CN114685585B - 核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途 - Google Patents

核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

一种核苷酸序列，所述核苷酸序列中的每个核苷酸为修饰或未修饰的核苷酸，其中，该核苷酸序列包含核苷酸序列I，所述核苷酸序列I是核苷酸序列A中按照5'端‑3'端方向的第2位至第8位核苷酸中至少一个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列，所述核苷酸序列A具有16‑30个核苷酸，并且所述核苷酸序列A与靶mRNA中的一段核苷酸序列至少有14个核苷酸反向互补，所述无环脱碱基基团具有如式(101)所示的结构。所述核苷酸序列、含有所述核苷酸序列作为反义链的双链寡核苷酸，含有该双链寡核苷酸的药物组合物和siRNA缀合物能够有效减少脱靶效应，达到降低毒性的目的。

Description

核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物与缀合物及制备方法 和用途
技术领域
本公开关于一种核苷酸序列、含有核苷酸序列的双链寡核苷酸、药物组合物和缀合物及它们的制备方法和用途。
背景技术
核酸药物作为重要的新型药物，日益显示出优异的研发和应用潜力。其中，双链寡核苷酸作为药物活性成分已为公众所知。近年来，在双链寡核苷酸成药领域的研究取得了巨大的进展。而在双链寡核苷酸的成药研究中，脱靶效应是重要的和药物毒性相关的效果之一。
然而，许多临床前药学研究中显示出优异药学活性的核酸药物例如双链寡核苷酸由于其明显的脱靶效应产生的毒性而难以用于实际的药物研发。介于此，本领域的技术人员一直在努力开发合成同时具有良好的药学活性和低的脱靶效应的核酸药物例如双链寡核苷酸。因此，如何在降低核酸药物脱靶效应的同时保持良好的药学活性，正是本领域中亟待解决的一类重要问题。
发明内容
为了开发一种在具有良好的药学活性的同时，还显示出降低的脱靶效应的核苷酸序列、以及含有该序列的双链寡核苷酸，本公开的发明人出人意料地发现，在核苷酸序列中的特定位置处，使用无环脱碱基基团替代原有的核苷酸，可有效降低核苷酸序列及含有该核苷酸序列的核酸药物的脱靶效应，同时，还能基本保持较高的药学活性。获得靶mRNA抑制效率和安全性具有良好平衡的核酸药物。从而，发明人作出如下发明：
在一方面，本公开提供一种核苷酸序列，所述核苷酸序列中的每个核苷酸为修饰或未修饰的核苷酸，其中，该核苷酸序列具有16-30个核苷酸；该核苷酸序列与靶mRNA中的一段核苷酸序列至少有14个核苷酸反向互补；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列的第2位至第8位核苷酸之间至少一个核苷酸被无环脱碱基基团所替代。
在另一方面，本公开还提供包含本公开的核苷酸序列形成的反义链和与其至少部分地反向互补的正义链所形成的双链寡核苷酸。
在又一方面，本公开还提供包含本公开的双链寡核苷酸药物组合物，该药物组合物含有本公开的双链寡核苷酸和药学尚可接受的载体。
在又一方面，本公开还提供包含本公开的双链寡核苷酸的缀合物，该缀合物包含本公开的双链寡核苷酸和缀合连接至该双链寡核苷酸的配体。
在又一方面，本公开提供了本公开的双链寡核苷酸、药物组合物或缀合物在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
在又一方面，本公开提供了一种治疗由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的方法，所述方法包括向患有该疾病的受试者给予本公开的双链寡核苷酸、药物组合物或缀合物。
在又一方面，本公开提供了一种抑制肝细胞中特定基因表达的方法，该方法包括将本公开的双链寡核苷酸、药物组合物或缀合物与所述肝细胞进行接触。
另外，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本公开的双链寡核苷酸、药物组合物或缀合物。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
附图说明
图1为分别转染了缀合物1-8或参比缀合物1后，psi-CHECK***中APOC3 mRNA相对表达量柱状图。
图2为分别转染了缀合物9-11或分别转染了参比缀合物2-4后，psi-CHECK***中APOC3 mRNA相对表达量的柱状图。
图3为分别转染了缀合物26-30、或参比缀合物5、或阴性参比缀合物后，在36天时间内，小鼠体内血清甘油三酯水平的折线图。
图4为分别转染了缀合物32、或参比缀合物15-17、或阴性参比缀合物后，非靶基因的基因表达水平发生显著上调、下调和不变的基因数量的柱状图。
图5为本公开的siRNA缀合物在体外溶酶体裂解液中的稳定性试验的半定量结果。
有益效果
本公开的核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物或缀合物在具有显著降低的脱靶效应的同时。还表现出较高的靶mRNA调节活性，并且具有良好的稳定性，具体说明如下。
第一，本公开的核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物或缀合物可在体外或体内具有显著更低的脱靶效应。例如，在体外psi-CHECK***中，与具有相同序列、但不含有无环脱碱基基团的siRNA缀合物相比，本公开的缀合物对脱靶目标序列的抑制活性在测试浓度范围内均不高于25％，均表现出明显降低的脱靶效应。又例如，与各种不包含无环脱碱基基团的不同修饰方案的双链寡核苷酸相比，本公开的双链寡核苷酸均具有显著降低的脱靶效应。并且，在不同位置、具有不同数量的、不同立体构型的无环脱碱基基团的本公开的siRNA缀合物均显示出与不具有无环脱碱基基团的siRNA缀合物相比显著降低的脱靶效应。又例如，本公开的用于调节HAO1 mRNA抑制活性的缀合物显示出比具有其它无环脱碱基基团的缀合物、或不含有无环脱碱基基团的缀合物更低的基因上调或下调数量，显示出显著更低的脱靶效应。又例如，本公开的用于调节ANGPTL3 mRNA的siRNA缀合物，对脱靶序列的抑制活性均未高到可以计算出IC50的数值，即均未表现出明显的脱靶效应
第二，本公开的核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物或缀合物可在体外或体内表现出较高的靶mRNA调节活性，甚至表现出比不具有无环脱碱基基团的siRNA缀合物更高的靶mRNA抑制活性。例如，在50nM的浓度下，本公开的siRNA缀合物表现出高达71.43％、甚至77.14％的APOC3 mRNA抑制活性，比不含有无环脱碱基基团的参比缀合物高出9.52％。又例如，本公开提供的siRNA缀合物在小鼠肝原代细胞中显示出较高的APOC3 mRNA抑制活性，在20nM的siRNA缀合物浓度下，对APOC3 mRNA抑制率均达到91.5％以上，均高于参比缀合物对APOC3mRNA的抑制率。并且，在给药剂量为3mg/kg的条件下，在单次给药后长达36天时间内，siRNA缀合物对甘油三酯的抑制率始终维持在78％以上、最大抑制率高达84.63％。又例如，本公开的包含无环脱碱基基团的双链寡核苷酸具有比包含其他无环脱碱基基团的双链寡核苷酸显著更高的HBV mRNA抑制活性。又例如，在20nM的siRNA缀合物浓度下，本公开的缀合物对HAO1 mRNA抑制率均达到91.5％以上。在50nM的浓度下，本公开的缀合物表现出了高达82.5％的ANGPTL3 mRNA抑制活性，比参比缀合物高出28％。并且，在20nM的siRNA缀合物浓度下，本公开的缀合物对小鼠体内ANGPTL3 mRNA抑制率均高达92％以上，比参比缀合物的抑制率高出64.33％和65.14％。
第三，本公开的核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物或缀合物具有良好的稳定性，例如，本公开的缀合物在溶酶体裂解液中显示出很高的稳定性，可维持长时间不降解。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
在本公开中，如无其他说明，HBV基因是指乙型肝炎病毒(HBV)的病毒基因，例如具有如Genbank注册号NC_003977.2所示序列的基因，HBV mRNA是指由上述HBV基因转录的mRNA；APOC3 mRNA是指具有如Genbank注册号NM_000040.3所示序列的mRNA，APOC3基因是指转录上述APOC3 mRNA的基因；ANGPTL3 mRNA是指具有如Genbank注册号NM_014495.4所示序列的mRNA，ANGPTL3基因是指转录上述ANGPTL3 mRNA的基因，HAO1 mRNA是指具有如Genbank注册号NM_017545.3所示序列的mRNA，HAO1基因是指转录上述HAO1 mRNA的基因。
定义
在上文及下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。字母组合(GLY)表示与该(GLY)左右相邻的两个核苷酸由式(A101)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-Ac)表示与该(GLY-Ac)左右相邻的两个核苷酸由式(A102)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-Ph)与该(GLY-Ph)左右相邻的两个核苷酸由式(A103)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-TOS)表示与该(GLY-TOS)左右相邻的两个核苷酸由式(A104)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-iBu)表示与该(GLY-iBu)左右相邻的两个核苷酸由式(A105)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-laev)表示与该(GLY-laev)左右相邻的两个核苷酸由式(A106)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-Cro)表示与该(GLY-Cro)左右相邻的两个核苷酸由式(A107)表示的无环脱碱基基团连接。
在上文及下文中，所述“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。
“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。所述“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在本文的上下文中，“互补”或“反向互补”一词可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(G)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(C)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
在上文及下文中，一个核苷酸序列与另外一个核苷酸序列存在“核苷酸差异”，是指前者与后者相比，相同位置的核苷酸的碱基种类发生了改变，例如，在后者中一个核苷酸碱基为A时，在前者的相同位置处的对应核苷酸碱基为U、C、G或者T的情况下，认定为两个核苷酸序列之间在该位置处存在核苷酸差异。在一些实施方式中，以无碱基核苷酸或者核苷酸类似物代替原位置的核苷酸时，也可认为在该位置处产生了核苷酸差异。
在上文及下文中，特别是在描述本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷单体(unmodified or modified RNA phosphoramidites，有时RNA phosphoramidites也称为Nucleoside phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。在下文中，有时也将本公开的siRNA缀合物简称为“缀合物”。siRNA缀合物应根据上下文，理解为siRNA缀合物的总称、式(305)和式(307)所示的siRNA缀合物总称，或式(305)、式(307)、式(308)所示的siRNA缀合物。在本公开的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至siRNA，最终形成本公开的siRNA缀合物的特定化合物。
在上文或下文中，取代的基团，如取代的烷基、取代的烷氧基、取代的氨基、取代的脂族基团、取代的杂脂族基团、取代的酰基、取代的芳基或取代的杂芳基，如无其他说明，“取代的”基团是指该基团中的氢原子被一个或多个取代基所替代而形成的基团。例如，“取代的烷氧基”是指烷氧基中的一个或多个氢原子被取代基所替代而形成的基团。本领域技术人员能够理解，可用于本公开应用的化合物中可以包含各种取代基，只要是该取代基的引入不会影响本公开的功能，能够实现本公开的目的，就可用于本公开。在一些实施方式中，所述取代基选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)。在一些实施方式中，所述取代基是C1-C3烷基、C6-C8芳基、-OC1-C3烷基、-OC1-C3烷基苯基、卤素、-OH、-NH2、氰基或硝基中的一种。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1至20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一分子氢而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两分子氢而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的一个子集，指的是与炔基相同、但有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指衍生自芳香族单环或多环烃环***、通过从环碳原子中除去氢原子而形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环***仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环***中的至少一个环是完全不饱和的，即，其根据Hückel理论包含环状、离域的(4n+2)π-电子***。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的一个子集，指与芳基相同、但具有两个附着点的残基。
如本文所使用的，“卤素取代基”或“卤代”指氟代、氯代、溴代或碘代，术语“卤素”包括氟、氯、溴或碘。
如本文所使用的，“卤代烷基”是指指定数量的碳原子被一个或多个、直至最大允许数量的卤素原子取代的如上述所定义的烷基。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基或五氟乙基。
“杂环基”是指稳定的3-至18-元非芳香族环基，包含2-12个碳原子和1-6个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫。除非说明书中另有说明，杂环基是单环、双环、三环或四环***，可包括稠环或桥环***。杂环基中的杂原子可以任选地被氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂环基是部分饱和或完全饱和的。杂环基可以通过任何环原子连接至分子的其余部分。此类杂环基的实例包括但不限于：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫酰基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧杂哌嗪基、2-氧杂哌啶基、2-氧杂吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫酰基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代硫吗啉基(1-oxo-thiomorpholinyl)和1,1-二氧代硫吗啉基(1,1-dioxo-thiomorpholinyl)。亚杂环基是杂环基的一个子集，指与杂环基相同、但具有两个附着点的残基。
“杂芳基”指由3-至18-元芳香环自由基衍生而成的基团，包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环***，其中环***中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环***。杂芳基中的杂原子被任选地氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂芳基通过任何环原子附着至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并***基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基(5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、***基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。亚杂芳基是杂芳基的一个子集，指与杂芳基相同、但具有两个附着点的残基。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能度对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能度上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2ded，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMTr)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4',4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠、兔和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的“预防”指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将双链寡核苷酸、药物组合物或寡核苷酸缀合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
核苷酸序列
在一方面，本公开提供了一种核苷酸序列。本公开的核苷酸序列含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，在此不再赘述。
本公开的核苷酸序列中的每个核苷酸为修饰或未修饰的核苷酸，其中，该核苷酸序列包含核苷酸序列I，所述核苷酸序列I是核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第2位至第8位核苷酸中至少一个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列，所述核苷酸序列A具有16-30个核苷酸，并且所述核苷酸序列A与靶mRNA中的一段核苷酸序列至少有14个核苷酸反向互补。
即，所述核苷酸序列A是具有16-30个核苷酸长度的核苷酸，并且所述核苷酸序列A与靶mRNA中的一段核苷酸序列至少部分反向互补。所述核苷酸序列I是由以下方式形成的核苷酸序列：按照5'端-3'端方向，将核苷酸序列A中的第2位至第8位核苷酸中的至少一个核苷酸用无环脱碱基基团替代。在一些实施方式中，所述核苷酸序列A与靶mRNA中的一段序列之间有超过85％的核苷酸形成反向互补；在一些实施方式中，所述核苷酸序列A与靶mRNA中的一段序列有不超过2个的碱基错配。
所述无环脱碱基具有如式(101)所示的结构：
其中，R1、R2和R3各自独立地具有式(201)所示的结构：
R4具有如式(202)所示的结构：
表示基团共价连接的位点，每个n独立地选自0-4的整数，每个m独立地选自为1-4的整数，E1选自OH、SH或BH2；
每个R101独立地选自由H、C1-C5直链烷基、C1-C5烷氧基、C1-C10酰基、C1-C5烷基磺酰基和C6-C10芳香基磺酰基所组成的组；
R201选自OH或NHR202，其中R202选自由H、C1-C5直链烷基、C1-C10酰基和、C1-C5烷基磺酰基和C6-C10芳香基磺酰基所组成的组。
在一些实施方式中，每个n各自独立地选自0-4的整数，并且m独立地选自1-4的整数。在一些实施方式中，每个n独立地选自0或者1，m独立地选自1或者2。在一些实施方式中，n为0，m为1。
在一些实施方式中，E1选自OH、SH或BH2。在一些实施方式中，为了原料易得，E1选自OH或SH。
在一些实施方式中，每个R101各自独立地选自由H、C1-C5直链烷基、C1-C5烷氧基、C1-C10酰基、C1-C5烷基磺酰基和C6-C10芳香基磺酰基所组成的组。在一些实施方式中，每个R101独立地选自由H、甲基、乙基和甲氧基组成的组。在一些实施方式中，每个R101独立地选自由H、甲基、乙基和甲氧基组成的组。
在一些实施方式中，R201选自OH或NHR202。在一些实施方式中，R201是NHR202，并且R202选自由H、C1-C5直链烷基、C1-C10酰基和被磺酰基取代的C1-C10酰基的基团所组成的组。在一些实施方式中，R202选自由H、C1-C5脂肪族酰基、C1-C5芳香族酰基、C1-C5烷基磺酰基和C6-C10芳香基磺酰基组成的组。在一些实施方式中，R202选自由乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、对甲苯磺酰基、乙酰丙酰基以及巴豆酰基组成的组。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列中的所有核苷酸均为修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列中的核苷酸均为未修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列A的长度为16-30个核苷酸的范围之间。在一些实施方式中，所述核苷酸序列A的长度为19-25、21-25、19-21或21-23个核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列A的长度为19-21个核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列A的长度为19个或21个核苷酸。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列A与靶mRNA中的一段核苷酸序列至少有14个核苷酸反向互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列A与靶mRNA中的一段核苷酸序列至少有16个核苷酸反向互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列A与靶mRNA中的一段核苷酸序列至少有18个核苷酸反向互补。
为简化核苷酸序列结构，在一些实施方式中，核苷酸序列I是核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第2、3、4、5、6、7、8位核苷酸中至少一个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。在一些实施方式中，核苷酸序列I是核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第3、4、5、6、7位的核苷酸中至少一个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。在一些实施方式中，核苷酸序列I是核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第2、6、7、8位核苷酸中至少一个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列I是所述核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第4、5、6或7位核苷酸中的一个被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列I是所述核苷酸A中按照5'端-3'端方向的第6、7或8位的核苷酸中的一个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I是所述核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第2-8位中核苷酸中的任意2个核苷酸被无环碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列I是所述核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第4、5、6或7位中的任意2个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列I是所述核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第4、5或6位中的任意1个核苷酸和第七位的核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。
在一些实施方式中，每个无环脱碱基基团独立地选自由基团A101-A107组成的组：
其中，以“*”标记的碳原子表示该碳原子为R构型、S构型或外消旋构型。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列A中的每一个核苷酸均为修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第2位至第16位中至少两个核苷酸为核苷酸的核糖基2'位具有氟代修饰的核苷酸，并且所述核苷酸序列A的其他位置的每个核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种。在一些实施方式中，该核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第2、6、14、16位中至少两个核苷酸为核苷酸的核糖基2'位具有氟代修饰的核苷酸，并且所述核苷酸序列A的其他位置的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种。在一些实施方式中，该核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第2、6、8、9、14、16位中至少两个核苷酸为核苷酸的核糖基2'位具有氟代修饰的核苷酸，并且所述核苷酸序列A的其他位置的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种。
在本公开的上文和下文中，在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“2'-氟代核糖基”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代而形成的具有如式(401)所示结构的化合物，其中的Base表示碱基，选自C、G、A或U。“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“2'-甲氧基核糖基”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代，而形成如式(402)所示的结构。
在本公开的上下文中，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸类似物或核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸类似物或核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸中的一种。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸可以是甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(402)所示。在一些实施方式中，2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸可以是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸(2'-MOE)，如式(403)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH2)如式(404)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(405)所示。
在一些实施方式中，核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在本公开的上文和下文中，核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。在一些实施方式中，核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸，如LNA、ENA、cETBNA等，其中，LNA如式(406)所示，ENA如式(407)所示，cET BNA如式(408)所示。
无环核苷酸是指核苷酸的糖环被打开形成的一类“开环”核苷酸，如解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(409)所示，GNA如式(410)所示。
/>
上述式(409)和式(410)中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物，例如，碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(411)或(412)所示。
上述式(411)-式(412)化合物中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET BNA、UNA和GNA中的一种。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列由所述核苷酸序列I构成。
在一些实施方式中，本领域存在多种可用于修饰核苷酸序列的方式，除了上问题及的核糖基团修饰外，还包括骨架修饰(如磷酸基团修饰)及碱基修饰等(例如，请参见Watts，J.K.，G.F.Deleavey and M.J.Damha，Chemically modified siRNA:tools andapplications.Drug Discov Today，2008.13(19-20)：p.842-55，以引用的方式将其整体内容并入本文)。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少1个为具有修饰修饰基团的磷酸酯基。所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。在一些实施方式中，所述硫代磷酸酯基是如式(421)所示的硫代磷酸(phosphorthioate)结构，用一个硫原子取代磷酸二酯键中的非桥氧原子，以硫代磷酸二酯键替换磷酸二酯键，即两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接。该修饰能稳定核苷酸序列的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
修饰或未修饰的双链寡核苷酸
在另一方面，本公开还提供了一种能够调节基因表达的、含有前述核苷酸序列的双链寡核苷酸。所述双链寡核苷酸含有正义链和反义链，所述反义链包含如上所述的核苷酸序列，所述正义链是具有16-30个核苷酸的核苷酸序列，并且所述正义链与反义链至少部分地反向互补形成双链区。
在一些实施方式中，所述反义链与所述正义链基本上反向互补或实质上反向互补。所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个碱基的错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个碱基的错配。
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸包含的核苷酸序列中每一个核苷酸均为修饰或未修饰的核苷酸。
所述双链寡核苷酸中还含有正义链，所述正义链是具有16-30个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述正义链的长度为16-30个核苷酸的范围之间。在一些实施方式中，所述正义链的长度为21-27、23-27、21-23或23-25个核苷酸。在一些实施方式中，所述正义链的长度为21-23个核苷酸。在一些实施方式中，所述正义链的长度为21个核苷酸。所述正义链或反义链的长度各自独立地可以是19-23个核苷酸。
这样，本公开提供的双链寡核苷酸的正义链和反义链的长度之比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、20/20、20/21、20/22、20/23、21/21、21/22、21/23、21/24、22/22、22/23、22/24、22/25、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中，本公开提供的双链寡核苷酸的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23，此时，本公开提供的双链寡核苷酸具有更好的靶mRNA沉默活性。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列A的2-19位的核苷酸中至少17个核苷酸与正义链互补。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列A的2-19位的核苷酸中至少16个核苷酸与正义链互补。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列A的2-19位的核苷酸中至少14个核苷酸与正义链互补。
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸所包含的核苷酸序列中每一个核苷酸均为修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸所包含的反义链中每一个核苷酸均为修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸所包含的正义链中每一个核苷酸均为修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸是具有以下修饰的双链寡核苷酸：按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸是具有以下修饰的双链寡核苷酸：按照5'端-3'端的方向，所述正义链的第5、7、8、9位的核苷酸为核苷酸的核糖基2'位具有氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；该反义链的第2、6、8、9、14和16位的核苷酸为核苷酸的核糖基2'位具有氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且该反义链包含前述核苷酸序列I，因此，该反义链中的1个或多个碱基可被无环脱碱基基团所替代。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸是具有以下修饰的双链寡核苷酸：按照5'端-3'端的方向，所述正义链的第7、8、9位的核苷酸为核苷酸的核糖基2'位具有氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；该反义链的第2、6、14和16位的核苷酸为核苷酸的核糖基2'位具有氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且该反义链包含前述核苷酸序列I，因此，该反义链中的1个或多个碱基可被无环脱碱基基团所替代。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸是具有以下修饰的双链寡核苷酸：按照5'端-3'端的方向，所述正义链的第7和8位的核苷酸为核苷酸的核糖基2'位具有氟代修饰的核苷酸，第5和9位的核苷酸为2'-脱氧核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；该反义链的第2、6、14和16位的核苷酸为核苷酸的核糖基2'位具有氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且该反义链包含前述核苷酸序列I，因此，该反义链中的1个或多个碱基可被无环脱碱基基团所替代。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸还含有其他修饰的核苷酸基团，所述修饰的核苷酸基团不会导致所述双链寡核苷酸调节靶基因表达的功能明显削弱或丧失。
目前，本领域存在多种可用于修饰双链寡核苷酸的方式，除了上文提及的核糖基团修饰外，还包括骨架修饰(如磷酸基团修饰)及碱基修饰等(例如，请参见Watts，J.K.，G.F.Deleavey and M.J.Damha，Chemically modified siRNA:tools andapplications.Drug Discov Today，2008.13(19-20)：p.842-55，以引用的方式将其整体内容并入本文)。
在一些实施方式中，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少1个为具有修饰基团的磷酸酯基。所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基，可以是如式(421)所示的硫代磷酸(phosphorthioate)结构，用一个硫原子取代磷酸二酯键中的非桥氧原子，以硫代磷酸二酯键替换磷酸二酯键，即两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接。该修饰能稳定双链寡核苷酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代
磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸分子的反义链序列5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸具有式(422)所示的结构：
同时，常用的所述5'-磷酸类似物修饰的核苷酸的种类是本领域技术人员公知的，例如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolution ofoligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2047,35(3):238-48中公开的式(423)至式(426)所示的核苷酸：
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团；Base表示选自A、U、C、G或T的碱基。
在一些实施方式中，5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为式(423)所示的含有乙烯基磷酸酯(E-vinylphosphonate，E-VP)的核苷酸，或式(425)所示的含有硫代磷酸酯的核苷酸。
本文所公开的修饰方案可以适用于各种调解基因表达的双链寡核苷酸。在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸是抑制或下调基因表达的双链寡核苷酸。在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸是siRNA。在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸是激活或上调基因表达的双链寡核苷酸。在一些事实方式中，所述双链寡核苷酸是saRNA。
按照本公开的一些实施方式，本公开的双链寡核苷酸为含有如表1A-1E所示序列的siRNA：
表1siRNA序列
表1A
/>
/>
/>
表1B
/>
表1C
表1D
表1E
/>
/>
其中，S表示正义链；AS表示反义链，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；小写字母d表示该字母d右侧相邻的一个核苷酸为2'-脱氧核苷酸；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，在一些实施方式中为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以VP表示)、5'-磷酸修饰的核苷酸(以下实施例中以P表示)或硫代磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以Ps表示)；(GLY)表示与该(GLY)左右相邻的两个核苷酸由式(A101)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-Ac)表示与该(GLY-Ac)左右相邻的两个核苷酸由式(A102)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-Ph)与该(GLY-Ph)左右相邻的两个核苷酸由式(A103)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-TOS)与该(GLY-TOS)左右相邻的两个核苷酸由式(A104)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-iBu)表示与该(GLY-iBu)左右相邻的两个核苷酸由式(A105)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-laev)表示与该(GLY-laev)左右相邻的两个核苷酸由式(A106)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-Cro)表示与该(GLY-Cro)左右相邻的两个核苷酸由式(A107)表示的无环脱碱基基团连接，并且前述无环脱碱基基团均为S构型；(GLY-S)表示左右相邻的两个核苷酸由S构型的如式(A101)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-R)表示左右相邻的两个核苷酸由R构型的如式(A101)表示的无环脱碱基基团连接。
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸为siAPO1L、siAPO1、siAPOa1M1SVP2、siAPOb1M1SVP2、siAPOc1M1SVP2、siAPOd1M1SVP2、siAPOe1M1SVP2、siAPOf1M1SVP2、siAPOf1M1SP2、siAPOg1M1SP2、siAPOg1M1SP2-Ac、siAPOg1M1SP2-Ph、siAPOg1M1SP2-TOS、siAPOg1M1SP2-iBu、siAPOg1M1SP2-laev、siAPOg1M1SP2-Cro、siAPOg1M1SVP1R、siAPOg1M1SVP1S、siAPOg1M1SVP2R、siAPOg1M1SVP2S、siAPOg1M1SVP3R、siAPOg1M1SVP3S、siAPOg1M1SVP4R、siAPOg1M1SVP4S、siAPOg1Ph2、siAPOg1Ph3、siAPOg1Ph4、siAPOg1Ph5、siAPOg1Ph6、siAPOg1Ph7、siAPOg1Ph8、siAPOg1Ph4ph7、siAPOg1Ph5ph7、siAPOg1M16ph7、siAPOg1M34ph7、siAPOg1Lph7、siAPOg1Nph7、siHBa1M1SP2、siHBa1M1SVP2、siHBb1M1SVP2、siHBa1M1SVP1-Ac、siHBa1M1SVP2-Ac、siHBa2M1SVP3-Ac、siC5a1M1S2、siC5b1M1S2、siHAOa2M1S2、siHAOa1M1S2、siANGa1M1S2-Ac、siANGa1M1S2-iBu、siANGa1Ph2、siANGa1Ph3、siANGa1Ph4、siANGa1Ph5、siANGa1Ph6、siANGa1Ph7、siANGa1Ph8、siANGa1Ph4ph7、siANGa1Ph5ph7、siANGa1M16ph7、siANGa1M34ph7、siANGa1Lph7或siANGa1Nph7中的一种。
本公开的发明人意外发现，这些本公开提供的双链寡核苷酸在减少了脱靶效应的同时，还具有很高的在血液中的稳定性、很高的溶酶体中的稳定性。同时，靶基因表达调节活性并未显著降低，显示出优异的体内抑制效果。
本公开提供的双链寡核苷酸可以通过本领域常规的双链寡核苷酸制备方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，固相合成已经有商业化订制服务。可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的双链寡核苷酸中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入双链寡核苷酸的方法也是本领域技术人员所熟知的。
本公开所述的包含无环脱碱基基团的核苷酸序列可按照本领域常规的寡核苷酸制备方法制备，区别仅在于，以无环脱碱基单体化合物代替被取代的位置的核苷单体进行上述制备，所述无环脱碱基单体化合物具有如式(110)所示的结构：
所述式(110)化合物可商购获得，或者由本领域技术人员使用已知的方法获得。在一些实施方式中，式(110)的无环脱碱基单体化合物可以通过以下制备方法得到：
该方法包括在有机溶剂中，在缩合反应条件下，以及在三级胺类有机碱和吡啶类化合物的存在下，将式(111)所示化合物与式(131)所示的亚磷酰二胺接触，分离得到式(110)所示化合物：
其中，R1、R2、R3、R4各自的定义和可选择的范围如前所述，每个B1独立地为C1-C5烷基；B2选自C1-C5烷基、乙氰基、丙氰基和丁氰基中的一种。
所述缩合反应条件包括反应温度为0-150℃，反应时间为0.5-72小时，在一个实施方式中，所述缩合反应条件包括反应温度为10-70℃，反应时间为1-10小时。
在一些实施方式中，所述有机溶剂可选自环氧溶剂、醚溶剂、卤代烷溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述环氧溶剂为二氧六环和/或四氢呋喃。在一些实施方式中，所述醚溶剂为***和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于所述式(111)所示化合物，所述有机溶剂的用量为1-50L/mol，在一些实施方式中为3-20L/mol。
在一些实施方式中，所述亚磷酰二胺为与式(111)所示化合物的摩尔比为0.5:1-10:1。
在一些实施方式中，所述三级胺类有机碱可以为N-甲基咪唑、N-甲基吗啉、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺。所述三级胺类有机碱在一些实施方式中为N-甲基咪唑；所述三级胺类有机碱与式(111)所示化合物的摩尔比可以为0.3:1-20:1，在一些实施方式中为0.5:1-10:1。
在一些实施方式中，所述吡啶类化合物可以为三氟乙酸吡啶、2-(三氟甲基)烟酸、2-氨基-6-(三氟甲基)吡啶。在一些实施方式中，所述吡啶类化合物为三氟乙酸吡啶。所述吡啶类化合物与式(111)所示化合物的摩尔比可以为0.3:1-20:1，在一些实施方式中为0.5:1-10:1。
可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(110)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(313)化合物，例如，可使用如下两组色谱条件进行分离：(1)正相纯化：200-300目硅胶填料，使用石油醚:乙酸乙酯＝10:1-1:10梯度洗脱，或使用二氯甲烷:乙酸乙酯＝10:1-1:10梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以在蒸发除去溶剂后、减压抽滤后，得到式(110)化合物产品，该产品可直接用于后续反应。
所述式(111)化合物可商购获得，或者由本领域技术人员使用已知的方法获得。在一些实施方式中，式(111)所示的化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，在取代反应条件下，以及在三级胺类有机碱的存在下，将式(112)所示化合物与卤代化合物接触，分离得到式(111)所示化合物：
其中，R1、R2、R3、R4各自的定义和可选择的范围如前所述。
在一些实施方式中，所述取代反应条件可包括反应温度为0-100℃，反应时间为1-72小时；在一些实施方式中反应温度为10-40℃，反应时间为5-30小时。
在一些实施方式中，所述有机溶剂可选自吡啶、环氧溶剂、醚溶剂、卤代烷溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、杂环化合物和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述环氧溶剂为二氧六环和/或四氢呋喃。在一些实施方式中，所述醚溶剂为***和/或甲基叔丁基醚。在一些实施方式中，所述卤代烷溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述杂环化合物为吡啶、吡咯和吡啶类似物中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为吡啶。相对于所述式(112)所示化合物，所述有机溶剂的用量为0.3-50L/mol，在一些实施方式中为1-20L/mol。
在一些实施方式中，所述卤代化合物为4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷、二硫代甲氧羰基、二甲基异丙基硅。在一些实施方式中，所述卤代化合物为4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷。所述卤代化合物与式(112)所示化合物的摩尔比为0.5:1-10:1。
在一些实施方式中，所述三级胺类有机碱可以为N-甲基咪唑、N-甲基吗啉、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺。所述三级胺类有机碱在一些实施方式中为N-甲基咪唑；所述三级胺类有机碱与式(111)所示化合物的摩尔比可以为0.3:1-20:1，在一些实施方式中为0.5:1-10:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(111)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(111)化合物例如，可使用如下两组色谱条件进行分离：(1)正相纯化：200-300目硅胶填料，使用甲醇:二氯甲烷＝0.01:1-0.5:1梯度洗脱；或者使用乙酸乙酯:石油醚＝0.1:1-1:1梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18和C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以在蒸发除去溶剂后、减压抽滤后，得到式(111)化合物产品，该产品可直接用于后续反应。
在一些实施方式中，R4是-CH2OH，此时，式(112)化合物是容易商购获得的丙三醇，此时，获得的式(110)化合物具有式(121)所示的结构。
所述式(112)化合物可商购获得，或者由本领域技术人员使用已知的方法获得。在一些实施方式中，R4是-CH2NHR202，式(112)所示的化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，在取代反应条件下，将式(113)所示化合物与R202OH表示的酸或(R202)2O表示的酸酐接触，分离得到式(112)所示化合物：
其中，R1、R2、R3各自的定义和可选择的范围如前所述。
在一些实施方式中，所述取代反应条件可包括反应温度为0-100℃，反应时间为1-72小时；在一些实施方式中反应温度为10-40℃，反应时间为3-30小时。
在一些实施方式中，所述有机溶剂可选自醇类溶剂、酯类溶剂、环氧溶剂、醚溶剂、卤代烷溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、杂环化合物和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述环氧溶剂为二氧六环和/或四氢呋喃。在一些实施方式中，所述醚溶剂为***和/或甲基叔丁基醚。在一些实施方式中，所述卤代烷溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述醇类溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇中的一种或多种。在一些实施方式中，所述酯类溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯中的一种或多种。相对于所述式(112)所示化合物，所述有机溶剂的用量为0.3-50L/mol，在一些实施方式中为1-20L/mol。
在一些实施方式中，所述R202OH表示的酸或(R202)2O表示的酸酐选自乙酸酐、苯甲酸酐、对甲苯磺酸酐、异丁酸酐、乙酰丙酸、巴豆酸中的一种或多种。所述R202OH表示的酸或(R202)2O表示的酸酐与式(112)所示化合物的摩尔比为0.5:1-10:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(112)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(112)化合物例如，可使用如下两组色谱条件进行分离：(1)正相纯化：200-300目硅胶填料，使用甲醇:二氯甲烷＝0.01:1-1:1梯度洗脱；或者使用乙酸乙酯:石油醚＝0.1:1-10:1梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18和C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以在蒸发除去溶剂后、减压抽滤后，得到式(112)化合物产品，该产品可直接用于后续反应。
所述式(113)化合物可商购获得，或者由本领域技术人员使用已知的方法获得。例如，当R1、R2、R3均为H时，即为式(113)所示的无环脱碱基单体化合物是容易商购获得的3-氨基-1,2-丙二醇。此时，获得的式(110)化合物具有式(122)-(127)所示结构中的一种。
在一些实施方式中，通过上述方法制备得到的式(110)所示的化合物具有下列如式(121)-式(127)中的一种所示的结构：
药物组合物
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的双链寡核苷酸作为活性成分和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以是双链寡核苷酸给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如基于Fe3O4或Fe2O3的纳米粒)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphatenanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-amino ethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。
所述药物组合物中，对双链寡核苷酸和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，可以是各组分常规的含量。在一些实施方式中，siRNA与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)，在一些的实施方式中，上述重量比为1:(1-50)。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。
所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。在一些实施方式中，所述药物组合物用于静脉注射给药。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中，所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于CN103380113A(通过引用的方式将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述有机胺可为CN103380113A中描述的如式(501)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
每个X101和X102各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C1-C20烃链；
每个Y和Z各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO2；
每个R301、R302、R303、R304、R305、R306或R307各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；
x是1-10的整数；
n101是1-3的整数，m101是0-20的整数，p是0或1；并且其中，当m101和p均为0时，R302是氢；
并且，如果n101或m101中的至少一个是2，那么R303和在式(501)中的氮形成如式(502)或式(503)所示的结构：
其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”表示烃链，且每个*N代表式(501)中示出的氮原子。
在一些实施方式中，R303是多胺。在其它实施方式中，R303是缩酮。在一些实施方式中，在式(501)中的R301和R302中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。
在一些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，R303可以是下述式(504)-式(513)中的任一个：
其中，式(504)-式(513)中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，每个“HCC”代表烃链，且每个*显示R303与在式(501)中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个H可以被替换以实现与在式(501)中的氮原子的连接。
其中，式(501)所示化合物可以根据CN1033113A中的描述制备。
在一些具体的实施方式中，所述有机胺为如式(514)所示的有机胺和/或如式(515)所示的有机胺：
所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；
所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80):(19.7-80):(0.3-50)，例如可以为(50-70):(20-40):(3-20)。
在一些实施方式中，由本公开的双链寡核苷酸与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。
在一些实施方式中，由本公开的双链寡核苷酸与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物中，双链寡核苷酸与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本公开的双链寡核苷酸与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。
在一些实施方式中，所述药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。在一些实施方式中，本公开提供的双链寡核苷酸与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备，只是用本公开提供的双链寡核苷酸替代现有双链寡核苷酸即可；在一些具体的实施方式中，可以按照如下方法制备：
将有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL，例如可以为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400中的一种或多种，例如可以为乙醇。
将本公开提供的双链寡核苷酸溶解于缓冲盐溶液中，得到双链寡核苷酸水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M，例如可以为0.1-0.2M，调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5，例如可以为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使双链寡核苷酸的浓度不超过0.6mg/mL，例如可以为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，例如可以为醋酸钠和/或醋酸钾。
将脂质溶液和双链寡核苷酸水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟，例如可以为5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和双链寡核苷酸水溶液的体积比为1:(2-5)，例如可以为1:4。
将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本公开提供的药物组合物，其理化参数为pH值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mOsm/kg；例如理化参数可以为pH值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mOsm/kg。
其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法，例如可以使用切相流***，中空纤维柱，在100K Da条件下超滤，超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法，例如可以在0.22μm滤器上过滤除菌。
siRNA缀合物
在另一方面，本公开提供了一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物包含上述的双链寡核苷酸以及连接至该双链寡核苷酸的缀合基团。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至双链寡核苷酸上而形成的化合物。在下文中，有时也将本公开的siRNA缀合物简称为“缀合物”。更具体地，在本公开的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至双链寡核苷酸、最终形成本公开的siRNA缀合物的特定化合物。所述配体的种类和连接方式为本领域技术人员所公知，其作用一般是与靶细胞表面的特异性受体相结合，介导与配体连接的双链寡核苷酸递送至靶细胞。
一般来说，所述缀合基团包含药学上可接受的至少一个靶向基团，或者进一步还包含接头(linker)，并且，所述双链寡核苷酸、所述接头和所述靶向基团依次连接。在一些实施方式中，所述靶向基团为1-6个。在一些实施方式中，所述靶向基团为2-4个。所述双链寡核苷酸分子可以非共价或共价缀合至所述缀合基团，例如可以共价缀合至所述缀合基团。双链寡核苷酸与缀合基团的缀合位点可以在双链寡核苷酸正义链的3'端或5'端，也可在反义链的5'端，还可以在双链寡核苷酸的内部序列中。在一些具体的实施方式中，所述双链寡核苷酸与缀合基团的缀合位点在双链寡核苷酸正义链的3'末端。
在一些实施方式中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2'-位羟基或者碱基上。在一些实施方式中，所述缀合基团可以连接在3'-位羟基上，此时核苷酸之间采用2'-5'磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在双链寡核苷酸链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在双链寡核苷酸的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可参考：Muthiah Manoharan et.al.siRNAconjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosaminelinked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo inhepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7.
靶向基团可经由合适的接头与双链寡核苷酸分子相连，本领域技术人员可以根据靶向基团的具体类型选择合适的接头。这些接头、靶向基团的种类以及与双链寡核苷酸的连接方式可参见WO2015006740A2的公开内容，通过引用的方式将其整体内容并入本文。在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸与缀合基团间可以通过酸不稳定的、或可还原的化学键相连，在细胞内涵体的酸性环境下，这些化学键可降解，从而使双链寡核苷酸成为自由状态。对于不可降解的缀合方式，缀合基团可连接至双链寡核苷酸的正义链，从而尽量降低缀合对双链寡核苷酸活性的影响。
在一些实施方式中，所述靶向基团可以是siRNA给药领域常规使用的配体。在一些实施方式中，所述靶向基团可以选自以下靶向分子或其衍生物形成的配体中的一种或多种；如亲脂分子，例如胆固醇、胆汁酸、维生素(例如维生素E)、不同链长的脂质分子；聚合物，例如聚乙二醇；糖类，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；肝实质细胞表达的受体配体，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖残基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神经递质(如肾上腺素)、生长因子、转铁蛋白等适配体；抗体；量子点；多肽，例如透膜肽，或小分子配体。
在一些实施方式中，所述靶向基团可以是siRNA给药领域常规使用的配体，例如WO2009082607A2中描述的各种配体，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
在一些实施方式中，至少一个或每个所述靶向基团选自能够和哺乳动物肝实质细胞表面受体(ASGPR)结合的配体。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地为与哺乳动物肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体亲和的配体。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地为去唾液酸糖蛋白或糖。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地为去唾液酸糖蛋白，例如去唾液酸血清类枯蛋白(asialoorosomucoid,ASOR)或去唾液酸始球蛋白(asialofetuin，ASF)。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-三氟乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺、N-异丁酰半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一种。在一些实施方式中，至少一个或每个所述靶向基团为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物中的接头具有如式(301)所示的结构：
其中，k为1-3的整数；
LA具有如式(302)所示的包含酰胺键的结构，LB具有如式(303)所示的包含N-酰基吡咯烷的结构，含有羰基和氧原子，LC为基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的连接基团；
其中，n302、q302和p302各自独立地为2-6的整数，可选地，n302、q302和p302各自独立地为2或3；n303为4-16的整数，可选地，n303为8-12的整数，表示基团共价连接的位点。
所述接头中，每个LA分别与一个所述靶向基团通过醚键连接，并通过LC部分中羟基的氧原子与LC部分形成醚键而连接；LB通过式(303)中的羰基与LC部分中氨基的氮原子形成酰胺键而连接，并通过式(303)中的氧原子与所述siRNA通过氧原子形成磷酸酯键或硫代磷酸酯键相连接。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA缀合物具有如式(305)所示的结构：
其中，Nu表示本公开提供的siRNA。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物中的接头具有式(306)所示的结构：
其中，n306为0-3的整数，每个p306独立地为1-6的整数，表示基团共价连接的位点；所述连接基团通过由*标出的氧原子与所述靶向基团形成醚键连接；所述连接基团由#标出的氧原子中的至少一个与所述siRNA形成磷酸酯键或硫代磷酸酯键而连接，其余由#标出的氧原子与氢原子连接形成羟基，或者与C1-C3烷基连接形成C1-C3烷氧基；
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物具有如式(307)所示的结构：
其中，Nu表示本公开提供的siRNA。
在一些实施方式中，所述缀合物具有式(308)所示的结构：
式(308)，
其中，n1为选自1-3的整数，n3为选自0-4的整数；
m1、m2和m3独立地为选自2-10的整数；
R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地为H，或选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基以及C1-C10烷氧基；
R3为式A59所示结构的基团：
其中，E1为OH、SH或BH2，Nu为双链寡核苷酸；
R2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基，并且其中，R2可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基，并且其中，L1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)。M1表示靶向基团。
表示基团共价连接的位点；
M1表示靶向基团，其定义和可选择的范围与上述相同。在一些实施方式中，每个M1独立地选自对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体中的一种。
技术人员会理解的是，尽管为了方便起见，虽然L1被定义为线性亚烷基，但是它可能不是线性基团或者名称不同，例如由于上述替换和/或置换而产生的胺或烯基。为了本公开内容的目的，L1的长度是连接两个附着点的链中的原子数。为此目的，将替换所述直链亚烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)计为一个原子。
当M1为对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体时，在一些实施方式中，n1可以是1-3的整数，n3可以是0-4的整数，保证所述缀合物中M1配体的个数至少为2；在一些实施方式中，n1+n3≥2，这样可以使得M1配体的个数至少为3，使得M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，进而促进所述缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M1配体的个数大于3个时，M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一些实施方式中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3。
在一些实施方式中，m1、m2和m3独立地选自2-10的整数时，可以使多个M1配体之间的空间位置适合M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体的结合，为了使本公开提供的缀合物更为简单，更容易合成和/或降低成本，在一些实施方式中，m1、m2和m3各自独立地为2-5的整数，在一些实施方式中，m1＝m2＝m3。
本领域技术人员可以理解，当R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基、以及C1-C10烷氧基中的一种时，不会改变本文公开的缀合物的性质，均可以实现本公开的目的。在一些实施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、甲基和乙基。在一些实施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15均为H。
根据本公开提供的siRNA缀合物，R3为式A59所示结构的基团，其中，E1为OH、SH或BH2，基于制备原料易获取性的考虑，在一些实施方式中，E1为OH或SH。
在一些实施方式中，R2的选择是为了实现与含氮骨架上的N原子与A59的连接。在本公开的上下文中，“含氮骨架”是指连接有R10、R11、R12、R13、R14和R15的碳原子与N原子互相连接的链状结构。因此，R2可以是任何能够以适当方式将A59基团连接至含氮骨架上的N原子的连接基团。在一些实施方式中，在通过固相合成的工艺制备本公开的siRNA缀合物的情况下，R2基团中需要同时含有与含氮骨架上的N原子连接的连接位点和与R3中的P原子相连接的连接位点。在一些实施方式中，R2中所述与含氮骨架上的N原子连接的位点与N原子形成酰胺键，所述与R3上的P原子连接的位点与P原子形成磷酸酯键。在一些实施方式中，R2是B5、B6、B5'或B6'：
其中，表示基团共价键连接的位点。
q2的取值范围可以是1-10的整数，在一些实施方式中，q2为1-5的整数。
L1的作用是将M1配体与含氮骨架上的N连接，为本公开的siRNA缀合物提供靶向功能。在一些实施方式中，L1选自式A1-A26基团中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中，L1选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一种或多种的连接组合；在一些实施方式中，L1选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合；在一些实施方式中，L1选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合。
在一些实施方式中，L1的长度可以为3-25个原子，3-20个原子、4-15个原子或5-12个原子。在一些实施方式中，L1的长度为3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个原子。
在一些实施方式中，j1为2-10的整数，在一些实施方式中，j1为3-5的整数。在一些实施方式中，j2为2-10的整数，在一些实施方式中，j2为3-5的整数。R’为C1-C4的烷基，在一些实施方式中，R’为甲基、乙基和异丙基中的一种。Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，在一些实施方式中，Ra为A27或A28。Rb为C1-C5的烷基，在一些实施方式中，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。在一些实施方式中，在式A1-A26中各自对j1、j2、R’、Ra、Rb进行选择，以实现M1配体与含氮骨架上的N连接，并使M1配体之间的空间位置更适合M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的结构：
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在一些实施方式中，式A59中的P原子可以连接到siRNA序列中任何可能的位置，例如，式A59中的P原子可以连接到siRNA正义链或反义链的任何一个核苷酸上；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的任何一个核苷酸上。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链或反义链的端部；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的端部。所述端部指所述正义链或所述反义链中从其一端起算的前4个核苷酸。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链或反义链的末端；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的3'末端。在连接至siRNA的正义链的上述位置的情况下，本公开提供的缀合物进入细胞后，在解旋时，可以释放出单独的siRNA反义链，以通过RNAi机制抑制靶基因表达。
式A59中的P原子可以连接到siRNA中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上。在一些实施方式中，式A59中的P原子可通过形成磷酸二酯键连接至所述siRNA中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接在siRNA正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上，或者式A59中的P原子通过取代siRNA正义链中的一个核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接，或者式A59中的P原子通过取代siRNA正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢与核苷酸连接。
本公开所述siRNA或siRNA缀合物中，每个相邻核苷酸之间由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子带有负电荷，它可以以羟基或巯基的形式存在，羟基或巯基中的氢离子也可以部分或全部被阳离子取代。所述阳离子可以是任意的阳离子，如金属阳离子，铵离子NH4+，有机铵阳离子中的一种。出于提高溶解性考虑，在一些实施方式中，所述阳离子选自碱金属离子、三级胺形成的铵阳离子和季铵阳离子中的一种或多种。碱金属离子可以是K+和/或Na+，三级胺形成的阳离子可以是三乙胺形成的铵离子和/或N,N-二异丙基乙胺形成的铵离子。因此，本公开所述siRNA或siRNA缀合物可以至少部分以盐的形式存在。在一种方式中，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子至少部分与钠离子结合，本公开所述siRNA或siRNA缀合物以钠盐或部分钠盐的形式存在。
本公开siRNA缀合物的制备
上述siRNA缀合物可以通过现有技术中已经详细描述的方法进行合成。例如，WO2015006740A2中详细描述了多种siRNA缀合物的制备方法。通过本领域技术人员熟知的方式，获得本公开的siRNA缀合物。如WO2014025805A1中记载了式(305)所示结构的制备方法，Rajeev等人在ChemBioChem 2015,16,903-908中描述了式(307)所示结构的制备方法。中国专利申请CN110959011A也详细公开了制备式(308)所示的siRNA缀合物的方法。以引用的方式将上述文献内容整体并入本文。
本公开的siRNA缀合物也可以与药学上可接受的其它辅料联用，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种，详情可参见上文关于本公开的药物组合物的描述。
本公开的核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物及siRNA缀合物的应用
在一些实施方式中，本公开提供了本公开提供的核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防由细胞中特定基因的表达引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
本公开提供的修饰的双链寡核苷酸、药物组合物和寡核苷酸缀合物可以用于调节各种基因异常表达，治疗各种由于基因异常表达引起的病理状况或疾病。这些基因可以是人体或动物体内各种内源性基因，也可以是在人体或动物体内繁殖的病原体基因。可以根据目标基因表达的mRNA设计和制备具有特定核苷酸序列和所述修饰方案的双链寡核苷酸。在一些实施方式中，所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ACE2、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、TMPRSS6、XO、HAO1等基因。在一些实施方式中，所述特定基因选自HBV基因、ANGPTL3、APOC3基因或者重组人羟基酸氧化酶1基因表达的mRNA。相应地，所述疾病或症状选自因基因表达异常导致的疾病或症状。所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和血脂异常。在一些实施方式中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗由特定基因的异常表达而引起的病理状况或疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本公开提供的双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物。在一些实施方式中，所述特定基因选自以下基因中的一种：ACE2、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、TMPRSS6、XO、HAO1。在一些实施方式中，所述特定基因选自HBV基因、ANGPTL3、APOC3基因或者重组人羟基酸氧化酶1基因表达的mRNA。相应地，所述疾病或症状选自因基因表达异常导致的疾病或症状。所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和血脂异常。在一些实施方式中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。在一些实施方式中，本公开提供的缀合物也可以用于治疗其他肝脏疾病，包括以不需要的细胞增殖为特征的疾病、血液疾病、代谢疾病和以炎症为特征的疾病。肝脏的增殖疾病可以是良性或恶性疾病，例如癌症、肝细胞癌(HCC)、肝转移或肝母细胞瘤。肝脏血液学或炎症疾病可以是涉及凝血因子、补体介导的炎症或纤维化的疾病。肝脏的代谢疾病包括血脂异常和葡萄糖调节的不规则性。在一个实施方案中，通过施用一种或多种具有与参与疾病的基因序列高度同源的双链寡核苷酸来治疗所述疾病。
在一些实施方式中，本公开提供了一种抑制细胞中特定基因表达的方法，该方法包括将有效量的本公开提供的双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物与所述细胞进行接触。
通过将本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物给予有需要的受试者，可以通过对基因表达进行调控的机制达到预防和/或治疗由细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的目的。因此，本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物可用于预防和/或治疗所述病理状况或疾病、或用于制备用于预防和/或治疗本文所述病理状况或疾病的药物。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物递送至受试者的基本整个身体。考虑到本公开旨在提供预防和/或治疗由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的手段，在一些实施方式中为能够将药物递送至肝脏的给药方式。
可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每三周、每个月、每2个月、每季度、每半年或每年1次或多次。
本公开所述的双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体死亡的致死剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中指能引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J或C3H/HeNCrlVr小鼠，以所述双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物中的双链寡核苷酸的量计：对于双链寡核苷酸与药学上可接受的缀合分子形成的siRNA缀合物，其双链寡核苷酸用量可以为0.001-100mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重，在进一步的实施方式中为0.05-20mg/kg体重，在更进一步的实施方式中为0.1-15mg/kg体重，在又进一步的实施方式中为0.1-10mg/kg体重。在给予本公开所述的双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物时，可优选上述用量。
另外，通过将本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物导入细胞，还可以通过RNAi机制达到抑制肝细胞中该特定基因的表达这一目的。在一个一些实施方式中，所述肝细胞为肝炎细胞，在一些实施方式中为将HEK293A细胞或HepG2.2.15细胞。在一些实施方式中，所述肝细胞可以选自Hep3B、HepG2、Huh7等肝癌细胞系或分离的肝原代细胞，在一些实施方式中为Huh7肝癌细胞。
采用本公开提供的方法抑制特定基因在肝细胞中表达，所提供的双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物中的双链寡核苷酸的用量是本领域技术人员根据期望获得的效果容易确定的。例如，在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸、药物组合物和/或siRNA缀合物是siRNA缀合物，所提供的siRNA缀合物中的siRNA用量是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部还是全身等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
试剂盒
本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含有效量的本公开的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物的至少一种。
在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在一个容器中提供siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可包含一个提供药学上可接受的赋形剂的容器。在一些实施方式中，所述试剂盒中还可包含其它成分，如稳定剂或防腐剂等。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在不同于提供本文所述siRNA的容器以外的其它容器中包含至少一种其它治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将siRNA与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分(若有的话)进行混合的说明书。
在本公开的试剂盒中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物，和/或药学上可接受的辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和/或siRNA缀合物和任选的药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，可在本公开的试剂盒中提供无菌水。
下面将通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例
除非特别说明、以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LBboratoryPress(1989))所记载的方法进行。
HEK293A细胞由北京大学分子医学研究所核酸技术实验室提供，用含有20％的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)及0.2体积％的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin，Gibco，Invitrogen公司)的DMEM完全培养基(Hyclone公司)培养细胞，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养。
除非另有说明，用以下合成的各种siRNA或siRNA缀合物转染细胞时，使用LipofectamineTM2000(Invitrogen)作为转染试剂，具体操作参照制造商提供的说明书。
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
所使用的动物模型如下：
C57BL/6N小鼠：6-8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，以下简称为C57小鼠；
SD大鼠：由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；
HBV转基因小鼠C57BL/6-HBV：品系名：B6-Tg HBV/Vst(1.28copy,genotype A)，购自北京维通达生物技术有限公司。于实验前选择COI>104的小鼠，以下也简称为1.28copy小鼠；
HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J：购自北京大学医学部实验动物科学部；
HBV转基因小鼠：命名为M-TgHBV，购自上海市公共卫生中心动物部，转基因小鼠的制备方法如Ren J.等，J.Medical Virology.2006,78:551-560所述；
AAV-HBV转基因小鼠：按照文献方法(董小岩等，Chin J Biotech2010,May 25；26(5):679-686)制备AAV-HBV模型，rAAV8-1.3HBV，D型(ayw)，购于北京五加和分子医学研究所有限公司，1×1012viral genome(v.g.)/mL，批号2016123011。实验前用无菌PBS稀释至5×1011v.g./mL。每只小鼠注射200μL，即每只小鼠注射1×1011v.g.。病毒注射后第28天，所有小鼠通过眼眶采血(约100μL)用于收集血清检测HBsAg和HBV DNA；
低浓度AAV-HBV转基因小鼠：采用与上述基本相同的造模方法，区别之处在于，病毒在实验前用无菌PBS稀释至1×1011v.g./mL，每只小鼠注射100μL病毒，即每只小鼠注射1×1010v.g.；
BALB/c小鼠：6-8周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司；
ob/ob小鼠：6-8周龄，购于常州卡文斯实验动物有限公司；
人APOC3转基因小鼠：B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，购于美国Jackson实验室；
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
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若无特别说明，以下体内/体外效果实验数据均以X±SEM表示，数据分析采用Graphpad prism6.0统计分析软件。
制备例1-48本公开提供的siRNA缀合物的合成
按照CN110959011A制备例1所述的制备方法，制备获得了以下表2中的缀合物1-48，区别仅在于，siRNA缀合物中含有的siRNA的正义链和反义链分别如表2中所示。按照以下表2中编号为缀合物1-缀合物48的siRNA的核酸序列，分别合成siRNA的正义链和反义链。使用超纯水(Milli-Q超纯水仪，电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将siRNA缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL(以siRNA计)后，利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-MassSP1ectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。实测值与理论值一致，说明所合成的缀合物1-48是目标设计的双链核酸序列。缀合物1-48具有式(403)所示的结构，并且该缀合物1-48包含的siRNA具有表2中缀合物1-48对应的siRNA序列。
表2siRNA缀合物中的siRNA序列
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表3参比siRNA缀合物中的siRNA序列
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其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；小写字母d表示该字母d右侧相邻的一个核苷酸为2'-脱氧核苷酸；字母组合VP表示该VP右侧相邻的一个核苷酸乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸；大写字母P表示P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸修饰的核苷酸；(GLY)表示与该(GLY)左右相邻的两个核苷酸由式(A101)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-Ac)表示与该(GLY-Ac)左右相邻的两个核苷酸由式(A102)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-Ph)与该(GLY-Ph)左右相邻的两个核苷酸由式(A103)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-iBu)表示与该(GLY-iBu)左右相邻的两个核苷酸由式(A105)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-Cro)表示与该(GLY-Cro)左右相邻的两个核苷酸由式(A107)表示的无环脱碱基基团连接，并且前述无环脱碱基基团均为S构型；(GLY-S)表示与该(GLY-S)左右相邻的两个核苷酸由S构型的式(101)表示的无环脱碱基基团连接；(GLY-R)表示与该(GLY-R)左右相邻的两个核苷酸由R构型的式(101)表示的无环脱碱基基团连接(GNA)表示与该GNA左侧相邻的核苷酸中的核糖被GNA替代形成的单体；(UNA)表示含有与该UNA左侧相邻的核苷酸中的核糖被UNA替代形成的单体。
对比制备例1-23参比siRNA缀合物的合成
按照CN110959011A制备例1所述的制备方法，制备获得了以上表3中编号为阴性参比缀合物和参比缀合物1-23的参比siRNA缀合物，区别仅在于，参比siRNA缀合物中含有的siRNA的正义链和反义链如表3中所示，参比siRNA缀合物NC中的siRNA序列是与已知的基因均不具显著相关性的阴性对照序列；参比缀合物1-23中含有的siRNA序列是与前述缀合物1-47中的siRNA序列拥有相同的碱基排序，但不含有无环脱碱基基团的序列。按照表3中编号为阴性参比缀合物和参比缀合物1-23的siRNA核酸序列，分别合成siRNA的正义链和反义链。使用超纯水(Milli-Q超纯水仪，电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将siRNA缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL(以siRNA计)后，利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-MassSP1ectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。实测值与理论值一致，说明所合成的阴性参比缀合物和参比缀合物1-23是目标设计的双链核酸序列。缀合物siRNA缀合物具有式(403)所示的结构，并且各参比siRNA缀合物中所包含的siRNA分别具有表3中阴性参比缀合物或参比缀合物1-23所对应的siRNA序列。
实验例1
本公开的缀合物在体外psi-CHECK***中对脱靶目标序列的抑制活性
本实验例中，采用体外psi-CHECK***，检测了缀合物1、缀合物2、缀合物3、缀合物4、缀合物5、缀合物6、缀合物7和缀合物8在体外psi-CHECK***中对目标序列的抑制活性。
根据Kumico Ui-Tei et.al.,Functional dissection of siRNA sequence bysystematic DNA substitution:modified siRNA with a DNA seed arm is a powerfultool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-targeteffect.Nucleic Acids Research,2008.36(7),2136-2151描述的方法，构建检测质粒，将所述检测质粒与待测缀合物共转染至HEK293A细胞中，通过双萤光素酶报告基因的表达水平，来反映siRNA的目标序列抑制活性。具体步骤如下：
[1]构建检测质粒
采用psiCHECKTM-2(PromegaTM)质粒构建了检测质粒，所述质粒中含有目标序列1,目标序列1中包含与待测缀合物中siRNA反义链部分互补的序列、且该序列在目标序列1中重复5次，因此待测缀合物对目标序列1的抑制效果即可反应脱靶效应的程度。即，抑制效果越高，待测缀合物越可能发生脱靶。将目标序列1及其互补序列克隆到psiCHECKTM-2质粒的Xho I/Not I位点。
对于待测siRNA缀合物，目标序列1如下所示：
5'-CTCGAGAAACCGCCCTAGGGACAAGAATTGGAAACCGCCC TAGGGACAAGAATTGGAAACCGCCCTAGGGACAAGAATTGGAAAC CGCCCTAGGGACAAGAATTGGAAACCGCCCTAGGGACAAGAA-3'(SEQ IDNO:131)
[2]转染
在添加有10％的胎牛血清(FBS，RMBIO公司)及0.2％体积比的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin，HyClone公司)的H-DMEM完全培养基(HyClone公司)中，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养HEK293A细胞(购自南京科百生物技术有限公司)。
将HEK293A细胞以8×103细胞/孔接种于96孔板中，16小时后细胞生长密度达到70％时，吸尽培养孔中完全培养基，每孔加入80μL opti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5小时。
用PBS将上述检测质粒稀释成20μM储存液；用PBS将每一种待测siRNA缀合物分别配制成4μM、1μM、0.25μM、0.0625μM、0.015625μM、0.003906μM、0.0009765μM、0.0002441μM、0.00006104μM、0.00001526μM和0.000003815μM(以siRNA缀合物中的siRNA量计)共11个不同浓度的siRNA缀合物工作液。所用siRNA缀合物分别为上述制备获得的缀合物1、缀合物2、缀合物3、缀合物4、缀合物5、缀合物6、缀合物7或缀合物8。
对于每一siRNA缀合物，分别配制1A1-1A11溶液，每份1A1-1A11溶液依次分别含有上述11个浓度的siRNA工作液1μL、检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和8.95μL的Opti-MEM培养基。
配制1B溶液，每份1B溶液含有0.2μL LipofectamineTM2000和9.8μL Opti-MEM培养基。
配制1C溶液，每份1C溶液含有检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和9.95μL的Opti-MEM培养基。
分别将一份1B溶液与得到的一份每个siRNA缀合物的1A1-1A11溶液混合，分别室温下孵育20min，得到每个siRNA缀合物的转染复合物1X1-1X11。
将一份1B溶液与一份1C溶液混合，分别室温下孵育20min，得到空白转染复合物1X12。
在培养孔中，分别加入每一siRNA缀合物的转染复合物1X1-1X11，均匀混合，加入量为20μL/孔，得到每个siRNA缀合物终浓度分别约为40nM、10nM、2.5nM、0.625nM、0.15625nM、0.03906nM、0.009765nM、0.002441nM、0.0006103nM、0.0001526nM、0.00003815nM(以siRNA缀合物中的siRNA量计)的转染复合物，每个siRNA缀合物的转染复合物1X1-1X11均转染3个培养孔，得到含siRNA缀合物的共转染混合物，记为测试组。
在另外3个培养孔中，分别加入空白转染复合物1X12，加入量为20μL/孔，得到不含siRNA缀合物的转染混合物，记为空白对照组。
分别将含siRNA缀合物的共转染混合物和不含siRNA缀合物的转染混合物在培养孔中转染4小时后，每孔补加100μL含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将96孔板置于CO2培养箱继续培养24小时。
[3]检测
吸去培养孔中的培养基，每孔加入150μL的Dual-Luciferase试剂与H-DMEM混合溶液(体积比1:1)，充分混匀，室温孵育10min后，转移120μL混合液到96孔酶标板上，使用Synergy II多功能酶标仪(BioTek公司)读取96孔酶标板上各培养孔中Firefly的化学发光值(Fir)；再向96孔酶标板上每孔加入60μL Dual-/>Stop&/>试剂，充分混匀，室温孵育10min后，按照读取Fir的排布方式，使用酶标仪读取96孔酶标板上各培养孔中Renilla的化学发光值(Ren)。
计算96孔酶标板上每孔发光比值Ratio＝Ren/Fir，各测试组或对照组的发光比值Ratio(测试)或Ratio(对照)为三个培养孔Ratio的平均值；以对照组的发光比值为基准，对各测试组的发光比值进行归一化，获得Ratio(测试)/Ratio(对照)的比值R，以此表示Renilla报告基因的相对表达水平，即残留活性。siRNA对目标序列的抑制率＝(1-R)×100％。
依据转染了不同浓度的待测siRNA后，HEK293A细胞中Renilla的相对残留活性，利用Graphpad 5.0软件的非线性回归分析功能拟合log(inhibitor)vs.response—Variableslope(four parameters)剂量-效应曲线。
根据拟合的剂量-效应曲线对应的函数，计算待测siRNA靶向目标序列的IC25值，所述函数如下，
式中：
Y是比值R，即Renilla的相对残留活性，
X为转染siRNA浓度的对数值，
Bot是稳态期底部的Y值，
Top是稳态期顶部的Y值，
X'是当Y在底部到顶部之间一半时对应的X值，而HillSlope则是曲线在X'处的斜率。
由该剂量-效应曲线和对应的函数，确定当Y＝75％时(即剩余活性75％，抑制率25％)对应的X25值，计算获得各siRNA的IC25值＝10^X25(nM)，相应地，IC25越大，表明待测缀合物发生脱靶的可能性越低。结果显示，缀合物1、缀合物2、缀合物3、缀合物4、缀合物5、缀合物6、缀合物7和缀合物8的剂量-效应曲线显示缀合物1-8对目标序列1在全部测试浓度范围内的抑制活性均未高于25％，即，在序列中各种位置包含无环脱碱基基团的本公开的缀合物均未表现出明显的脱靶效应。
对比实验例1
siRNA缀合物在体外psi-CHECK***中对脱靶目标序列的抑制活性
按照实验例1的方法，测试了参比缀合物1在体外psi-CHECK***中的脱靶序列抑制活性，测得的IC25值为1.145nM。
参比缀合物1是siRNA序列和缀合物1-8相同，但不含有无环脱碱基基团的缀合物。由实验例1和对比实验例1的结果可知，对于脱靶目标序列，参比缀合物1显示出一定的脱靶情况；而本公开的在siRNA反义链中不同位置处含有无环脱碱基基团的缀合物则均未表现出任何脱靶效应。说明本公开的双链寡核苷酸通过在反义链中设置无环脱碱基基团，使得本公开的双链寡核苷酸均具有显著降低的脱靶效应。
实验例2
本公开的siRNA缀合物在体外Huh7细胞中对APOC3 mRNA的抑制活性。
[1]细胞培养
将Huh7细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)，用含有10％的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)的DMEM完全培养基(Hyclone公司)培养细胞，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养。
[2]转染
将Huh7细胞以1.5×105细胞/孔接种于12孔板中，16小时后细胞生长密度达到40％时，吸尽培养孔中完全培养基，每孔加入1mL opti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5小时。
用PBS将每一种待测siRNA缀合物分别配制成浓度为20μM(以siRNA缀合物中的siRNA量计)的siRNA缀合物工作液。所用siRNA缀合物分别为上述制备获得的缀合物1、缀合物2、缀合物3、缀合物4、缀合物5、缀合物6、缀合物7或缀合物8。
对于每一siRNA缀合物，分别配制2A溶液，每份2A溶液依次分别含有上述siRNA工作液3μL和97μL的Opti-MEM培养基。
配制2B溶液，每份2B溶液含有2μL LipofectamineTM2000和98μL Opti-MEM培养基。
配制2C溶液，每份2C溶液含有100μL的Opti-MEM培养基。
分别将一份2B溶液与得到的一份每个siRNA缀合物的2A溶液混合，分别室温下孵育20min，得到每个siRNA缀合物的转染复合物2X1-2X8。
将一份2B溶液与一份2C溶液混合，分别室温下孵育20min，得到空白转染复合物2X9。
在培养孔中，分别加入每一siRNA缀合物的转染复合物2X1-2X8，均匀混合，加入量为200μL/孔，得到每个siRNA缀合物终浓度分别约为50nM(以siRNA缀合物中的siRNA量计)的转染复合物，每个siRNA缀合物的转染复合物2X1-2X8均转染2个培养孔，得到含siRNA缀合物的共转染混合物，记为测试组。
在另外2个培养孔中，分别加入转染复合物2X9，加入量为200μL/孔，得到不含siRNA缀合物的转染混合物，记为空白对照组。
分别将含siRNA缀合物的共转染混合物和不含siRNA缀合物的共转染混合物在培养孔中转染4小时后，每孔补加1mL含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将12孔板置于CO2培养箱继续培养24小时。
[3]检测
随后，使用RNAVzol(购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，货号N002)根据说明书记载的方法提取各孔细胞中的总RNA。
对于每孔细胞，分别取1μg总RNA，使用反转录试剂盒GoldenstarTM RT6 cDNASynthesis Kit(购自北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSK301M)提供的试剂，其中选取GoldenstarTM Oligo(dT)17作为引物，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配置反转录反应体系20μl，对各孔细胞的总RNA进行反转录。反转录的条件为：对于每一反转录反应体系，将反转录反应体系置于50℃孵育50min，然后85℃孵育5min，最后4℃孵育30s，反应结束后，向反转录反应体系中加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液。
对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液5μl做模板，使用SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01B)提供的试剂配置qPCR反应体系20μl，其中，用于扩增目标基因APOC3和内参基因GAPDH的PCR引物序列如表9所示，每条引物的终浓度为0.25μM。将各qPCR反应体系置于ABI StepOnePlusReal-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因APOC3和内参基因GAPDH的产物W。产物W随即依次经过95℃15s，60℃1min，95℃15s的孵育，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W中目标基因APOC3和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因APOC3和内参基因GAPDH的Ct值。
表4引物信息
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因APOC3进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组三个培养孔各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，测试组和对照组的每一培养孔均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组APOC3 mRNA的表达水平进行归一化，定义空白对照组APOC3 mRNA表达水平为100％，
测试组APOC3 mRNA相对表达水平＝2-ΔΔCt(测试组)×100％
测试组APOC3 mRNA抑制率＝(1-测试组APOC3 mRNA相对表达水平)×100％
图1为分别转染了本公开的缀合物1-8后，Huh7细胞中APOC3mRNA相对表达水平的柱状图。
对比实验例2
本公开的siRNA缀合物在体外Huh7细胞中对APOC3 mRNA的抑制活性。
按照实验例2的方法，测试了参比缀合物1的抑制活性，结果如图1所示。
图1的结果显示，在50nM的浓度下，本公开的siRNA缀合物均表现出不低于50％的APOC3 mRNA抑制活性。总体上说，本公开的siRNA缀合物与参比缀合物具有相当的APOC3mRNA抑制活性。其中，参比缀合物1表现出67.62％的抑制活性。缀合物1、缀合物4、缀合物5、缀合物7、缀合物8分别表现出55.24％、59.05％、53.33％、60％和59.05％的APOC3 mRNA抑制活性，和参比缀合物1相比，活性均略有降低降低。缀合物6表现出65.71％的抑制活性，即和参比缀合物1相当的抑制活性。而缀合物2和缀合物3分别显示出71.43％和77.14％的抑制活性，即比参比缀合物1更高的抑制活性，尤其是缀合物3的抑制活性最高。
由实验例1-2以及对比实验例1-2的结果可以得出，siRNA的反义链中含有不同数量、不同位置的无环脱碱基基团时，不仅具有显著降低的脱靶效应，并且还能保持很高的抑制活性，甚至表现出比不具有无环脱碱基基团的siRNA缀合物更高的靶mRNA抑制活性。
实验例3
本公开的siRNA缀合物在体外psi-CHECK***中对脱靶目标序列的抑制活性
按照实验例1的方法，分别测试了制备得到的缀合物6、缀合物9和缀合物10在体外psi-CHECK***中的抑制活性，区别仅在于，使用缀合物6、缀合物9和缀合物10代替所测试的siRNA缀合物进行测试。其中，缀合物6、缀合物9和缀合物10中的siRNA是具有相同的碱基序列，但核酸修饰方案不同的siRNA。结果如表5所示。结果显示，缀合物6和缀合物9对目标序列1的抑制活性在全部测试浓度范围内均为高于25％，即，缀合物6和缀合物9未表现出明显的脱靶效应。缀合物10的IC25值为4.409nM。
对比实验例3
按照实验例3的方法，分别测试了制备得到的参比缀合物1、参比缀合物2和参比缀合物3的在体外psi-CHECK***中的抑制活性。结果如表5所示。其中，参比缀合物1和参比缀合物2中的siRNA是分别和缀合物6和参比缀合物9中siRNA具有相同修饰的碱基序列，但不含有无环脱碱基基团的siRNA；参比缀合物3和缀合物10中的siRNA中的碱基均为未修饰的碱基，且碱基序列相同，但参比缀合物3中的siRNA不含有无环脱碱基基团的siRNA。
表5缀合物的IC25
缀合物编号 IC25(nM) 缀合物编号 IC25(nM)
缀合物6 无 参比缀合物1 1.145
缀合物9 无 参比缀合物2 5.235
缀合物10 4.409 参比缀合物3 0.269
由表5的结果可知，对于双链寡核苷酸碱基排列相同，且其余部分修饰方法均相同的缀合物之间进行比较，不包含无环脱碱基基团的参比缀合物1和参比缀合物2均显示出明显的脱靶效应，而本公开的缀合物6和缀合物9在全部测试浓度内均未发生脱靶；类似地，本公开的缀合物10显示出比不包含无环脱碱基基团的参比缀合物3明显更低的脱靶效应。可见，对于具有不同修饰方案的双链寡核苷酸，通过设置无环脱碱基基团，所得到的本公开的双链寡核苷酸均具有显著降低的脱靶效应。
实验例4
按照实验例1的方法，分别测试了制备得到的缀合物6和缀合物11在体外psi-CHECK***中对脱靶目标序列的活性。结果显示，缀合物6和缀合物11对目标序列1的抑制活性均未高到可以计算出IC25的数值，即，缀合物6和缀合物11均未表现出明显的脱靶效应。
对比实验例4
按照实验例4的方法，分别测试了参比缀合物1和参比缀合物4在体外psi-CHECK***中对脱靶目标序列的活性。结果显示，参比缀合物1和参比缀合物4的IC25值分别为1.145nM和2.878nM，均表现出明显的脱靶效应。
其中，缀合物6和缀合物11中的siRNA是靶向同一段靶mRNA，但正义链长度分别为19和21个核苷酸，反义链长度分别为21和23个核苷酸的siRNA。参比缀合物1和参比缀合物4中的siRNA是分别和缀合物6和缀合物11具有相同的碱基序列的siRNA。由实验例5和对比实验例5的结果可以看出，具有不同序列长度的含有无环脱碱基基团的本公开的缀合物，均表现出了比不含有无环脱碱基基团的参比缀合物显著降低的脱靶效应。
实验例5
按照实验例2的方法，分别测试了制备得到的缀合物9、缀合物10和缀合物11在体外Huh7细胞中对APOC3 mRNA的抑制活性。结果如图2中所示。
对比实验例5
按照实验例2的方法，分别测试了制备得到的参比缀合物2、参比缀合物3和参比缀合物4在体外Huh7细胞中对APOC3 mRNA的抑制活性。结果如图2中所示。
图2结果显示，在50nM的浓度下，本公开的缀合物9、缀合物10和缀合物11对APOC3mRNA的抑制率高达65.72％、67.14％和73.33％。均表现出高于参比缀合物2、参比缀合物3和参比缀合物4更高的抑制活性。由实验例3-5和对比实验例3-5的结果可知，本公开的含有无环脱碱基基团的siRNA缀合物，不仅显示出比不含有无环脱碱基基团的缀合物显著更低的脱靶效应，进一步地，还显示出相对参比缀合物更高的抑制活性。
实验例6
按照实验例1的方法，测试了制备得到的缀合物12-19在体外psi-CHECK***中对脱靶序列的抑制活性，区别在于用目标序列2替代了目标序列1，目标序列2中包含与待测缀合物中siRNA反义链部分互补的序列，因此待测缀合物对目标序列2的抑制效果即可反应脱靶效应的程度。即，抑制效果越高，待测缀合物越可能发生脱靶。
目标序列2：
5'-AAACCGCCCTAGGGACAAGAA-3'(SEQ ID NO:136)
在检测步骤中，由剂量-效应曲线和对应的函数，确定当Y＝50％时对应的X50值，计算获得各siRNA的IC50值＝10^X50(nM)，相应地，IC50越大，表明待测缀合物发生脱靶的可能性越低。
实验结果显示，本公开的缀合物12-19对目标序列2的抑制活性均未高到可以计算出IC50的数值，即均未表现出明显的脱靶效应。
其中，缀合物12-19含有相同的碱基序列。区别在于，缀合物12、缀合物14、缀合物16、缀合物18中的siRNA，是按照5'端到3'端方向，在第6、7、8位或第6和第7位的核苷酸含有R立体构型的无环脱碱基基团的siRNA。缀合物13、缀合物15、缀合物17、缀合物19中的siRNA是在上述对应位置含有S立体构型的无环脱碱基基团的siRNA。
对比实验例6
按照实验例6的方法，测试了制备得到的参比缀合物12在体外psi-CHECK***中对脱靶目标序列的抑制活性。结果显示，参比缀合物12的IC50为0.29nM。参比缀合物12是和缀合物12-19有相同碱基序列，但不含有无环脱碱基基团的缀合物。
由实验例6和对比实验例6的结果可知，在不同位置、具有不同数量的、不同立体构型的无环脱碱基基团的本公开的缀合物均显示出相较于不具有无环脱碱基基团的缀合物显著降低的脱靶效应。通过设置不同构型的无环脱碱基基团，由此进一步说明，本公开的各种双链寡核苷酸及寡核苷酸缀合物均显示出相类似的降低的脱靶效应。
实验例7
按照实验例6的方法，测试了本公开的缀合物12-19在体外Huh7细胞中对在靶目标序列的抑制活性。区别仅在于使用目标序列3替代了目标序列2：
目标序列3：5'-CCCAAUAAAGCUGGACAAGAA-3'(SEQ ID NO:137)；
该目标序列1与靶mRNA中的一部分同源，并与所检测的siRNA缀合物中反义链的完全互补序列，因此各siRNA缀合物对目标序列3的抑制效果可反应所检测的siRNA缀合物的目标基因表达的APOC3 mRNA的抑制能力。
测得的缀合物12-19的IC50值如表6所示。
对比实验例7
按照实验例7方法，测试了参比缀合物12-19在体外psi-CHECK***中对在靶目标序列的抑制活性，结果如表6所示。
表6siRNA缀合物的IC50
制备例编号 IC50(nM)
缀合物12 0.015nM
缀合物13 0.013nM
缀合物14 0.0078nM
缀合物15 0.0044nM
缀合物16 0.021nM
缀合物17 0.024nM
缀合物18 0.023nM
缀合物19 0.022nM
参比缀合物12 0.011
由上述表6的结果可知，缀合物12-19均表现出较高的APOC3 mRNA抑制活性，IC50在0.0044-0.024nM之间。
与不含有无环脱碱基基团的siRNA缀合物相比，本公开的含有无环脱碱基基团的siRNA缀合物的活性均未表现出明显的下降。其中，缀合物12和缀合物13表现出和参比缀合物12基本相当的APOC3 mRNA抑制活性。进一步地，缀合物14和缀合物15甚至表现出了比参比缀合物12更高的APOC3 mRNA的抑制活性。实验例6-7和对比实验例6-7的结果说明，本公开的包含无环脱碱基基团的双链寡核苷酸缀合物在具有显著降低的脱靶效应的同时，还能基本维持对靶mRNA的抑制活性，甚至显示出进一步提升的对靶mRNA的抑制活性。
实验例8
按照实验例7的方法，测定了缀合物测定了本公开的缀合物20-25在体外psi-CHECK***中对在靶目标序列的抑制活性，区别仅在于对于缀合物20、21、22、23、24和25，使用的目标序列分别是目标序列4、5、6、7、8和9：
目标序列4：
5'-CCCTGAAAGACTACTGGAGCA-3'(SEQ ID NO:138)；
目标序列5：
5'-GCTTAAAAGGGACAGTATTCT-3'(SEQ ID NO:139)；
目标序列6：
5'-GGACAGTATTCTCAGTGCTCT-3'(SEQ ID NO:140)；
目标序列7：
5'-AGTATTCTCAGTGCTCTCCTA -3'(SEQ ID NO:141)；
目标序列8：
5'-ACAGTATTCTCAGTGCTCTCC-3'(SEQ ID NO:142)
目标序列9：
5'-AGGGACAGTATTCTCAGTGCT-3'(SEQ ID NO:143)；
目标序列4-9分别与靶mRNA中的一部分同源，并与所检测的siRNA缀合物中反义链的序列完全互补，因此各siRNA缀合物对对应目标序列的抑制效果可反应所检测的siRNA缀合物对目标基因表达的mRNA的抑制能力。
实验结果如表7所示。
对比实验例8
按照实验例9的方法，测定了参比缀合物6-11在体外psi-CHECK***中对在靶目标序列的抑制活性。对于参比缀合物6、7、8、9、10和11，使用的目标序列分别是目标序列3、4、5、6、7和8。实验结果如表7所示。
表7 siRNA缀合物的IC50
缀合物编号 IC50(nM) 缀合物编号 IC50(nM)
缀合物20 0.29 参比缀合物6 0.27
缀合物21 0.032 参比缀合物7 0.032
缀合物22 0.29 参比缀合物8 0.12
缀合物23 0.019 参比缀合物9 0.032
缀合物24 0.017 参比缀合物10 0.029
缀合物25 0.038 参比缀合物11 0.089
由表7结果可知，本公开的含有无环脱碱基基团的缀合物，相较于序列相同、区别仅在于不含有无环脱碱基基团的缀合物，抑制活性未见明显的下降。进一步地，其中缀合物23、缀合物24和缀合物25还表现出了比参比缀合物更高的抑制活性。证明了对于不同碱基序列而言，本公开的包含无环脱碱基基团的双链寡核苷酸在具有显著降低的脱靶效应的同时，还能基本维持对靶mRNA的抑制活性，甚至能够进一步地提升对靶mRNA的抑制活性。
实验例9
本公开的siRNA缀合物在小鼠肝原代细胞中对APOC 3mRNA的抑制率测定。
本实验考查了制备得到的缀合物21、23和25在小鼠肝原代细胞中对APOC3 mRNA的抑制率的测定。具体步骤如下。
从APOC3转基因小鼠新鲜肝组织提取获得小鼠肝原代细胞，在I型胶原蛋白包被的组织培养皿中接种小鼠肝原代细胞，在含有1×双抗和10％FBS的RPMI 1460培养基中，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养30min。
弃去培养基，以opti-MEM调整小鼠肝原代细胞密度至2×105细胞/mL，得到小鼠肝原代细胞悬液。随后在6孔板的不同培养孔中分别加入得到的小鼠肝原代细胞悬液，将小鼠肝原代细胞接种到培养孔中。加入小鼠肝原代细胞悬液的体积为2mL/孔，小鼠肝原代细胞数量为4×105细胞/孔。
用PBS将下面的siRNA缀合物中的每一个siRNA缀合物分别配制成20μM的siRNA缀合物工作液，所用siRNA缀合物分别为缀合物21、23和25。
在培养孔中，分别加入每一个siRNA缀合物5μL，均匀混合，得到每个细胞孔中siRNA缀合物终浓度约为50nM的测试组。
在另外3个培养孔中，分别加入5μL不含siRNA缀合物的PBS溶液，记为空白对照组。
将含siRNA缀合物的转染混合物和不含siRNA缀合物的转染混合物在培养孔中转染4h后，每孔补加1ml含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将6孔板置于CO2培养箱在37℃下继续培养24h。
随后，使用RNAVzol(购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，货号N002)根据说明书记载的方法提取各孔细胞中的总RNA。
对于每孔细胞，分别取1μg总RNA，使用反转录试剂盒GoldenstarTM RT6 cDNASynthesis Kit(购自北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSK301M)提供的试剂，其中选取GoldenstarTM Oligo(dT)17作为引物，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配置反转录反应体系20μl，对各孔细胞的总RNA进行反转录。反转录的条件为：对于每一反转录反应体系，将反转录反应体系置于50℃孵育50min，然后85℃孵育5min，最后4℃孵育30s，反应结束后，向反转录反应体系中加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液。
对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液5μl做模板，使用SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01B)提供的试剂配置qPCR反应体系20μl，其中，用于扩增目标基因APOC3和内参基因GAPDH的PCR引物序列如表8所示，每条引物的终浓度为0.25μM。将各qPCR反应体系置于ABI StepOnePlusReal-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因APOC3和内参基因GAPDH的产物W。产物W随即依次经过95℃15s，60℃1min，95℃15s的孵育，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W中目标基因APOC3和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因APOC3和内参基因GAPDH的Ct值。
表8引物信息
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因APOC3进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组三个培养孔各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，测试组和对照组的每一培养孔均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组APOC3 mRNA的表达水平进行归一化，定义空白对照组APOC3 mRNA表达水平为100％。
测试组APOC3 mRNA相对表达水平＝2-ΔΔCt(测试组)×100％
测试组APOC3 mRNA抑制率＝(1-测试组APOC3 mRNA相对表达水平)×100％。各siRNA缀合物对APOC3 mRNA的抑制率总结于表9中。
对比实验例9
按照实验例9的方法，考查了制备得到的参比缀合物7、9和11在小鼠肝原代细胞中对APOC3 mRNA的抑制率，区别仅在于，分别使用参比缀合物7、9和11代替所使用的siRNA缀合物配制成缀合物工作液进行测试。
各siRNA缀合物对APOC3 mRNA的抑制率总结于表9中。对于同一测试组siRNA缀合物，APOC3 mRNA抑制率是三个培养孔测定的测试组APOC3 mRNA抑制率的算术平均值。
表9小鼠肝原代细胞中APOC3 mRNA的抑制
缀合物编号 APOC3 mRNA抑制率％
缀合物21 92.08
缀合物23 91.54
缀合物25 92.03
参比缀合物7 88.77
参比缀合物9 84.34
参比缀合物11 89.77
由表9及图2的结果可见，本公开提供的siRNA缀合物在小鼠肝原代细胞中显示出较高的APOC3 mRNA抑制活性，在50nM的siRNA缀合物浓度下，缀合物21、缀合物23和缀合物25对APOC3 mRNA抑制率均达到91.5％以上，均高于参比缀合物对APOC3 mRNA的抑制率。进一步地说明了，本公开的提供siRNA缀合物能够有效抑制APOC3 mRNA的表达，因此显示出优异的治疗APOC3靶点相关疾病、特别是对应血脂异常所致疾病的应用前景。
实验例10
siRNA缀合物在CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J小鼠体内对血脂的影响本实验考察了本公开的缀合物26-30对小鼠体内血脂水平的影响，具体步骤如下：
将6-8周龄CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J小鼠随机分组，每组6只，分别向每组小鼠给予siRNA缀合物(制备例27-32)和对比制备例1作为对照。所有动物根据体重计算药量，采用皮下注射方式单次给药，siRNA缀合物给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg，给药体积为5mL/kg。各siRNA缀合物分别以生理盐水溶液提供，根据给药剂量和给药体积，换算出siRNA缀合物应配置的药物浓度。在给药前(记为第0天)与给药后第8、15、22、29、36天对小鼠眼眶静脉丛取血，在各时间点检测血清血脂水平。
眼眶静脉采血，每次约0.1mL，离心得到血清，离心后血清。取20ul血清使用PBS/0.9％生理盐水进行5倍稀释，血清样本送北京迪安中心检测血清甘油三酯(TG)指标。
标准化的血脂水平＝(给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。
血脂水平的抑制率＝(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。结果如图3所示。
对比实验例10
用和实验例10相同的方法，分别考察了参比缀合物5和阴性参比缀合物对小鼠体内血脂水平的影响，区别仅在于，分别使用参比缀合物5或阴性参比缀合物代替各siRNA缀合物进行测试。结果如图3所示。
由图3可以看出，在给药剂量为3mg/kg的条件下，给药后不同时间点，与阴性参比缀合物相比，对于血清甘油三酯水平，在单次给药后长达36天时间内，siRNA缀合物26-30对甘油三酯的抑制率始终维持在78％以上，与参比缀合物5对血清甘油三酯的抑制率相近；最大抑制率出现在给药后第7天，缀合物26对甘油三酯的抑制率高达84.63％。
由此说明，含有不同无环脱碱基基团的本公开的siRNA缀合物均能够显著地降低血清甘油三酯水平，并且与不含无环脱碱基基团的缀合物相比显示出基本相同的降低血清甘油三酯水平的效果。
实验例11
用和实验例8相同的方法，考察了制备得到的缀合物31在体外psi-CHECK***中对HBV mRNA的抑制效果，区别仅在于，使用缀合物31代替实验例8中使用的siRNA缀合物进行测试。
本实验例中所使用的HEK293A细胞购自南京科佰生物科技有限公司，用含有10％的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)及0.2体积％的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin，Gibco，Invitrogen公司)的DMEM完全培养基(Hyclone公司)培养细胞，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养。
区别在于，使用的目标序列为目标序列10：
目标序列10：5'-GACCTTGAGGCATACTTCAAA-3'(SEQ ID NO:148)
该目标序列10是与HBV mRNA中的一部分同源，并与所检测的siRNA中的反义链序列完全互补，因此缀合物31对目标序列10的抑制效果可反应器对HBV mRNA的抑制能力。
siRNA缀合物终浓度分别为10nM、3.33nM、1.11nM、0.370nM、0.122nM、0.0407nM、0.0136nM、0.0045nM、0.00150nM(以siRNA的量计)结果总结于表10中。
对比实验例11
用和实验例11相同的方法，考察了参比缀合物14在体外psi-CHECK***中对HBVmRNA的抑制效果。结果总结于表10中。
表10 siRNA缀合物的IC50
其中，缀合物31是本公开的含有无环脱碱基基团的缀合物，参比缀合物14是和缀合物31具有相同的核苷酸序列，但含有其它无环脱碱基基团的缀合物。
由表10的结果可知，相较于参比缀合物14，缀合物31显示出显著较高的活性，说明本公开的包含无环脱碱基基团的双链寡核苷酸具有比其他无环脱碱基基团显著更高的抑制活性。因此显示出优异的治疗HBV相关疾病、特别是乙肝的应用前景。
实验例12
用和实验例9相同的方法，测定了制备得到的缀合物32和缀合物33在大鼠肝原代细胞中对HAO1 mRNA的抑制率。区别仅在于，试验所使用的肝原代细胞取自SD大鼠；用于扩增目标基因HAO1和内参基因β-actin的PCR引物序列如表11所示。
表11引物信息
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因HAO1进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组三个培养孔各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，测试组和对照组的每一培养孔均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组HAO1 mRNA的表达水平进行归一化，定义空白对照组HAO1 mRNA表达水平为100％，
测试组HAO1 mRNA相对表达水平＝2-ΔΔCt(测试组)×100％
测试组HAO1 mRNA抑制率＝(1-测试组HAO1 mRNA相对表达水平)×100％。
结果总结于表12中。
对比实验例12
用和实验例13相同的方法，测定了参比缀合物15和阴性参比缀合物在大鼠肝原代细胞中对HAO1 mRNA的抑制率。结果总结于表12中。对于同一测试组siRNA缀合物，HAO1mRNA抑制率是三个培养孔测定的测试组HAO1 mRNA抑制率的算术平均值。
表12大鼠肝原代细胞中HAO1 mRNA的抑制
缀合物编号 HAO1 mRNA抑制率％
缀合物32 92.77
缀合物33 91.66
参比缀合物15 91.75
阴性参比缀合物 23.28
由表12的结果可见，本公开的缀合物32和缀合物33在大鼠肝原代细胞中显示出较高的HAO1 mRNA抑制活性，在20nM的siRNA缀合物浓度下，缀合物32和33对HAO1 mRNA抑制率均达到91.5％以上。相较于参比缀合物15，表现出相当甚至更高的抑制率。可见，本公开提供的缀合物能够有效抑制HAO1 mRNA的表达，因此显示出优异的治疗HAO1靶点相关疾病的应用前景。
实验例13
首先用和实验例12相同的方法测定了缀合物32在大鼠肝原代细胞中对HAO1 mRNA的抑制率测定，区别仅在于缀合物32的浓度为10nM(以siRNA的量计)，并进行了RNAseq差异基因统计，具体步骤如下：
进行RNAseq测序分析，对HAO1 mRNA表达数据进行统计学分析，筛选样本在不同状态下表达水平显著差异的基因，实验步骤如下：
[1]对原始的readcount进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正
[2]统计学模型进行假设检验概率的计算
[3]进行多重假设检验校正，得到FDR值
以(|log2FC|≥0Q value≤0.05)作为差异基因的筛选标准，对阈值标准进行筛选。
测定的抑制率总结于表13中，RNAseq差异基因统计的结果总结于图4中。
对比实验例13
用和实验例13相同的方法分别测定了阴性参比缀合物、参比缀合物15、参比缀合物16和参比缀合物17在大鼠肝原代细胞中对HAO1mRNA的抑制率以及RNA seq差异基因统计。结果分别总结于表13和图4中。
表13大鼠肝原代细胞中HAO1 mRNA的抑制
其中，参比缀合物16和17是含有和缀合物32相同的核苷酸序列，但分别含有GNA和UNA的缀合物。表15的结果显示，在10nM的浓度下，缀合物32和参比缀合物15-17表现出基本相当的抑制活性。
图4是显示了缀合物32、参比缀合物15-17和阴性参比缀合物的RNAseq差异基因分析结果和空白对照组对比后得到的数值的柱状图。如图4所示，缀合物32与HAO1 mRNA的基因相关度是最高的，与参比缀合物15-17相比，影响非靶基因表达使其发生显著上调或下调的基因数量明显降低，由此可见，和具有其它无环脱碱基基团的缀合物、或不含有无环脱碱基基团的缀合物相比，含有本公开无环脱碱基基团的缀合物在具有基本相当的抑制活性的同时，更进一步地，表现出了显著降低的脱靶效应。由此说明，本公开的包含无环脱碱基基团的siRNA缀合物，在能够维持双链寡核苷酸对HAO1 mRNA的抑制活性的同时，具有显著降低的脱靶效应。
实验例14
按照和实验例1相同的方法，测试了本公开的缀合物34-42在体外psi-CHECK***中对脱靶目标序列的抑制活性。区别在于采用目标序列11取代了目标序列1：
目标序列11：
5'-CTCGAGCTAACCTCTACACAAGAACTATTGGCTAACCTCTACACAAGAACTATTGGCTAACCTCTACACAAGAACTAGCGGCCGC-3'(SEQ ID NO:153)
目标序列11中包含与待测缀合物中siRNA反义链部分互补的序列、且该序列在目标序列11中重复3次，因此待测缀合物对目标序列11的抑制效果即可反应脱靶效应的程度。即，抑制效果越高，待测缀合物越可能发生脱靶。
在检测步骤中，由剂量-效应曲线和对应的函数，确定当Y＝50％时对应的X50值，计算获得各siRNA的IC50值＝10^X50(nM)，相应地，IC50越大，表明待测缀合物发生脱靶的可能性越低。
实验结果显示，本公开的缀合物34-42对目标序列10，即，脱靶序列的抑制活性均未高到可以计算出IC50值。即，本公开的缀合物34-42均未表现出明显的脱靶效应。
对比实验例14
按照和实验例14相同的方法，测试了参比缀合物18在体外psi-CHECK***中对脱靶序列的抑制活性，测得到IC50值为1.76nM。
其中，缀合物34-42是具有相同的核苷酸碱基序列，在siRNA中反义链具有不同数量、不同位置的无环脱碱基基团的缀合物。而参比缀合物18是和缀合物34-42具具有相同的核苷酸碱基序列，但不含有无环脱碱基基团的缀合物。由实验例15和对比实验例15的结果可知，本公开的含有无环脱碱基基团的缀合物，相较于不含有无环脱碱基基团的缀合物，表现出显著降低的脱靶效应。并且，本公开的含有不同数量、不同位置的无环脱碱基基团的缀合物均表现出了显著降低的脱靶效应。
实验例15
按照和实验例2相同的方法，测定了缀合物35-42在Huh7细胞中对ANGPTL3 mRNA的抑制活性，结果总结于表14中。
对比实验例15
按照和实验例15相同的方法，测定了参比缀合物18在Huh7细胞中对ANGPTL3 mRNA的抑制活性，结果总结于表14中。
表14 siRNA缀合物的ANGPTL3 mRNA抑制率
由表14结果可知，在50nM浓度的条件下，相较于参比缀合物18，本公开的缀合物35-42均表现出了基本相当的ANGPTL3 mRNA抑制率。更进一步地，缀合物36、37、38、39和42甚至表现出了比参比缀合物18更高的抑制活性，尤其是缀合物38，表现出了高达82.5％的抑制活性，比参比缀合物高出28％。实验例14-15和对比实验例14-15的结果说明，本公开的包含无环脱碱基基团的双链寡核苷酸不仅具有显著降低的脱靶效应，还具有与不包含无环脱碱基的相应双链寡核苷酸相当的抑制活性。甚至还显示出更高的对ANGPTL3 mRNA的抑制活性。
实验例16
用和实验例14相同的方法，测定了缀合物39以及缀合物43-45在体外psi-CHECK***中对脱靶目标序列的抑制活性。实验结果显示，本公开的缀合物43-45对目标序列10的抑制活性均未高到可以计算出IC50的数值，即均未表现出明显的脱靶效应。
对比实验例16
用和实验例17相同的方法测定了参比缀合物18、参比缀合物19、参比缀合物20和参比缀合物21在体外psi-CHECK***中对脱靶目标序列的抑制活性。实验结果总结于表15中。
表15siRNA缀合物的IC50
缀合物编号 IC50
参比缀合物18 1.76
参比缀合物19 1.04
参比缀合物20 2.67
参比缀合物21 0.32
其中，缀合物39以及缀合物43-45中的siRNA是具有相同的碱基序列，但不同的碱基序列修饰方案的siRNA，这些siRNA在反义链中的相同位置含有无环脱碱基基团。参比缀合物18-21中的siRNA是分别和缀合物39以及缀合物43-45中的siRNA具有相同的碱基修饰方案、但不含有无环脱碱基基团的siRNA。表15的结果表明，与不含有无环脱碱基基团的siRNA缀合物相比，本公开的包含无环脱碱基基团的siRNA缀合物表现出显著降低的脱靶效应。进而说明，通过设置无环脱碱基基团，本公开的具有不同碱基修饰方案的双链寡核苷酸均显示出显著降低的脱靶效应。
实验例17
用和实验例16相同的方法测定了缀合物39和缀合物46在体外psi-CHECK***中对脱靶目标序列的抑制活性，实验结果显示，缀合物39和缀合物46对目标序列10的抑制活性均未高到可以计算出IC50的数值，即均未表现出明显的脱靶效应。
对比实验例17
用和实验例16相同的方法测定了参比缀合物18和参比缀合物22在体外psi-CHECK***中对脱靶目标序列的抑制活性，测得的IC50值分别为1.76nM和1.347nM。
其中，缀合物39和缀合物46中的siRNA是靶向ANGPTL3 mRNA中同一段靶mRNA，但正义链长度分别为19和21、反义链长度分别为21和23的siRNA。参比缀合物18和参比缀合物22是分别和缀合物39和缀合物46具有相同的核苷酸序列、但不含有无环脱碱基基团的缀合物。由实验例18和对比实验例18的结果可知。对于具有不同长度的寡核苷酸序列，本公开的包含无环脱碱基基团的双链寡核苷酸均显示出显著降低的脱靶效应。
实验例18
用和实验例15相同的方法测定了缀合物43-46在体外Huh7细胞中对ANGTL3靶mRNA的抑制活性。实验结果总结于表16中。
对比实验例18
用和实验例18相同的方法测定了参比缀合物19-22在体外Huh7细胞中对ANGPTL3靶mRNA的抑制活性。实验结果总结于表16中。
表16.siRNA缀合物的ANGPTL3 mRNA抑制率
缀合物编号 抑制率％ 缀合物编号 抑制率％
缀合物43 61.5％ 参比缀合物19 65.5％
缀合物44 79.0％ 参比缀合物20 72.5％
缀合物45 62.5％ 参比缀合物21 75.5％
缀合物46 66％ 参比缀合物22 74.5％
由表16结果可知，在50nM的浓度下，本公开的缀合物均表现出不低于60％的ANGPTL3 mRNA抑制率。和参比缀合物19-21的抑制活性相比，未出现明显的活性降低。尤其是缀合物44，抑制率高达79.0％，表现出比参比缀合物19-21更高的ANGPTL3 mRNA活性。由此可见，本公开的包含无环脱碱基基团的siRNA缀合物在具有显著降低的脱靶效应的同时，还具有并未降低的对靶mRNA的抑制活性，甚至出人意料地显示出更高的靶mRNA抑制活性。
实验例19
按照实验例9的方法，测定了本公开的缀合物47和缀合物48在小鼠肝原代细胞中对ANGPTL3 mRNA的抑制率。区别仅在于，测试的缀合物浓度为20nM(以siRNA的量计)。
区别仅在于，小鼠肝原代细胞由正常C57BL/6N小鼠新鲜肝组织提取获得，在I型胶原蛋白包被的玻璃或塑料盖玻片或组织培养皿中接种适当密度的细胞，用含有1×双抗和10％FBS的RPMI 1460培养基培养细胞，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养细胞30min；用于扩增目标基因ANGPTL3和内参基因GAPDH的PCR引物序列如表17所示。
表17引物信息
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因ANGPTL3进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组三个培养孔各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，测试组和对照组的每一培养孔均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组ANGPTL3 mRNA的表达水平进行归一化，定义空白对照组ANGPTL3 mRNA表达水平为100％，
测试组ANGPTL3 mRNA相对表达水平＝2-ΔΔCt(测试组)×100％
测试组ANGPTL3 mRNA抑制率＝(1-测试组ANGPTL3 mRNA相对表达水平)×100％
各siRNA缀合物对ANGPTL3 mRNA的抑制率总结于表18中。对于同一测试组siRNA缀合物，ANGPTL3 mRNA抑制率是三个培养孔测定的测试组ANGPTL3 mRNA抑制率的算术平均值。
对比实验例19
用和实验例19相同的方法，测定了参比缀合物23和阴性参比缀合物在小鼠肝原代细胞中对ANGPTL3 mRNA的抑制率，结果如表18所示。
表18小鼠肝原代细胞中ANGPTL3 mRNA的抑制率
其中，缀合物47和48是含有不同的无环脱碱基基团的本公开的缀合物，而参比缀合物23是含有其它无环脱碱基基团的缀合物。
由表18的结果可见，本公开提供的siRNA缀合物在小鼠肝原代细胞中显示出较高的ANGPTL3 mRNA抑制活性，在20nM的siRNA缀合物浓度下，缀合物47和缀合物48对ANGPTL3mRNA抑制率均高达92％以上，比参比缀合物23对ANGPTL3 mRNA的抑制率高出64.33％和65.14％。可见，与含有其它无环脱碱基基团的缀合物相比，本公开的含有无环脱碱基基团的缀合物具有显著更高的对靶mRNA的抑制活性。
由此可以说明，本公开的提供siRNA缀合物能够有效抑制ANGPTL3mRNA的表达，因此显示出优异的治疗ANGPTL3靶点相关疾病、特别是对应血脂异常所致疾病的应用前景。
实验例20
缀合物12-19在体外溶酶体裂解液中的稳定性
经溶酶体裂解液处理的测试样品制备：缀合物12-19分别以siRNA浓度为20μM的0.9％氯化钠水溶液形式提供，每组6μl)分别与27.2μL柠檬酸钠水溶液(pH5.0)、4.08μL去离子水和2.72μL Tritosomes(商购自Xenotech公司，货号R0610LT，批号1610069)混匀。37℃恒温孵育。分别在0h、1h、3h、6h取出5μl样本，分别加入到15μL 9M的尿素中变性，随后加入4μl 6×上样缓冲液(索莱宝公司，货号20160830)，立即冷冻于-80℃冰箱终止反应。0小时表示，将待测样品与溶酶体裂解液混匀后，立即取出的时刻。
未经溶酶体裂解液处理的参比样品制备：取等摩尔量的上述siRNA缀合物(20μM)各1.5μl分别与7.5μL柠檬酸钠水溶液(pH5.0)、1μL去离子水混匀，加入30μL 9M的尿素溶液变性，随后加入8μL 6×上样缓冲液混匀，立即冷冻于-80℃冰箱终止反应。各siRNA缀合物参比样品在电泳图中标记为Con。
配制16重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，上述测试样品及参比样品各取20μl上样至凝胶，在20mA恒流条件下电泳10min后，继续在40mA恒流条件下电泳30min。电泳结束后，将凝胶置于摇床上，用Gelred染料(BioTium公司，货号13G1203)染色10min。凝胶成像观察并拍照，结果如图5所示。
对比实验例20
用和实验例20相同的方法测定了参比缀合物12在溶酶体裂解液中的稳定性，结果如图5所示。
图5显示了所测试的本公开的缀合物12-19在体外溶酶体裂解液中的稳定性半定量检测结果。结果显示，相较于不含有无环脱碱基基团的参比缀合物，本公开的缀合物在体外溶解液中显示出相当的稳定性。可维持长时间不降解。
以上详细描述了本公开的具体实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 苏州瑞博生物技术股份有限公司
<120> 核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
<130> CP1211372/CB
<150> CN202011635152.0
<151> 2020-12-31
<160> 155
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 51
ggacaguauu cucagugca 19
<210> 52
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 52
ugcacuagaa uacugucccu 20
<210> 53
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 53
uuugaguaug ccucaagguu 20
<210> 54
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 54
uuugaauaug ccucaagguu 20
<210> 55
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 55
uuugaagaug ccucaagguu 20
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 56
ugacaaaaua acucacuaua a 21
<210> 57
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 57
uuauaggagu uauuuuguca au 22
<210> 58
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 58
acaaaauaac ucacuauaa 19
<210> 59
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 59
uuauaggagu uauuuuguca 20
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 60
gaaugugaaa gucaucgaca a 21
<210> 61
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 61
uugucgugac uuucacauuc ug 22
<210> 62
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 62
augugaaagu caucgacaa 19
<210> 63
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 63
uugucgugac uuucacauuc 20
<210> 64
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 64
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 65
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 65
uguucuuggu gcucuuggcu 20
<210> 66
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 66
uauucuuggu gcucuuggcu 20
<210> 67
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 67
uagucuuggu gcucuuggcu 20
<210> 68
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 68
uagucuuggu gcucuuggcu 20
<210> 69
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 69
uaguuuuggu gcucuuggcu 20
<210> 70
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 70
uaguucuggu gcucuuggcu 20
<210> 71
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 71
uaguucuggu gcucuuggcu 20
<210> 72
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 72
uagucuggug cucuuggcu 19
<210> 73
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 73
uagucuggug cucuuggcu 19
<210> 74
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 74
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 75
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 75
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 76
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 76
uaguucuggu gcucuuggcu 20
<210> 77
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 77
agccaagagc accaagaacu a 21
<210> 78
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 78
uaguucuggu gcucuuggcu uu 22
<210> 79
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 79
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 80
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 80
uaguucuggu gcucuuggcu 20
<210> 81
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 81
uaguucuggu gcucuuggcu 20
<210> 82
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 82
uaguucuggu gcucuuggcu 20
<210> 83
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 83
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 84
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 84
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 85
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 85
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 86
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 87
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 87
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 88
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 89
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 89
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 90
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 90
uucuugucca gcuuuauugg guu 23
<210> 91
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 91
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 92
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 92
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 93
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 93
cugaaagacu acuggagca 19
<210> 94
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 94
ugcuccagua gucuuucagu u 21
<210> 95
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 95
uuaaaaggga caguauuca 19
<210> 96
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 96
ugaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 97
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 97
acaguauucu cagugcuca 19
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 98
ugagcacuga gaauacuguc c 21
<210> 99
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 99
uauucucagu gcucuccua 19
<210> 100
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 100
uaggagagca cugagaauac u 21
<210> 101
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 101
aguauucuca gugcucuca 19
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 102
ugagagcacu gagaauacug u 21
<210> 103
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 103
ggacaguauu cucagugca 19
<210> 104
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 104
ugcacugaga auacuguccc u 21
<210> 105
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 105
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 106
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 106
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 107
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 107
ggacaguauu cucagugca 19
<210> 108
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 108
ugcacugaga auacuguccc u 21
<210> 109
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 109
ccuugaggca uacuucaaa 19
<210> 110
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 110
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 111
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 111
augugaaagu caucgacaa 19
<210> 112
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 112
uugucgauga cuuucacauu c 21
<210> 113
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 113
augugaaagu caucgacaa 19
<210> 114
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 114
uugucgagna ugacuuucac auuc 24
<210> 115
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 115
augugaaagu caucgacaa 19
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 116
uugucgauga cuuucacauu c 21
<210> 117
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 117
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 118
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 118
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 119
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 119
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 120
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 120
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 121
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 121
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 122
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 123
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 123
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 124
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 124
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 125
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 125
agccaagagc accaagaacu a 21
<210> 126
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 126
uaguucuugg ugcucuuggc uuu 23
<210> 127
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 127
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 128
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 128
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 129
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 129
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 130
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 130
acgugacacg uucggagaac u 21
<210> 131
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标序列
<400> 131
ctcgagaaac cgccctaggg acaagaattg gaaaccgccc tagggacaag aattggaaac 60
cgccctaggg acaagaattg gaaaccgccc tagggacaag aattggaaac cgccctaggg 120
acaagaa 127
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 132
gtgaccgatg gcttcagttc 20
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 133
atggataggc aggtggactt 20
<210> 134
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 134
ggtcggagtc aacggattt 19
<210> 135
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 135
ccagcatcgc cccacttga 19
<210> 136
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标序列
<400> 136
aaaccgccct agggacaaga a 21
<210> 137
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标序列
<400> 137
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标序列
<400> 138
ccctgaaaga ctactggagc a 21
<210> 139
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标序列
<400> 139
gcttaaaagg gacagtattc t 21
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标序列
<400> 140
ggacagtatt ctcagtgctc t 21
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标序列
<400> 141
agtattctca gtgctctcct a 21
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标序列
<400> 142
acagtattct cagtgctctc c 21
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标序列
<400> 143
agggacagta ttctcagtgc t 21
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 144
gtgaccgatg gcttcagttc 20
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 145
atggataggc aggtggactt 20
<210> 146
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 146
tgcaccacca actgcttag 19
<210> 147
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 147
ggatgcaggg atgatgttc 19
<210> 148
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标序列
<400> 148
gaccttgagg catacttcaa a 21
<210> 149
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 149
cctcactgcc cattgttg 18
<210> 150
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 150
gtgcctttcc tgactccc 18
<210> 151
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 151
ccgtgaaaag atgacccaga t 21
<210> 152
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 152
gccaggtcca gacgcagg 18
<210> 153
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标序列
<400> 153
ctcgagctaa cctctacaca agaactattg gctaacctct acacaagaac tattggctaa 60
cctctacaca agaactagcg gccgc 85
<210> 154
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 154
gaggagcagc taaccaactt aat 23
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 155
tctgcatgtg ctgttgactt aat 23
<210> 156
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 156
tgcaccacca actgcttag 19
<210> 157
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 157
ggatgcaggg atgatgttc 19

Claims (32)

1.一种核苷酸序列，所述核苷酸序列中的每个核苷酸为修饰或未修饰的核苷酸，其中，该核苷酸序列包含核苷酸序列I，所述核苷酸序列I是核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第2位至第8位核苷酸中的一个或两个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列，所述核苷酸序列A具有19-25个核苷酸，并且所述核苷酸序列A与靶mRNA中的一段核苷酸序列至少有16个核苷酸反向互补，所述无环脱碱基基团具有如式(101)所示的结构：
其中，R1、R2和R3各自独立地具有式(201)所示的结构：
R4具有如式(202)所示的结构：
表示基团共价连接的位点，每个n独立地为0，每个m独立地选自1或2，E1选自OH、SH或BH2；
每个R101独立地选自由H、甲基和乙基组成的组；
R201选自OH或NHR202，其中R202选自由C1-C5脂肪族酰基和C7-C10芳香族酰基所组成的组。
2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其中，R202选自由乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、乙酰丙酰基以及巴豆酰基组成的组。
3.如权利要求1所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列I是所述核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第3位至第8位核苷酸中的一个或两个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列I是所述核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第6、7和8位核苷酸中的一个或两个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列I是所述核苷酸A中按照5'端-3'端方向的第6、7或8位的核苷酸中的一个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。
6.如权利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列I是所述核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第4、5、6和7位核苷酸中的任意2个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列I是所述核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第4、5或6位中的任意1个核苷酸和第7位的核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。
8.如权利要求1-7中任意一项所述的核苷酸序列，其中，每个无环脱碱基基团独立地选自于由基团A101-A103、A105-A107组成的组：
其中，以“*”标记的碳原子表示该碳原子为R构型、S构型或外消旋构型。
9.如权利要求1所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列A中每一个核苷酸均为修饰的核苷酸。
10.如权利要求9所述的核苷酸序列，按照5'端-3'端方向，所述核苷酸序列A中第2、6、14、16位或第2、6、8、9、14、16位中至少两个核苷酸为核苷酸的核糖基2'位具有氟代修饰的核苷酸，并且所述核苷酸序列I是所述核苷酸序列A中按照5'端-3'端方向的第2、3、4、5、6、7或8个核苷酸中的一个或两个核苷酸被无环脱碱基基团所替代而形成的核苷酸序列。
11.如权利要求10所述的核苷酸序列，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸类似物或核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸中的一种。
12.如权利要求11所述的核苷酸序列，其中，核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种；核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET BNA、UNA和GNA中的一种。
13.如权利要求1所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列由所述核苷酸序列I构成。
14.如权利要求13所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少1个为具有修饰基团的磷酸酯基；所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
15.一种双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸含有正义链和反义链，所述反义链具有权利要求1-14中任意一项所述的核苷酸序列；所述正义链是具有16-30个核苷酸的核苷酸序列，所述正义链与反义链至少部分地反向互补形成双链区。
16.如权利要求15所述的双链寡核苷酸，其中，所述反义链与所述正义链基本上反向互补或实质上反向互补。
17.如权利要求16所述的双链寡核苷酸，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列A的第2-19位的核苷酸中，至少16个核苷酸与正义链互补。
18.如权利要求17所述的双链寡核苷酸，其中，所述正义链的第7、8位、或第5、7、8、9位，或第7、8、9位，或第9、10、11的核苷酸为核苷酸的核糖基2'位具有氟代修饰的核苷酸，正义链其他位置的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种。
19.如权利要求18所述的双链寡核苷酸，其中，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少1个为具有修饰基团的磷酸酯基；所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
20.如权利要求15-19中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸是saRNA或siRNA。
21.如权利要求20所述的双链寡核苷酸，其中，所述靶mRNA选自以下基因表达的mRNA中的一种：ACE2、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、TMPRSS6、XO、HAO1。
22.如权利要求21所述的双链寡核苷酸，其中，所述靶mRNA选自以下基因表达的mRNA中的一种：HBV、ANGPTL3、APOC、C5或HAO1。
23.如权利要求21所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸为siAPO1L、siAPO1、siAPOa1M1SVP2、siAPOb1M1SVP2、siAPOc1M1SVP2、siAPOd1M1SVP2、siAPOe1M1SVP2、siAPOf1M1SVP2、siAPOf1M1SP2、siAPOg1M1SP2、siAPOg1M1SP2-Ac、siAPOg1M1SP2-Ph、siAPOg1M1SP2-TOS、siAPOg1M1SP2-iBu、siAPOg1M1SP2-laev、siAPOg1M1SP2-Cro、siAPOg1M1SVP1R、siAPOg1M1SVP1S、siAPOg1M1SVP2R、siAPOg1M1SVP2S、siAPOg1M1SVP3R、siAPOg1M1SVP3S、siAPOg1M1SVP4R、siAPOg1M1SVP4S、siAPOg1Ph2、siAPOg1Ph3、siAPOg1Ph4、siAPOg1Ph5、siAPOg1Ph6、siAPOg1Ph7、siAPOg1Ph8、siAPOg1Ph4ph7、siAPOg1Ph5ph7、siAPOg1M16ph7、siAPOg1M34ph7、siAPOg1Lph7、siAPOg1Nph7、siHBa1M1SP2、siHBa1M1SVP2、siHBb1M1SVP2、siHBa1M1SVP1-Ac、siHBa1M1SVP2-Ac、siHBa2M1SVP3-Ac、siC5a1M1S2、siC5b1M1S2、siHAOa2M1S2、siHAOa1M1S2、siANGa1M1S2-Ac、siANGa1M1S2-iBu、siANGa1Ph2、siANGa1Ph3、siANGa1Ph4、siANGa1Ph5、siANGa1Ph6、siANGa1Ph7、siANGa1Ph8、siANGa1Ph4ph7、siANGa1Ph5ph7、siANGa1M16ph7、siANGa1M34ph7、siANGa1Lph7或siANGa1Nph7中的一种。
24.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1-14中任意一项所述的核苷酸序列和权利要求15-23中任意一项所述的双链寡核苷酸和药学上可接受的载体。
25.一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有权利要求15-23中任意一项所述的双链寡核苷酸以及缀合连接至该双链寡核苷酸的缀合基团。
26.如权利要求25所述的siRNA缀合物，其中，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且，所述双链寡核苷酸、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接。
27.如权利要求25或26所述的siRNA缀合物，其中，每个所述靶向基团独立地为与哺乳动物肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体亲和的配体。
28.如权利要求27所述的siRNA缀合物，其中，每个靶向基团独立地为去唾液酸糖蛋白或糖。
29.如权利要求28所述的siRNA缀合物，其中，至少一个或每个所述靶向基团为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺。
30.权利要求1-14中任意一项所述的核苷酸序列、权利要求15-23中任意一项所述的双链寡核苷酸、权利要求24所述的药物组合物和/或权利要求25-29中任意一项所述的siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防基因表达异常导致的疾病或症状的药物中的用途。
31.一种抑制细胞中基因表达的方法，所述方法用于非治疗目的，该方法包括将有效量的权利要求15-23中任意一项所述的双链寡核苷酸、权利要求24所述的药物组合物和/或权利要求25-29中任意一项所述的siRNA缀合物与所述细胞接触。
32.一种试剂盒，其中，该试剂盒含有权利要求15-23中任意一项所述的双链寡核苷酸、权利要求24所述的药物组合物和/或权利要求25-29中任意一项所述的siRNA缀合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107075516A (zh) * 2014-08-20 2017-08-18 阿尔尼拉姆医药品有限公司 经修饰的双链rna试剂
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