CN117568245B - 一种高活性植物乳杆菌制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高活性植物乳杆菌制剂的制备方法。本发明的制备方法包括植物乳杆菌培养发酵、冻干等步骤，本发明通过改进制备工艺，尤其是优选冻干保护剂、优化冻干程序，提高了植物乳杆菌的冻干存活率，延长了制剂储存期限，解决了植物乳杆菌的难以长期存活的问题。

Description

一种高活性植物乳杆菌制剂的制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高活性植物乳杆菌制剂的制备方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与***免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌等。有消化***问题、免疫力较弱者、长期服用抗生素、肠道疾病患者、长期饮食不规律或高脂肪饮食、化疗或者放射治疗的肿瘤患者等人群可以适当补充益生菌。
植物乳杆菌是一种常见的乳杆菌，在自然界中广泛存在于植物、土壤和发酵食品中。它是一种革兰氏阳性菌，呈杆状，不产生芽孢，属于乳酸菌科。植物乳杆菌是一种重要的益生菌具，有多种特性和功能，包括：
（1）发酵能力：植物乳杆菌是一种优秀的发酵菌种，可以利用多种碳水化合物进行发酵，例如蔗糖、果糖、葡萄糖等。它能够将这些碳水化合物转化为乳酸，维持酸度平衡，抑制有害菌的生长。
（2）益生作用：植物乳杆菌能够在肠道中定殖并生长，对人体有益。它可以调节肠道菌群平衡，增加有益菌数量，并抑制有害菌的生长。这种作用有助于维持肠道健康，并提高免疫力。
（3）抗氧化性：植物乳杆菌具有一定的抗氧化能力，可以中和自由基，减少氧化应激对身体的损害。这有助于预防炎症、老化等相关疾病。
（4）改善消化功能：植物乳杆菌能够分解食物中的复杂碳水化合物，增强人体对营养物质的吸收。它还可以产生多种酶来帮助消化，促进肠道蠕动，改善消化功能。
（5）抗菌性：植物乳杆菌可以产生乳酸和其他抑菌物质，对多种有害菌具有抑制作用。它可以竞争性地占据肠道生境，减少有害菌的滋生，维护肠道微生态平衡。
（6）防治肠道疾病：植物乳杆菌在预防和治疗肠道疾病方面具有潜力。它可以缓解腹泻、便秘等肠道问题，并减轻肠炎、克罗恩病等炎症性肠道疾病的症状。
植物乳杆菌的长期活性保持是难点问题，通常采用冷冻干燥法将植物乳杆菌制成制剂以延长保存时间、提高其活性，其中冻干保护剂是关键技术之一，不仅影响发酵剂在冻干过程中的细胞存活率，也影响保藏期间的细胞稳定性。
公开号为CN103695330A的中国专利公开了一种植物乳杆菌活菌制剂的制备方法，是将植物乳杆菌培养至稳定期后加入经过破壁处理的酿酒酵母，将发酵液离心得到菌泥，菌泥中混入保护剂进行真空干燥，将真空干燥得到的植物乳杆菌菌粉与低聚糖混合。其中酿酒酵母可以产生麦角甾醇和谷胱甘肽，真空干燥时对植物乳杆菌形成保护，但是酿酒酵母产生麦角甾醇和谷胱甘肽的质量和速度无法精确控制，会导致植物乳杆菌的活性不稳定。
发明内容
现有技术中存在植物乳杆菌存活率低、活性不稳定等缺陷，本发明克服了现有技术的不足，通过改进植物乳杆菌制剂，尤其是含有植物乳杆菌LP45制剂的制备方法解决了植物乳杆菌的难以长期存活的难点问题，提供了一种高活性植物乳杆菌LP45制剂及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种植物乳杆菌制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）将植物乳杆菌LP45培养发酵，离心，收集菌泥；
（2）菌泥与冻干保护剂A按1：0.5～1.5的体积比混合、搅拌均匀，进行第1~4阶段的冻干；所述冻干保护剂A为：10~30g/L海藻糖、10~30g/L水苏糖、1~5g/L脯氨酸、水；所述第1~4阶段冻干程序为：第1阶段：温度设定为-10°C，冻干时长4h；第2阶段：以0.2~0.8℃/min速度由-10°C降温至-35°C，保持-35°C冻干2h；第3阶段：温度设定为-15°C，冻干时长4h；第4阶段：温度设定为2°C，冻干时长2h；
（3）再加入菌泥0.3~0.8倍体积的冻干保护剂B，进行第5~6阶段冻干；所述冻干保护剂B为：1~10g/L氮酮、1~5g/L L-半胱氨酸盐酸盐、20~70g/L脱脂奶粉、0.5~5g/L交联聚维酮、水；所述第5~6阶段冻干程序为：第5阶段：温度设定为10°C，冻干时长2h；第6阶段：以0.1~0.5℃/min速度由8°C升温至35°C，保持35°C冻干2h，得到植物乳杆菌冻干粉。
（4）将植物乳杆菌冻干粉进行加工，制成植物乳杆菌制剂。
所述植物乳杆菌冻干粉的加工为直接分装或压片或装置胶囊，即为进一步制备成制剂的常规操作。
在一些实施例中，所述步骤（2）中菌泥与冻干保护剂A按1：0.8的体积比混合。
在一些实施例中，所述步骤（3）中加入冻干保护剂B的体积为菌泥的0.5倍。
在一些实施例中，所述第2阶段为：以0.5℃/min速度由-10°C降温至-35°C，保持-35°C冻干2h。
在一些实施例中，所述第6阶段为：以0.2℃/min速度由8°C升温至35°C，保持35°C冻干2h。
在一些实施例中，所述冻干保护剂A为：20g/L海藻糖、15g/L水苏糖、2g/L脯氨酸、水。
在一些实施例中，所述冻干保护剂B为：4g/L氮酮、2g/L L-半胱氨酸盐酸盐、45g/L脱脂奶粉、2g/L交联聚维酮、水。
进一步的，所述植物乳杆菌制剂还可加入氨基酸、维生素、葡萄糖中的一种或多种。
进一步的，所述植物乳杆菌制剂为粉剂、片剂、胶囊，其制备方法如同植物乳杆菌粉剂的制备方法，再进一步进行压片处理，制备成植物乳杆菌片剂，也可装入胶囊，制备成植物乳杆菌胶囊。
需要说明的是，所述的植物乳杆菌为常规市售产品。按照上述方法制备得到的植物乳杆菌LP45制剂在生物领域中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过改进植物乳杆菌制剂的制备方法，尤其是优化冻干程序，分别在降温与升温的冻干过程中加入不同的冻干保护剂，提高了冻干存活率，延长了植物乳杆菌制剂的储存期限，解决了植物乳杆菌的难以长期存活的难点问题，提供了一种高活性植物乳杆菌制剂及其制备方法。
附图说明
图1：实施例1~3植物乳杆菌LP45粉剂、对比例1~5植物乳杆菌LP45粉剂中植物乳杆菌LP45活菌数变化。
图2：实施例1~3植物乳杆菌LP45粉剂、对比例1~5植物乳杆菌LP45粉剂含水量变化。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步的说明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，实施例仅用于解释本发明。本领域技术人员应该理解的是，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
菌种发酵培养
（1）菌泥复苏：取将植物乳杆菌LP45（YMC1005），于37℃水浴锅内进行菌种复苏，培养12 h，接种至含10mL MRS培养基的试管中，39℃静置密封培养16～20h；
（2）菌种扩大培养：将上述菌泥培养液按照5％的接种量接种至装有MRS培养基（MRS培养基：含葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二胺2 g/L、乙酸钠5 g/L、七水硫酸镁0.25 g/L、一水硫酸锰0.05 g/L、吐温-80 1 g/L）的100ml三角瓶中，装液量80％，39℃静置密封培养20小时；
（3）菌种一级发酵：按照5％接种量，将菌种扩大培养结束的菌悬液接种至装有MRS培养基的100mL三角瓶中，装液量80％，39℃静置密封培养6～10小时；在发酵开始3.5小时后，通过流加氢氧化钠溶液来维持菌液的恒pH为5.5~5.6，直至监测到菌液OD600值停止增长，立即停止发酵；
（4）菌种二级发酵：按照5％接种量，将菌种一级发酵的菌悬液接种至装有MRS培养基的发酵罐中，优化培养基装液体积占发酵罐容积的80％，39℃恒温搅动培养6～10小时；搅拌速度80rpm，通气量为0，在发酵开始3.5小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持菌液的恒pH为5.5~5.6，直至用紫外分光光度计监测到菌液OD600值停止增长，停止发酵，活菌数达8.87×1012CFU/g。
实施例1 植物乳杆菌LP45粉剂的制备方法
（1）将植物乳杆菌LP45按上述方法培养发酵，离心，收集菌泥；
（2）菌泥与冻干保护剂A（20g/L海藻糖、15g/L水苏糖、2g/L脯氨酸、水）按1：0.8的体积比混合、搅拌均匀，进行冻干，冻干程序为：
温度设定为-10°C，冻干时长4h；
以0.5℃/min速度由-10°C降温至-35°C，保持-35°C冻干2h；
温度设定为-15°C，冻干时长4h；
温度设定为2°C，冻干时长2h；
（3）加入菌泥0.5倍体积的冻干保护剂B（4g/L氮酮、2g/L L-半胱氨酸盐酸盐、45g/L脱脂奶粉、2g/L交联聚维酮、水），进行冻干，冻干程序为：
温度设定为10°C，冻干时长2h；
以0.2℃/min速度由8°C升温至35°C，保持35°C冻干2h；
得到植物乳杆菌LP45冻干粉；
（4）植物乳杆菌LP45冻干粉分装，制成植物乳杆菌LP45粉剂。
实施例2 植物乳杆菌LP45粉剂的制备方法
（1）将植物乳杆菌LP45按上述方法培养发酵，离心，收集菌泥；
（2）菌泥与冻干保护剂A（10g/L海藻糖、10g/L水苏糖、1g/L脯氨酸、水）按1：0.5的体积比混合、搅拌均匀，进行冻干，冻干程序为：
温度设定为-10°C，冻干时长4h；
以0.2℃/min速度由-10°C降温至-35°C，保持-35°C冻干2h；
温度设定为-15°C，冻干时长4h；
温度设定为2°C，冻干时长2h；
（3）加入菌泥0.3倍体积的冻干保护剂B（1g/L氮酮、1g/L L-半胱氨酸盐酸盐、20g/L脱脂奶粉、0.5g/L交联聚维酮、水），进行冻干，冻干程序为：
温度设定为10°C，冻干时长2h；
以0.1℃/min速度由8°C升温至35°C，保持35°C冻干2h；
得到植物乳杆菌LP45冻干粉；
（4）植物乳杆菌LP45冻干粉分装，制成植物乳杆菌LP45粉剂。
实施例3 植物乳杆菌LP45粉剂的制备方法
（1）将植物乳杆菌LP45按上述方法培养发酵，离心，收集菌泥；
（2）菌泥与冻干保护剂A（30g/L海藻糖、30g/L水苏糖、5g/L脯氨酸、水）按1：1.5的体积比混合、搅拌均匀，进行冻干，冻干程序为：
温度设定为-10°C，冻干时长4h；
以0.8℃/min速度由-10°C降温至-35°C，保持-35°C冻干2h；
温度设定为-15°C，冻干时长4h；
温度设定为2°C，冻干时长2h；
（3）加入菌泥0.8倍体积的冻干保护剂B（10g/L氮酮、5g/L L-半胱氨酸盐酸盐、70g/L脱脂奶粉、5g/L交联聚维酮、水），进行冻干，冻干程序为：
温度设定为10°C，冻干时长2h；
以0.5℃/min速度由8°C升温至35°C，保持35°C冻干2h；
得到植物乳杆菌LP45冻干粉；
（4）植物乳杆菌LP45冻干粉分装，制成植物乳杆菌LP45粉剂。
对比例1 植物乳杆菌LP45粉剂的制备方法
（1）将植物乳杆菌LP45按上述方法培养发酵，离心，收集菌泥；
（2）菌泥与冻干保护剂A（20g/L海藻糖、15g/L水苏糖、2g/L脯氨酸、4g/L氮酮、2g/LL-半胱氨酸盐酸盐、45g/L脱脂奶粉、2g/L交联聚维酮、水）按1：1.3的体积比混合、搅拌均匀，进行冻干，冻干程序为：
温度设定为-10°C，冻干时长4h；
以0.5℃/min速度由-10°C降温至-35°C，保持-35°C冻干2h；
温度设定为-15°C，冻干时长4h；
温度设定为2°C，冻干时长2h；
温度设定为10°C，冻干时长2h；
以0.2℃/min速度由8°C升温至35°C，保持35°C冻干2h；
得到植物乳杆菌LP45冻干粉；
（3）植物乳杆菌LP45冻干粉分装，制成植物乳杆菌LP45粉剂。
对比例2 植物乳杆菌LP45粉剂的制备方法
（1）将植物乳杆菌LP45按上述方法培养发酵，离心，收集菌泥；
（2）菌泥与冻干保护剂A（20g/L海藻糖、15g/L水苏糖、2g/L脯氨酸、水）按1：0.8的体积比混合、搅拌均匀，进行冻干，冻干程序为：
温度设定为-10°C，冻干时长4h；
以0.5℃/min速度由-10°C降温至-35°C，保持-35°C冻干2h；
温度设定为-15°C，冻干时长4h；
温度设定为2°C，冻干时长2h；
（3）加入菌泥0.5倍体积的冻干保护剂B（2g/L L-半胱氨酸盐酸盐、45g/L脱脂奶粉、2g/L交联聚维酮、水），进行冻干，冻干程序为：
温度设定为10°C，冻干时长2h；
以0.2℃/min速度由8°C升温至35°C，保持35°C冻干2h；
得到植物乳杆菌LP45冻干粉；
（4）植物乳杆菌LP45冻干粉分装，制成植物乳杆菌LP45粉剂。
对比例3 植物乳杆菌LP45粉剂的制备方法
（1）将植物乳杆菌LP45按上述方法培养发酵，离心，收集菌泥；
（2）菌泥与冻干保护剂A（20g/L海藻糖、15g/L水苏糖、2g/L脯氨酸、水）按1：0.8的体积比混合、搅拌均匀，进行冻干，冻干程序为：
温度设定为-10°C，冻干时长4h；
以0.5℃/min速度由-10°C降温至-35°C，保持-35°C冻干2h；
温度设定为-15°C，冻干时长4h；
温度设定为2°C，冻干时长2h；
（3）加入菌泥0.5倍体积的冻干保护剂B（4g/L氮酮、2g/L L-半胱氨酸盐酸盐、45g/L脱脂奶粉、水），进行冻干，冻干程序为：
温度设定为10°C，冻干时长2h；
以0.2℃/min速度由8°C升温至35°C，保持35°C冻干2h；
得到植物乳杆菌LP45冻干粉；
（4）植物乳杆菌LP45冻干粉分装，制成植物乳杆菌LP45粉剂。
对比例4 植物乳杆菌LP45粉剂的制备方法
（1）将植物乳杆菌LP45按上述方法培养发酵，离心，收集菌泥；
（2）菌泥与冻干保护剂A（20g/L海藻糖、15g/L水苏糖、2g/L脯氨酸、水）按1：0.8的体积比混合、搅拌均匀，进行冻干，冻干程序为：
温度设定为-10°C，冻干时长4h；
以0.5℃/min速度由-10°C降温至-35°C，保持-35°C冻干2h；
温度设定为-15°C，冻干时长4h；
温度设定为2°C，冻干时长2h；
（3）加入菌泥0.5倍体积的冻干保护剂B（0.5g/L氮酮、2g/L L-半胱氨酸盐酸盐、45g/L脱脂奶粉、8g/L交联聚维酮、水），进行冻干，冻干程序为：
温度设定为10°C，冻干时长2h；
以0.2℃/min速度由8°C升温至35°C，保持35°C冻干2h；
得到植物乳杆菌LP45冻干粉；
（4）植物乳杆菌LP45冻干粉分装，制成植物乳杆菌LP45粉剂。
对比例5 植物乳杆菌LP45粉剂的制备方法
（1）将植物乳杆菌LP45按上述方法培养发酵，离心，收集菌泥；
（2）菌泥与冻干保护剂A（20g/L海藻糖、15g/L水苏糖、2g/L脯氨酸、水）按1：0.8的体积比混合、搅拌均匀，进行冻干，冻干程序为：
温度设定为-10°C，冻干时长4h；
温度设定-35°C，冻干时长2h；
温度设定为-15°C，冻干时长4h；
温度设定为2°C，冻干时长2h；
（3）加入菌泥0.5倍体积的冻干保护剂B（4g/L氮酮、2g/L L-半胱氨酸盐酸盐、45g/L脱脂奶粉、2g/L交联聚维酮、水），进行冻干，冻干程序为：
温度设定为10°C，冻干时长2h；
温度设定35°C，冻干时长2h；
得到植物乳杆菌LP45冻干粉；
（4）植物乳杆菌LP45冻干粉分装，制成植物乳杆菌LP45粉剂。
植物乳杆菌LP45粉剂活菌数与水分
测定实施例1~3制备方法中冻干前菌泥中植物乳杆菌LP45活菌数与实施例1~3制备方法得到的植物乳杆菌LP45粉剂（冻干后）中植物乳杆菌LP45活菌数、以及对比例1~5制备方法中冻干前菌泥中植物乳杆菌LP45活菌数与实施例1~3制备方法得到的植物乳杆菌LP45粉剂（冻干后）中植物乳杆菌LP45活菌数，探究制备方法对植物乳杆菌的保护作用以及冻干后植物乳杆菌LP45粉剂的含水量。
表1 植物乳杆菌LP45粉剂活菌数与水分
将实施例1~3制备方法得到的植物乳杆菌LP45粉剂、对比例1~5制备方法得到的植物乳杆菌LP45粉剂进行活菌数的检测，结果如表1，可知实施例1~3制备方法得到的植物乳杆菌LP45粉剂中活菌数为8.19×1012~8.43×1012，植物乳杆菌LP45活性高，其冻干保护剂及冻干方法能够更好的保护菌粉，提高冻干活菌率，而对比例1~5制备方法得到的植物乳杆菌LP45粉剂中植物乳杆菌LP45活性低；对实施例1~3制备方法得到的植物乳杆菌LP45粉剂、对比例1~5制备方法得到的植物乳杆菌LP45粉剂进行水分含量的检测，显示本发明制备方法制备得到的粉剂水分低，冻干效果好。
植物乳杆菌LP45粉剂活性稳定性
将实施例1~3植物乳杆菌LP45粉剂、对比例1~5植物乳杆菌LP45粉剂包装好后放置于25℃条件中保存，于第1个月、第3个月、第6个月、第12个月进行植物乳杆菌LP45活菌数的测定，考察植物乳杆菌LP45粉剂的稳定性。
如图1所示，实施例1~3植物乳杆菌LP45粉剂、对比例1~5植物乳杆菌LP45粉剂中植物乳杆菌LP45活菌数变化，证明本发明实施例1~3植物乳杆菌LP45粉剂稳定性高，在12个月时植物乳杆菌LP45的活性依然保持较高。
植物乳杆菌LP45粉剂含水量稳定性
将实施例1~3植物乳杆菌LP45粉剂、对比例1~5植物乳杆菌LP45粉剂包装好后放置于25℃条件中保存，于第1个月、第3个月、第6个月、第12个月进行含水量的测定，考察植物乳杆菌LP45粉剂的稳定性。
图2为实施例1~3植物乳杆菌LP45粉剂、对比例1~5植物乳杆菌LP45粉剂含水量变化，实验显示本发明植物乳杆菌LP45粉剂冻干效果好，储存12个月时含水量基本保持不变，稳定性高。
实施例4~60植物乳杆菌LP45制剂
表2实施例4~60植物乳杆菌LP45制剂的处方
本发明植物乳杆菌LP45制剂具有改善肠道菌群、维持肠道微环境平衡、增强胃肠的消化吸收的功能，能够增强免疫力、改善组织损伤、减轻炎症等，可用于生物制剂中。本发明植物乳杆菌LP45制剂还可加入氨基酸、维生素、葡萄糖等对人体有益的物质，起到调节免疫力、健脑、调节血压、改善睡眠、淡化细纹、促进生长和发育、抗疲劳、增强视力、预防夜盲症、促进新陈代谢、进能量转化、抗氧化、维持骨骼健康等作用。
本发明所得植物乳杆菌LP45粉剂可以进一步进行压片处理，制备成片剂，也可装入胶囊，制备胶囊。

Claims (8)

1.一种植物乳杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将植物乳杆菌培养发酵，离心，收集菌泥；
（2）菌泥与冻干保护剂A按1：0.5～1.5的体积比混合、搅拌均匀，进行第1~4阶段的冻干；
（3）再加入菌泥0.3~0.8倍体积的冻干保护剂B，进行第5~6阶段冻干，得到植物乳杆菌冻干粉；
（4）将植物乳杆菌冻干粉进行加工，制成植物乳杆菌制剂；
所述冻干程序为：
第1阶段：温度设定为-10°C，冻干时长4h；
第2阶段：以0.2~0.8℃/min速度由-10°C降温至-35°C，保持-35°C冻干2h；
第3阶段：温度设定为-15°C，冻干时长4h；
第4阶段：温度设定为2°C，冻干时长2h；
第5阶段：温度设定为10°C，冻干时长2h；
第6阶段：以0.1~0.5℃/min速度由8°C升温至35°C，保持35°C冻干2h；
所述冻干保护剂A为：
10~30g/L海藻糖、10~30g/L水苏糖、1~5g/L脯氨酸、水；
所述冻干保护剂B为：
1~10g/L氮酮、1~5g/L L-半胱氨酸盐酸盐、20~70g/L脱脂奶粉、0.5~5g/L交联聚维酮、水；
所述植物乳杆菌为植物乳杆菌LP45。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中菌泥与冻干保护剂A按1：0.8的体积比混合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中加入冻干保护剂B的体积为菌泥的0.5倍。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第2阶段为：以0.5℃/min速度由-10°C降温至-35°C，保持-35°C冻干2h；所述第6阶段为：以0.2℃/min速度由8°C升温至35°C，保持35°C冻干2h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂A为：20g/L海藻糖、15g/L水苏糖、2g/L脯氨酸、水。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂B为：4g/L氮酮、2g/L L-半胱氨酸盐酸盐、45g/L脱脂奶粉、2g/L交联聚维酮、水。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌制剂还包括氨基酸、维生素、葡萄糖中的一种或多种。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌制剂为粉剂、片剂、胶囊。
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