在一些实施方式中，第2官能团为亚磷酰胺、羧基或羧酸盐。在一些实施方式中，第2官能团为经与羟基或氨基形成的共价键连接至分子其它部分的固相载体。在一些实施方式中，所述固相载体经由磷酸酯键、羧酸酯键或酰胺键连接。在一些实施方式中，所述固相载体为树脂。
在一些实施方式中，所述第1官能团含有羟基、-ORk或式(C3)所示的基团；和/或所述第2官能团含有式(C1)、(C2)、(C3)、(C1’)或(C3’)所示的基团：
Figure BDA0004119470660000531
式中，q1为1-4的整数，X为O或NH，M+为阳离子，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体，
Figure BDA0004119470660000532
表示基团共价连接的位点。/>
在一些实施方式中，第1官能团含有亚磷酰胺官能团，如式(C3)所示的基团，该亚磷酰胺官能团可以与核苷酸上的任意位置的羟基，如2'位羟基或3'位羟基发生偶联，并经氧化形成磷酸二酯键，从而将缀合分子缀合至寡核苷酸。因此，即使第2官能团不存在，本文公开的缀合分子也能够缀合到核苷酸上。该情况下，缀合分子适合于与核苷酸序列中末端核苷酸上的羟基反应，并在后续的氧化过程中形成磷酸二酯键，从而将本公开的缀合分子缀合至寡核苷酸。
在一些实施方式中，所述第1官能团含有被保护的羟基。在一些实施方式中，所述第2官能团含有对固相载体有反应性的基团，以提供含有固相载体的缀合分子。在一些实施方式中，第2官能团含有羧基、羧酸盐或亚磷酰胺，如式(C1)、(C2)或(C3)所示。羧基或羧酸盐可以与固相载体，例如树脂上的羟基或氨基进行酯化反应或酰胺化反应，形成含有经羧酸酯键连接的固相载体或经酰胺键连接的固相载体的缀合分子。亚磷酰胺可以与通用固相载体，例如树脂上的羟基发生偶联反应，并经后续的氧化形成经磷酸二酯键连接的固相载体。由此，根据本发明的一方面，提供了一种用这种缀合分子来制备本公开的缀合物的方法。在一些实施方式中，该方法包括首先将缀合分子与固相载体通过缩合或偶联反应进行连接，然后按照固相亚磷酰胺合成方法加入核苷单体，从而得到包含缀合至寡核苷酸的本公开的缀合分子的本公开的缀合物。在一些实施方式中，在亚磷酰胺固相合成过程中，第1官能团发生脱保护，随后在偶联反应条件下与核苷上的亚磷酰胺基团发生偶联，
在一些实施方式中，R4含有第1官能团和第2官能团，所述第1官能团含有羟基或被保护的羟基；所述第2官能团含有羧酸酯键、酰胺键或磷酸二酯键，或者通过羧酸酯键、酰胺键或磷酸二酯键连接的固相载体。在一些实施方式中，第2官能团为如式(C1’)或(C3’)所示的基团。在一些实施方式中，当第2官能团含有固相载体时，含有所述固相载体的缀合分子用于本公开缀合物的制备。因此，在本发明的一方面，提供了一种用所述缀合分子制备本公开的缀合物的方法。在一些实施方式中，该方法包括将含有固相载体的缀合分子与核苷单体按照亚磷酰胺固相合成方法进行反应，从而将本公开的缀合分子缀合到寡核苷酸上。在一些实施方式中，所述含有固相载体的缀合分子可通过缀合分子与固相载体反应在内部得到，所述缀合分子具有羧基、羧酸盐或亚磷酰胺。在一些实施方式中，缀合分子可以由供应商提供。
在一些实施方式中，羧酸盐可以表示为—COO-M+，其中，M+是阳离子，例如选自金属阳离子，铵阳离子NH4 +或有机铵阳离子。在一些实施方式中，所述金属离子可为碱金属离子，如K+或Na+。出于提高溶解性、使反应顺利进行的考虑，在一些实施方式中，有机铵阳离子为三级胺形成的铵阳离子或季铵阳离子，如，三乙胺形成的铵离子或N,N-二异丙基乙胺形成的铵阳离子。在一些实施方式中，羧酸盐是三乙胺羧酸盐或N,N-二异丙基乙胺羧酸盐。
在本公开的一些实施方式中，R4为式(B9)、(B10)、(B9’)、(B10’)、(B11)、(B12)、(B11’)或(B12’)所示的基团：
Figure BDA0004119470660000541
Figure BDA0004119470660000551
其中，q1为1-4的整数，q2为1-10的整数，X为O或NH，M+为阳离子，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体，
Figure BDA0004119470660000552
表示基团共价连接的位点。在一些实施方式中，q1为1或2。在一些实施方式中，q2为1-5的整数。在一些实施方式中，R4含有式(B9)或(B10)所示的基团。在一些实施方式中，R4含有式(B11)或(B12)所示的基团。
在一些实施方式中，Rk为Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)、TMTr(4,4’,4’-三甲氧基三苯甲基)中的一种或多种。在一些实施方式中，Rk是DMTr。
L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)。技术人员会理解，尽管为了方便起见，L1被定义为线性亚烷基，但是它可能不是线性基团或者名称不同，例如由于上述替换和/或取代而产生的胺或烯基。为了本公开的目的，L1的长度是连接两个连接点的链中的原子数。为此目的，将替换所述直链亚烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)计为一个原子。
在一些实施方式中，L1的作用是将M1配体(或对应的S1基团)与含氮骨架上的N原子连接，从而为本公开的缀合物提供肝靶向功能。在一些实施方式中，L1选自式A1-A26基团中的任何一种或其任意组合。在一些实施方式中，L1为A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的任何一种或任意组合。在一些实施方式中，L1为A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的组合。在一些实施方式中，L1为A1、A8、A10中至少2个的组合。
在一些实施方式中，L1的长度可为3-25、3-20、4-15或5-12个原子。在一些实施方式中，L1的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55或60个原子。根据本公开的一些实施方式中，j1为2-10的整数，在一些实施方式中，j1为3-5的整数。在一些实施方式中，j2为2-10的整数，在一些实施方式中，j2为3-5的整数。R’为C1-C4烷基，在一些实施方式中，R’为甲基、乙基和异丙基中的一种。Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，在一些实施方式中，Ra为A27或A28。Rb为C1-C5烷基，在一些实施方式中，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。在一些实施方式中，分别对式A1-A26中的j1、j2、R’、Ra、Rb进行选择，以实现在由缀合分子形成的寡核苷酸缀合物中，M1配体与含氮骨架上的N原子连接，并使M1配体之间的空间位置更适合于使M1配体与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体结合。
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个M1为能够和肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个M1为能够和哺乳动物细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个M1为能够和人肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个M1为能够和肝表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的配体。
在一些实施方式中，M1可能是对哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)具有亲合力的任何一种配体，这些配体的种类为本领域技术人员所公知。在一些实施方式中，至少一个M1为糖。在一些实施方式中，每个M1为糖。在一些实施方式中，至少一个M1为单糖、二糖、三糖或多糖。在一些实施方式中，每个M1为单糖、二糖、三糖或多糖。在一些实施方式中，至少一个M1是修饰的糖。在一些实施方式中，每个M1为修饰的糖。在一些实施方式中，每个M1独立地选自多糖、修饰的多糖、单糖或单糖衍生物。在一些实施方式中，每个或至少一个M1可能独立地选自于由以下糖所组成的组：葡萄糖及其衍生物、甘露糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖及其衍生物、麦芽糖及其衍生物、***糖及其衍生物、果糖及其衍生物以及唾液酸。
在一些实施方式中，每个或至少一个M1可能独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。在一些实施方式中，至少一个M1为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。在一些实施方式中，每个M1均为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。配体选择可参见例如CN105378082A的公开内容，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
CN105378082A公开了一种包含修饰寡核苷酸和缀合基团的化合物，所述缀合基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团及1个或多个配体。每个配体选自多糖、修饰多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。据称，该化合物可以降低细胞中核酸转录物的量或活性。
WO2016077321A1公开了众多特异性靶向HBV基因的siRNA以及对其进行递送的方法，并通过对siRNA的核苷酸进行修饰，从而增强了siRNA的血清稳定性。该文献还公开了siRNA缀合物，并且进一步具体公开了数种siRNA缀合物。
WO2016168286A1公开了众多特异性靶向ANGPTL3基因的siRNA以及对其进行递送的方法，并通过对siRNA的核苷酸进行修饰，从而增强了siRNA的血清稳定性。该文献还公开了siRNA缀合物。
N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalgactosamine，GalNAc)是一种与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的配体。去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是肝细胞特异性表达的一种内吞型受体。近年来，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)作为靶向分子以将小RNA递送至肝脏。例如，阿尔尼拉姆公司(Alnylam pharmaceuticals,Inc.)首次报道了基于GalNAc缀合技术的siRNA在小鼠体内发挥干扰活性(Nair等，J.Am.Chem.Soc.,2014，136，16958-16961)。文章报道了缀合至三簇GalNAc的siRNA，在体内和体外实验中均展现了良好的递送活性。通过皮下给药的小鼠体内实验，单一剂量的ED50确定为1mg/kg，单次注射剂量小于1ml。在长期给药实验中，每周皮下注射一次，可获得长达9个月的稳定干扰活性。
在一些实施方式中，S1独立的为M1。在一些实施方式中，S1独立地是M1中至少一个活性羟基被羟基保护基团保护的基团。在一些实施方式中，S1独立地是M1中全部活性羟基(如果存在的话)被羟基保护基团保护的基团。在一些实施方式中，本领域技术人员熟知的任何羟基保护基团可被用于保护M1上的活性羟基。在一些实施方式中，被保护的羟基由式YCOO-表示，其中每个Y独立地选自于由C1-C10烷基和C6-C10芳基所组成的组，其可任选地由一个或多个选自卤素取代基和C1-C6烷基的取代基取代。在一些实施方式中，每个Y独立地选自于由以下基团所组成的组：甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基和C1-C6烷基苯基。
在一些实施方式中，每个S1各自独立地选自于由式A46-A54基团所组成的组：
Figure BDA0004119470660000581
Figure BDA0004119470660000591
在一些实施方式中，S1为式A49或A50。
在一些实施方式中，每个Y独立地为甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及烷基苯基中的一种。出于简化本公开的缀合分子的目的，在一些实施方式中，Y为甲基。
在一些实施方式中，本公开的缀合分子具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000592
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Figure BDA0004119470660000601
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Figure BDA0004119470660000611
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Figure BDA0004119470660000621
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Figure BDA0004119470660000631
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Figure BDA0004119470660000641
以上式(403)-(422)中，其中，X为O或NH，Rk为羟基保护基团，M+为金属阳离子、铵阳离子、三级胺形成的阳离子或季铵阳离子中的一种。在一些实施方式中，M+为
Figure BDA0004119470660000651
在一些实施方式中，本公开的缀合分子可具有式(423)、(424)、(425)、(426)、(427)、(428)、(429)、(430)、(431)、(432)、(433)、(434)、(435)、(436)、(437)、(438)、(439)、(440)、(441)或(442)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000652
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Figure BDA0004119470660000661
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Figure BDA0004119470660000671
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Figure BDA0004119470660000681
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Figure BDA0004119470660000691
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Figure BDA0004119470660000701
以上式(423)-(442)中，其中，X为O或NH，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体。
在一些实施方式中，本公开的缀合分子具有式(503)、(504)、(505)、(506)、(507)、(508)、(509)、(510)、(511)、(512)、(513)、(514)、(515)、(516)、(517)、(518)、(519)、(520)、(521)或(522)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000711
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Figure BDA0004119470660000721
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Figure BDA0004119470660000731
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Figure BDA0004119470660000741
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Figure BDA0004119470660000751
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Figure BDA0004119470660000761
以上式(503)-(522)中，DMTr表示4,4’-双甲氧基三苯甲基，结构
Figure BDA0004119470660000762
表示相应羧酸与三乙胺形成的盐。
在一些实施方式中，本公开的缀合分子可具有式(523)、(524)、(525)、(526)、(527)、(528)、(529)、(530)、(531)、(532)、(533)、(534)、(535)、(536)、(537)、(538)、(539)、(540)、(541)或(542)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000763
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Figure BDA0004119470660000771
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Figure BDA0004119470660000781
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Figure BDA0004119470660000791
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Figure BDA0004119470660000801
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Figure BDA0004119470660000811
以上式(523)-(542)中，SPS表示固相载体，DMTr表示4,4’-双甲氧基三苯甲基。
本公开的缀合分子的制备
本领域技术人员可采用任意合理的合成路线制备本公开的缀合分子。
在本公开的一些实施方式中，制备式(321)所示缀合分子的方法包括在有机溶剂中，在酯化反应条件下，以及在碱和成酯催化剂存在下，将式(313)所示化合物与环状酸酐接触，进行离子交换，分离得到式(321)所示化合物：
Figure BDA0004119470660000821
其中：
R6为提供式(321)中R4的基团。在一些实施方式中，例如，R6具有式(A61)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000822
n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15、L1、S1各自的定义和可选择的范围如前所述，Ri为能够与含氮骨架上的N原子连接、与RkO连接并且连接有游离羟基的任意基团，Rk为羟基保护基团。此时，所获得的是式(321)化合物，其中R4包含作为第1官能团的羟基保护基团，和作为第2官能团的如式(C1)或(C2)所示的基团。在一些实施方式中，R6为B7或B8：
Figure BDA0004119470660000823
其中，q2和Rk各自的定义如前所述。
所述酯化反应条件包括反应温度为0-100℃，反应时间为8-48小时，在一个实施方式中，所述酯化反应条件包括反应温度为10-40℃，反应时间为20-30小时。
在一些实施方式中，所述有机溶剂包括环氧溶剂、醚溶剂、卤代烷溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述环氧溶剂为二氧六环和/或四氢呋喃。在一些实施方式中，所述醚溶剂为***和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于所述式(313)所示化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一些实施方式中为5-20L/mol。
在一些实施方式中，所述环状酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐或庚二酸酐中的一种，在一些实施方式中所述环状酸酐为丁二酸酐。所述环状酸酐与所述式(313)所示化合物的摩尔比为1:1-10:1，在一些实施方式中为2:1-5:1。
所述成酯催化剂可以是任何对该酯化反应起到催化作用的催化剂，例如该催化剂可以是4-二甲氨基吡啶。所述催化剂与式(313)所示化合物的摩尔比为1:1-10:1，在一些实施方式中为2:1-5:1。
在一些实施方式中，所述碱可以是任意的无机碱、有机碱或者它们的结合。考虑溶解性和产物稳定性，碱是三级胺。在一些实施方式中，所述三级胺为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺。所述三级胺与式(313)所示化合物的摩尔比为1:1-20:1，在一些实施方式中为3:1-10:1。
所述离子交换作用用于将式(321)化合物转化为期望的羧酸或羧酸盐的形式，离子交换的方法为本领域技术人员所公知，可以使用合适的离子交换溶液和交换条件，得到具有M+阳离子的缀合分子。在一些实施方式中，所述离子交换反应使用三乙胺磷酸盐溶液进行。在一些实施方式中，所述三乙胺磷酸盐溶液的浓度为0.2-0.8M，在一些实施方式中，所述三乙胺磷酸盐溶液的浓度为0.4-0.6M。在一些实施方式中，相对于式(313)化合物，所述三乙胺磷酸盐溶液的用量为3-6L/mol，在另一些实施方式中为4-5L/mol。
可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(321)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(321)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化：200-300目硅胶填料，使用含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱；或者(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可直接除去溶剂得到式(321)化合物粗产品，该粗产品可直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(321)化合物的制备方法还进一步包括在缩合反应条件下，在有机溶剂中，在缩合剂、缩合催化剂和三级胺的存在下，将上述离子交换产物与含有氨基或羟基的固相载体进行接触。此时，所获得的为式(321)化合物，其中R4中含有作为第1官能团的羟基保护基团和作为第2官能团的式(C1’)所示的基团。
所述固相载体为固相合成siRNA中所用的载体中的一种，其中的一些为本领域技术人员所公知。例如，所述固相载体可选自含有活性羟基或氨基官能团的固相载体，在一些实施方式中，所述固相载体为氨基树脂或羟基树脂。在一些实施方式中，所述氨基或羟基树脂具有如下参数：粒径100-400目(mesh)，表面氨基或羟基载量为0.2-0.5mmol/g。式(321)所示化合物与固相载体的比为10-400μmol化合物每克固相载体(μmol/g)。在一些实施方式中，所述式(321)所示化合物与固相载体的比为50-200μmol/g。
所述有机溶剂可以是本领域技术人员已知的任何合适的溶剂或混合溶剂。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧溶剂、醚溶剂、卤代烷溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述环氧溶剂为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚溶剂为***和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。相对于式(313)化合物，所述有机溶剂的用量为20-200L/mol，在一个实施方式中为50-100L/mol。
在一些实施方式中，所述缩合剂可以是苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐、3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯并***4(3H)-酮和/或O-苯并***-四甲基脲六氟磷酸盐。在一些实施方式中，所述缩合剂为O-苯并***-四甲基脲六氟磷酸盐。所述缩合剂与式(313)所示化合物的摩尔比为1:1-20:1，在其他实施方式中为1:1-5:1。
在一些实施方式中，所述三级胺为三乙胺和/或N,N-二异丙基乙胺，在一些实施方式中为N,N-二异丙基乙胺；所述三级胺与式(313)所示化合物的摩尔比为1:1-20:1，在一些实施方式中为1:1-5:1。
在一些实施方式中，制备式(321)化合物的方法还包括在盖帽反应条件下，在有机溶剂中，将得到的缩合反应产物与盖帽试剂和酰化催化剂接触，分离得到式(321)所示化合物。所述盖帽反应的作用在于除去任何尚未反应的活性官能团，以避免在后续反应中产生不必要的副产物。所述盖帽反应的条件包括反应温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应的时间为1-10h，在一些实施方式中为3-6h。盖帽试剂可为siRNA固相合成中所使用的盖帽试剂，其为本领域技术人员所公知。在一些实施方式中，所述盖帽试剂由盖帽试剂A(capA)和盖帽试剂B(capB)组成。盖帽试剂A为N-甲基咪唑，在一些实施方式中以N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液形式提供，其中，吡啶与乙腈的体积比为1:10-1:1。在一些实施方式中为1:3-1:1。在一些实施方式中，吡啶与乙腈的总体积与N-甲基咪唑的体积比为1:1-10:1，在一些实施方式中为3:1-7:1。在一些实施方式中，所述盖帽试剂B为乙酸酐，在一些实施方式中，盖帽试剂B以乙酸酐的乙腈溶液形式提供，其中，乙酸酐和乙腈的体积比为1:1-1:10，在另一些实施方式中为1:2-1:6。
在一些实施方式中，所述N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液的体积与式(313)化合物的质量之比为5ml/g-50ml/g，在一些实施方式中为15ml/g-30ml/g。所述乙酸酐的乙腈溶液的体积与式(313)化合物的质量之比为0.5ml/g-10ml/g，在一些实施方式中为1ml/g-5ml/g。
在一些实施方式中，盖帽试剂为等摩尔量的乙酸酐与N-甲基咪唑。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧溶剂、醚溶剂、卤代烷溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。相对于式(313)化合物，所述有机溶剂的用量为10-50L/mol，在一些实施方式中为5-30L/mol。
在一些实施方式中，所述酰化催化剂可以选自任何可用于成酯或成酰胺反应的催化剂，例如碱性杂环化合物。在一些实施方式中，所述酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶。所述催化剂与式(313)所示化合物的质量之比为0.001:1-1:1，在一些实施方式中为0.01:1-0.1:1。
在一些实施方式中，可使用任何合适的方法从反应混合物中分离式(321)化合物。在一些实施方式中，可通过以有机溶剂充分洗涤，并过滤去除未反应的反应物、过量的盖帽试剂及其它杂质，得到式(321)化合物，所述有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷或甲醇，在一些实施方式中有机溶剂为乙腈。
在一些实施方式中，式(321)所示缀合分子的制备方法包括在有机溶剂中，在偶联反应条件下，以及在偶联试剂存在下，将式(313)所示化合物与亚磷酰二胺接触，分离得到式(321)所示化合物。此时，所获得的为式(321)化合物，其中R4中含有作为第1官能团的羟基保护基团和作为第2官能团的式(C3)所示的基团。
在一些实施方式中，偶联反应条件包括温度为0-50℃，例如为15-35℃，式(313)化合物与亚磷酰二胺的摩尔比可以为1:1-1:50，例如为1:5-1:15。式(313)化合物和偶联试剂的摩尔比可以为1:1-1:100，例如为1:50-1:80。反应时间可以为200-3000秒，例如为500-1500秒。所述亚磷酰二胺例如可为双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦，其可商购获得或按照本领域中公知的方法制备获得。偶联试剂选自1H-四唑、5-乙基硫-1H-四唑、5-苄基硫-1H-四唑中的一种或多种，例如为5-乙基硫-1H-四唑。所述偶联反应可在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自无水乙腈、无水DMF、无水二氯甲烷中的一种或多种，优选为无水乙腈。相对于式(313)化合物，所述有机溶剂的用量可为3-50L/mol，例如可以为5-20L/mol。通过进行该偶联反应，式(313)化合物中的羟基与亚磷酰二胺反应形成亚磷酰胺基团。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(321)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(321)化合物的制备方法还包括：在偶联反应条件下，在有机溶剂中，以及在偶联试剂存在下，将分离产物与含有羟基的固相载体进行接触。随后，经盖帽反应、氧化反应，分离得到式(321)化合物。此时，所获得的为式(321)化合物，其中R4含有作为第1官能团的羟基保护基团和作为第2官能团的式(C3’)所示的基团。
在一些实施方式中，所述固相载体为可用于核酸固相合成的固相载体，例如，可以是经脱保护反应后的市售的通用固相载体(例如
Figure BDA0004119470660000851
HLUnyLinkerTM300Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate Life Sciences，结构如式B80所示)：
Figure BDA0004119470660000852
Figure BDA0004119470660000861
脱保护反应为本领域众所周知的。在一些实施方式中，脱保护条件包括温度为0-50℃，例如为15-35℃；反应时间为30-300秒，例如为50-150秒。脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中，脱保护试剂为二氯乙酸。脱保护试剂与固相载体上的-DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)保护基的摩尔比可为2:1-100:1，例如为3:1-50:1。通过进行所述脱保护，在所述固相载体表面上获得具有反应活性的游离羟基，从而能够进行后续的偶联反应。
偶联反应条件以及偶联试剂可如上所述进行选择。通过进行该偶联反应，脱保护反应中形成的游离羟基与亚磷酰胺基团反应形成亚磷酸酯连接。
在一些实施方式中，盖帽反应条件包括温度为0-50℃，例如为15-35℃，反应时间为5-500秒，例如为10-100秒。盖帽试剂和用量可如上所述进行选择。
氧化反应条件可包括温度为0-50℃，例如可以为15-35℃，反应时间为1-100秒，例如5-50秒，氧化试剂例如可以为碘(在一些实施方式中，以碘水的形式提供)。在一些实施方式中，氧化试剂与连接至固相载体的核酸序列的摩尔比为1:1-100:1，优选为5:1-50:1。在一些实施方式中，所述氧化反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1-1:1:3的混合溶剂中进行。
在一些实施方式中，R6为式B7或B8，此时，式(313)所示化合物可以通过以下制备方法得到：在有机溶剂中，在成酰胺反应条件下，以及在成酰胺反应缩合剂和三级胺存在下，将式(314)所示化合物与式(A-1)所示化合物或式(A-2)所示化合物接触，分离得到式(313)所示化合物：
Figure BDA0004119470660000862
其中，n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15、L1、S1、q2和Rk各自的定义和可选择的范围如前所述。
所述成酰胺反应条件可包括：反应温度为0-100℃，反应时间为1-48小时。在一些实施方式中，所述成酰胺反应条件为反应温度为10-40℃，反应时间为2-16小时。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为醇溶剂、环氧溶剂、醚溶剂、卤代烷溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述醇溶剂为甲醇、乙醇、和丙醇中的一种或多种，在另一些实施方式中为乙醇。在一些实施方式中，所述环氧溶剂为二氧六环和/或四氢呋喃。在一些实施方式中，所述醚溶剂为***和/或甲基叔丁基醚。在一些实施方式中，所述卤代烷类溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于式(314)化合物，有机溶剂用量为3-50L/mol，在一个实施方式中为3-20L/mol。
在一些实施方式中，所述成酰胺反应缩合剂为苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐、3-二乙氧基磷酰氧基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)或O-苯并***-四甲基脲六氟磷酸盐，在进一步的实施方式中为3-二乙氧基磷酰氧基-1,2,3-苯并三嗪4(3H)-酮。所述成酰胺反应缩合剂与式(314)所示化合物的摩尔比可为1:110:1，在一些实施方式中为2.5:1-5:1。
在一些实施方式中，所述三级胺为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺，在进一步的实施方式中为N,N-二异丙基乙胺。所述三级胺与式(314)所示化合物的摩尔比为3:1-20:1，在一个实施方式中为5:1-10:1。
在一些实施方式中，式(A-1)和式(A-2)化合物可通过任何适当的方式制备。例如，当Rk为DMTr基团时，可通过甘油酸钙与DMTrCl反应制备式(A-1)化合物。类似地，可先将3-氨基-1,2-丙二醇与环状酸酐接触，随后再与DMTrCl反应制备式(A-2)化合物，所述环状酸酐可以是碳原子数为4-13、在一个实施方式中为4-8的环状酸酐。本领域技术人员容易理解的是，所述环状酸酐的选择对应于(A-2)化合物中q2的不同值，例如，当所述环状酸酐为丁二酸酐时，q2＝1，当所述环状酸酐为戊二酸酐时，q2＝2，以此类推。
在一些变型中，也可通过使式(314)所示化合物依次与所述环状酸酐、3-氨基-1,2-丙二醇和DMTrCl反应，制备式(313)化合物。本领域技术人员容易理解的是，这些变型不会影响式(313)化合物的结构与功能，并且这些变型是本领域技术人员在上述方法的基础上容易实现的。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(313)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(313)化合物，例如，可使用如下两组色谱条件进行分离：(1)正相纯化：200-300目硅胶填料，使用石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺＝1:1:1:0.5-1:1:1:0.6梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(313)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(314)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，在脱保护反应条件下，将式(315)所示化合物与卤代乙酸接触，分离得到所述式(314)所示化合物：
Figure BDA0004119470660000881
其中，R7选自式(330)、(331)、(332)或(333)所示的基团，在一个实施方式中，R7的结构如式(330)所示：
Figure BDA0004119470660000882
其中n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14、R15、L1、S1各自的定义和可选择的范围如前所述。
所述卤代乙酸可选自二氯乙酸、三氯乙酸、一氯乙酸和三氟乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中为二氯乙酸。
所述脱保护反应条件可包括反应温度为0-100℃，反应时间为0.1-24小时，在一个实施方式中反应温度为10-40℃，反应时间为0.5-16小时。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为环氧溶剂、醚溶剂、卤代烷溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。所述环氧溶剂在一个实施方式中为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚溶剂在一些实施方式中为***和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷溶剂在一些实施方式中为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于式(315)化合物，有机溶剂用量为3-50L/mol，在进一步的实施方式中为5-20L/mol。
所述卤代乙酸与所述式(315)所示化合物的摩尔比可为5:1-100:1，在一些实施方式中为10:1-50:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(314)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(314)化合物，例如，可使用如下两组色谱条件进行分离：(1)正相纯化：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:甲醇＝100:30-100:40梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18和C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(314)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
式(315)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，在成酰胺反应缩合剂和三级胺存在下，在缩合反应条件下，将式(317)所示化合物与式(316)所示化合物接触，随后进行分离：
S1-L1-COOH
式(316)
Figure BDA0004119470660000891
其中，n1、n3、m1、m2、m3、R7、R10、R11、R12、R13、R14、R15、L1、S1各自的定义和可选择的范围如前所述。
式(316)化合物可使用例如J.Am.Chem.Soc.2014,136,16958-16961中所公开的化合物，或者，式(316)化合物可由本领域技术人员通过各种方法制备，例如，可参照US 8,106,022 B2实施例1中所公开的方法制备某些式(316)化合物，以引用的方式将以上文献的全部内容整体并入本文。
在一些实施方式中，所述缩合反应条件包括反应温度为0-100℃，反应时间为0.1-24小时，在一些实施方式中为反应温度为10-40℃，反应时间为0.5-16小时。
所述式(316)所示化合物与所述式(317)所示化合物的摩尔可比为2:1至10:1，在一些实施方式中为2.5:1-5:1。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧溶剂、醚溶剂、卤代烷溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。所述环氧溶剂在一些实施方式中为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚溶剂在一些实施方式中为***和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷溶剂在一个实施方式中为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。相对于式(317)化合物，所述有机溶剂的用量可为3-50L/mol，在一个实施方式中为5-20L/mol。
在一些实施方式中，所述成酰胺反应缩合剂为苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐、3-二乙氧基磷酰氧基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)、O-苯并***-四甲基脲六氟磷酸盐或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，在进一步的实施方式中可为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。所述成酰胺反应缩合剂与式(317)所示化合物的摩尔比为2:1-10:1，在一些实施方式中为2.5:1-5:1；
所述三级胺可为N-甲基吗啉、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺，在一些实施方式中为N-甲基吗啉；所述三级胺与式(317)所示化合物的摩尔比可为3:1-20:1，在一些实施方式中为5:1-10:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(315)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(315)化合物例如，可使用如下两组色谱条件进行分离：(1)正相纯化：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:7梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18和C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(315)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(317)化合物与足量的一种式(316)化合物一次反应即生成期望的式(315)化合物，式(315)化合物各个S1-L1基团彼此相同。在一些实施方式中，可根据需要，通过使式(317)化合物分批与不同的式(316)化合物，即L1和/或S1不同的式(316)化合物发生反应，使得生成的式(315)化合物中含有两种或多于两种的S1和/或L1。例如，可先使1eq的式(317)化合物与2eq的第一式(316)化合物接触，在式(317)化合物中的两个末端伯胺基团上连接第一S1-L1基团，随后，使其与(n3+n1-1)eq的第二式(316)化合物接触(n3和n1的定义和取值范围如前所述)，从而在式(317)化合物中的(n3+n1-1)个仲胺基团上连接第二S1-L1基团。
在一些实施方式中，式(317)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂存在下，在脱保护反应条件下，将式(318)所示化合物与甲胺水溶液接触，分离得到式(317)所示化合物：
Figure BDA0004119470660000901
其中，n1、n3、m1、m2、m3、R7、R10、R11、R12、R13、R14和R15各自的定义和可选择的范围如前所述。
所述脱保护反应条件可包括反应温度为0-150℃，反应时间为5-72小时，在一些实施方式中为反应温度为20-80℃，反应时间为10-30小时。
所述有机溶剂可选自醇，在一些实施方式中为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种，在一些实施方式中为甲醇；相对于式(318)化合物，所述有机溶剂的用量可为1-20L/mol，在一个实施方式中为1.5-10L/mol。
所述甲胺水溶液的浓度可为30-40质量％，甲胺与式(318)所示化合物的摩尔比可为10:1-500:1，在一些实施方式中为50:1-200:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(317)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(317)化合物例如，可使用如下两组色谱条件进行分离：(1)正相纯化：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:甲醇:氨水(25wt％)＝1:1:0.05-1:1:0.25梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18和C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(317)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(318)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂存在下，在取代反应条件下，将式(319)所示化合物与三苯基氯甲烷(TrCl)、二苯基乙苯基氯甲烷、苯基二乙苯基氯甲烷或三乙苯基氯甲烷接触、在一些实施方式中为与三苯基氯甲烷(TrCl)接触，随后进行分离：
Figure BDA0004119470660000911
其中，n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14和R15各自的定义和可选择的范围如前所述。
所述取代反应条件可包括反应温度为0-100℃，反应时间为5-72小时，在一个实施方式中反应温度为10-40℃，反应时间为10-30小时。
三苯基氯甲烷(TrCl)、二苯基乙苯基氯甲烷、苯基二乙苯基氯甲烷或三乙苯基氯甲烷可商购得到，三苯基氯甲烷(TrCl)、二苯基乙苯基氯甲烷、苯基二乙苯基氯甲烷或三乙苯基氯甲烷与式(319)所示化合物的摩尔比可为1:1-10:1，在一些实施方式中为1:1-3:1。
所述有机溶剂可为环氧溶剂、醚溶剂、卤代烷溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。所述环氧类溶剂在一些实施方式中为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚溶剂在一个实施方式中为***和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷溶剂在一个实施方式中为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种；在一个实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于式(319)化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一个实施方式中为5-20L/mol。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(318)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(318)化合物例如，可使用如下两组色谱条件进行分离：(1)正相纯化：200-300目硅胶填料，使用甲醇:二氯甲烷＝0.01:1-0.5:1梯度洗脱；或者使用甲醇:二氯甲烷:乙酸乙酯:石油醚＝0.1:1:1:1-1:1:1:1梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18和C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(318)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(319)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，在取代反应条件下，将式(320)所示化合物与三氟乙酸乙酯接触，分离得到式(319)所示化合物：
Figure BDA0004119470660000921
其中，n1、n3、m1、m2、m3、R10、R11、R12、R13、R14和R15各自的定义和可选择的范围如前所述。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧溶剂、醚溶剂、卤代烷溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述环氧溶剂在一些实施方式中为二氧六环和/或四氢呋喃，在一些实施方式中，所述醚溶剂在一个实施方式中为***和/或甲基叔丁基醚，在一些实施方式中，所述卤代烷溶剂在一个实施方式中为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。相对于式(320)化合物，所述有机溶剂的用量为1-50L/mol，在一些实施方式中为1-20L/mol。
所述取代反应条件可包括反应温度为0-100℃，反应时间为5-72小时，在一些实施方式中反应温度为10-40℃，反应时间为10-30小时。
式(320)化合物可商购获得，或者由本领域技术人员使用已知的方法获得。例如，当m1＝m2＝m3＝3，n1＝1，n3＝2，且R10、R11、R12、R13、R14、R15均为H时，式(320)化合物可自阿法埃莎公司(Alfa Aesar Inc.)商购获得。
所述三氟乙酸乙酯与式(320)所示化合物的摩尔比可为2:1-10:1，在一个实施方式中为3:1-5:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(319)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(319)化合物例如，可使用如下两组色谱条件进行分离：(1)正相纯化：200-300目硅胶填料，使用甲醇:二氯甲烷＝0.01:1-0.5:1梯度洗脱；或者使用甲醇:二氯甲烷:乙酸乙酯:石油醚＝0.1:1:1:1-1:1:1:1梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18和C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(319)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
缀合物
在另一方面，本公开提供了一种缀合物，该缀合物具有如式(1)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000931
其中：
n1为1-3的整数，n3为0-4的整数；
每个m1、m2和m3独立地为2-10的整数；
每个R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基，在一些实施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、甲基或乙基；
R3为活性药物，在一些实施方式中，R3含有功能性寡核苷酸；
R2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，R2任选地被选自以下任何一个或多个基团所取代：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；在一些实施方式中，L1可选自式A1-A26基团或其任意组合，A1-A26的结构和定义如前所述。
n1,n3,m1,m2,m3,R10,R11,R12,R13,R14,R15和M1如前述所定义。
在一些实施方式中，R2是式(321)化合物中的R4基团经反应连接至活性药物而形成的连接基团。在一些实施方式中，R2是式(321)化合物中的R4基团经反应连接至功能性寡核苷酸而形成的连接基团。在一些实施方式中，R2基团中同时含有与含氮骨架上的N原子连接的连接位点以及与R3中的P原子相连接的连接位点。在一些实施方式中，R2中与含氮骨架上的N原子连接的位点与N原子形成酰胺键，所述与R3中的P原子连接的位点与P原子形成磷酸酯键。在一些实施方式中，R2可以是B5、B6、B5’或B6’：
Figure BDA0004119470660000941
其中，
Figure BDA0004119470660000942
表示基团共价键连接的位点，q2的选择和取值范围如前所述。
在一些实施方式中，R3为A59所示结构的基团：
Figure BDA0004119470660000951
其中，E1为OH、SH或BH2，在一些实施方式中，E1为OH或SH；Nu为功能性寡核苷酸。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”基团或分子是指能够与相应的配位体形成共价键的基团或分子，且缀合基团或分子及其配位体都具有特定的功能。相应地，“缀合物”是指该化学基团与其配位体通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“寡核苷酸缀合物”表示一个或多个具有特定功能的缀合基团共价连接至寡核苷酸上而形成的化合物。在一些实施方式中，本文公开的缀合物是寡核苷酸缀合物。在本公开的上下文中，“缀合分子”可以是通过反应缀合至寡核苷酸、最终形成本公开的寡核苷酸缀合物的特定化合物。在一些实施方式中，寡核苷酸是siRNA，此时，本公开的缀合物是siRNA缀合物。
在一些实施方式中，缀合物具有式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)或(22)所示的结构：
Figure BDA0004119470660000952
/>
Figure BDA0004119470660000961
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Figure BDA0004119470660000971
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Figure BDA0004119470660000981
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Figure BDA0004119470660000991
/>
Figure BDA0004119470660001001
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸是功能性寡核苷酸。功能性寡核苷酸是指这样的寡核苷酸：所述寡核苷酸能够通过与靶序列之间产生稳定且特异性的杂交，利用RNA激活(RNA activation，RNAa)、RNA干扰(RNA interference，RNAi)、反义核酸技术、外显子跳跃(exon skipping)技术等原理，上调或下调靶基因的表达，或导致mRNA可变剪接。在一些方面，功能性寡核苷酸还可以是与靶蛋白之间产生稳定且特异性地结合的核酸结构。此外，本领域技术人员容易理解的是，多核苷酸(例如mRNA本身或其片段)也同样适用于与本公开提供的缀合分子缀合形成缀合物以实现靶向递送，比如肝靶向递送，从而调节mRNA转录出的蛋白质的表达。因此，在上下文中，“功能性寡核苷酸”的概念也可涵盖mRNA或其片段。
在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸能够与靶序列发生相互作用，从而影响靶序列分子的正常功能，如导致发生mRNA断裂或翻译阻遏或外显子跳跃引发mRNA可变剪接等。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸与靶序列的碱基互补。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以与靶序列中超过80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的碱基互补，或者与靶序列完全互补。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以含有1个、2个或3个不与靶序列互补的碱基。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、以及具有修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸是单链的DNA、RNA或DNA-RNA嵌合体(chimera)，或者是双链的DNA、RNA或DNA-RNA杂交体(hybrid)。
由此，在一些实施方式中，适合于本公开的寡核苷酸缀合物的功能性寡核苷酸可以是小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗剂(antagomir)、微小RNA模拟物(microRNA mimics)、诱饵寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四极子(G-quadruplex)、可变剪接体(splice altering)、单链RNA(ssRNA)、反义核酸(antisense)、核酸适配体(Nucleic Acid Aptamer)、小激活RNA(small activating RNA，saRNA)、茎环RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一种。WO2015/006740A2公开了一种不同配体缀合到寡核苷酸的缀合物，其中配体通过接头(linker)与寡核苷酸进行连接。所述寡核苷酸选自小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗剂(antagomir)、微小RNA模拟物(microRNA mimics)、诱饵寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四极子(G-quadruplex)、可变剪接体(splice altering)、单链RNA(ssRNA)、反义核酸(antisense)、适配体(aptamer)、茎环RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一种。这些缀合物在寡核苷酸的体内递送上表现出好的稳定性。在进一步的实施方式中，适合于本公开的寡核苷酸缀合物的功能性寡核苷酸是WO2009082607A2、WO2009073809A2或WO2015006740A2中公开的寡核苷酸，以引用的方式将其整体内容并入本文。
本公开的寡核苷酸缀合物可通过提高活性剂比如功能性寡核苷酸的肝靶向递送效率，来调节特定细胞如肝细胞中特定基因的异常表达，从而增强功能性寡核苷酸和细胞中靶向序列之间的相互作用。在一些实施方式中，所述特定基因可以是肝脏中表达的内源性基因，也可以是在肝脏中繁殖的病原体基因。在肝细胞中异常表达的基因可以是例如ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等基因。在一些实施方式中，所述在肝细胞异常表达的基因是HBV基因、ANGPTL3基因或APOC3基因。在本公开的上下文中，HBV基因是指具有如Genbank注册号NC_003977.1所示序列的基因；ANGPTL3基因是指具有如Genbank注册号NM_014495.3所示mRNA序列的基因；APOC3基因是指具有如Genbank注册号NM_000040.1所示mRNA序列的基因。
在一些实施方式中，“靶序列”是靶mRNA。在本公开的上下文中，“靶mRNA”是指在如肝细胞中异常表达的基因对应的mRNA，它既可以是过量表达的基因对应的mRNA，或者是表达不足的基因对应的mRNA。在一些实施方式中，由于大部分疾病源于mRNA的过量表达，因此靶mRNA优选为过量表达的基因对应的mRNA。在本公开的一些实施方式中，对应于上述异常表达的基因的靶mRNA可以是ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等基因对应的mRNA。在一些实施方式中，所述靶mRNA可以是由对应HBV基因、ANGPTL3基因或者APOC3基因转录而得的mRNA。
式A59中的P原子可以连接到寡核苷酸序列中任何可能的位置，例如，可以连接到寡核苷酸的任意核苷酸上。在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸是单链寡核苷酸(例如，单链RNA或者适配体)。此时，式A59中的P原子可以连接到所述单链寡核苷酸的末端区域，所述单链寡核苷酸的末端区域指所述单链寡核苷酸中从一端起算的前4个核苷酸。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到所述单链寡核苷酸的任意末端。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸是双链寡核苷酸(例如，siRNA、microRNA或者DNA)，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链。在一些实施方式中，所述式A59中的P原子连接到所述双链寡核苷酸中正义链或反义链的末端区域，所述末端区域指所述正义链或所述反义链中从一端起算的前4个核苷酸，在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到所述正义链或所述反义链的任意末端；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到所述正义链的3'末端。在式A59中的P原子连接至双链寡核苷酸的正义链的上述位置的情况下，本公开提供的寡核苷酸缀合物进入细胞后，在解旋时，可以释放出单独的双链寡核苷酸反义链，以阻断靶mRNA翻译蛋白质的过程，抑制特定基因的表达。
式A59中的P原子可以连接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上。在一些实施方式中，式A59中的P原子可通过形成磷酸二酯键而连接至所述寡核苷酸序列中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些具体实施方式中，式A59中的P原子连接在双链寡核苷酸序列中正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上，或者式A59中的P原子通过取代双链寡核苷酸序列中正义链中的核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接，或者式A59中的P原子通过取代双链寡核苷酸序列中正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢原子与核苷酸连接。
在不愿受到限制的情况下，在下面的实施方式和实施例中，详细描述了本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸为小干扰RNA(siRNA)的情况。此时，本公开的寡核苷酸缀合物为siRNA缀合物。在本文的上下文中，为了描述方便，也将这些实施方式中的siRNA缀合物称为本公开的siRNA缀合物。这并不代表本公开的寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸仅可以是siRNA，相反，所述寡核苷酸甚至活性药物可能是本公开的或者本领域技术人员所熟知的其它替代物。根据siRNA缀合物的详细说明，可以设想其它活性药物或者功能性寡核苷酸与本公开提供的缀合分子缀合时也会有类似的作用。
本领域技术人员公知，siRNA含有核苷酸基团作为结构单元，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基。通常活性的，即功能性的siRNA的长度约为12-40个核苷酸，在一些实施方式中约为15-30个核苷酸，所述siRNA中的每个核苷酸可以独立地是修饰或未修饰的核苷酸，为了增加稳定性，所述siRNA中至少一个核苷酸是修饰的核苷酸。
本公开的发明人发现，下面的实施方式中所述的siRNA具有较高的活性和/或稳定性，因而可以作为本公开中发明目的的siRNA。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物中的siRNA(以下，也称为本公开的siRNA)中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，该siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2。所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成互补双链区，所述核苷酸序列2的至少一部分与第一段核苷酸序列互补，所述第一段核苷酸序列为靶mRNA中的一段核苷酸序列。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是指在3mg/kg的浓度下，能够抑制至少50％HBV基因表达、至少50％ANGPTL3基因表达或者至少50％APOC3基因表达的siRNA。在一些实施方式中，本公开的siRNA指在浓度为3mg/kg时，能够抑制至少55％、60％、65％、70％、75％或80％HBV基因、ANGPTL3基因或APOC3基因表达。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列2与核苷酸序列B长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列B为与所述第一段核苷酸序列完全反向互补的核苷酸序列。在不愿受到限制的情况下，这些特定的核苷酸差异并不会显著降低siRNA缀合物的抑制能力，而这些包含特定核苷酸差异的siRNA缀合物也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互补、基本上完全反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B不多于1个核苷酸差异。在一些实施方式中，所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B之间的核苷酸差异包括按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一个核苷酸Z'位置上的差异。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1上的最后一个核苷酸Z是与Z'互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度相等且均为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端，所述核苷酸序列4与第二段核苷酸序列互补，该第二段核苷酸序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4基本上完全反向互补或完全反向互补。因此，所述正义链和反义链的长度可以是19-23个核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端(overhang)；在一些实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为1或2个核苷酸。这样，在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比可以是19/20、19/21、20/21、20/22、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24或23/25。
在一个实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、或连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与第三段核苷酸序列互补，所述第三段序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻、或者和所述第二段核苷酸序列相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23，此时，本公开的siRNA具有显著的肝细胞mRNA沉默活性。
在一些实施方式中，本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开的siRNA不含修饰的核苷酸基团；在一些实施方式中，本公开的siRNA含有修饰的核苷酸基团。
目前，本领域存在多种可用于修饰siRNA的方式，包括骨架修饰(也称为核苷酸间连接修饰，如磷酸基团修饰)、核糖基团修饰及碱基修饰等(例如，请参见Watts，J.K.，G.F.Deleavey and M.J.Damha，Chemically modified siRNA:tools andapplications.Drug Discov Today，2008.13(19-20)：p.842-55，以引用的方式将其整体内容并入本文)。
在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”包括以下核苷酸：其核糖基被修饰，比如2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸、核苷酸类似物，或者具有经修饰的碱基的核苷酸。
在本公开的一些实施方式中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。换句话说，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-核糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基(或修饰的磷酸酯基和/或修饰的核糖基)。在本公开的一些实施方式中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，正义链和反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(207)所示的结构。
“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地为核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。
核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸例如为2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸或2'-脱氧核苷酸。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，如式(208)所示。在一些实施方式中，2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸，如式(209)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸如式(210)所示。
在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(211)所示。
Figure BDA0004119470660001051
核苷酸类似物指能够代替核酸中的核苷酸，但不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶的基团。在一些实施方式中，所述核苷酸类似物可以为如异核苷酸、桥联核酸(bridged nucleic acid，简称BNA)核苷酸或无环核苷酸。
BNA核苷酸是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥并入该核糖环的2'-、4'-位处以提供2',4'-BNA核苷酸，如LNA、ENA和cET BNA，其中，LNA如式(212)所示，ENA如式(213)所示，cET BNA如式(214)所示。
Figure BDA0004119470660001052
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的核苷酸，如解锁核酸(UNA)核苷酸和甘油核酸(GNA)核苷酸，其中，UNA如式(215)所示，GNA如式(216)所示。
Figure BDA0004119470660001053
其中，R为H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的核苷酸，例如，碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(217)或(218)所示。
Figure BDA0004119470660001061
其中，Base表示核酸碱基，例如A、U、G、C或T；R为H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物为异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA或GNA。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2'-氟代核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代而形成的具有如式(207)所示结构；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2'-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代，而形成如式(208)所示。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸和/或在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；和/或在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，和/或按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中所述核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在本公开所述siRNA的一些具体实施方式中，所述核苷酸含有磷酸基团修饰。在本公开的上下文中，磷酸基团上的修饰在一个实施方式中为如下式(201)所示的硫代磷酸(phosphorthioate)修饰，即，用硫原子取代磷酸二酯键中的非桥氧原子，从而以硫代磷酸二酯键替换磷酸二酯键。在一些实施方式中，该修饰稳定siRNA的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
Figure BDA0004119470660001071
根据本公开一些实施方式，所述siRNA中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
按照本公开一些实施方式，所述siRNA分子的反义链序列5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸可具有式(202)所示结构：
Figure BDA0004119470660001072
/>
常用的所述5'-磷酸类似物修饰的核苷酸的种类是本领域技术人员公知的，例如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolution ofoligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开的如下如式(203)-(206)所示的4种核苷酸：
Figure BDA0004119470660001073
Figure BDA0004119470660001081
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团；
Base表示选自A、U、C、G或T的碱基。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为式(203)所示的含有乙烯基磷酸酯(vinylphosphonate，VP)修饰的核苷酸、式(202)所示的5'-磷酸核苷酸或式(205)所示的5'-硫代磷酸修饰的核苷酸。
本公开的发明人出人意料地发现，本公开所述siRNA缀合物在具有显著提高的血清稳定性的同时，还表现出并未明显降低的靶mRNA沉默活性以及优异的体内基因表达抑制效果。从而显示出，本公开的siRNA缀合物具有较高的体内递送效率。按照本公开的一些实施方式，本公开的寡核苷酸缀合物为包含诸如表1A至1F所示的siRNA的siRNA缀合物：
表1siRNA序列
表1A
Figure BDA0004119470660001082
Figure BDA0004119470660001091
表1B
Figure BDA0004119470660001092
表1C
Figure BDA0004119470660001093
/>
Figure BDA0004119470660001101
表1D
Figure BDA0004119470660001102
表1E
Figure BDA0004119470660001103
/>
Figure BDA0004119470660001111
表1F
Figure BDA0004119470660001112
/>
Figure BDA0004119470660001121
*S：正义链；AS：反义链
上表中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，在一些实施方式中为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以VP表示)、5'-磷酸核苷酸(以下实施例中以P表示)或硫代磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以Ps表示)。
本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
寡核苷酸缀合物的制备
可以采用任意合理的合成路线制备本公开的寡核苷酸缀合物。例如，本公开的寡核苷酸缀合物可以采用如下方法制备，该方法包括在亚磷酰胺固相合成的条件下，分别按照所述寡核苷酸的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；在一些实施方式中，所述方法还包含在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(321)所示的化合物与核苷单体或连接在固相载体上的核苷酸序列接触，从而使式(321)所示的化合物经偶联反应连接至核苷酸序列。
在一些实施方式中，该方法还包含脱除保护基并与固相载体切割、分离纯化步骤。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述制备方法包含以下步骤：在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(321)所示的化合物与正义链或反义链的3'端的核苷单体接触，使式(321)所示的化合物连接上序列中第一个核苷酸，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成双链寡核苷酸的正义链或反义链；其中，(321)化合物为R4中含有作为第1官能团被保护的羟基，和作为第2官能团的如式(C1’)或(C3’)所示基团的式(321)所示的化合物，与第一个核苷单体连接前，式(321)化合物经过脱保护；每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；得到连接有缀合分子的核酸的正义链或反义链；按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接来合成双链寡核苷酸另一条链，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；脱除保护基并与固相载体切割，分离纯化获得正义链和反义链，退火。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述制备方法包含以下步骤：按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成双链寡核苷酸的正义链和反义链，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应，得到连接在固相载体上的正义链和连接在固相载体上的反义链；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(321)所示的化合物与连接在固相载体上的正义链或连接在固相载体上的反义链接触，从而将式(321)化合物连接至正义链或反义链，其中，式(321)化合物是R4中含有亚磷酰胺作为第1官能团的式(321)化合物；脱除保护基并与固相载体切割，通过分离纯化获得寡核苷酸的正义链或反义链，退火，其中，所述寡核苷酸的正义链或反义链上连接有缀合分子。
在一些实施方式中，式A59中的P原子连接至siRNA中的正义链的3'末端，本公开的siRNA缀合物的制备方法包括：
(1)脱除上述连接有固相载体的式(321)化合物(以下，也称为连接固相载体的L缀合分子)中的保护基团Rk；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将该连接固相载体的L缀合分子与核苷单体接触，得到通过L缀合分子连接至固相载体的核苷单体；
(2)以该通过L缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向通过亚磷酰胺固相合成方法合成siRNA的正义链；
(3)通过亚磷酰胺固相合成方法，合成siRNA的反义链；
(4)分离出siRNA的正义链和反义链并退火，获得本公开的siRNA缀合物。
其中，在步骤(1)中，脱除该连接固相载体的L缀合分子中的保护基团Rk的方法包括在脱保护条件下，将式(321)化合物与脱保护试剂接触。脱保护条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为30-300秒，在一些实施方式中为50-150秒，脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中为二氯乙酸。脱保护试剂与式(321)化合物的摩尔比可为10:1至1000:1，在一些实施方式中为50:1至500:1。
所述偶联反应条件和偶联试剂可使用任何适于上述偶联反应的条件和试剂。在一些实施方式中，使用与所采用的固相合成方法中的偶联反应相同的条件与试剂。
在一些实施方式中，所述偶联反应的条件包括反应温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃。式(321)化合物与核苷单体的摩尔比可为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:2-1:5；式(321)化合物和偶联试剂的摩尔可比为1:1至1:50，在一些实施方式中为1:3-1:10，反应时间可为200-3000秒，在一些实施方式中为500-1500秒。偶联试剂可选自1H-四唑、5-乙硫基1H-四唑、5-苄硫基1H-四唑中的一种或多种，在一些实施方式中为5-乙硫基1H-四唑。所述偶联反应可在有机溶剂中进行，所述有机溶剂可选自无水乙腈、无水DMF、无水二氯甲烷中的一种或多种，在一些实施方式中为无水乙腈。相对于式(321)化合物，所述有机溶剂的用量可为3-50L/mol，在一些实施方式中为5-20L/mol。
在步骤(2)中，通过亚磷酰胺核酸固相合成的方法，从通过上述步骤制备的L缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向合成siRNA缀合物的正义链S。此时，L缀合分子连接至所得到的正义链的3'末端。
步骤(2)和(3)中所述固相合成的其它条件，包括核苷单体脱保护条件，脱保护试剂种类和用量，偶联反应条件，偶联试剂的种类和用量，盖帽反应的条件，盖帽试剂的种类和用量，氧化反应条件，氧化试剂种类和用量，硫化反应条件，硫化试剂种类和用量，本文中采用本领域中常规使用的各种试剂、用量和条件。
例如，在一些实施方式中，步骤(2)和(3)中所述固相合成可使用如下条件：
核苷单体脱保护条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为30-300秒，在一些实施方式中为50-150秒，脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中为二氯乙酸。脱保护试剂与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的的摩尔比可为2:1-100:1，在一些实施方式中为3:1-50:1。
偶联反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比可为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:5-1:15；固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比可为1:1-1:100，在一些实施方式中为1:50-1:80，反应时间和偶联试剂的选择与前述相同。
盖帽反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为5-500秒，在一些实施方式中为10-100秒，盖帽试剂的选择与前述相同。盖帽试剂的总量与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比可为1:100-100:1，在一些实施方式中为1:10-10:1。在使用等摩尔量的乙酸酐与N-甲基咪唑作为盖帽试剂的情况下，乙酸酐、N-甲基咪唑以及固相载体上连接的核酸序列的摩尔比可为1:1:10-10:10:1，在一些实施方式中为1:1:2-2:2:1。
氧化反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为1-100秒，在一些实施方式中为5-50秒，氧化试剂在一些实施方式中为碘(在进一步实施方式中，以碘水的形式提供)。氧化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比可为1:1-100:1，在一些实施方式中为5:1-50:1。在一些实施方式中，所述氧化反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1-1:1:3的混合溶剂中进行。硫化反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为50-2000秒，在一些实施方式中为100-1000秒，硫化试剂在一些实施方式中为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比可为10:1–1000:1，在一些实施方式中为10:1-500:1。在一些实施方式中，所述硫化反应在乙腈:吡啶＝1:3-3:1的混合溶剂中进行。
按照本公开提供的方法，在将所有核苷单体连接之后，退火之前，该方法还包括分离出siRNA的正义链和反义链。分离的方法为本领域技术人员所公知，一般包括将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团，纯化和脱盐。
将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，并脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团可按照siRNA合成中常规的切割和脱保护方法进行。例如，将得到的连接有固相载体的核苷酸序列与浓氨水接触；在脱保护的过程中，A46-A54基团的保护基团YCOO-转化为羟基，S1基团转化为相应的M1基团，从而生成式(1)所示的缀合物。其中，所述浓氨水可以是指浓度为25-30重量％的氨水，浓氨水的用量与目标siRNA序列相比可为0.2ml/μmol-0.8ml/μmol。
在所合成的核苷酸序列上存在至少一个2'-TBDMS保护时，所述方法还包括将脱除了固相载体的核苷酸序列与三乙胺三氢氟酸盐接触，以脱除该2'-TBDMS保护。此时，所得到的目标siRNA序列中具有相应核苷的游离2'-羟基。三乙胺三氢氟酸盐纯品的用量与目标siRNA序列相比可为0.4ml/μmol-1.0ml/μmol。这样即可得到本公开的siRNA缀合物。
纯化和脱盐的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可利用制备型离子色谱纯化柱，通过NaBr或NaCl的梯度洗脱，来进行核酸的纯化；产品收集合并后，可采用反相色谱纯化柱进行脱盐。
在合成过程中，可随时对核酸序列的纯度和分子量进行检测，从而更好地把控合成质量，检测的方法为本领域技术人员所公知。例如，可通过离子交换色谱检测核酸纯度，并通过液质联用色谱(LC-MS)测定分子量。
退火的方法也是本领域技术人员熟知的。例如，可简单地将所合成的正义链(S链)与反义链(AS链)以等摩尔比混合在注射用水中加热至70-95℃，随后室温冷却，使其通过氢键形成双链结构。这样即可得到本公开的siRNA缀合物。
在获得本公开的缀合物后，在一些实施方式中，还可利用例如液质联用色谱等方法，通过分子量检测等方式对所合成的siRNA缀合物进行表征，确定所合成的siRNA缀合物为目标设计的siRNA缀合物，且所合成的siRNA的序列与欲合成的siRNA的序列相符，例如与上述表1中所列的序列之一相符。
本公开的缀合物的应用
如本公开所示，所述缀合物可向细胞递送某种活性剂，用于治疗或预防可能需要这种递送的疾病或状况。在不愿受任何理论束缚的情况下，我们认为缀合分子的空间排列在靶向细胞表面受体方面特别有效，从而使负载的活性剂与细胞接触。在一些实施方式中，这种缀合物是靶向肝细胞的寡核苷酸缀合物。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物具有优异的肝靶向特异性，因此能够高效地将所缀合的功能性寡核苷酸递送至肝部，从而有效地对肝细胞内特定基因表达进行调控。从而，本公开的寡核苷酸缀合物具有广泛的应用前景。
按照本公开的一些实施方式，本公开提供了本公开的寡核苷酸缀合物在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达引起的病理状况或疾病的药物中的用途。所述特定基因可以是肝脏中表达的内源性基因，也可以是在肝脏中繁殖的病原体基因。在一些实施方式中，所述特定基因例如为ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV或HCV。在一些实施方式中，所述特定基因为乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因。相应地，所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和血脂异常。在一些实施方式中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
在一些实施方式中，本文提供用于治疗由肝细胞中特定基因的表达引起的病理状况或疾病的方法，其包括向有需要的患者给予本公开的寡核苷酸缀合物。在一些实施方式中，所述特定基因例如为ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV或HCV。在一些实施方式中，所述特定基因选自乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因和载脂蛋白C3基因。相应地，所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和血脂异常。在一些实施方式中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。在一些实施方式中，本公开提供的缀合物也可用于治疗其它肝脏疾病，包括以不期望的细胞增殖为特征的疾病、血液疾病、代谢疾病和以炎症为特征的疾病。肝脏的增殖疾病可以是良性或噁性疾病，例如癌症、肝细胞癌(HCC)、肝转移或肝母细胞瘤。肝脏血液学或炎症疾病可以是涉及凝血因子、补体介导的炎症或纤维化的疾病。肝脏的代谢疾病包括血脂异常和葡萄糖调节的不规则性。在一些实施方案中，该方法包括施用一种或多种具有与参与肝病的基因序列高度同源的寡核苷酸。
按照本公开一些实施方式，本公开提供了一种抑制肝细胞中特定基因表达的方法，该方法包括将本公开的siRNA缀合物与所述肝细胞进行接触。
通过将本公开的寡核苷酸缀合物给予有需要的患者，可以通过对基因表达进行调控的机制达到预防和/或治疗由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的目的。因此，本公开的寡核苷酸缀合物可用于预防和/或治疗本文公开的病理状况或疾病、或用于制备用于预防和/或治疗本文公开的病理状况或疾病的药物。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将缀合物如寡核苷酸缀合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将缀合物递送至受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括但并不仅限于局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者体循环相比将更多寡核苷酸缀合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述寡核苷酸缀合物递送至患者的体循环。考虑到本公开旨在提供预防和/或治疗由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的手段，在一些实施方式中采用能够将药物递送至肝脏的给药方式。
可通过本领域已知的任何合适途径向患者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，例如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每个月或每年1次或多次。
本公开所述的寡核苷酸缀合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是患者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体死亡的致死剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中，指能引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的缀合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J或C3H/HeNCrlVr小鼠，以所述寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸的量计：对于递送功能性寡核苷酸与缀合分子形成的寡核苷酸缀合物，被缀合物递送的寡核苷酸用量可以为0.001-100mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重，在一些实施方式中为0.05-20mg/kg体重，另一些实施方式中为0.1-15mg/kg体重，在另一些实施方式中为0.1-10mg/kg体重。在给予本公开所述的寡核苷酸缀合物时，可参考上述用量。
另外，通过将本公开的寡核苷酸缀合物导入特定基因异常表达的肝细胞，还可以通过基因表达调控的机制达到抑制肝细胞中该特定基因的表达这一目的。在一些实施方式中，所述肝细胞为肝炎细胞，在一些实施方式中为HepG2.2.15细胞。在一些实施方式中，所述肝细胞可以选自Hep3B、HepG2、Huh7等肝癌细胞系或分离的肝原代细胞，在一些实施方式中为Huh7肝癌细胞。
采用本公开提供的方法抑制特定基因在肝细胞中表达的情况下，所提供的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸的用量是本领域技术人员根据期望获得的效果容易确定的。例如，在一些实施方式中，所述寡核苷酸缀合物是siRNA缀合物，所提供的siRNA缀合物中的siRNA用量是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或0.05nM至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送途径(局部还是全身)等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
有益效果
在一些实施方式中，本公开提供的缀合物在体内具有更高的寡核苷酸递送效率、更低的毒性、更好的稳定性和/或更高的活性。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的靶基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的HBV基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的肝内HBV基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的动物模型中肝内HBV基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的人类对象中HBV表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的HBV表面抗原表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、siRNA组合物或siRNA缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的ANGPTL3基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的肝内ANGPTL3基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的动物模型中肝内ANGPTL3基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的人类对象中ANGPTL3基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的APOC3基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的肝内APOC3基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的动物模型中肝内APOC3基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的人类对象中APOC3基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开的缀合物未显示出明显脱靶效应。脱靶效应可以是例如抑制非靶基因的基因表达。如果脱靶基因表达的结合/抑制与在靶基因效果相比低于50％、40％、30％、20％或10％的水平，则认为该脱靶效应就是不显著的。
根据本公开的一些实施方式，本公开的缀合物可有效地将siRNA递送至肝脏，并表现出优异的抑制HBV基因表达性质。例如，在具有低脱靶效应的同时，在1mg/kg的剂量下抑制乙肝模型小鼠肝脏中87.4％-92.2％的HBV基因表达。在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表达，在3mg/kg的剂量下可以达到96.9％的HBV表面抗原表达抑制率和95.4％的HBV DNA抑制率。在一些实施方式中，本发明提供的缀合物在最长达140天的时间内在低剂量下对HBV表达表现出优异的抑制作用。
根据本公开的一个实施方案，本公开提供的缀合物可有效地将siRNA递送至肝脏，并且表现出优异的抑制HBV基因表达的性质，例如，在具有低脱靶效应的同时，在1mg/kg的剂量下抑制乙肝模型小鼠肝脏中至少69.3％、或78.1-89.1％的HBV基因表达。在一些实施方式中，本公开的缀合物有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表达，在3mg/kg的剂量下达到98.4％的HBV表面抗原表达抑制率和95.8％的HBV DNA抑制率。在一些实施方式中，相比于参比缀合物，本发明提供的特异性缀合物在最长达84天的时间内在低剂量下对HBV表达表现出优异的抑制作用。
根据本公开的一个实施方案，本公开提供的缀合物可有效地将siRNA递送至肝脏，并且表现出优异的抑制HBV基因表达的性质，例如，在具有低脱靶效应的同时，能够在1mg/kg的剂量下抑制乙肝模型小鼠肝脏中至少48.5％、或76.8-80.0％的HBV基因表达。在一些实施方式中，本公开的缀合物还有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表达，甚至在3mg/kg的剂量下达到84.6％的HBV表面抗原表达抑制率和85.6％的HBV DNA抑制率。在一些实施方式中，相比于参比缀合物，本发明提供的缀合物在最长达21天的时间内在低剂量下对HBV表达表现出更高的抑制作用。
根据本公开的一个实施方案，本公开提供的缀合物可有效地将siRNA递送至肝脏，并且表现出优异的抑制HBV基因表达的性质，例如，在具有低脱靶效应的同时，能够在1mg/kg的剂量下抑制乙肝模型小鼠肝脏中至少60.1％、或在一个实施方式中为80.7-84.5％的HBV X基因区基因表达。在一些实施方式中，本公开的缀合物还有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表达，甚至在3mg/kg的剂量下达到94.8％的HBV表面抗原表达抑制率和95.8％的HBV DNA抑制率。在一些实施方式中，相比于参比缀合物，本发明提供的缀合物在最长达56天的时间内在低剂量下对HBV表达表现出优异的抑制作用。
根据本公开的一个实施方案，本公开提供的缀合物可有效地将siRNA递送至肝脏，并且表现出优异的抑制ANGPTL3基因表达的性质，例如，在1mg/kg的剂量下抑制高脂模型小鼠肝脏中至少57.3％的ANGPTL3基因表达；3mg/kg剂量下，基因抑制率最高为90.4％。在一些实施方案中，与参考缀合物相比，本公开提供的缀合物在低剂量和低施用频率下在最长为49天的时间内表现出优异的ANGPTL3表达抑制和降血脂作用。
根据本公开的一个实施方案，本公开提供的缀合物可有效地将siRNA递送至肝脏，并且表现出优异的抑制ApoC3基因表达的性质，例如，在3mg/kg的剂量下抑制高脂模型小鼠肝脏中至少75％的APOC3基因表达。在一些实施方案中，与参考缀合物相比，本公开提供的缀合物在低剂量和低施用频率下在最长为65天的时间内表现出优异血脂抑制作用。
在某些实施方式中，本公开所述的缀合物在动物模型中表现出低毒性，这表明良好的安全性。例如，在一些实施方式中，对于本公开的缀合物，即使在C57BL/6J小鼠中给予高达起效浓度的100倍(按起效浓度3mg/kg计)，也未观察到明显的毒性反应。
上述示例说明，本文提供的缀合物对靶细胞表面受体有效，并将负载的活性剂递送到表达受体的细胞。设想缀合物分子可适应于额外的细胞表面受体和额外的活性剂，以靶向表达这些受体的细胞的活性剂。
试剂盒
在另一方面，本文提供了包含如上所述的缀合物的试剂盒。
在一些实施方案中，本文提供的试剂盒在一个容器中包含的缀合物。在一些实施方式中，本文提供的试剂盒包含容器，其包含药学上可接受的辅料。在一些实施方式中，本文提供的试剂盒进一步包括药学上可接受的辅料，比如稳定剂或防腐剂。在一些实施方式中，本文提供的试剂盒包含至少一种附加的治疗剂。在一些实施方式中，该试剂盒包含至少一种容器中的附加治疗剂，其不同于包含本公开所述缀合物的治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒包含用于将缀合物与药学上可接受的辅料或其它成分(如果存在)进行混合的说明书。
在本公开的试剂盒中，所述缀合物和/或药学上可接受的辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中，缀合物和/或药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，在本公开的试剂盒中提供无菌水。
实施例
以下将通过实施例对本公开进行详细描述。除非另外说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照MolecularCloning(Cold Spring Harbor LBboratory Press(1989))所记载的方法进行。
HEK239A细胞由北京大学分子医学研究所核酸技术实验室提供，用含由20％胎牛血清(FBS，Hyclone)、0.2v％蓝莓素双抗(青霉素-链霉素，Gibco，Invitrogen)的DMEM完全培养基(Hyclone)于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养。
Huh7细胞购自中国科学院干细胞库，用含有10％的胎牛血清(FBS，Hyclone)、1％非必需氨基酸(NEAA，Corning)的DMEM完全培养基(Hyclone)于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养。
若无其它说明，用以下制备例12-制备例15中合成的siRNA缀合物转染细胞时，使用LipofectamineTM2000(Invitrogen)作为转染试剂，具体操作参照制造商提供的说明书。
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
若无其它说明，所使用的动物模型如下：
C57BL/6J小鼠：购自北京维通利华实验动物技术有限公司；
SD大鼠：由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；
HBV转基因小鼠C57B/6N-Tg(1.28HBV)/Vst(genotype A)，购自北京维通达生物技术有限公司。于实验前选择COI＞104的小鼠(以下也简称为1.28copy小鼠)；
HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J：购自北京大学医学部实验动物科学部。于实验前选择S/CoV＞10的小鼠；
HBV转基因小鼠：命名为M-TgHBV，购自上海市公共卫生中心动物部，转基因小鼠的制备方法如Ren J.等，J.Medical Virology.2006,78:551-560所述；
AAV-HBV转基因小鼠：其按照文献方法(董小岩等，Chin J Biotech 2010,May 25；26(5):679-686)制备。将rAAV8-1.3HBV，D型(ayw)病毒(购于北京五加和分子医学研究所有限公司，1×1012病毒基因组(v.g.)/mL，批号2016123011)用无菌PBS将rAAV8-1.3HBV稀释至5×1011v.g./mL，每只小鼠注射200μL稀释后的rAAV8-1.3HBV，(即每只小鼠注射1×1011v.g.)。病毒注射后第28天，所有小鼠通过眼眶采血(约100μL)用于收集血清以检测HBsAg和HBV DNA；
低浓度AAV-HBV转基因小鼠：采用与上述基本相同的造模方法，区别之处在于，病毒在实验前用无菌PBS稀释至1×1011v.g./mL，每只小鼠注射100μL病毒，即每只小鼠注射1×1010v.g.；
BALB/c小鼠：6-8周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司；
ob/ob小鼠：6-8周龄，购于常州卡文斯实验动物有限公司；
人APOC3转基因小鼠：B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，购于Jackson Lab；
代谢综合症猴：全部为雄性，由北京大学分子医学研究所非人灵长类研究中心提供。
制备例1L-9缀合分子(缀合分子1)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了缀合分子1(以下，也称为L-9缀合分子)。
(1-1)GAL-5的合成(L-9缀合分子的末端段的分子)
Figure BDA0004119470660001221
(1-1a)GAL-2的合成
将100.0g GAL-1(N-乙酰-D-半乳糖胺盐酸盐，CAS号：1772-03-8，购自宁波弘翔生化公司，463.8mmol)溶于1000ml无水吡啶，冰水浴下加入540ml乙酸酐(购自Enox公司，5565.6mmol)，室温搅拌反应1.5小时。将反应液倒入10L冰水中，减压抽滤，滤饼用2L冰水洗涤后，加乙腈/甲苯混合溶剂(体积比乙腈:甲苯＝1:1)至完全溶解，蒸干溶剂，得到白色固体产品GAL-2130.0g。
(1-1b)GAL-3的合成
将步骤(1-1a)中获得的GAL-2(35.1g，90.0mmol)溶解于213ml无水1,2-二氯乙烷中，在冰水浴且氮气保护条件下，加入24.0g TMSOTf(CAS号：27607-77-8，购自麦克林公司，108.0mmol)，室温反应过夜。
在反应液中加入400ml二氯甲烷稀释，以硅藻土过滤，再加入1L饱和碳酸氢钠水溶液，搅拌均匀，分出有机相，水相用二氯乙烷萃取两次，每次300ml，合并有机相，分别用300ml饱和碳酸氢钠水溶液和300ml饱和食盐水洗涤，分出洗涤获得的有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得到浅黄色粘稠糖稀状产品GAL-326.9g。
(1-1c)GAL-4的合成
将步骤(1-1b)中获得的GAL-3(26.9g，81.7mmol)溶于136ml无水1,2-二氯乙烷中，加入干燥的
Figure BDA0004119470660001231
分子筛粉末30g，再加入9.0g 5-己烯-1-醇(CAS号：821-41-0，购自Adamas-beta公司，89.9mmol)，室温下搅拌30分钟，冰浴和氮气保护下加入9.08gTMSOTf(40.9mmol)，室温下搅拌反应过夜。过滤除去/>
Figure BDA0004119470660001232
分子筛粉末，滤液中加入300ml二氯乙烷稀释，以硅藻土过滤，再加入500ml饱和碳酸氢钠水溶液搅拌10分钟洗涤，分出有机相，剩余水相用300ml二氯乙烷萃取一次，合并全部有机相并分别用300ml饱和碳酸氢钠水溶液和300ml饱和食盐水洗涤，分出洗涤获得的有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得到黄色糖稀状产品GAL-441.3g，不进行纯化直接进行下一步氧化反应。
(1-1d)GAL-5的合成
将按照步骤(1-1c)中描述的方法得到的GAL-4(14.9g，34.7mmol)溶于77ml二氯甲烷和77ml乙腈的混合溶剂中，分别加入103ml去离子水和29.7g高碘酸钠(CAS号：7790-28-5，购自阿拉丁公司，138.8mmol)，冰水浴下搅拌10分钟，加入三氯化钌(CAS号：14898-67-0，购自安耐吉公司，238mg，1.145mmol)，室温反应过夜。反应液加入300ml水稀释搅拌，加饱和碳酸氢钠调pH约为7.5，分出并弃去有机相，剩余水相用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，弃去萃取得到的有机相。萃取得到的水相用柠檬酸固体调节pH约为3，用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得到白色泡沫状固体产品GAL-56.85g。
以下，使用按照上述方法得到的GAL-5化合物，通过以下工艺路线合成了L-9缀合分子：
Figure BDA0004119470660001241
(1-2)M-11-T3的合成：
Figure BDA0004119470660001251
将J-0(1.883g，10mmol，商购自阿法埃莎公司)溶于25ml乙腈中，加入三乙胺(4.048g，40mmol)冰水浴冷却至0℃，加入三氟乙酸乙酯(5.683g，40mmol)，室温下反应22h，减压蒸干溶剂，用真空油泵使残余物发泡并干燥18h，得到5.342g粗品固体M-11-T3，不经进一步纯化地直接用于后续反应。MS m/z：C15H22F9N4O3，[M+H]+，理论值：477.35，实测值：477.65。
(1-3)M-11-T3-Tr的合成：
Figure BDA0004119470660001252
将M-11-T3粗品(5.342g，10mmol)溶于50ml二氯甲烷，向所得反应液中加入TrCl(3.345g，12mmol)和三乙胺(1.518g，15mmol)，室温下搅拌反应20h，将反应溶液洗涤两次，每次使用20ml饱和碳酸氢钠，再用20ml饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干有机溶剂，用真空油泵使残余物发泡并干燥过夜，得到粗品固体M-11-T3-Tr7.763g。MS m/z：C34H36F9N4O3，[M+Na]+，理论值：741.25，实测值：741.53。粗品固体M-11-T3-Tr不经纯化地继续用于下一步M-18-Tr的合成。
(1-4)M-18-Tr的合成：
Figure BDA0004119470660001253
将步骤(1-3)中获得的M-11-T3-Tr粗品(7.763g，10mmol)溶于100ml甲醇，再加入100ml甲胺水溶液(40质量％)，在50℃搅拌反应23h，过滤除去不溶颗粒物，减压蒸干溶剂，向残余物加入200ml体积比为1:1的DCM:甲醇混合溶剂，用50ml饱和碳酸氢钠洗涤，水相再用二氯甲烷萃取3次，每次50ml，合并全部有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，用真空油泵使残余物发泡并干燥过夜，用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷:甲醇:氨水(25wt％)＝1:1:0.05-1:1:0.25梯度洗脱，收集洗脱液，减压蒸干溶剂，用真空油泵使残余物发泡并干燥得到纯品M-18-Tr2.887g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.47–7.39(m,6H),7.32–7.24(m,6H),7.19–7.12(m,3H),2.60–2.47(m,4H),2.46–2.19(m,13H),1.70–1.55(m,4H),1.40(p,J＝6.8Hz,2H).MS m/z：C28H39N4，[M+H]+，理论值：431.65，实测值：432.61。
(1-5)L-5-Tr的合成：
Figure BDA0004119470660001261
将步骤(1-4)中获得的M-18-Tr(2.02g，4.69mmol)与步骤(1-1)中获得的GAL-5(6.93g，15.48mmol)混合溶于47ml乙腈，加入N-甲基吗啉(3.13g，30.96mmol)和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM，4.28g，15.48mmol)，室温搅拌反应2h。以200ml二氯甲烷稀释反应液，100ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相，100ml饱和食盐水洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品。200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:7梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干得到纯品L-5-Tr 7.49g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.83–7.10(m,4H),7.67–7.60(m,1H),7.44–7.34(m,6H),7.33–7.24(m,6H),7.20–7.15(m,3H),5.22(s,3H),4.97(d,J＝11.3Hz,3H),4.49(d,J＝8.4Hz,3H),4.06–3.07(m,9H),3.95–3.83(m,3H),3.77–3.64(m,3H),3.45–3.35(m,3H),3.12–2.87(m,8H),2.30–2.15(m,3H),2.11–1.98(m,22H),1.95–1.84(m,11H),1.81–1.61(m,14H),1.54–1.36(m,14H).MS m/z：C85H119N7O30，[M+H]+，理论值：1718.81，实测值：1718.03。
(1-6)L-8的合成：
Figure BDA0004119470660001271
将步骤(1-5)中得到的L-5-Tr(5.94g，3.456mmol)溶于69ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(13.367g，103.67mmol)，室温下反应2h，加入100ml二氯甲烷稀释所得反应液，再加饱和碳酸氢钠溶液洗涤调节pH＝7-8，分离出的水相以二氯甲烷萃取6次，每次30ml，合并全部有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品。纯化使用200-300目正相硅胶，以10wt％三乙胺中和硅胶酸性，1wt‰三乙胺平衡柱子，以二氯甲烷:甲醇＝100:30-100:40梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品L-84.26g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.84(d,J＝9.0Hz,3H),7.27–7.23(m,1H),7.13–7.18(m,1H),5.22(d,J＝3.1Hz,3H),4.97(dd,J＝11.3,3.1Hz,3H),4.48(d,J＝8.4Hz,3H),4.09–3.98(m,9H),3.88(dd,J＝19.3,9.3Hz,3H),3.75–3.66(m,3H),3.44–3.38(m,3H),3.17–3.30(m,4H),3.10–2.97(m,4H),2.35–2.20(m,6H),2.15–2.08(m,9H),2.07–1.98(m,13H),1.94–1.87(m,9H),1.81–1.74(m,9H),1.65–1.42(m,18H).MS m/z：C85H119N7O30，[M+H]+，理论值：1477.59，实测值：1477.23。
(1-7a)A-1的合成
Figure BDA0004119470660001272
将DMTrCl(4,4'-双甲氧基三苯甲基氯，38.12g，112.5mmol)溶于450ml无水吡啶中，加入DL-甘油酸钙水合物(12.88g，45.0mmol)，在45℃反应22h，将所得反应液过滤，滤饼用200ml DCM淋洗，滤液减压浓缩至干，残余物用500ml二氯甲烷重新溶解，0.5M三乙胺磷酸盐(pH＝7-8)洗涤2次，每次200ml，分离出的水相以二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，残余物用200-300目正相硅胶柱纯化，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.35-1:1:1:0.55梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，残余物用500ml二氯甲烷重新溶解，以200ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤1次，水相用二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合并全部有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，用真空油泵使残余物减压干燥过夜，得到白色固体产品A-120.7g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.46(ddd,J＝6.5,2.3,1.1Hz,1H),7.40–7.28(m,7H),6.89–6.81(m,4H),4.84(d,J＝5.0Hz,1H),4.36–4.24(m,1H),4.29(s,6H),3.92(dd,J＝12.4,7.0Hz,1H),3.67(dd,J＝12.3,7.0Hz,1H),2.52(q,J＝6.3Hz,6H),1.03(t,J＝6.3Hz,9H).MS m/z：C24H23O6，[M-H]-，理论值：407.15，实测值：406.92。
(1-7b)L-7的合成：
Figure BDA0004119470660001281
将步骤(1-6)中获得的L-8(2.262g，1.532mmol)和步骤(1-7a)中获得的A-1(2.342g，4.596mmol)混合，溶于16ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷酰氧基-1,2,3-苯并三嗪4(3H)-酮(DEPBT，1.375g，4.596mmol)，再加入二异丙基乙胺(1.188g，9.191mmol)，25℃下搅拌反应2h，用10ml饱和碳酸氢钠洗涤有机相，水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，合并全部有机相，以10ml饱和食盐水洗涤有机相，分离出的水相以二氯甲烷萃取2次，每次10ml，合并所得有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，残余物用真空油泵发泡干燥过夜，得到粗品4.900g。粗品进行柱纯化，使用120g 200-300目正相硅胶，以20ml三乙胺中和硅胶酸性，以含1wt％三乙胺的石油醚平衡柱子，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺＝1:1:1:0.5-1:1:1:0.6梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品L-72.336g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.90–7.78(m,4H),7.75–7.64(m,1H),7.38–7.18(m,9H),6.91–6.83(m,4H),5.25–5.10(m,4H),4.97(dd,J＝11.2,3.2Hz,3H),4.48–4.30(m,4H),4.02(s,9H),3.93–3.84(m,3H),3.76–3.66(m,9H),3.45–3.35(m,3H),3.24–2.98(m,10H),2.30–2.20(m,2H),2.11–1.88(m,31H),1.80–1.40(m,28H).MS m/z：C90H128N7O35，[M-DMTr]+，理论值：1564.65，实测值：1564.88。
(1-8)L-9的合成：
Figure BDA0004119470660001291
将步骤(1-7b)中获得的L-7(2.300g，1.26mmol)、丁二酸酐(0.378g，3.78mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.462g，3.78mmol)混合溶于13ml二氯甲烷，再加入DIPEA(0.814g，6.30mmol)，25℃下搅拌24h。5ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤所得反应液，分离出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次5ml，合并全部有机相减压蒸干得到2.774g粗品。粗品进行柱纯化，使用60g 200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷平衡柱子，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100::20梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品L-9缀合分子(缀合分子1)1.874g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.58(d,J＝4.2Hz,1H),7.94–7.82(m,3H),7.41–7.29(m,5H),7.22(d,J＝8.1Hz,5H),6.89(d,J＝8.3Hz,4H),5.49–5.37(m,1H),5.21(d,J＝3.0Hz,3H),4.97(d,J＝11.1Hz,3H),4.49(d,J＝8.2Hz,3H),4.02(s,9H),3.88(dd,J＝19.4,9.4Hz,3H),3.77–3.65(m,9H),3.50–3.39(m,6H),3.11–2.90(m,5H),2.61–2.54(m,4H),2.47–2.41(m,2H),2.26–2.17(m,2H),2.15–1.95(m,22H),1.92–1.84(m,9H),1.80–1.70(m,10H),1.65–1.35(m,17H),1.31–1.19(m,4H),0.96(t,J＝7.1Hz,9H).MS m/z：C94H132N7O38，[M-DMTr]+，理论值：1664.72，实测值：1665.03。所得到的L-9缀合分子的结构如式(503)所示。
制备例2P-9缀合分子(缀合分子2)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了缀合分子2(以下，也称为P-9缀合分子)：
Figure BDA0004119470660001301
(2-1)GAL5-C4-1的合成
向40ml N,N-二甲基甲酰胺中加入按照上述(1-1)中描述的方法得到的GAL-5(13.43g，30.0mmol)、4-氨基酸叔丁酯盐酸盐(5.87g，30.0mmol)、O-苯并***-四甲基脲六氟磷酸盐(13.65g，36.0mmol)和二异丙基乙胺(11.63g，90.0mmol)，溶解均一后室温搅拌反应5小时。向所得反应液中加入300ml饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取分离出的水相3次，每次200ml，合并洗涤获得的有机相，用200ml饱和食盐水洗涤一次，分出洗涤获得的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂至干得到30.3g油状物粗品GAL5-C4-1，直接进行下一步反应。
(2-2)GAL5-C4-2的合成
将步骤(2-1)中获得的GAL5-C4-1粗品(30.3g，30mmol)溶于180ml甲酸中，室温搅拌反应16小时。蒸发溶剂至干，粗品通过柱层析纯化(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱)，收集洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物GAL5-C4-2共14.84g。
(2-3)P-6的合成：
将按照步骤(1-4)中描述的方法得到的M-18-Tr(2.02g，4.69mmol)与将步骤(2-2)中获得的GAL5-C4-2(8.24g，15.48mmol)混合溶于47ml乙腈，再加入N-甲基吗啉(3.13g，30.96mmol)，最后加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM，4.28g，15.48mmol)，室温搅拌反应2h。以200ml二氯甲烷稀释所得反应液，分别以100ml饱和碳酸氢钠溶液和100ml饱和食盐水洗涤有机相，合并全部有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品，200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:7梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干得到纯品P-6共8.27g。
(2-4)P-7的合成：
将按照上述(2-3)中得到的P-6(6.82g，3.456mmol)溶于69ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(13.367g，103.67mmol)，室温下反应2h。加入100ml二氯甲烷稀释所得反应液，再加入饱和碳酸氢钠溶液洗涤并调节pH＝7-8，分离出的水相以二氯甲烷萃取6次，每次30ml，合并全部有机相，无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品。用200-300目正相硅胶纯化，以10wt％三乙胺中和硅胶酸性，以1wt‰三乙胺平衡柱子，二氯甲烷:甲醇＝100:30-100:40梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到P-7共4.82g。MS m/z：C78H127N10O33，[M+H]+，理论值：1732.91，实测值：1735.73。
(2-5)P-8的合成：
Figure BDA0004119470660001311
将P-7(2.653g，1.532mmol)和A-1(2.342g，4.596mmol)混合溶于16ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯并***4(3H)-酮(DEPBT)(1.375g，4.596mmol)，再加入二异丙基乙胺(1.188g，9.191mmol)，25℃下搅拌反应2h。用10ml饱和碳酸氢钠洗涤有机相，水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，合并全部有机相并用10ml饱和食盐水洗涤，分离出的水相以二氯甲烷萃取2次，每次10ml，合并所得有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，残余物用真空油泵发泡干燥过夜得到粗品。粗品进行柱纯化，使用120g 200-300目正相硅胶，以20ml三乙胺中和硅胶酸性，以含1wt％三乙胺的石油醚平衡柱子，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺＝1:1:1:0.5-1:1:1:0.6梯度洗脱，收集洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品P-8共2.793g。
(2-6)P-9的合成：
将P-8(490mg，0.231mmol)、丁二酸酐(69mg，0.693mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，68mg，0.554mmol)混合溶于2.3ml二氯甲烷，再加入二异丙基乙胺(DIPEA，149mg，1.155mmol)，25℃下搅拌反应21h。50ml二氯甲烷稀释所得反应液，再用100ml0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液，分离出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，合并全部有机相，减压蒸干得到粗品。粗品进行柱纯化，使用80g 200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷平衡柱子，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱，收集洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品P-9缀合分子(缀合分子2)共200mg。MS m/z：C106H153N10O41，[M-DMTr]+，理论值：1921.05，实测值：1920.97。所得到的P-9缀合分子的结构如式(504)所示。
制备例3R-4缀合分子(缀合分子3)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了缀合分子3(以下，也称为R-4缀合分子)。
Figure BDA0004119470660001331
(3-1)GAL-C7-1的合成
将按照步骤(1-1b)中描述的方法得到的GAL-3(26.4g，80.2mmol)溶于134ml无水1,2-二氯乙烷中，加入
Figure BDA0004119470660001341
分子筛粉末60g，再加入7-辛烯-1-醇(11.3g，88.2mmol)，室温下搅拌反应10分钟，冰浴和氮气保护下加入三氟甲基磺酸三甲基甲硅烷基酯(TMSOTf，8.9g，40.1mmol)，室温搅拌反应24小时。过滤除去/>
Figure BDA0004119470660001342
分子筛粉末，滤液中加入500ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，分出有机相，剩余水相用100ml二氯甲烷萃取一次。合并全部有机相并用250ml饱和食盐水洗涤一次，分出洗涤获得的有机相，用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂至干得到黄色糖稀状产品GAL-C7-133.3g，不进行纯化直接进行下一步氧化反应。
(3-2)GAL-C7-2的合成
将步骤(3-1)中得到的GAL-C7-1(33.3g，72.8mmol)溶于160ml二氯甲烷和160ml乙腈的混合溶剂中，分别加入216ml水和高碘酸钠固体(62.3g，291.2mmol)，冰水浴下搅拌10分钟，加入催化剂三氯化钌(498mg，2.4mmol)自然升至室温搅拌反应23小时。所得反应液加入200ml水稀释，搅拌，加饱和碳酸氢钠调节pH值为7.5，分掉有机相，剩余水相再用二氯甲烷萃取三次，弃去萃取获得的有机相，萃取获得的水相用柠檬酸固体调节pH约为3，用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，合并所得有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后柱层析(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱)纯化得到白色泡沫状固体产品GAL-C7-222.4g。MS m/z：C21H32NO11，[M+H]+，理论值：476.50，实测值：475.94。
(3-3)R-1的合成：
将按照步骤(1-4)中描述的方法得到的M-18-Tr(2.02g，4.69mmol)与GAL-C7-2(7.36g，15.48mmol)混合溶于47ml乙腈，再加入N-甲基吗啉(3.13g，30.96mmol)，最后加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM，4.28g，15.48mmol)，室温搅拌反应2h。以200ml二氯甲烷稀释所得反应液，分别用100ml饱和碳酸氢钠溶液和100ml饱和食盐水洗涤有机相，合并全部有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品，200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:7梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干得到纯品R-17.82g。
(3-4)R-2的合成：
将R-1(6.23g，3.456mmol)溶于69ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(13.367g，103.67mmol)，室温下反应2h。加入100ml二氯甲烷稀释所得反应液，再加饱和碳酸氢钠溶液洗涤并调节pH＝7-8，分离出的水相以二氯甲烷萃取6次，每次30ml。合并全部有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品。粗品用200-300目正相硅胶纯化，以10wt％三乙胺中和硅胶酸性，以1wt‰三乙胺平衡柱子，二氯甲烷:甲醇＝100:30-100:40梯度洗脱，减压蒸干溶剂得到纯品R-24.49g。
(3-5)R-3的合成：
将R-2(2.391g，1.532mmol)和A-1(2.342g，4.596mmol)混合溶于16ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷酰氧基-1,2,3-苯并三嗪4(3H)-酮(DEPBT，1.375g，4.596mmol)，再加入二异丙基乙胺(1.188g，9.191mmol)，25℃下搅拌反应2h。用10ml饱和碳酸氢钠洗涤有机相，分离出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml。合并全部有机相并以10ml饱和食盐水洗涤，分离出的水相以二氯甲烷萃取2次，每次10ml，合并所得有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，用真空油泵使残余物减压干燥过夜得到粗品。粗品进行柱纯化，使用120g200-300目正相硅胶，以20ml三乙胺中和硅胶酸性，以含1wt％三乙胺的石油醚平衡柱子，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺＝1:1:1:0.5-1:1:1:0.6梯度洗脱，减压蒸干溶剂得到纯品R-32.642g。
(3-6)R-4的合成：
将R-3(795mg，0.4074mmol)、丁二酸酐(82mg，0.8148mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，100mg，0.8148mmol)混合溶于4ml二氯甲烷，再加入二异丙基乙胺(DIPEA，100mg，0.8148mmol)，25℃下搅拌反应18h。5ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤所得反应液，水相以二氯甲烷萃取3次，每次5ml，合并全部有机相减压蒸干溶剂得到粗品。粗品进行柱纯化，使用30g200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷平衡柱子，含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱，收集洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品R-4缀合分子(缀合分子3)505mg。所得到的R-4缀合分子的结构如式(507)所示。
制备例4LA-4缀合分子(缀合分子4)的制备
按照以下工艺路线，预期能够合成缀合分子4(以下，也称为LA-4缀合分子)，所得LA-4缀合分子的结构如式(512)所示。
Figure BDA0004119470660001361
缀合分子缀合分子
制备例5LB-4缀合分子(缀合分子5)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了缀合分子5(以下，也称为LB-4缀合分子)：
Figure BDA0004119470660001371
(5-1)LB-1的合成：
将按照步骤(1-6)中描述的方法得到的L-8(5.0g，3.386mmol)、己二酸酐(870mg，6.772mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，827mg，6.772mmol)混合溶于130ml二氯甲烷，再加入二异丙基乙胺(DIPEA，2.2g，16.931mmol)，25℃下搅拌反应4h。加入70ml二氯甲烷稀释所得反应液，以0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液，分离出的水相以二氯甲烷萃取4次，每次10ml，合并全部有机相，减压蒸干溶剂得到粗品。粗品进行柱纯化，使用120g 200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷平衡柱子，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.2-1:1:1:1梯度洗脱。减压蒸干溶剂得到纯品LB-14.267g。
(5-2)LB-2的合成：
将按照步骤(5-1)中描述的方法得到的LB-1(4.697g，2.753mmol，由两批次产物合并而得)、3-氨基-1,2-丙二醇(313mg，3.442mmol)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM，953mg，3.442mmol)和N-甲基吗啉(700mg，6.884mmol)先后加入30ml乙腈和3ml甲醇的混合物中，室温搅拌反应过夜。蒸发溶剂至干，残余物用柱层析(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:甲醇＝1:0.07-1:0.5梯度洗脱)纯化，收集洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物LB-23.27g。
(5-3)LB-3的合成：
将LB-2(2.27g，1.353mmol)用14ml无水吡啶溶解。再加入4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(688mg，2.03mmol)室温下搅拌反应过夜。加150ml甲醇淬灭反应，蒸发溶剂至干。残余物进行柱层析(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:甲醇＝1:0.05-1:0.2梯度洗脱)纯化，收集洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物LB-31.647g。
(5-4)LB-4的合成：
将LB-3(822mg，0.415mmol)、丁二酸酐(83g，0.83mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，102mg，0.83mmol)混合溶于4ml二氯甲烷，再加入DIPEA(270mg，2.075mmol)，25℃下搅拌反应过夜。0.5M三乙胺磷酸盐洗涤所得反应液3次，分离出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次2ml。合并全部有机相减压蒸干溶剂得到粗品。粗品进行柱纯化，使用200-300目正相硅胶，以5wt％三乙胺中和硅胶酸性，以石油醚平衡柱子，用含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:20梯度洗脱，减压蒸干溶剂得到纯品LB-4缀合分子(缀合分子5)787mg。所得到的LB-4缀合分子的结构如式(513)所示。
制备例6V-7缀合分子(缀合分子6)的合成
按照以下工艺路线，预期能够合成缀合分子6(以下，也称为V-7缀合分子)，所得V-7缀合分子结构如式(514)所示。
Figure BDA0004119470660001391
制备例7W-7缀合分子(缀合分子7)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了缀合分子7(以下，也称为W-7缀合分子)。
Figure BDA0004119470660001401
(7-1)W-1的合成：
将W-0(2.024g，10mmol)溶于25ml乙腈中，再加三乙胺(4.048g，40mmol)，冰水浴冷却至0℃左右，加入三氟乙酸乙酯(5.683g，40mmol)，室温下反应22h。减压蒸干溶剂，用真空油泵使残余物发泡干燥18h，得到5.835g粗品固体W-1。
(7-2)W-2的合成：
将W-1粗品(5.835g，10mmol)溶于50ml二氯甲烷，向反应液中加入TrCl(3.345g，12mmol)和三乙胺(1.518g，15mmol)，室温下搅拌反应20h。用20ml饱和碳酸氢钠洗涤所得反应液2次，再用20ml饱和食盐水洗涤1次。合并全部有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干有机溶剂，用真空油泵使残余物发泡干燥过夜，得到粗品固体W-28.012g。粗品固体W-2不经处理，进行下一步脱保护反应。
(7-3)W-3的合成：
将W-2粗品(8.012g，10mmol)溶于100ml甲醇，再加入100ml甲胺水溶液(40wt％)，在50℃下搅拌反应23h。过滤除去不溶颗粒物，减压蒸干溶剂，残余物加入200ml体积比为1:1的DCM-甲醇混合溶剂，以50ml饱和碳酸氢钠洗涤所得有机相，分离出的水相再用二氯甲烷萃取3次，每次50ml。合并全部有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，用真空油泵使残余物发泡干燥过夜，用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷:甲醇:氨水(25wt％)＝1:1:0.05-1:1:0.25梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，残余物用真空油泵发泡干燥得到纯品W-33.062g。
(7-4)W-4的合成：
将W-3(675mg，1.517mmol)与GAL-C7-2(2.60g，5.46mmol)混合溶于47ml乙腈，再加二异丙基乙胺(1.57g，12.14mmol)，最后加入3-二乙氧基磷酰氧基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT，1.816g，6.04mmol)，室温搅拌反应2.5h。以100ml二氯甲烷稀释所得反应液。分别用80ml饱和碳酸氢钠溶液和80ml饱和食盐水洗涤有机相。合并全部有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品。粗品进行200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:7梯度洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得到纯品W-41.610g。
(7-5)W-5的合成：
将W-4(1.61g，0.886mmol)溶于125ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(3.5ml，42.43mmol)，室温下反应1h。加入150ml吡啶中和所得反应液，减压蒸干溶剂得粗品。粗品进行柱纯化，使用200-300目正相硅胶，10wt％三乙胺中和硅胶酸性，1wt‰三乙胺平衡柱子，二氯甲烷:甲醇＝100:30-100:40梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品W-51.26g。
(7-6)W-6的合成：
将W-5(1.25g，0.793mmol)和按照步骤(1-7a)中描述的方法得到的A-1(1.21g，2.38mmol)混合溶于12ml二氯甲烷，加入3-二乙氧基磷酰氧基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT，0.712g，2.38mmol)，再加入二异丙基乙胺(0.615g，4.76mmol)，25℃下搅拌反应3h。用80ml饱和碳酸氢钠洗涤有机相，分离出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml。合并全部有机相并以10ml饱和食盐水洗涤，合并所得有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，残余物用真空油泵发泡干燥过夜得到粗品。粗品进行柱纯化，使用185g 200-300目正相硅胶，20ml三乙胺中和硅胶酸性，以含1wt％三乙胺的石油醚平衡柱子，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺＝1:1:1:0.1-1:1:0.7梯度洗脱，收集洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品W-61.57g。
(7-7)W-7的合成：
将W-6(1.238g，0.63mmol)、丁二酸酐(0.189g，1.89mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.231g，1.89mmol)混合溶于7ml二氯甲烷，再加入DIEA(0.407g，3.15mmol)，25℃下搅拌反应24h。以5ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤所得反应液，分离出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次5ml。合并全部有机相减压蒸干得到粗品。粗品进行柱纯化，使用30g 200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，二氯甲烷平衡柱子，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品W-7缀合分子(缀合分子7)1.033g。MS m/z：C101H146N7O38，[M-DMTr]+，理论值：1763.92，实测值：1763.21。所得到的W-7缀合分子的结构如式(515)所示。
制备例8X-7缀合分子(缀合分子8)的制备
按照以下工艺路线，预期能够合成缀合分子8(以下，也称为X-7缀合分子)，所得X-7缀合分子结构如式(521)所示。
Figure BDA0004119470660001431
制备例9K-3缀合分子(对比缀合分子1)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了K-3缀合分子(以下，也称为对比缀合分子1)。
Figure BDA0004119470660001441
(9-1)K-1的合成：
向60ml二氯甲烷中加入按照步骤(1-7a)中描述的方法得到的A-1(3.0g，6.0mmol)、PyBOP(6.2g，12.0mmol)、HOBt(1.6g，2.0mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA，3.9g，30.0mmol)，室温搅拌反应10分钟，随后将上述溶液加入到K-0(5.6g，30.0mmol)中，室温反应1小时50分钟。将反应液倒入30ml饱和碳酸氢钠溶液中，分离出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次30ml。合并全部有机相并以饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤浓缩。粗品进行柱纯化，以200-300目正相硅胶柱纯化，以二氯甲烷:甲醇:氨水(25wt％)＝10:2:0.1-4:4:1梯度洗脱，收集产物洗脱液，浓缩除去溶剂，残余物用真空油泵发泡干燥，得到白色固体产品K-12.2g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.02(s,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,2H),7.34–7.17(m,7H),6.87(d,J＝8.6Hz,4H),4.05(d,J＝5.2Hz,1H),3.74(s,6H),3.20–3.01(m,5H),2.60–2.38(m,12H),1.60–1.39(m,8H),1.24(s,1H).MS m/z：C33H47N4O5，[M+H]+，理论值：579.35，实测值：579.26。
(9-2)K-2的合成：
向3ml二氯甲烷中加入按照(1-1)中描述的方法得到的GAL-5(483mg，1.08mmol)、3-二乙氧基磷酰氧基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(359mg，1.2mmol)、二异丙基乙胺(DIPEA，310mg，2.4mmol)，室温搅拌30分钟，随后加入K-1(174mg，0.3mmol)，室温反应16小时。将反应液倒入10ml饱和碳酸氢钠溶液中，分离出的水相以二氯甲烷萃取3次，每次10ml，合并全部有机相并以10ml饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤浓缩。以200-300目正相硅胶柱纯化，二氯甲烷:甲醇＝20:1洗脱，收集洗脱液，浓缩除去溶剂，真空油泵干燥发泡，得到黄色固体产品K-2205mg。
(9-3)K-3的合成：
向1.1ml二氯甲烷中加入K-2(205mg，0.11mmol)、丁二酸酐(22mg，0.22mmol)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，27mg，0.22mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA，71mg，0.55mmol)，室温搅拌反应过夜。反应液用0.5M三乙胺磷酸盐溶液洗3次，每次0.5ml，并且每次洗涤获得的水相用0.5ml二氯甲烷反萃一次。合并全部有机相并用无水硫酸钠干燥，浓缩除去溶剂，真空油泵干燥发泡，得到浅黄色固体产品K-3缀合分子(对比缀合分子1)218mg。
制备例10本制备例用于说明(GalNAc)3缀合分子(对比缀合分子2)的合成
本制备例中，按照WO2014025805A1中实施例1-4所述的制备方法合成了化合物47，所述化合物47的结构如下式所示，本文中将其称为(GalNAc)3缀合分子(对比缀合分子2)：
Figure BDA0004119470660001451
制备例11本制备例用于说明FIN-2缀合分子(对比缀合分子3)的制备
在本制备例中，参照Rajeev等人，ChemBioChem 2015,16,903–908中描述的制备方法，按照以下工艺路线，合成了FIN-2缀合分子(对比缀合分子3)：
(11-1)PRO-10化合物的合成
Figure BDA0004119470660001461
(11-1-1)PRO-7的合成
将2.93g PRO-6(L-羟基脯氨酸，CAS号：51-35-4，购自安耐吉公司，22.4mmol)溶于22.5ml 1,4-二氧六环(1,4-dioxane)中，加入34ml 10％(w/w)Na2CO3的水溶液，将6.954gFmoc-Cl(氯甲酸-9-芴基甲酯，CAS号：28920-43-6，购自安耐吉公司，26.8mmol)溶于56.5ml1,4-二氧六环，冰浴下加入到反应混合物中，自然升至室温反应过夜。反应液倒入150ml冰水中，用甲基叔丁基醚萃取三次，每次100ml，弃去所得有机相，剩余水相用浓HCl调节pH≤5，用100ml乙酸乙酯萃取两次，合并所得有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂得到白色泡沫状固体产品PRO-77.83g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91(t,J＝7.2Hz,2H),7.67(d,J＝7.5Hz,2H),7.48–7.39(m,2H),7.38–7.27(m,2H),5.17(s,1H),4.27(s,2H),4.23–4.11(m,2H),3.55–3.41(m,3H),2.31–2.10(m,1H),2.08–1.88(m,1H).HRMS(ESI)m/z calcd forC20H19NO5[M-H]-352.1190,实测值352.1033.
(11-1-2)PRO-8的合成
将7.83g PRO-7(22.2mmol)溶于80ml THF中，油浴加热到65℃，回流状态下加入36.6ml 2mol/L的BH3-Me2S的THF溶液(CAS号13292-87-0，购自百灵威公司，73.2mmol)，继续回流反应3小时。倒出反应液，用甲醇溶解剩余固体，搅拌下加入甲醇至反应液无气体放出并继续搅拌30分钟，减压蒸除溶剂后，残余物用石油醚提纯三次后得白色固体产物PRO-87.1g。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91(t,J＝6.7Hz,2H),7.67(d,J＝7.2Hz,2H),7.49–7.39(m,2H),7.38–7.26(m,2H),5.18(dd,J＝6.1,3.8Hz,1H),4.28(s,2H),4.23–4.13(m,2H),3.55–3.38(m,2H),2.32–2.11(m,1H),2.08–1.89(m,1H).HRMS(ESI)m/z calcd forC20H21NO4[M+Na]+362.1368,实测值362.1012.
(11-1-3)PRO-9的合成
将7.1g PRO-8(21mmol)溶于100ml吡啶中，加入14.2g DMTr-Cl(4,4'-双甲氧基三苯甲基氯，42mmol)，室温下搅拌反应5小时。减压蒸除溶剂，粗品用乙酸乙酯溶解后过滤除去盐类杂质，减压蒸除溶剂后，用硅胶柱纯化残余物。为了纯化，将溶解在DCM中的粗产物加载到用吡啶预处理以碱化的硅胶柱上。先用含1％(v/v)吡啶的DCM洗脱DMTr-Cl，随后用乙酸乙酯洗脱产物，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，得白色固体产物PRO-98.2g；HRMS(ESI)m/z calcd for C41H39NO6[M+Na]+664.2675,实测值664.2348；C18 RP-HPLC(批号JJS160324-1)纯度94.20％。
(11-1-4)PRO-10的合成
将8.2g PRO-9(12.8mmol)溶于64ml DMF中，加入40ml哌啶(384mmol)，室温下搅拌反应30分钟。反应液倒入300ml冰水中，乙酸乙酯萃取三次，每次150ml，合并所得有机相，用200ml饱和食盐水洗涤后，洗涤获得的有机相以无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后，将残余物用硅胶柱纯化，为了纯化，将溶解在DCM中的粗产物加载到用吡啶预处理以碱化的硅胶柱上。先用含1％(v/v)吡啶的DCM洗脱Fmoc，随后用乙酸乙酯洗脱产物，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，得白色固体产物PRO-104.65g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.40(d,J＝7.2Hz,2H),7.35–7.18(m,7H),6.93–6.84(m,4H),4.56(d,J＝3.9Hz,1H),4.12(s,1H),3.74(s,6H),3.46–3.37(m,1H),2.88(ddd,J＝18.5,10.0,5.5Hz,2H),2.75(dd,J＝8.7,5.8Hz,1H),2.62(dd,J＝11.0,2.7Hz,1H),1.74–1.65(m,1H),1.40(ddd,J＝12.9,8.5,5.9Hz,1H)；HRMS(ESI)m/z calcd for C26H29NO4[M+Na]+442.1994,实测值442.1999；C18 RP-HPLC(批号JJS160329-1)纯度97.07％。
(11-2)FIN-1的合成
Figure BDA0004119470660001471
将按照(1-1)中描述的方法得到的GAL-5(4.5g，10mmol)溶于40ml DMF中，依次加入3.9g DIPEA(N,N-二异丙基乙胺，CAS号：7087-68-5，购自阿拉丁公司，30mmol)和3.8gHBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，CAS号：94790-37-2，商购自阿拉丁公司，11mmol)，室温下搅拌10分钟获得反应液。将步骤(12-4)中获得的PRO-10(4.2g，10mmol)溶于40mlDMF中，随后加入到上述反应液中，反应液中加入无水硫酸钠干燥，室温搅拌2小时。将反应液倒入120ml冰水中，用乙酸乙酯萃取三次，每次60ml，合并有所得机相，分别用20ml水、20ml饱和食盐水洗涤，分出有洗涤获得的机相并以无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，残余物硅胶柱纯化。为了纯化，将样品加载到用吡啶预处理以碱化的硅胶柱上。用含1％(v/v)三乙胺和1％(v/v)甲醇的二氯甲烷(DCM)溶液洗脱，收集洗脱液，减压蒸干溶剂，得到浅黄色泡沫状固体产品FIN-16.5g。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.83(d,J＝9.2Hz,1H),7.32(t,J＝6.6Hz,4H),7.20(td,J＝8.9,3.5Hz,5H),6.93–6.84(m,4H),5.21(d,J＝3.2Hz,1H),5.04–4.90(m,2H),4.49(s,1H),4.40(d,J＝4.4Hz,0.8H),4.31(d,J＝5.0Hz,0.2H),4.15(s,1H),4.03(s,3H),3.93(s,1H),3.74(s,7H),3.59(dt,J＝12.0,6.0Hz,1H),3.50–3.40(m,1H),3.39–3.25(m,3H),3.13(dd,J＝8.9,5.2Hz,1H),3.00(dq,J＝9.3,5.3,4.3Hz,1H),2.22(s,2H),2.07(s,3H),1.99(s,3H),1.90(s,4H),1.74(s,3H),1.50(s,3H),1.36(s,1H)。C18 RP-HPLC(批号LJ160422)纯度95.45％。
(11-3)FIN-2的合成
Figure BDA0004119470660001481
将步骤(11-2)中获得的FIN-1(3.0g，3.53mmol)溶于10ml DMF，氮气保护下加入2.13g PA(双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦，Adamas公司，商品编号11356B，7.06mmol)、346mg四唑(CAS号：288-94-8，购自阿拉丁公司，4.94mmol)，室温下搅拌反应，补加10ml DMF，继续搅拌反应1小时。减压蒸除溶剂后，残余物以硅胶柱色谱纯化。为了纯化，将溶解在DCM中的粗产物加载到用吡啶预处理以碱化的硅胶柱上，乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，减压蒸除溶剂，得无色糖浆状粗品4.5g。粗品用50％(v/v)乙腈水溶液溶解至完全溶解，用(C-18，330g，
Figure BDA0004119470660001482
)中压纯化柱纯化样品，柱预先用含1％(v/v)吡啶的乙腈溶液碱化，梯度洗脱收集产品，减压蒸除溶剂得白色粉末产品FIN-2缀合分子(对比缀合分子3)2.2g。31PNMR(162MHz,CDCl3)δ148.04,147.94,147.62,147.19，磷谱纯度92％；C18 RP-HPLC纯度90.54％。
制备例12本制备例用于说明Z-4缀合分子(缀合分子153)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了缀合分子153(以下，也称为Z-4缀合分子)。
Figure BDA0004119470660001491
(12-1)Z-1的合成：
将按照步骤(7-3)中描述的方法得到的W-3(1.50g，3.37mmol)与按照步骤(2-2)中描述的方法得到的GAL5-C4-2(7.18g，13.48mmol)混合溶于34ml二氯甲烷，再加入二异丙基乙胺(3.48g，26.96mmol)，之后加入3-二乙氧基磷酰氧基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT，4.04g，13.48mmol)，室温搅拌反应4.5小时。以100ml二氯甲烷稀释所得反应液，用80ml饱和碳酸氢钠溶液和80ml饱和食盐水分别洗涤有机相，合并全部有机相并以无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂得粗品，粗品用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，以二氯甲烷:甲醇＝30:1-15:1梯度洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得到纯品Z-13.97g。MS m/z：C98H143N10O33，[M+H]+，理论值：1987.98，实测值：1987.90。
(12-2)Z-2的合成：
将Z-1(3.97g，2.00mmol)溶于250ml二氯甲烷，再加入二氯乙酸(10.941g，84.85mmol)，室温下反应1小时。加入吡啶中和所得反应液至中性，减压蒸干溶剂得粗品。200g 200-300目正相硅胶装柱，10％吡啶中和硅胶酸性，1‰吡啶平衡柱子，二氯甲烷:甲醇＝10:1-2:1梯度洗脱，收集洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品Z-23.49g。MS m/z：C79H129N10O33，[M+H]+，理论值：1746.94，实测值：1746.90。
(12-3)Z-3的合成：
将按步骤(1-7a)所述方法得到的Z-2(3.49g，2.0mmol)和A-1(3.06g，6.0mmol)混合溶解于30ml二氯甲烷中，加入3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT，1.80g，6.0mmol)，然后加入二异丙基乙胺(1.55g，12.0mmol)，25℃下搅拌反应3小时。加入100ml二氯甲烷稀释所得反应液，用饱和碳酸氢钠洗涤有机相2次，每次30ml，水相以10ml二氯甲烷萃取。合并全部有机相并以50ml饱和食盐水洗涤，合并所得有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸干溶剂，残余物用真空油泵发泡干燥过夜得到粗品。粗品进行柱纯化，使用200g 200-300目正相硅胶，20ml三乙胺中和硅胶酸性，以含1wt％三乙胺的石油醚平衡柱子，二氯甲烷:甲醇＝25:1-15:1梯度洗脱，收集洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品Z-32.2g。MS m/z：C103H151N10O38，[M+H]+，理论值：2136.02，实测值：2136.20。
(12-4)Z-4的合成：
将Z-3(2.10g，0.983mmol)溶解在含有DIEA(635mg，4.915mmol)的14.8ml二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，240mg，1.966mmol)搅拌澄清后，加入丁二酸酐(197mg，1.966mmol)，25℃下搅拌反应18小时。加入50ml二氯甲烷稀释所得反应液，以80ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤有机相，水相以二氯甲烷萃取2次，每次50ml。合并全部有机相减压蒸干得到粗品。粗品进行柱纯化，使用188g 200-300目正相硅胶，以1wt％三乙胺中和硅胶酸性，二氯甲烷平衡柱子，以含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝10:1-3:1梯度洗脱，收集洗脱液，减压蒸干溶剂得到纯品Z-4缀合分子(缀合分子12)1.95g。MS m/z：C107H155N10O41，[M+H]+，理论值：1935.07，实测值：1935.29。所得到的Z-4缀合分子的结构如式(422)所示。
制备例13L10-siHBa1缀合物(缀合物9)的制备
本制备例中，以L-9缀合分子(缀合分子1)出发，按照以下方法制备了L10-siHBa1缀合物(以下，也称为缀合物9)。
(13-1)L-10化合物的合成：
Figure BDA0004119470660001501
此步骤中，通过将L-9缀合分子连接至固相载体，制备了L-10化合物。
将步骤(1-8)中获得的L-9缀合分子(0.233g，0.1126mmol)、O-苯并***-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，0.064g，0.1689mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA，0.029g，0.2252mmol)混合，溶于19ml乙腈，室温搅拌5分钟。加入氨甲基树脂(0.901g，100-200目，氨基载量400μmol/g，购自南开和成公司)至反应液中，25℃下于摇床进行反应，转速220转/分钟，反应15h后过滤。将残留物用DCM淋洗2次，每次30ml；乙腈淋洗3次，每次30ml；30ml***淋洗1次，真空油泵干燥2h。再按照表2中示出的投料配比进行盖帽反应。
表2盖帽反应投料配比
原料 用量 规格 批号 生产厂家
Cap1 20ml —— —— ——
Cap2 2.3ml —— —— ——
DMAP 0.01g 分析纯 I1422139 Aladdin
乙腈 2.3ml 光谱纯 O15161001 上海星可
其中，Cap1和Cap2为盖帽试剂溶液，Cap1为20％(v/v)N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合物中的溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5；Cap2为20％(v/v)乙酸酐的乙腈溶液；
将Cap1、Cap2、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和乙腈加入到上述反应混合物中，25℃下在摇床进行反应，转速200转/分钟，反应5小时。反应液过滤，将残留物用乙腈淋洗3次，每次30ml，使溶剂蒸发至干，用真空油泵使混合物减压下干燥过夜，得到L-10化合物(即，连接固相载体的L-9缀合分子)1.100g，载量90.8μmol/g。L-10化合物的结构如式(523)所示。
(13-2)合成L10-siHBa1缀合物正义链
本步骤中，siRNA缀合物的siRNA为编号为siHBa1的序列：
siHBa1
正义链：5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3'(SEQ ID NO:1)，
反义链：5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3'(SEQ ID NO:2)；
通过亚磷酰胺固相合成的方法，由上述步骤制备的L-10化合物起始，按照上述序列顺序按照3'-5'的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、和氧化四步反应。合成条件给定如下：
核苷单体以0.1M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％v/v)，二氯乙酸与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为5-乙基硫-1H-四唑的0.5M乙腈溶液。
每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒。盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的Cap1和Cap2的混合溶液，盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐:N-甲基咪唑:固相载体上连接的核酸序列＝1:1:1。
每一步氧化反应条件相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒，氧化试剂为0.05M的碘水。碘与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1。反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1的混合溶剂中进行。
切割和脱保护条件如下：将合成的连接有载体的核苷酸序列加入25wt％的氨水中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃反应16h，除去液体，将残余物真空浓缩至干。在氨水处理后，对于单链核酸的量，以0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解产品，随后加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氢氟酸盐，从而脱除核糖上的2'-TBDMS保护。纯化与脱盐：利用制备型离子色谱柱(Source 15Q)，通过NaCl的梯度洗脱来实现核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用Sephadex柱进行脱盐，填料为Sephadex-G25，以去离子水洗脱。
检测：使用离子交换色谱(IEX-HPLC)检测的纯度为92.4％；采用液质联用(LC-MS)分析分子量，理论值7253.96，实测值7253.12。
从而，该步骤中将L-9缀合分子连接至所得到的正义链的3'末端，得到L-9缀合分子缀合在siRNA 3'末端的siRNA正义链S。
(13-3)合成反义链
本步骤中，利用通用固相载体(UnyLinkerTM loaded
Figure BDA0004119470660001521
HL SolidSupports，Kinovate Life SciencesInc.)，合成了L10-siHB1缀合物的反义链AS。通过与正义链合成相同的条件获得siRNA的反义链AS，包括固相合成方法中的脱保护、偶联、盖帽、氧化反应条件，脱保护和切割，分离条件。
检测：采用离子交换色谱(IEX-HPLC)进行检测的纯度为93.2％；分子量采用液质联用(LC-MS)进行分析。理论值6675.04，实测值6674.50。
(13-4)合成L10-siHBa1缀合物
将S链和AS链分别溶于注射用水溶液中，得到40mg/ml的溶液。它们以等摩尔比混合，在50℃下加热15分钟，冷却至室温后，使它们通过氢键形成双链结构。
在上述合成完成后，用超纯水(Milli-Q超纯水仪自制，电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将缀合物稀释至0.2mg/mL的浓度。利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-MassSpectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。其结果，分子量理论值S：7253.96，AS：6675.04；分子量实测值S：7253.24，AS：6674.61，实测值与理论值一致，从而确定所合成的缀合物是目标设计的带有L-9缀合分子的双链核酸序列。L10-siHBa1缀合物(缀合物9)的结构如式(3)所示。
制备例14缀合物16-18、24-26、42-43、62、78、105、109、111、115、144以及154-171的制备
采用与制备例13相同的方法制备题述缀合物，不同的是：1)缀合的siRNA具有表3A-3G中所示的对应于缀合物16-18、24-26、42-43、62、78、105、109、111、115、144、157-163以及167-171的序列；2)当目标序列中两个核苷酸之间为硫代磷酸酯连接时，用以下硫化反应步骤代替该两个核苷酸中后一个核苷酸的连接中的氧化反应步骤；每一步硫化反应的条件相同，包括温度为25℃，反应时间为300秒，硫化试剂为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为120:1。反应在乙腈:吡啶＝1:1的混合溶剂中进行；并且3)当目标序列中的全部核苷酸的2'-位均为修饰的羟基基团时，切割与脱保护条件中不包括脱除核糖上的2'-TBDMS保护的步骤。从而，制备得到本公开的缀合物16-18、24-26、42-43、62、78、105、109、111、115、144、157-163以及167-171。
另外，采用与制备例13相同的方法制备缀合物154-156和164-166，区别在于分别用如下缀合分子代替L-9缀合分子：使用上述制备例2获得的P-9缀合分子(缀合分子2)制备缀合物164、使用上述制备例7获得的W-7缀合分子(缀合分子7)制备缀合物155、156和165、使用上述制备例12获得的Z-4缀合分子(缀合分子12)制备缀合物154和166，并且缀合的siRNA分别为表3A-3G中所示的对应于缀合物154-156和164-166的序列，按照表3A-3G对上述缀合物分别进行编号，它们的结构分别如式(3)、式(4)、式(15)和式(22)所示。通过液质联用仪检测缀合物分子量，结果如下，缀合物142的理论值S：7649.55，AS：6991.46；实测值S：7649.1，AS：6991；缀合物170的理论值S：7649.55，AS：6995.47，实测值S：7648.8，AS：6994.8；缀合物171的理论值S：7649.55，AS：7011.53，实测值S：7648.8，AS：7010.9；缀合物115的理论值S：7584.5，AS：7007.46，实测值S：7584，AS：7006.2；缀合物109的理论值S：7584.5，AS：6931.47，实测值S：7584，AS：6930.9；缀合物106的理论值S：7572.47，AS：6907.41，实测值S：7571.8，AS：6906.9；缀合物113的理论值S：7584.5，AS：7011.47，实测值S：7584，AS：7011.3；缀合物17的理论值S：7504.34，AS：6961.52，实测值S：7503.4，AS：6960.9；缀合物25的理论值S：7504.34，AS：7037.51，实测值S：7503.6，AS：7036.9；缀合物18的理论值S：8218.83，AS：7703.05，实测值S：8218，AS：7702.5；缀合物16的理论值S：7516.37，AS：6985.58，实测值S：7516.5，AS：6984.9；缀合物159的理论值S：7504.34，AS：7057.58，实测值S：7503.6，AS：7057；缀合物160的理论值S：7504.34，AS：7041.52，实测值S：7503.6，AS：7040.8；缀合物161的理论值S：7516.37，AS：7065.58，实测值S：7516.6，AS：7064.5；缀合物162的理论值S：7504.34，AS：7139.68，实测值S：7515.6，AS：7138.9；缀合物163的理论值S：7516.37，AS：7081.64，实测值S：7515.6，AS：7080.9；缀合物62的理论值S：7485.3，AS：7161.7，实测值S：7484.4，AS：7160.9；缀合物78的理论值S：7423.22，AS：7207.78，实测值S：7422.6，AS：7207.2；缀合物42的理论值S：7407.22，AS：7208.77，实测值S：7406.4，AS：7208.1；缀合物43的理论值S：7407.22，AS：7170.72，实测值S：7406.5，AS：7170.1，测定值与理论值相符。
表3siRNA缀合物
表3A
Figure BDA0004119470660001541
/>
Figure BDA0004119470660001551
/>
Figure BDA0004119470660001561
表3B
Figure BDA0004119470660001562
/>
Figure BDA0004119470660001571
表3C
Figure BDA0004119470660001572
/>
Figure BDA0004119470660001581
表3D
Figure BDA0004119470660001582
/>
Figure BDA0004119470660001591
表3E
Figure BDA0004119470660001601
/>
Figure BDA0004119470660001611
/>
Figure BDA0004119470660001621
表3F
Figure BDA0004119470660001622
/>
Figure BDA0004119470660001631
/>
Figure BDA0004119470660001641
表3G
Figure BDA0004119470660001642
/>
Figure BDA0004119470660001651
*S：正义链；AS：反义链
注：大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；dT表示脱氧胸腺嘧啶核苷酸；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；VP表示该字母VP右侧的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸；P表示该字母P右侧的一个核苷酸为磷酸酯核苷酸；Ps表示该字母Ps右侧的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，Tmoe表示2'-甲氧乙氧基修饰的胸腺嘧啶核苷酸。
乙烯基磷酸酯和2'-甲氧基修饰的尿嘧啶核苷单体(VP-Um)按照以下方法合成：
Figure BDA0004119470660001652
(14-1)VP-U-2的合成
按照以下方法，合成了VP-U-2分子：
Figure BDA0004119470660001661
将2'-甲氧基修饰的尿嘧啶核苷(2'-OMe-U，51.30g，91.6mmol)，叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl，50.35g，183.2mmol)，咪唑(12.47g，183.2mmol)混合溶于450ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下搅拌反应20小时。蒸除DMF，残余物用600ml二氯甲烷溶解后加300ml饱和碳酸氢钠洗涤，分离出的水相再用二氯甲烷(DCM)萃取3次，每次300ml。合并全部有机相，用5％草酸洗涤至水相pH<5，蒸发溶剂至干后获得VP-U-1粗品，直接用于随后VP-U-2的合成。
将VP-U-1粗品用100ml二氯甲烷溶解后，外加冰浴搅拌10分钟，再加入预先在4℃冰箱预冷好的450ml的2％对甲苯磺酸溶液(溶剂为体积比3:7的甲醇-二氯甲烷混合溶剂)，反应10分钟。再加入200ml饱和碳酸氢钠淬灭反应，所得有机相加入饱和碳酸氢钠水溶液洗涤至pH＝8。合并水相，用二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合并全部有机相，再用200ml饱和食盐水洗涤一次，蒸发溶剂至干。残余物用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，残余物用真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-2共40.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.79(d,J＝4.7Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.94(t,J＝7.0Hz,1H),4.12(td,J＝4.6,3.9Hz,1H),4.05(dd,J＝4.8,4.0Hz,1H),3.96(t,J＝4.7Hz,1H),3.68(ddd,J＝11.8,7.0,4.6Hz,1H),3.57–3.46(m,1H),3.39(s,3H),1.05(s,8H).MS m/z：C26H33N2O6Si，[M+H]+，理论值：497.21，实测值：497.45。
(14-2)VP-U-4的合成：
Figure BDA0004119470660001662
将VP-U-2(19.84g，40.0mmol)，二环己基碳二亚胺(DCC，16.48g，80.0mmol)，吡啶(4.20g，53.2mmol)，三氟乙酸(6.61g，53.2mmol)混合溶于200ml二甲基亚砜(DMSO)，室温下搅拌反应20小时获得反应液。另取亚甲基二磷酸四乙酯(21.44g，74.4mmol)溶于120mlTHF，冰浴降温，在冰浴温度下加入t-BuOK(11.36g，101.2mmol)，先在冰浴温度下反应10分钟，再升至室温反应0.5小时，然后加入至前述反应液中，约1小时加完，冰浴温度下反应1h，再升至室温反应18小时。加水淬灭反应，分离出的水相以二氯甲烷提取3次，每次200ml。合并全部有机相，用200ml饱和食盐水水洗一次后蒸发溶剂至干。用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯＝1:1-1:4梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，残余物用真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-4共14.00g。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.82–6.71(m,2H),5.90(ddd,J＝25.9,15.0,1.0Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.36–4.21(m,3H),4.18(t,J＝4.9Hz,1H),4.05(ddq,J＝9.7,8.5,6.9Hz,2H),3.87(t,J＝4.8Hz,1H),3.39(s,3H),1.32(td,J＝6.9,0.7Hz,6H),1.05(s,8H).MS m/z：C31H42N2O8PSi，[M+H]+，理论值：629.24，实测值：629.51。
(14-3)VP-U-5的合成：
Figure BDA0004119470660001671
将VP-U-4(14.00g，22.29mmol)溶于100ml四氢呋喃，加入三乙胺三氢氟酸盐(17.96g，111.45mmol)，室温搅拌20小时至反应完全。直接蒸发溶剂至干燥，再用二氯甲烷溶解随后蒸干2次，每次使用50ml二氯甲烷，得到粗品。粗品用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，残余物用真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-5共6.70g。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),6.77(dd,J＝15.0,6.2Hz,1H),5.99–5.82(m,2H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),5.27(d,J＝5.1Hz,1H),5.10(dd,J＝5.3,4.7Hz,1H),4.29(ddq,J＝9.8,8.6,7.0Hz,2H),4.17(ddd,J＝6.2,5.2,1.0Hz,1H),4.12–3.98(m,3H),3.39(s,2H),1.32(td,J＝6.9,0.6Hz,6H).MS m/z：C15H24N2O8P，[M+H]+，理论值：391.13，实测值：391.38。
(14-4)VP-U-6的合成：
Figure BDA0004119470660001672
在氩气保护条件下向10ml无水二氯甲烷中加入VP-U-5(391mg，1.0mmol)、三氟乙酸吡啶盐(0.232g，1.2mmol)、N-甲基咪唑(0.099g，1.2mmol)，双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(0.452g，1.5mmol)，室温搅拌反应5小时。蒸除溶剂至干，残余物用柱层析纯化(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:乙腈(含0.5wt％三乙胺)＝3:1-1:3梯度洗脱)，收集产物洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物VP-U-6共508mg。31P NMR(161MHz,DMSO-d6)δ150.34,150.29,17.07,15.50.MS m/z：C24H41N4O9P2，[M+H]+，理论值：591.23，实测值：591.55。表明VP-U-6是目标产物VP-Um，作为核苷单体参与RNA链合成。
使用如下方法将5'-磷酸酯修饰连接至反义链5'端：
原料为具有如下式CPR-I结构的磷酸化结构单体，由苏州吉玛提供，货号Cat#13-2601-XX：
Figure BDA0004119470660001681
在反义链全部核苷单体连接完毕后，按照亚磷酰胺核酸固相合成的方法，经脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应将式CPR-I单体连接至反义链5'末端。随后按照如下条件进行切割与脱保护，获得反义链：
将合成的连接有载体的核苷酸序列加入浓度为25wt％的氨水中，相对于核苷酸序列，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃反应16小时，除去液体，残余物用真空浓缩至干。在氨水处理后，相对于单链核酸的量，以0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解产品，随后加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氢氟酸盐，从而脱除核糖上的2'-TBDMS保护。纯化与脱盐：利用制备型离子色谱柱(Source 15Q)，通过NaCl的梯度洗脱纯化核酸。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用Sephadex柱进行脱盐，填料为Sephadex-G25，以去离子水洗脱。
对于目标产物具有5'-硫代磷酸酯修饰的情况，使用与上述同样的步骤，区别在于在连接时，以硫化反应条件代替上述氧化反应条件，从而进行硫化反应。
对于上述合成的正义链和反义链，使用离子交换色谱(IEX-HPLC)检测纯度，并以液质联用色谱(LC-MS)分析分子量，确认所合成的核酸序列是对应于表5中各实施例与对比例的siRNA。
制备例15表3A-3G中其余缀合物的制备
另外地，采用与制备例13中相同的方法，预期能够制备表3A-3G中其余的siRNA缀合物，不同之处在于：1)对于缀合物31-37、52-58、68-74、84-90、121-127和146-152以及对比缀合物4-5、7-8和10-13，以上述制备例2-10或12获得的缀合分子2-8或12和对比缀合分子1-2代替L-9缀合分子(例如，以P-9缀合分子(缀合分子2)代替L-9缀合分子时，预期获得的是缀合物31、52、68、84、121和146这些编号标注有P10的缀合物，以R-4缀合分子(缀合分子3)代替L-9缀合分子时，预期获得的是缀合物32、53、69、85、122和147这些编号标注有R5的缀合物，依此类推)；2)缀合的siRNA具有表3A-3G中所示的对应于缀合物10-15、19-23、27-41、44-61、63-77、79-104、106-108、110、112-114、116-141和143-152以及对比缀合物4-5、7-8和10-17的序列；3)当目标序列中两个核苷酸之间为硫代磷酸酯连接时，用制备例13中描述的硫化反应步骤代替该两个核苷酸中后一个核苷酸的连接中的氧化反应步骤；并且4)当目标序列中的全部核苷酸的2'-位均为修饰的羟基基团时，切割与脱保护条件中不包括脱除核糖上的2'-TBDMS保护的步骤。从而，预期能够制备得到缀合物10-15、19-23、27-41、44-61、63-77、79-104、106-108、110、112-114、116-141和143-152以及对比缀合物4-5、7-8和10-17，按照表3A-3G对其分别进行编号。这些本公开的缀合物结构分别如式(3)、(4)、(7)、(12)、(13)、(14)、(15)、(21)或(22)所示，各对比缀合物结构分别如式(901)、式(902)所示：
Figure BDA0004119470660001691
其中，Nu为对比缀合物4-5、7-8和10-13中的siRNA。
制备例16对比缀合物6和9的合成
使用上述步骤(11-3)中得到的FIN-2合成对比缀合物6和9。RNA固相合成条件、脱保护条件与前述步骤(11-2)所述的核酸固相合成一致，区别仅在于需要使用通用固相载体(UnyLinkerTM loaded
Figure BDA0004119470660001701
HL Solid Supports)，先通过FIN-2的三次反应循环将FIN_FIN_FIN缀合在RNA正义链的3'末端，随后再进行固相合成。
参照Rajeev等人，ChemBioChem 2015,16,903-908中描述的方法进行FIN_FIN_FIN缀合基团的连接，具体而言，首先脱除上述通用固相载体上的羟基保护基团，在偶联反应条件和偶联试剂存在下与FIN-2缀合分子接触发生偶联，经盖帽反应和氧化反应后，获得连接至固相载体的FIN缀合分子。另外脱除该连接至固相载体的FIN缀合分子上的羟基保护基团DMTr，与另一FIN-2缀合分子接触发生偶联，进行盖帽反应和氧化反应，并再重复一次上述脱保护-偶联-盖帽-氧化步骤，连接第三个FIN-2缀合分子，由此获得连接在固相载体上的的缀合基团(FIN_FIN_FIN)。之后由连接至固相载体缀合基团开始，由此连接核苷酸单体，并最终获得具有缀合至3'末端的缀合基团(FIN_FIN_FIN)的RNA正义链。
上述反应中，所述的脱保护、偶联、盖帽、氧化反应的条件、溶剂和试剂与步骤(11-2)中描述的核酸固相合成方法相同。
随后，通过与制备例12中相同的方法进行切割与脱保护、纯化与脱盐、检测、退火，最终获得对比缀合物6和9(以下有时也简称为FIN缀合物)。利用液质联用仪(LC-MS，LiquidChromatography-Mass Spectrometry，购于WatersCorp.，型号：LCT Premier)进行分子量检测。其结果，实测值与理论值相符，从而确定所合成的FIN-siHBa1M1SP缀合物是目标设计的化合物，其结构式如以下式(903)所示：
Figure BDA0004119470660001702
其中，Nu为对比缀合物6或9中的siRNA。
在上述缀合物制备后，使用标准手段冻干为固体粉末保存备用。在需要时，可使用例如注射用水或生理盐水将其重新溶解为所需浓度的溶液使用。
实验例1本实验说明本公开的缀合物的毒性。
在C57BL/6J小鼠上，分别向每只小鼠皮下单次给予100mg/kg或200mg/kg(以siRNA计，为0.9％氯化钠水溶液的形式，各自以浓度10mg/mL或20mg/mL施用10mL/kg)的缀合物24，在持续观察期间，未出现动物死亡，也未观察到与药物不良反应相关的临床症状；给药24h后，临床病理学检验和大体解剖也均未发现异常。上述结果表明，本公开的缀合物具有较低的动物水平毒性。
实验例2本实验说明本公开的缀合物的稳定性
实验例2-1在体外溶酶体裂解液中的稳定性
将缀合物24、25、42、43、62、78以及对比序列1(分别以siRNA浓度为20μM的0.9％氯化钠水溶液形式提供，每组12μl)分别与27.2μL柠檬酸钠水溶液(pH5.0)、4.08μL去离子水和2.72μL鼠Tritosomes(商购自XenotechInc.，货号R0610LT，No.1610069，终浓度为0.2mU/μL)混匀，并在37℃恒温孵育。分别在0h、5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h中的每个时间点取出5μl样本，分别加入到15μL的9M的尿素水溶液中变性，随后加入4μl上样缓冲液(索莱宝公司，货号20160830)，立即冷冻于-80℃冰箱终止反应。0小时表示将待测样品与溶酶体裂解液混匀后，立即取出的时刻。未经溶酶体裂解液处理的参比样品制备：取等摩尔量的上述缀合物(20μM)各1.5μl分别与7.5μL柠檬酸钠水溶液(pH5.0)、1μL去离子水混匀，分别加入15μL 9M的尿素水溶液变性，随后加入4μL上样缓冲液(索莱宝公司，货号20160830)混匀，立即冷冻于-80℃冰箱终止反应。各缀合物参比样品在电泳图中标记为Con。
配制16重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，将冷冻保藏样品中每一组的全部样品分别与4μl上样缓冲液(商购自索莱宝公司，20mM EDTA，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝的水溶液)混合，然后取20μl混合液装载至前述凝胶中，在20mA下电泳10分钟，然后40mA下电泳30分钟。电泳结束后，凝胶用Gelred染料(BioTium，Cat.13G1203)染色10分钟后成相，结果如图1A所示。
所述对比序列1如下：
正义链：5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(SEQ ID NO:250)；
反义链：5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(SEQ ID NO:251)。
按照同样方法，对缀合物105、109、111和115在6h内的稳定性进行了测量，结果示于图1B中。
图1A-1B显示了siRNA缀合物在体外Tritosome中的稳定性半定量检测结果。结果显示，本公开的缀合物在Tritosome中可维持长时间不降解，显示出很好的稳定性。
实验例2-2在人血浆中的体外稳定性
将缀合物24、25、42、43、62、78以及对比序列1(分别以siRNA浓度为20μM的0.9wt％氯化钠水溶液形式提供，每组12μl)分别与108μL 90％人血浆(Humanplasma，PBS稀释)混匀并在37℃恒温孵育。分别在0、2、4、6、8、24、48、72小时中的每个时间点取出10μL样本，立即进行液氮速冻于-80℃冰箱中冻存备用。同时，取等摩尔量的各缀合物(2μM，2μl)与8μl 1×PBS混匀获得10μL未经人血浆处理的样品(记为Con)。配制20重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，将冷冻保藏样品中每一组的全部样品分别与4μL上样缓冲液(20mM EDTA，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝的水溶液)混合，然后上样至前述凝胶，在80mA恒流条件下电泳60分钟。电泳结束后，凝胶用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)染色15分钟后成相，结果如图2A所示。所述对比序列1如下：
正义链：5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(SEQ ID NO:250)；
反义链：5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(SEQ ID NO:251)。
按照同样方法，对缀合物105、109、111和115在72h内的稳定性进行了测量，结果示于图2B中。
由图2A和2B显示了测试的siRNA缀合物在体外人血浆中的稳定性半定量检测结果。结果显示，本公开的缀合物在人血浆中最高72h时仍未降解，显示出优异的在人血浆中的稳定性。
实验例2-3在猴血浆中的体外稳定性
将缀合物24、25、42、43、62、78和对比序列2(分别以siRNA浓度为20μM的0.9wt％氯化钠水溶液形式提供，每组12μl，所述对比序列2为正义链和反义链分别具有SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81所示序列、但未与任何缀合分子缀合的siRNA)分别与108μL 90％食蟹猴血浆(Monkey plasma，购自鸿泉生物，HQ70082，PBS稀释)混匀并在37℃恒温孵育。分别在0、2、4、6、8、24、48、72小时中的每个时间点取出10μL样本，立即进行液氮速冻于-80℃冰箱中冻存。待各时间点取样完毕后，各样品以1×PBS(pH7.4)稀释5倍后取10μL备用。同时，取等摩尔量的以上各缀合物(2μM，2μl)与8μl 1×PBS混匀获得10μL未经猴血浆处理的样品(记为Con)。配制20重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，将上述稀释过样品中每一组的全部样品与4μL上样缓冲液(20mM EDTA，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝的水溶液)混合，然后上样至前述凝胶，在80mA恒流条件下电泳60分钟。电泳结束后，凝胶用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)染色15分钟后成相，结果如图3A所示。
按照同样方法，对缀合物105、109、111和115以及对比序列2在72h内的稳定性进行了测量，结果示于图3B中。
图3A和3B示出了所测试siRNA在体外猴血浆中的稳定性半定量检测结果。可以看出，本公开的siRNA缀合物在食蟹猕猴血浆中最高为72h仍未降解，显示出优异的在猴血浆中的稳定性。
实验例3本实验说明缀合物24和25在大鼠体内的药代动力学
在本实验例中，分别向各实验组的大鼠(每组10只大鼠，雌雄各半)皮下注射给予缀合物24和缀合物25，单次剂量按照10mg/kg和50mg/kg实施。随后检测各时间点的大鼠血浆药物浓度和肝肾组织药物浓度。
首先，将SD大鼠采用PRISTIMA7.2.0版数据***根据大鼠体重分性别随机分组，随后按照设计的剂量分别给予缀合物。所有动物根据体重计算药量，皮下单次给药，剂量为10和50mg/kg，以1mg/ml和5mg/ml的0.9％氯化钠水溶液的形式，体积为10ml/kg。给药前及给药后5分钟(±30秒)、30分钟(±1分钟)、1小时(±2分钟)、2小时(±2分钟)、6小时(±5分钟)、24小时(±10分钟)、48小时(±20分钟)、72小时(±20分钟)、120小时(±30分钟)、168小时(±30分钟)分别从颈静脉采集大鼠全血。之后全血样品于2～8℃在离心力1800×g下离心10分钟分离血浆，血浆样品在一管中放置约70μL，剩余的同一样品放置于另一管中，二者均在-70～-86℃冻存待检。分别在给药后约24、48、72、120、168小时采集大鼠肝肾组织，采集方法包括根据大鼠体重以戊巴比妥钠麻醉(腹腔注射60mg/kg)，腹主动脉采血使大鼠安乐死，对其进行大体解剖。对各大鼠肝脏、肾脏取样，并保存在1mL冻存管中，-68℃以下保存至检测分析。
采用HPLC-FLD(高效液相荧光色谱法)定量检测大鼠血浆及肝肾组织中的缀合物24和25的浓度，具体依据以下步骤：
(1)研磨组织至组织块不大于80mg，随后加入组织和细胞裂解液(Tissue andCell Lysis Solution,供应商：Epicentre，货号：MTC096H)配制成66.7mg/mL的组织匀浆；
(2)对组织匀浆进行超声(150W，30s)以破碎细胞；
(3)对于每组组织样品，取75μL组织样品加至96孔PCR板，加入5μL蛋白酶K(供应商：Invitrogen，货号：25530-015)和10μL的10wt％乙腈和0.01wt％吐温20混合水溶液；
对于血浆样品，取20μL血浆加至96孔PCR板，加入45μL组织和细胞裂解液，5μL蛋白酶K和20μL的10wt％乙腈和0.01wt％吐温20混合液；(4)封板，置于PCR仪(供应商：AppliedBiosystems，型号：
Figure BDA0004119470660001741
PCR system 9700)中，在65℃下孵育45分钟；
(5)孵育结束后，加入10μL 3M KCl水溶液(供应商：Sigma-aldrich，货号：60135-250ML)，摇匀，在4℃，3200rcf离心15分钟；
(6)对于每组组织样品，取80μL上清液加入到120μL杂交混合物中(配方：0.5mL 6μM PNA探针(供应商：杭州泰禾生物科技有限公司)，1mL 200mM的Trizma/pH＝8，5mL 8M尿素水溶液，3.5mL H2O，2mL乙腈)；
对于每组血浆样品，取40μL上清液加入到160μL杂交混合液物(配方：0.5mL 6μMPNA探针，1mL 200mM的Trizma/pH＝8，5mL 8M尿素水溶液，7.5mLH2O，2mL乙腈)；
(7)封板，置于PCR仪中，95℃孵育15分钟；立即置于冰上5分钟；
(8)将样品转移至新的锥形底96孔板，摇匀，以3200rcf离心1分钟；
(9)进样检测，使用HPLC-FLD定量分析(液相***供应商：Thermo Fisher，色谱仪型号：ultimate 3000)。
分析结果参见图4-图11。图4-图7分别示出了缀合物24在大鼠血浆中PK/TK血浆浓度的经时代谢曲线以及在大鼠肝脏及肾脏中PK/TK组织浓度的经时代谢曲线；图8-图11则示出了缀合物25在大鼠血浆中PK/TK血浆浓度的经时代谢曲线以及在大鼠肝脏及肾脏中PK/TK组织浓度的经时代谢曲线。具体而言，
图4是给药量为10mg/kg时，缀合物24在大鼠血浆中PK/TK血浆浓度的经时代谢曲线。
图5是给药量为10mg/kg时，缀合物24在大鼠肝脏及肾脏中PK/TK组织浓度的经时代谢曲线。
图6是给药量为50mg/kg时，缀合物24在大鼠血浆中PK/TK血浆浓度的经时代谢曲线。
图7是给药量为50mg/kg时，缀合物24在大鼠肝脏及肾脏中PK/TK组织浓度的经时代谢曲线。
图8是给药量为10mg/kg时，缀合物25在大鼠血浆中PK/TK血浆浓度的经时代谢曲线。
图9是给药量为10mg/kg时，缀合物25在大鼠肝脏及肾脏中PK/TK组织浓度的经时代谢曲线。
图10是给药量为50mg/kg时，缀合物25在大鼠血浆中PK/TK血浆浓度的经时代谢曲线。
图11是给药量为50mg/kg时，缀合物25在大鼠肝脏及肾脏中PK/TK组织浓度的经时代谢曲线。
由图4-图11的结果可以看出，无论是在低剂量(10mg/kg)还是在相对更高剂量(50mg/kg)下，缀合物24和25在大鼠血浆中的浓度均迅速在数小时内降低至检测限以下；而在肝脏组织中则均在至少168h维持了较高稳定水平的浓度。这表明，通过缀合L-9缀合分子，所得到的siRNA缀合物能够特异性地在肝脏中显著富集并保持稳定，具有高度的靶向性。
实验例4本实验说明由不同缀合分子形成的缀合物在C57BL/6J小鼠中的靶mRNA抑制效果。
首先，将C57BL/6J小鼠随机分组(均为雌性)。实验组分别以缀合物158(5只小鼠)和对比缀合物14进行编号(5只小鼠)，和PBS对照组(8只小鼠)进行编号。所有动物根据体重计算药量，分别以1mg/kg或0.1mg/kg的不同单次剂量皮下给药。给药体积为5ml/kg。为获得不同剂量，缀合物以0.2mg/ml和0.02mg/ml溶于0.9％氯化钠水溶液。给药后72h将动物处死，收集肝脏；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用RNAVzol(VIGOROUS,lot:161G)根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中TTR mRNA的表达水平，具体地：使用ReverseTranscription System(Promega,Lot#0000223677，REF：A3500)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA。接着用荧光定量PCR仪(ABI Step One)检测siRNA对肝组织中的mTTR mRNA表达的抑制效率。在该检测方法中，以GAPDH基因作为内参基因，使用针对TTR的引物和针对GAPDH的引物分别对mTTR和GAPDH进行检测。
检测引物的序列参见表4。
表4检测引物的序列
Figure BDA0004119470660001751
在该实时PCR法中，mTTR mRNA的表达量用TTR基因表达剩余量百分比表示，按如下等式计算：
TTR基因表达剩余量＝(测试组TTR基因的拷贝数/测试组GAPDH的拷贝数)/(对照组TTR基因的拷贝数/对照组GAPDH的拷贝数)×100％，
随后根据下式计算缀合物对mRNA的抑制率：
mRNA抑制率＝(1-TTR基因表达剩余量)×100％，
其中，对照组为本实验中施以PBS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于表5中。
表5小鼠中mTTR mRNA抑制效果
Figure BDA0004119470660001761
根据结果可见，尽管所使用的siRNA序列及修饰均相同，然而缀合物158的靶mRNA抑制率显著高于对比缀合物14。
在以下实验例5至实验例11中，根据siRNA靶位置和序列相关性实验验证表3A至3F中siRNA缀合物的性质和效果。
实验例5对表3A的siRNA缀合物的效果进行验证的实验
实验例5-1对缀合物26的脱靶效果进行验证的实验
根据Kumico Ui-Tei et.al.,Functional dissection ofsiRNA sequence bysystematic DNA substitution:modified siRNA with a DNA seed arm is a powerfultool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-targeteffect.Nucleic Acids Research,2008.36(7),2136-2151描述的方法，构建检测质粒，与被检测的siRNA缀合物共转染至HEK293A细胞中，使用双萤光报告者基因检测试剂盒，检测双萤光报告者基因的表达水平。具体步骤如下：
1，构建检测质粒
采用psiCHECKTM-2(PromegaTM)质粒构建了4种重组质粒，其中GSCM表示在靶质粒，PSCM、GSSM、PSSM表示脱靶质粒：
(1)GSCM，含有目标序列，该目标序列与被检测缀合物的反义链的所有21个核苷酸序列完全互补；
(2)PSCM，含有目标序列，该目标序列与被检测缀合物的正义链的所有21个核苷酸序列完全互补；
(3)GSSM，含有目标序列，该目标序列与被检测缀合物的反义链5’末端的1-8位核苷酸序列完全互补。被检测的缀合物中反义链的5'末端9-21位的核苷酸序列与其相应的目标序列互补错配。错配的规则是，被检测缀合物的反义链5’端第9-21位的任意位置的G、C、A或U核苷酸，分别在目标序列的对应位置与核苷酸T、A、C或G错配。
(4)PSSM，含有目标序列，该目标序列与被检测缀合物的反义链的5’末端1-8位核苷酸序列完全互补。被检测的缀合物中正义链的5'末端9-21位的核苷酸序列与其相应的目标序列互补错配。错配的规则是，被检测缀合物的正义链5’末端第9-21位的任意位置的G、C、A或U核苷酸，分别在目标序列的对应位置与核苷酸T、A、C或G错配。
将目标序列嵌入到psiCHECKTM-2质粒的Xho I/Not I位点。
转染
在96孔板中，根据LipofectamineTM 2000(Invitrogen)的使用说明，共转染siRNA和上述每一种质粒，每种质粒分别对应11组一定浓度的siRNA。具体地，每孔转染质粒10ng，每孔使用LipofectamineTM 20000.2μL，每孔共转染的siRNA终浓度为100nM至0.0001nM(4倍系列稀释物)，每组3个复孔。
3，检测
共转染24小时后，将HEK293A细胞使用双萤光报告者基因检测试剂盒(Dualluciferase reporter gene assay kit，Promega公司，cat.E2940)，根据使用说明书裂解，以检测双萤光报告者基因的表达水平。每一特定浓度的测试组以无缀合物处理为对照(con)。以海肾萤光素酶蛋白水平(Ren)相对于萤火虫萤光素酶蛋白水平(Fir)进行标准化。通过采用不同siRNA浓度所测得的活性结果来绘制剂量-效应曲线，使用Graphad5.0软件的函数log(Inhibitor)与响应-变化斜率用以下公式进行曲线建模：
Figure BDA0004119470660001771
式中：
Y是残留mRNA的表达水平，
X为转染siRNA浓度的对数值，
Bot是稳态期底部的Y值，
Top是稳态期顶部的Y值，
LogIC50是当Y在稳态期底部到顶部之间一半时的X值，而HillSlope则是曲线的斜率。
通过基于剂量效应曲线的计算，确定与GSCM相对应的待测缀合物的IC50值，并与PSCM、GSSM或PSSM进行比较。
对于缀合物24，结果如图12A-12D所示，对应于GSCM，缀合物24的IC50值计算为0.0019nM；与PSCM、GSSM或PSSM相比，缀合物24在各siRNA浓度下均无明显抑制作用，说明本公开的siRNA缀合物在体外具有较高的活性和较低的脱靶效应。
实验例5-2本实验说明表3A中siRNA缀合物在体内对HBV mRNA表达量的抑制效率
在本实验例中，对缀合物16和24在HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中对HBV mRNA表达量的抑制效率进行了考察。
首先，将C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量随机分组(均为雌性，每组4只小鼠)，分别以缀合物16和缀合物24进行编号，并增加生理盐水(NS)对照组。所有动物根据体重计算药量，皮下施用1mg/kg的单次剂量，缀合物浓度分别为0.9％氯化钠水溶液中的0.2mg/ml以及0.02mg/ml，给药体积为5ml/kg。给药后第14天将动物处死，收集肝脏，用RNA Later(SigmaAldrich)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织。再用Trizol根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中HBV mRNA的表达水平。具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA。接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的HBV mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因，使用针对HBV的引物和针对β-肌动蛋白的引物分别对HBV和β-肌动蛋白进行检测。
检测引物的序列参见表5A。
表5A检测引物的序列
Figure BDA0004119470660001781
在该荧光定量PCR法中，HBV mRNA的表达量用HBV基因表达剩余量表示，按如下等式计算：
HBV基因表达剩余量＝(测试组HBV基因的拷贝数/测试组β-肌动蛋白的拷贝数)/(对照组HBV基因的拷贝数/对照组β-肌动蛋白的拷贝数)×100％，图中标识为HBV X/β-肌动蛋白mRNA表达量。
随后根据下式计算缀合物对mRNA的抑制率：
对mRNA的抑制率＝(1-HBV基因表达剩余量)×100％，
其中，对照组为本实验中施以NS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于图13中。
在其它实验中，根据下面的条件再进行两次实验：
采用与上述相同的方法，不同之处在于给予的siRNA缀合物更换为缀合物17、25、159和160进行实验，在第7天收集数据；以及
采用与上述相同的方法，不同之处在于给予的siRNA缀合物更换为缀合物24、161、162和163进行实验，在第28天收集数据，对于每一缀合物，按照1mg/kg和0.3mg/kg两个剂量给药(给药体积保持不变，相应调整缀合物溶液浓度)，结果分别示于图14-15中。
由上述结果可见，在测试时间点不同的多次实验中，全部上述本公开的缀合物均显示出了高的小鼠体内HBV mRNA表达抑制活性。
实验例5-3本实验说明表3A的具有不同缀合分子的siRNA缀合物在HBV转基因小鼠中对mRNA的抑制效果
按照实验例4的方法，在44Bri HBV小鼠中，以表5A的检测序列作为引物对缀合物25、164、165和166的靶mRNA抑制效率进行了检测，结果分别示于表6A中：
表6A siRNA缀合物的靶mRNA抑制效果
Figure BDA0004119470660001791
由表6A可见，由本公开的各种缀合分子形成的siRNA缀合物具有优异的小鼠体内靶mRNA抑制效率。
实验例5-4本实验说明表3A的siRNA缀合物在HBV转基因小鼠血清中对HBsAg和HBVDNA的抑制效率的时间相关性测试
使用AAV-HBV小鼠模型，在动物造模成功后，按血清HBsAg含量随机分组(每组5只)，每组分别给予缀合物24、25和对比缀合物15，以及NS用作空白对照。所有动物根据体重计算药量，皮下单次给药，给药剂量为3mg/kg，药物以0.6mg/ml的0.9wt％氯化钠水溶液的形式提供，给药体积为5ml/kg。在给药前(记为D0)与给药后第7、14、21、28、56、84、112、140、154、168、182天对小鼠眼眶静脉丛取血，在各时间点检测血清HBsAg水平。期间，一旦检测结果中血清HBsAg含量已经接近或超过初始值，则终止该对象的检测。
眼眶取血每次约100μl，离心后血清不少于20μl。利用HBsAg CLIA试剂盒(安图生物，CL0310)检测血清中HBsAg的表达水平。参照QIAamp 96DNABlood Kit说明书提取血清中DNA，进行定量PCR，检测HBV DNA的表达水平。
标准化的HBsAg的表达水平＝(给药后HBsAg含量/给药前HBsAg含量)×100％。
HBsAg抑制率＝(1-给药后HBsAg含量/给药前HBsAg含量)×100％。其中，HBsAg含量用每毫升(ml)血清含多少当量(UI)HBsAg表示。
标准化的HBV DNA的表达＝(给药后HBV DNA含量/给药前HBV DNA含量)×100％。
HBV DNA抑制率＝(1-给药后HBV DNA含量/给药前HBV DNA含量)×100％。
其中，HBV DNA含量用每毫升(ml)血清含多少拷贝HBV DNA表示。
结果如图16和图17所示。由图16的结果可以看出，在给药后不同时间点，NS阴性对照组未显示出任何抑制作用；与之相比，缀合物24和25在给药后不同时间点均体现出了优异的HBsAg抑制效果。特别在3mg/kg剂量下，在最长140天期间，缀合物24始终显示出高的血清中HBsAg的抑制率，说明在较长时间内，缀合物24能够稳定有效地抑制HBV基因的表达。
由图17的结果可以看出，各实施例的siRNA缀合物同样显示出高效的HBV DNA表达抑制，并且在最长84天的时间内均保持了较高的抑制率。
相比之下，尽管对比缀合物15在最初的28天内在每个实施例中实现了近似的mRNA抑制效果，然而此后抑制效果明显下降，从而图16和图17中所示的其抑制效果的持续时间与相同剂量水平下的缀合物24和25相比明显较短。
采用与上述相同的方法又进行了四次实验，对血清HBsAg进行检测，区别之处在于：
采用AAV-HBV低浓度小鼠模型，使用缀合物25，给药剂量分别为3mg/kg和1mg/kg，对照组给予生理盐水NS，测试至第140天，结果参见图18；
采用M-Tg模型，使用缀合物17和25，给药剂量分别为3mg/kg和1mg/kg，对照组给予PBS，测试至第70天，结果参见图19；
采用M-Tg模型，缀合物26的给药剂量分别为5mg/kg、1mg/kg、0.2mg/kg，对比缀合物15的给药剂量为5mg/kg，对照组给予PBS，测试至第78天，结果参见图20；
采用1.28copy模型，使用缀合物24，给药剂量为3mg/kg和1mg/kg，测试至第210天，结果参见图21。
对于上述各种剂量，每种缀合物以相同的剂量体积施用，同时单独调节缀合物溶液的浓度，以便相应地给药。
由图18-21可以看出，本公开的siRNA缀合物在多种动物模型中均显示出持久高效的血清HBsAg抑制效率，并呈现出较规律的剂量依赖性。
实验例6验证表3B-3D的siRNA缀合物效果的实验
实验例6-1缀合物43、62和78的脱靶效应测试
按照实验例5-1描述的方法，分别对缀合物43、62和78的脱靶效应进行了验证，区别仅在于：对于每个缀合物，利用与相应缀合物中的siRNA反义链序列完全互补配对的目标序列构建在靶质粒GSCM，而使用分别与相应缀合物的siRNA反义链序列完全相同、与相应缀合物的siRNA反义链序列的1-8位互补配对或与相应缀合物的siRNA反义链序列的1-8位相同的目标序列构建脱靶质粒GSSM、PSCM和PSSM。结果分别如图22-24所示。从图22-24的结果可以看出，以上所有的缀合物不仅对靶mRNA有很好的抑制作用，而且脱靶效应也很低。
实验例6-2本实验说明本公开的缀合物在小鼠体内对HBV mRNA表达的抑制效果
在本实验例中，关于缀合物25、42、43、62和78在HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中对HBV mRNA表达的抑制效率进行了考察。
首先，将C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量随机分组(均为雌性，每组4只小鼠)，分别进行编号，并增加NS组作为对照组。所有动物根据体重计算药量。分别以1mg/kg以及0.1ml/kg的剂量皮下给予缀合物25和缀合物42，以0.2mg/ml以及0.02mg/ml的缀合物的0.9％氯化钠水溶液的形式给药，给药体积为5ml/kg。给药后第7天将动物处死，收集肝脏，用RNA Later(SigmaAldrich)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织。然后用Trizol根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中HBV mRNA的表达水平，具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的HBV mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因，使用针对HBV的引物和针对β-肌动蛋白的引物分别对HBV和β-肌动蛋白进行检测。
检测引物的序列参见表5A。
在该荧光定量PCR法中，HBV mRNA的表达量以及缀合物对mRNA的抑制率的计算方法与实验例5-2相同。
其中，对照组为本实验中施以NS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于图25中。
在另外的实验中，按照以下条件再进行两次实验：
采用与上述相同的方法，不同之处在于：给予的siRNA缀合物更换为缀合物43、62、78和25进行实验，在第7天收集检测数据，结果示于图26；以及
采用与上述相同的方法，不同之处在于：给予的siRNA缀合物更换为缀合物42、43和25进行实验，对于缀合物42和25，各自分别以1mg/kg和0.1mg/kg(其中，剂量体积保持不变，缀合物溶液浓度分别进行调整)的剂量给药，且用于检测的引物序列更换为表5B所示的序列，结果示于图27：
表5B检测引物的序列
Figure BDA0004119470660001811
由图26和图27可见，全部上述本公开的缀合物对于小鼠体内HBV mRNA表达均具有高抑制活性。另外对于不同HBV mRNA的抑制效果基本一致。
实验例6-3本实验说明表3B的siRNA缀合物在HBV转基因小鼠血清中对HBsAg表达和HBV DNA的抑制效率的时间相关性测试
使用AAV-HBV低浓度模型小鼠。成功建立动物模型之后，按血清HBsAg含量随机分组(每组5只小鼠)。每组分别给予缀合物43，PBS用作空白对照。所有动物根据体重计算药量。皮下单次给药，给药剂量为3mg/kg或1mg/kg两个组别，使用浓度分别为0.6mg/ml或0.2mg/ml的缀合物的0.9％氯化钠水溶液，给药体积为5ml/kg。在给药前与给药后第7、14、21、28、56、84、112、126和140天对小鼠眼眶静脉丛取血，在各时间点检测血清HBsAg水平。
眼眶取血每次约100μl，离心后血清不少于20μl。利用HBsAg CLIA试剂盒(安图生物，CL0310)检测血清中HBsAg的含量。
标准化的HBsAg的表达＝(给药后HBsAg含量/给药前HBsAg含量)×100％。
HBsAg抑制率＝(1-给药后HBsAg含量/给药前HBsAg含量)×100％。其中，HBsAg含量用每毫升(ml)血清含多少当量(UI)HBsAg表示。
结果如图28所示。由图28的结果可以看出，在给药后不同时间点，NS阴性对照组未显示出抑制作用；与之相比，缀合物43在给药后不同时间点均体现出了优异的HBsAg抑制效果，在最长达100天的时间内持续显示出高的血清HBsAg抑制率，表明其能够在较长时间内稳定高效地抑制HBV基因的表达。
在进一步的实验中，按照上述方法，在M-Tg模型小鼠中，缀合物24、62和78，分别按3mg/kg和1mg/kg剂量给药，使用浓度为0.6mg/ml或0.2mg/ml的缀合物的0.9wt％氯化钠水溶液，给药体积为5ml/kg。测试持续至第85天，结果示于图29和30。
由图29的结果可以看出，缀合物24、62和78均最长85天内显示出延长且有效的血清HBsAg抑制效果；由图30可知，在给药后第85天，3mg/kg剂量组的缀合物24和78分别显示出68.6％和62％的HBV mRNA抑制率。
在进一步的实验中，按照上述方法，在1.28copy模型小鼠中，分别按3mg/kg和1mg/kg剂量施用缀合物43，使用浓度分别为0.6mg/ml或0.2mg/ml的缀合物的0.9％氯化钠水溶液，给药体积为5ml/kg，测试持续至第85天。按照实验例5-4的方法对HBsAg和HBV DNA的抑制效果进行检测，结果示于图31和32。
由图31和32的结果可知，在1.28copy小鼠中，本公开的缀合物43在最长85天的时间内持续显示出对HBV表达以及HBV DNA的高效抑制。
实验例7验证缀合物167和168效果的实验
实验例7-1本实验说明本公开的siRNA缀合物在体外具有较高活性的同时，还具有低脱靶效应。
本实验例考察了缀合物168在体外psiCHECK***中的在靶活性(on-targetactivity)及脱靶效应。具体来说，测定了缀合物168靶向完全匹配目标序列(其核苷酸序列与缀合物168的反义链的全长核苷酸序列完全互补或一致)或靶向种子区域匹配目标序列(其核苷酸序列与缀合物168的反义链的1-8位核苷酸序列互补或一致)的活性。
按照实验例5-1的方法，对缀合物168进行了验证，区别仅在于，使用完全与缀合物168中的siRNA反义链的序列互补的目标序列以构建在靶质粒GSCM，而使用与缀合物168中siRNA的反义链序列完全相同的目标序列、与缀合物168中siRNA的反义链序列的1-8位互补配对的目标序列或与缀合物168中siRNA的反义链序列的1-8位相同的目标序列分别构建脱靶质粒GSSM、PSCM和PSSM。从实验结果可以看出，以上所有的缀合物不仅对靶mRNA有很好的抑制作用(IC50＝0.0513nM)，还显示出低的脱靶效应。
实验例7-2本实验说明本公开的siRNA缀合物在溶酶体裂解液中的体外稳定性
将制备例1中得到的缀合物167和对比序列1(以siRNA浓度计算，分别为20μM的0.9wt％氯化钠水溶液，每组6μl，将对比序列1标记为NC)分别与27.2μL柠檬酸钠水溶液(pH5.0)、4.08μL去离子水和2.72μL鼠源溶酶体裂解液(商购自Xenotech Inc.，货号R0610LT，终浓度为0.2mU/μL)混匀并在37℃恒温孵育。分别在0、1、2、4、6、24小时中的每个时间点取出5μl样本，分别加入到15μL 9M的尿素水溶液中变性，立即于-80℃冰箱中冻存备用。0小时表示将siRNA缀合物与溶酶体裂解液混匀后，立即取出测试的时刻。平行地，对于缀合物167和对比序列1，分别取等摩尔量的siRNA(20μM，1.5μl)，与7.5μL柠檬酸钠水溶液(pH 5.0)和1μL去离子水混匀，再加入到30μl 9M的尿素水溶液中变性，接着和8μL的6x上样缓冲液(20mM EDTA水溶液，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝)混匀，并立即于-80℃冰箱中冻存淬灭反应。由此制得未经溶酶体裂解液处理的待测样品(在电泳图中标记为M)。配制16重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶。将20μL每个用于测试的样品上样到凝胶，在80mA恒流条件下电泳60分钟。电泳结束后，凝胶用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)染色15分钟后成相，结果如图33所示。
采用相同的方法测定缀合物167和对比序列1(图34中标记为NC)中鼠源溶酶体裂解液的稳定性，除了用鼠源裂解液代替人源溶酶体裂解液(Rat Liver Tritosomes，商购自Xenotech Inc.，货号R0610.LT，终浓度为0.2mU/μL)，结果如图34所示。
由图33和34表明，本公开的缀合物无论在人源溶酶体裂解液还是在鼠源溶酶体裂解液中，都表现出令人满意的稳定性，至少能够维持24小时不降解。
实验例7-3本实验说明本公开的缀合物在小鼠体内对HBV mRNA表达的抑制效率
本实验例考察了缀合物167和缀合物168的siRNA缀合物在HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中对HBV mRNA表达的抑制效率。
首先，将C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HBsAg含量随机分组(均为雌性，每组5只小鼠)，分别给予PBS和缀合物167、缀合物168。其中，PBS组，每只动物皮下施用5ml/kg的1×PBS；对于缀合物167或缀合物168，单次皮下给药，各自的给药剂量为1mg/kg，缀合物以0.2mg/ml浓度的0.9％氯化钠水溶液提供，给药体积为5ml/kg。给药后第28天将所有动物处死。收集肝脏，用RNALater(SigmaAldrich)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中HBV mRNA的表达水平，具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的HBV mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因，使用针对HBV的引物和针对β-肌动蛋白的引物分别对HBV和β-肌动蛋白进行检测。
检测引物的序列参见表5G。
表5G检测引物的序列
Figure BDA0004119470660001841
在该荧光定量PCR法中，HBV mRNA的表达量以及缀合物对mRNA的抑制率的计算方法与实验例5-2相同。结果示于以下表6G中。
在其他实验中，采用与上述相同的方法，所不同的是以缀合物167和168替换用于检测的给予的siRNA缀合物，并且给药剂量改变，结果示于以下表6G中。
表6G siRNA缀合物在小鼠肝脏中对HBV mRNA表达的抑制
Figure BDA0004119470660001842
由上述结果可见，本公开全部缀合物均显示出了高的小鼠体内HBV mRNA表达抑制活性。这也说明本公开的siRNA缀合物具有良好的体内递送效率。
实验例7-4本实验说明表3B中的siRNA缀合物在HBV转基因小鼠血清中对HBsAg和HBV DNA表达量的抑制效率的时间相关性测试
在1.28copy模型中，将这些小鼠随机分组(每组6只小鼠，雌雄各半)。各组分别给予生理盐水和不同剂量的缀合物168。生理盐水组皮下注射5ml/kg的生理盐水。对于缀合物组，所有动物根据体重计算药量。皮下单次给药，给药剂量分别为3mg/kg或1mg/kg，缀合物分别以0.6mg/ml或0.2mg/ml的0.9wt％氯化钠水溶液提供，给药体积为5ml/kg。在给药前与给药后第7、13、21、28、42、56、70、84、98、112、126、140和154天对小鼠眼眶静脉丛取血，在各时间点检测血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平。
眼眶取血每次约100μl，离心后血清不少于20μl。利用HBsAg CLIA试剂盒(安图生物，CL0310)检测血清中HBsAg的含量；利用HBeAg CLIA试剂盒(安图生物，CL0310)检测血清中HBeAg的含量；参照QIAamp 96DNABloodKit说明书提取血清中DNA，进行定量PCR，检测HBVDNA的表达水平。
标准化的HBsAg的表达＝(给药后HBsAg含量/给药前HBsAg含量)×100％。
HBsAg抑制率＝(1-给药后HBsAg含量/给药前HBsAg含量)×100％。其中，HBsAg含量用每毫升(ml)血清含多少当量(UI)HBsAg表示。
标准化的HBeAg的表达＝(给药后HBeAg含量/给药前HBeAg含量)×100％。
HBeAg抑制率＝(1-给药后HBeAg含量/给药前HBeAg含量)×100％。其中，HBeAg含量用每毫升(ml)血清含多少当量(UI)HBeAg表示。
标准化的HBV DNA的表达＝(给药后HBV DNA含量/给药前HBV DNA含量)×100％。
HBV DNA抑制率＝(1-给药后HBV DNA含量/给药前HBV DNA含量)×100％。
其中，HBV DNA含量用每毫升(ml)血清含多少HBV DNA拷贝表示。
结果如图35-37所示。由图35可以看出，在给药后不同时间点，施以生理盐水的阴性对照组未显示出抑制作用；与之相比，缀合物168在给药后不同时间点对HBsAg均体现出了优异的HBsAg抑制效果。特别是3mg/kg组在最长达100天的时间内始终显示出90％以上的血清HBsAg抑制率，表明其能够在较长时间内稳定高效地抑制HBV基因的表达。
由图36可以看出，siRNA缀合物同样可以抑制HBeAg的表达，其中3mg/kg剂量组在最长达70天内，对血清HBeAg的表达抑制率始终在50％以上。
由图37的结果可以看出，siRNA缀合物还可以高效抑制HBV DNA的表达，在最长达154天的时间内始终保持了较高的抑制率。
实验例8验证表3E的siRNA缀合物效果的实验
实验例8-1本实验说明表3E的siRNA缀合物在体内对ANGPTL3 mRNA表达量的抑制效率的影响
在本实验例中，考察缀合物105、109、111和115对于正常BALB/c小鼠肝脏组织中ANGPTL3 mRNA的抑制率。
将正常BALB/c小鼠(6-8周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司)随机分组(每组5只)，分别向每组小鼠给予缀合物105、109、111和115以及PBS。所有动物根据体重计算药量，采用皮下注射方式单次给药，siRNA缀合物给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg和0.3mg/kg，缀合物分别以0.3mg/ml和0.03mg/ml浓度的0.9wt％氯化钠水溶液提供，给药给药体积为10mL/kg。给药后14天和第28天各自处死一批小鼠，收集肝脏，用RNA Later(Sigma Aldrich)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol(Thermo Fisher公司)根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中ANGPTL3 mRNA的表达水平，具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的ANGPTL3 mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以GAPDH基因作为内参基因，使用针对ANGPTL3的引物和GAPDH的引物分别对ANGPTL3和GAPDH进行检测。
检测引物的序列参见表5E。
表5E检测引物的序列
Figure BDA0004119470660001861
ANGPTL3 mRNA的表达量按如下等式计算：ANGPTL3 mRNA表达量＝(测试组ANGPTL3mRNA的表达量/测试组GAPDH mRNA的表达量)/(对照组ANGPTL3 mRNA的表达量/对照组GAPDH mRNA的表达量)×100％。
缀合物对ANGPTL3 mRNA表达量的抑制率按如下等式计算：ANGPTL3 mRNA表达量抑制率＝[1-(测试组ANGPTL3 mRNA的表达量/测试组GAPDH mRNA的表达量)/(对照组ANGPTL3mRNA的表达量/对照组GAPDH mRNA的表达量)]×100％。对照组为本实验中施以PBS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于图38A和38B中。
图38A和38B的结果表明，上述siRNA缀合物均显示出优异的ANGPTL3 mRNA表达抑制活性。
将上述实验对象眼眶采集的血液(约100μl)进行离心得到血清，进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的含量，血脂结果进行标准化处理，血脂水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。血脂指总胆固醇或甘油三酯。检测结果示于图39A和39B中。
由图39A和39B的结果可见，经不同剂量下的缀合物105、109、111和115治疗后的小鼠血清中的CHO和TG的含量明显下降，并且至少在给药后28天时仍观察到血脂水平降低。
实验例8-2本公开的siRNA缀合物对血脂的影响
对于Tg(APOC3)3707Bres模型小鼠，将其按照TG含量>2mmol/L进行随机分组(每组5只小鼠)，给予缀合物115，以及PBS空白对照。所有动物根据体重计算药量，皮下单次给药，给药剂量为3mg/kg或1mg/kg，缀合物分别以0.6mg/ml和0.2mg/ml浓度的0.9％氯化钠水溶液提供，给药体积为5ml/kg。在给药前与给药后第7、14、21、28、35、56、70、84、98、112、126、140、154和168天对小鼠眼眶取血，检测血清CHO和TG水平。
眼眶取血每次约0.1ml，离心后血清不少于20μl。使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的含量。
血脂结果进行标准化处理，
标准化的血脂水平＝(给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)。
血脂水平的抑制率＝(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。
结果如图40A和40B所示。
由图40A和40B可以看出，在给药后不同时间点，在最长达168天的时间，缀合物115有明显地降TG和CHO效果；表明其能够在长时间内稳定高效地抑制小鼠体内ANGPTL3基因的表达。
在另外的实验中，采用与上述相同的方法，区别在于：采用ob/ob模型小鼠，单独给予缀合物111、缀合物115和对比缀合物16，每一缀合物按照3mg/kg和1mg/kg分别给药；在给药后第0、7、14、21、28、35和41天采集数据。其结果示于图41A-41B中。
由图41A-41B的结果可见，本公开的缀合物111和115能够在41天的时间内持续降低ob/ob小鼠体内的血脂水平，显示出优异的抑制活性。
在另外的实验中，采用与上述相同的实验方法，区别在于：单独给予缀合物111和对比缀合物16，每一缀合物按照3mg/kg和1mg/kg分别给药，缀合物分别以0.6mg/ml和0.2mg/ml浓度的0.9wt％氯化钠水溶液提供，给药体积5ml/kg；在给药后第0、7、14、21、28、35、42、56和70天检测CHO值和TG值。其结果示于图42A-42D中。
由图42A-42D可见，本公开的缀合物111能够在70天内持续降低血脂，且优于同等剂量下的对比缀合物16。
实验例8-3本实验说明表3A中具有不同缀合分子的siRNA缀合物对ANGPTL3mRNA表达的抑制效率以及对非人类灵长类动物血脂的影响
对于患有代谢综合症的猴(全部为雄性)，将12只进行分组，8只为给予缀合物169的实验组，4只为给予缀合物25的对照组；对猴子的基础数据进行测定和观察，时间为3周，每周取血一次，检测血脂水平(TG、CHO、HDL)。随后，给予缀合物169和缀合物25(作为对比缀合物，因为其siRNA靶向完全不相关的mRNA)，所有动物按照体重计算药物剂量。单次皮下注射，剂量为9mg/kg(按siRNA数量计)，以100mg/ml的0.9wt％NaCl水溶液形式给药，每个给药部位的剂量体积不超过2ml。在给药前与给药后第7、14、21、28、35天取血，在各时间点检测血清TG和CHO水平。
血脂结果进行标准化处理，标准化的血脂水平＝(给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)。
血脂水平的抑制率＝(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。
给药前测试组血脂含量：给药前3周的血脂含量均值。图43A和图43B中标记为D0。
在第0天(给药当天)和第28天进行肝脏穿刺活检检测肝脏组织ANGPTL3 mRNA表达水平。收集肝脏，用RNA Later(Sigma Aldrich)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol(Thermo Fisher公司)根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中ANGPTL3 mRNA的表达水平。具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega公司)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的ANGPTL3mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作为内参基因，使用针对ANGPTL3的引物和针对GAPDH的引物分别对ANGPTL3和GAPDH进行检测。
检测引物的序列参见表6E。
表6E检测引物的序列
Figure BDA0004119470660001881
ANGPTL3 mRNA的表达量以及对ANGPTL3 mRNA的抑制率计算与实验例8-1相同。对照组为本实验中施以PBS的对照组猴，测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组猴。结果如图43A-43C所示。
由图43A-43C可以看出，缀合物169显示出明显的降低TG效果以及ANGPTL3基因的表达抑制，在给药后第28天降低了82.7％的ANGPTL3基因mRNA。
实验例9表3F的siRNA缀合物效果的实验
实验例9-1本实验说明表3F的siRNA缀合物在体内对APOC3 mRNA表达的抑制效率
在本实验例中，考察缀合物144在人APOC3转基因小鼠(B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，购于Jackson Lab)体内对肝脏组织中APOC3表达水平的抑制率。
将人APOC3转基因小鼠(6-8周龄，甘油三酸酯>2mmol/L)随机分组，每组5只小鼠，分别向每组小鼠给予缀合物144和缀合物25(作为对比缀合物，因为其siRNA靶向完全不相关的mRNA)。所有动物根据体重计算药量，皮下单次给药，siRNA缀合物给药剂量(以siRNA的量计)分别为1mg/kg和0.1mg/kg，缀合物分别以0.2mg/ml和0.02mg/ml浓度的0.9wt％氯化钠水溶液提供，给药体积为5mL/kg。给药后14天处死小鼠，收集肝脏，用RNA Later(SigmaAldrich)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol(Thermo Fisher公司)根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中APOC3 mRNA的表达水平。具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的APOC3 mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因，使用针对APOC3的引物和针对β-肌动蛋白的引物分别对APOC3和β-肌动蛋白进行检测。
检测引物的序列参见表7F。
表7F检测引物的序列
Figure BDA0004119470660001891
APOC3 mRNA表达量按如下等式计算：APOC3 mRNA表达量＝(测试组APOC3mRNA的表达量/测试组β-肌动蛋白mRNA的表达量)/(对照组APOC3 mRNA的表达量/对照组β-肌动蛋白mRNA的表达量)×100％。
缀合物对APOC3 mRNA表达量的抑制率通过下式计算：抑制率＝[1-(测试组APOC3mRNA的表达量/测试组β-肌动蛋白mRNA的表达量)/(对照组APOC3 mRNA的表达量/对照组β-肌动蛋白mRNA的表达量)]×100％。其中，对照组为本实验中施以PBS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于图44A中。
图44A的结果显示，缀合物144对转基因鼠中的人APOC3基因显示出显著的体内抑制活性。
实验例9-2本实验说明实施例144的siRNA缀合物在体内对血脂含量的影响
在本实验例中，考察实施例144的siRNA缀合物在人APOC3转基因小鼠(B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，购于Jackson Lab)体内对血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)含量的影响。
将人APOC3转基因小鼠(6-8周龄，TG含量>2mmol/L)进行随机分组(每组7只小鼠)：(1)NS控制组；(2)缀合物1443mg/kg组；(3)缀合物1441mg/kg组。所有动物根据体重计算药量，皮下单次给药，siRNA缀合物分别以0.6mg/ml和0.2mg/ml浓度的0.9wt％氯化钠水溶液提供，给药体积为5mL/kg。
分别于给药前(记为第0天)，及给药后第7、14、21、28、35、42、49、63、77、91、112、133、147、154、161、175和189天进行眼眶采血(约100μL)，离心得到血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的含量，血脂结果进行标准化处理，标准化的血脂水平和血脂水平的抑制率的计算方法与实验例8-3相同。检测结果示于图44B和44C中。
由图44B和44C可以看出，在最长189天，实施例的siRNA缀合物有明显地下调TG和CHO效果，表明其能够在长时间内稳定高效地抑制人APOC3基因的表达。
在另外的实验中，使用与以上相同的方法，区别在于，给予缀合物170；以0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg分别给药(给药体积不变，相应调整缀合物溶液浓度)；在给药后第112天采集数据。结果示于图45A和45B中。
由图45A和45B的结果可知，缀合物170能够在最长达112天的时间内持续降低转基因小鼠体内的血脂和ANGPTL3 mRNA水平，并且该降低效果显示出明显的剂量依赖效应。
在另外的实验中，采用与上述相同的方法对小鼠血清总胆固醇(CHO)和总血脂(TG)进行测量，区别在于：给予缀合物144、170和171以及对比缀合物17，每一缀合物按1mg/kg和3mg/kg给药(给药体积不变，相应调整缀合物溶液浓度)。在给药后第112天采集数据。结果参见图46A-图46D。
由图46A-图46D的结果可知，在最长达112天的时间内，缀合物144、170和171均显示出对转基因小鼠中血脂的持续降低作用，其持续降低效果总体上优于对比缀合物17。
以上详细描述了本公开的具体实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开不再描述各种可能的组合方式。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以任意组合来实施，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种化合物，所述化合物具有式(321)所示的结构：
Figure FDA0004119470650000011
其中，
n1为1-3的整数，n3为0-4的整数；
每个m1、m2和m3各自独立地为2-10的整数；
每个R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基和C1-C10烷氧基；
R4为能够通过共价键与活性药物或活性剂结合的基团；
每个L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个S1独立地为M1，其中任何活性羟基，如果有的话，都被羟基保护基团保护；
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，每个L1独立地选自于由基团A1-A26及其任意组合所组成的组：
Figure FDA0004119470650000021
其中，每个j1独立地为1-20的整数；
每个j2独立地为1-20的整数；
每个R’独立地为C1-C10烷基；
每个Ra独立地选自于由基团A27-A45及其任意组合所组成的组：
Figure FDA0004119470650000031
每个Rb独立地为C1-C10烷基；
Figure FDA0004119470650000041
表示基团连接至分子其余部分的位点；
优选地，L1选自于由基团A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13及其连接组合所组成的组；进一步优选地，L1为基团A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合；和/或
L1的长度为3-25个原子，其中所述L1的长度指L1中由与含氮骨架中的N原子连接的原子到与S1连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数；优选地，L1的长度为4-15个原子。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3；和/或，每个m1、m2和m3各自独立地为2-5的整数；优选地，m1＝m2＝m3。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中，受保护的羟基具有YCOO-结构，其中每个Y独立地选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基和C6-C10芳基，其任选地具有一个或多个取代基，所述取代基选自于由卤素取代基和C1-C6烷基所组成的组；和/或
每个M1独立地为肝实质细胞表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体；优选地，每个M1独立地选自于由以下所组成的组：D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖和L-4-硫代核糖；更优选地，至少一个或每个M1为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中，R4是能够通过磷酸二酯键连接到寡核苷酸的基团；优选地，R4包括第1官能团，所述第1官能团可以与寡核苷酸或核苷酸上的基团反应以形成磷酸酯键；更优选地，R4还包括第2官能团，所述第2官能团能够和羟基基团或氨基基团形成共价键，或者为通过与羟基基团或氨基基团形成的共价键而连接于分子其余部分的固相载体。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的化合物，其中，该化合物具有式(403)-(442)所示的结构：
Figure FDA0004119470650000051
Figure FDA0004119470650000061
Figure FDA0004119470650000071
Figure FDA0004119470650000081
Figure FDA0004119470650000091
Figure FDA0004119470650000101
/>
Figure FDA0004119470650000111
/>
Figure FDA0004119470650000121
/>
Figure FDA0004119470650000131
/>
Figure FDA0004119470650000141
/>
Figure FDA0004119470650000151
/>
Figure FDA0004119470650000161
其中，X为O或NH，M+为阳离子，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体。
7.一种缀合物，所述缀合物具有式(1)所示的结构：
Figure FDA0004119470650000162
其中，
n1为1-3的整数，n3为0-4的整数；
每个m1、m2和m3各自独立地为2-10的整数；
每个R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基和C1-C10烷氧基；
R3为活性药物；
R2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，R2任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个L1独立地是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个M1选自能够和细胞表面受体结合的配体之一。
8.根据权利要求7所述的缀合物，其中，R3为具有式A59所示结构的基团：
Figure FDA0004119470650000181
其中，E1为OH、SH或BH2，Nu为功能性寡核苷酸；
优选地，所述缀合物具有式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)或(22)所示的结构：
Figure FDA0004119470650000182
/>
Figure FDA0004119470650000191
/>
Figure FDA0004119470650000201
/>
Figure FDA0004119470650000211
/>
Figure FDA0004119470650000221
/>
Figure FDA0004119470650000231
9.根据权利要求8所述的缀合物，其中，所述功能性寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述式A59中的P原子连接到所述双链寡核苷酸的末端区域，所述双链寡核苷酸的末端区域指最靠近所述正义链或所述反义链一端的4个核苷酸；
优选地，式A59中的P原子连接到所述正义链的3'末端。
更优选地，所述双链寡核苷酸为siRNA，所述siRNA中的每个核苷酸独立地为修饰或未修饰的核苷酸；所述siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为19个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成双链互补区；所述核苷酸序列2与第一段核苷酸序列至少部分互补，所述第一段核苷酸序列为靶mRNA中的一段核苷酸；所述靶mRNA指在肝细胞中异常表达的基因的mRNA。
10.根据权利要求7-9中任意一项所述的缀合物在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途；
优选地，所述特定基因选自于由以下基因所组成的组：乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因和载脂蛋白C3基因；
更优选地，所述疾病选自于由以下疾病所组成的组：慢性肝病、肝炎、肝纤维化、肝增生性疾病和血脂异常。
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Assignee: Qilu Pharmaceutical Co.,Ltd.

Assignor: Suzhou Ruibo Biotechnology Co.,Ltd.

Contract record no.: X2024990000092

Denomination of invention: Conjugates and their preparation methods and applications

License type: Common License

Record date: 20240307

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