KR102048690B1 - 안정성이 증진된 유산균 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 안정성이 증진된 유산균 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 덱스트린; 젤라틴 또는 콜라겐; 및 자일리톨을 순차적으로 3중 코팅함으로써 저장 및 열안정성, 내산성, 내담즙성, 및 소화효소에 대한 안정성이 증진된 유산균 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 코팅방법으로 제조된 유산균은 덱스트린; 젤라틴 또는 콜라겐; 및 자일리톨을 이용해 순차적으로 3중 코팅함으로써 종래 코팅처리하지 않은 유산균에 비하여 보관온도 및 열에 대한 안정성, 내산성, 내담즙성, 및 소화효소에 대한 안정성이 증진되는 것을 실험적으로 확인함으로써 외부 스트레스에 대한 저항성 및 위장관 통과 시 균주의 생존력이 증가하고 장내에서 본래의 생리활성 기능을 유지할 수 있음을 확인하였는바, 본 발명에 따른 코팅 방법은 유산균을 이용한 발효유, 발효식품, 기능성 식품, 일반식품, 화장품, 및 의약품 등의 관련 산업에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

안정성이 증진된 유산균 및 이의 제조방법{lactic acid bacteria improved stability and preparing method thereof}
본 발명은 안정성이 증진된 유산균 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 덱스트린; 젤라틴 또는 콜라겐; 및 자일리톨을 순차적으로 3중 코팅함으로써 저장 및 열안정성, 내산성, 내담즙성, 및 소화효소에 대한 안정성이 증진된 유산균 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
유산균(lactic acid bacteria)은 락트산 균 또는 젖산균이라고도 하며, 글루코오스 등의 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 그람 양성세균으로, 사람이나 포유동물의 소화관, 구강, 및 질 등에서 발견된다. 유산균은 인류가 가장 오랫동안 광범위하게 활용하고 있는 미생물 중 하나로서, 사람이나 동물의 장에 해로운 물질을 생성하지 않으며 장내에서 유해균에 의한 이상발효를 방지해 정장제로도 유용하게 이용되고 있다. 또한, 젖산발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해균의 생육이 저지되는 성질을 유제품, 김치류, 양조식품 등의 식품 제조에도 이용해왔다.
한편, 프로바이오틱스(Probiotics)란 체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 및 페디오코커스 속(Pedicoccus sp.) 등에 속하는 유산균들이며 일부 바실러스(Bacillus) 등을 포함하고 있다. 일리야 메치니코프에 의해 불가리아 사람들이 장수를 누리는 이유가 락토바실러스로 발효된 발효유의 섭취 때문이라는 것이 밝혀진 이래로 유산균, 프로바이오틱스의 기능성은 오랫동안 연구되어 오고 있다.
임상적으로 프로바이오틱스는 유당불내증 및 결장암 예방, 콜레스테롤 및 혈압 저하, 면역기능 개선, 감염예방, 무기물의 흡수개량, 스트레스로 인한 유해한 세균의 성장 방지, 및 과민성대장증후군과 결장염 개선 등의 효과가 있다고 보고되어 있고, 또한, 면역시스템을 강하게 하며, 캔디다증과 관련된 장 질환 치료와 항생제로서 권고되어 왔다. 상기와 같은 유산균을 비롯한 미생물들이 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산과 담즙산에서 살아남아 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하여야 하며 장관 내에서 유용한 효과를 나타내어야 하고 독성이 없으며 비병원성이어야 한다.
유산균 식품은 유산간균, 유산구균, 비피더스균 등의 생균을 배양하여 식품에 혼합한 것을 안정적이고 섭취가 용이하도록 분말, 과립, 정제, 캡슐 등으로 만든 것으로 유산균 발효식품, 유산균 발효유, 유산균 음료 이외의 것을 말한다. 상기와 같은 유산균 식품을 제조하는 공정은 크게 유산균 배양, 균체 회수, 동결건조, 분쇄, 제품화 등으로 구분되는데 이 과정에서 유산균은 다양한 물리화학적인 스트레스에 노출된다. 즉, 균체회수 시에는 농축에 따른 삼투압 영향을 받으며, 동결건조 과정에서는 급격한 온도 변화에 따른 세포질 내 얼음결정이 형성되거나 세포 외부에 생성되는 얼음 결정 및 탈수(dehydration) 현상으로 인하여 온도와 삼투압 영향을 동시에 받게 된다. 또한, 분쇄 및 제품화 과정에서 고온, 고압에 노출되거나 공기 중의 수분에 의하여 수화(hydration)될 경우 유산균의 안정성이 떨어지게 되며, 단기간 보관되는 유산균 발효식품, 유산균 발효유, 유산균 음료와 같은 액상 제품뿐만 아니라 장기 보관을 목적으로 분말 형태로 제조되는 제품에 있어서도 산소에 노출될 경우 세포막을 구성하고 있는 지방산이 산화되어 생존율이 감소하게 되는 문제점이 지적되어 왔다.
또한, 프로바이오틱스 제품은 생균 자체를 이용하기 때문에 섭취 후 장에 도달하기 전에 인체 내에서 다양한 스트레스에 노출된다. 예컨대, 위장에서는 pH 3 이하로 떨어지는 산성 환경에 노출되고 소장에서는 분비되는 소화효소와 담즙산 등의 영향을 받아 생존율이 크게 감소할 수 있다. 장에 도달해서도 기존 장내 정착한 미생물과 경쟁함과 동시에 각종 유해 성분과 활성산소 등에 의한 성장 저해를 받게 된다.
최근까지 상기와 같은 문제점들을 해결하기 위하여, 유산균을 코팅하는 방법에 대한 다양한 연구들이 이루어져 왔다. 예컨대, 캡슐제를 이용한 장용코팅제와 젤라틴, 당류, 검류 등을 이용한 마이크로캡슐화(microencapsulation) 공정 등이 있었으나, 고가의 코팅제를 사용하거나 공정이 추가되는 문제점들이 지적되어 왔다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 고농도의 유산균이 살아있는 이중 구조의 젤리를 제조하는 방법 또는 단백질과 다당류로 이중 코팅하는 방법을 도입하거나, 공기, 수분과의 직접적인 반응이 억제되며 내열성, 내산성 및 내담즙성이 강화되어 생균 안정성 및 가공 안정성이 증강된 3중 코팅 유산균의 제조방법(대한민국 특허출원 제10-2008-10397호)이 개발되었다. 그러나 상기의 종래 유산균의 코팅 기술 또한 유산균의 표면을 완전히 코팅할 수 없어, 상기의 방법으로 제조된 유산균은 내열성, 내산성 및 내담즙성이 충분히 우수하지 못한 문제점이 여전히 지적되었다.
따라서 유산균이 체내에서 기능을 충분히 발휘하도록 저장안정성, 내열성, 내산성, 내담즙성 등을 현저히 증진시킬 수 있는 코팅방법의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 유산균의 보관 및 체내에서의 안정성을 증진시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구한 결과, 상기 유산균, 바람직하게는 락토바실러스 펜토서스 균주를 덱스트린; 젤라틴 또는 콜라겐; 및 자일리톨을 이용해 순차적으로 3중 코팅한 결과 균주의 저장안정성, 열안정성, 내산성, 내담즙성, 및 소화효소에 대한 안정성이 증진되는 것을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 안정성이 증진된 유산균의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 유산균의 안정성 증진 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 안정성이 증진된 유산균의 제조방법을 제공한다.
(a) 유산균에 덱스트린(dextrin)을 첨가하고 균질화 하여 1차 코팅하는 단계; (b) 상기 1차 코팅된 유산균에 젤라틴(gelatin) 또는 콜라겐(collagen)을 첨가하고 균질화 하여 2차 코팅하는 단계; 및 (c) 상기 2차 코팅된 유산균에 자일리톨(xylitol)을 첨가하고 균질화 하여 3차 코팅하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 유산균의 안정성 증진 방법을 제공한다.
(a) 유산균에 덱스트린(dextrin)을 첨가하고 균질화 하여 1차 코팅하는 단계; (b) 상기 1차 코팅된 유산균에 젤라틴(gelatin) 또는 콜라겐(collagen)을 첨가하고 균질화 하여 2차 코팅하는 단계; 및 (c) 상기 2차 코팅된 유산균에 자일리톨(xylitol)을 첨가하고 균질화 하여 3차 코팅하는 단계.
본 발명의 일구현예로, 상기 (a) 단계에서 덱스트린은, 덱스트린 증류수 용해액 중량을 기준으로, 1 중량% 내지 30 중량% 농도일 수 있다. 상기 덱스트린은 유산균 균체 100 중량부 대비 10 중량부 내지 100 중량부의 비율로 혼합하여 코팅할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (b) 단계에서 젤라틴 또는 콜라겐은, 젤라틴 또는 콜라겐의 증류수 용해액 중량을 기준으로, 1 중량% 내지 30 중량% 농도일 수 있다. 상기 젤라틴 또는 콜라겐은 유산균 균체 100 중량부 대비 0.5 중량부 내지 50 중량부의 비율로 혼합하여 코팅할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 자일리톨은, 자일리톨의 증류수 용해액 중량을 기준으로, 10 중량% 내지 50 중량% 농도일 수 있다. 상기 자일리톨은 유산균 균체 100 중량부 대비 0.5 중량부 내지 50 중량부의 비율로 혼합하여 코팅할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium sp.) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus sp.) 속, 락토코커스(Lactococcus sp.) 속, 엔테로코커스(Enterococcus sp.) 속, 페디오코커스(Pediococcus sp.) 속, 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 속, 및 비셀라(Weissella sp.) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 균주일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유산균은 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (a) 단계에서 상기 덱스트린은, 덱스트린의 증류수 용해액 중량 기준, 1 중량% 내지 30 중량% 농도일 수 있으며, 유산균 균체 100 중량부 대비 10 중량부 내지 100 중량부의 비율로 혼합하여 1차 코팅하는 단계;
상기 (b) 단계에서 상기 젤라틴 또는 콜라겐은, 젤라틴 또는 콜라겐의 증류수 용해액 중량 기준, 1 중량% 내지 30 중량% 농도일 수 있으며, 유산균 균체 100 중량부 대비 0.5 중량부 내지 50 중량부의 비율로 혼합하여 2차 코팅하는 단계; 및
상기 (c) 단계에서 상기 자일리톨은, 자일리톨의 증류수 용해액 중량 기준, 10 중량% 내지 50 중량% 농도일 수 있으며, 유산균 균체 100 중량부 대비 0.5 중량부 내지 50 중량부의 비율로 혼합하여 3차 코팅하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 코팅방법으로 제조된 유산균은 덱스트린; 젤라틴 또는 콜라겐; 및 자일리톨을 이용해 순차적으로 3중 코팅함으로써 종래 코팅 처리하지 않은 유산균에 비하여 보관온도 및 열에 대한 안정성, 내산성, 내담즙성, 및 소화효소에 대한 안정성이 증진되는 것을 실험적으로 확인함으로써 외부 스트레스에 대한 저항성 및 위장관 통과 시 균주의 생존력이 증가하고 장내에서 본래의 생리활성 기능을 유지할 수 있음을 확인하였는바, 본 발명에 따른 코팅 방법은 유산균을 이용한 발효유, 발효식품, 기능성 식품, 일반식품, 화장품, 및 의약품 등의 관련 산업에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 덱스트린, 젤라틴, 및 자일리톨을 순차적으로 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 동결건조한 후 최종 원료를 촬영한 사진이다.
도 2는 덱스트린, 콜라겐, 및 자일리톨을 순차적으로 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 동결건조한 후 최종 원료를 촬영한 사진이다.
도 3은 덱스트린, 젤라틴, 및 자일리톨을 순차적으로 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 주사전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 4는 덱스트린, 콜라겐, 및 자일리톨을 순차적으로 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 주사전자현미경으로 촬영한 사진이다.
본 발명자들은 유산균의 보관 및 체내에서의 안정성을 증진시킬 수 있는 코팅방법을 개발하기 위하여 예의 연구한 결과, 균주의 저장 및 열안정성, 내산성, 내담즙성, 및 소화효소에 대한 안정성이 증진된 유산균 코팅방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (a) 유산균에 덱스트린(dextrin)을 첨가하고 균질화 하여 1차 코팅하는 단계; (b) 상기 1차 코팅된 유산균에 젤라틴(gelatin) 또는 콜라겐(collagen)을 첨가하고 균질화 하여 2차 코팅하는 단계; 및 (c) 상기 2차 코팅된 유산균에 자일리톨(xylitol)을 첨가하고 균질화 하여 3차 코팅하는 단계를 포함하는, 안정성이 증진된 유산균의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 유산균에 덱스트린(dextrin)을 첨가하고 균질화 하여 1차 코팅하는 단계; (b) 상기 1차 코팅된 유산균에 젤라틴(gelatin) 또는 콜라겐(collagen)을 첨가하고 균질화 하여 2차 코팅하는 단계; 및 (c) 상기 2차 코팅된 유산균에 자일리톨(xylitol)을 첨가하고 균질화 하여 3차 코팅하는 단계를 포함하는, 유산균의 안정성 증진 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 단계별로 자세히 설명한다.
상기 제조방법에 따른 유산균 코팅 수행 전에 유산균을 배양하는 과정이 필요하며, 유산균 배양은 이용하는 유산균의 종류에 따라 통상적인 유산균 배양배지 및 배양 조건에서 실시할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
상기 (a) 단계에서, 덱스트린은 증류수에 용해하여, 덱스트린의 증류수 용해액 중량 기준, 1 중량% 내지 30 중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 15 중량%, 더욱 바람직하게는 3 중량% 내지 7 중량%, 더더욱 바람직하게는 5 중량% 농도일 수 있고, 사용 전 멸균하고 실온에서 냉각한 후 코팅과정에 이용할 수 있다.
상기 덱스트린은 배양 후 회수한 균체 100 중량부에 대하여 10 중량부 내지 100 중량부, 바람직하게는 50 중량부 내지 100 중량부, 더욱 바람직하게는 회수균체와 동량인 100 중량부를 첨가한 후 균질화 하고 상온에서 0.5 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 내지 2시간 동안 실온에 정치함으로써 균체를 1차 코팅할 수 있다.
상기 (b) 단계에서, 콜라겐은 증류수에 용해하여, 콜라겐의 증류수 용해액 중량 기준, 1 중량% 내지 30 중량%, 바람직하게는 5 중량% 내지 20 중량%, 더욱 바람직하게는 10 중량% 내지 15 중량%, 더더욱 바람직하게는 12 중량% 농도일 수 있고, 사용 전 멸균하고 실온에서 냉각한 후 코팅과정에 이용할 수 있다.
상기 콜라겐은 배양 후 회수한 균체 100 중량부에 대하여 0.5 중량부 내지 50 중량부, 바람직하게는 5 중량부 내지 50 중량부, 더욱 바람직하게는 10 중량부 내지 30 중량부를 첨가한 후 균질화 하고 상온에서 0.5 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 내지 2시간 동안 실온에 정치함으로써 균체를 2차 코팅할 수 있다.
상기 (b) 단계에서, 젤라틴은 증류수에 용해하여, 젤라틴의 증류수 용해액 중량 기준, 1 중량% 내지 30 중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 15 중량%, 더욱 바람직하게는 4 중량% 내지 7 중량%, 더더욱 바람직하게는 6 중량% 농도일 수 있고, 사용 전 멸균하고 실온에서 냉각한 후 코팅과정에 이용할 수 있다.
상기 젤라틴은 배양 후 회수한 균체 100 중량부에 대하여 0.5 중량부 내지 50 중량부, 바람직하게는 5 중량부 내지 50 중량부, 더욱 바람직하게는 10 중량부 내지 30 중량부를 첨가한 후 균질화 하고 상온에서 0.5 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 내지 2시간 동안 실온에 정치함으로써 균체를 2차 코팅할 수 있다.
상기 (c) 단계에서, 자일리톨은 증류수에 용해하여, 자일리톨의 증류수 용해액 중량 기준, 10 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 10 중량% 내지 30 중량%, 더욱 바람직하게는 15 중량% 내지 25 중량%, 더더욱 바람직하게는 20 중량% 농도일 수 있고, 사용 전 멸균하고 실온에서 냉각한 후 코팅과정에 이용할 수 있다.
상기 자일리톨은 배양 후 회수한 균체 100 중량부에 대하여 0.5 중량부 내지 50 중량부, 바람직하게는 5 중량부 내지 50 중량부, 더욱 바람직하게는 10 중량부 내지 30 중량부를 첨가한 후 균질화 하고 상온에서 0.5 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 내지 2시간 동안 실온에 정치함으로써 균체를 3차 코팅할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기와 같은 유산균 코팅과정 후 코팅된 유산균을 동결건조하는 과정을 포함할 수 있으며, 당업자가 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 안정성은 유산균에 대한 체외에서의 안정성 및 체내에서의 안정성을 모두 포함하는 의미이며, 보다 구체적으로, 유산균에 대하여 저장 및 열에 대한 안정성, 내담즙산, 내산성, 및 소화효소에 대한 안정성, 및 장관조건에서의 안정성을 의미한다.
본 발명의 실시예에서는 상기 제조방법으로 락토바실러스 펜토서스 균주를 3중 코팅한 후 코팅 처리하지 않은 경우와 비교하여 다양한 측면에서 균주의 안정성을 평가하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 저장안정성 증진여부를 평가하게 위해 상기 유산균 샘플들을 각각 4, 25, 및 40℃ 조건에서 4주 동안 저장하면서 2주 간격으로 생균수 및 생존율을 측정하였다. 그 결과, 저장 온도가 높아질수록 균체의 감소 비율이 증가하는데, 코팅 처리를 하지 않은 경우와 비교하여 3중 코팅한 유산균의 생존율이 크게 증가하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 유산균의 내산성을 평가하기 위해 상기 유산균 샘플들에 대해 각각 pH 2.0 및 2.5의 인공위액을 처리하고 30분, 60분, 및 120분 동안 반응시킨 후 생균수 및 생존율을 측정하였다. 그 결과 코팅 처리를 하지 않은 경우에 비하여 본 발명에 따른 3중 코팅한 샘플에서 높은 생존율을 보이는 것을 알 수 있었다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 유산균의 내담즙성을 평가하기 위해 상기 유산균 샘플들에 대해 각각 0.3% 및 2.0%의 담즙용액을 처리하고 30분, 60분, 및 120분 동안 반응시킨 후 생균수 및 생존율을 측정한 결과, 코팅 처리를 하지 않은 경우에 비해 3중 코팅 처리한 유산균에서 상대적으로 내담즙성이 크게 증가하는 것을 관찰하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 유산균의 소화효소에 대한 안정성을 평가하기 위해 상기 유산균 샘플들에 대해 0.2% 판크레아틴 및 100 unit/mL의 알파-아밀라아제를 각각 처리하고 30분, 60분, 및 120분 동안 반응시킨 후 생균수 및 생존율을 측정하였다. 그 결과, 본 실시예에서 이용한 락토바실러스 펜토서스 균주 자체의 높은 소화효소 안정성을 확인 할 수 있었고, 본 발명에 따른 3중 코팅 처리에 의해 상기 유산균의 소화효소에 대한 안정성이 보다 증진되는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 유산균의 열에 대한 안정성을 평가하기 위해 상기 유산균 샘플들에 각각 40℃, 50℃, 및 70℃로 온도를 맞춘 멸균 식염수를 가하고 항온수조 내에서 10분 및 30분 동안 온도를 유지시킨 후 생균수 및 생존율을 측정하였다. 그 결과, 코팅 처리하지 않은 샘플에 비하여 3중 코팅 처리한 유산균의 생존율이 높게 측정되었으며, 특히 고온인 70℃에서 3중 코팅 유무에 의한 유산균의 현저한 생존율 차이를 확인하였다(실시예 7 참조).
상기 실시예 결과들을 통해 본 발명에 따른 3중 코팅방법은 코팅 처리하지 않은 유산균에 비하여 보관온도에 따른 저장안정성, 내산성, 내담즙성, 소화효소에 대한 안정성 및 열안정성을 전반적으로 증진시키는 것을 알 수 있었다.
이에, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된, 3중 코팅된 유산균을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium sp.) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus sp.) 속, 락토코커스(Lactococcus sp.) 속, 엔테로코커스(Enterococcus sp.) 속, 페디오코커스(Pediococcus sp.) 속, 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 속, 및 비셀라(Weissella sp.) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 균주일 수 있고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 펜토서스 KF340(수탁번호 KCCM 11675P)일 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 배양
락토바실러스 펜토서스 KF340 균주는 360 L의 modified-MRS 배지를 이용하여 32℃, pH 6.0 조건에서 12±3 시간 동안 교반하며 배양하였다. 배양된 락토바실러스 펜토서스 KF340 균체는 원심분리기를 이용하여 분리하였으며, 이 공정을 통해 5.2 Kg의 균체를 회수하였다.
실시예 2. 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 3중 코팅 및 동결건조
상기 실시예 1의 방법에 따라 배양한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주에 대하여 균주의 안정성을 증진시키기 위해 덱스트린; 젤라틴 또는 콜라겐; 및 자일리톨을 이용한 3중 코팅방법을 이용하여 균주를 코팅한 후 다양한 방법으로 안정성 증진여부를 평가하고자 하였다.
구체적인 본 발명에 따른 3중 코팅원료 조성 및 대조군 조성을 하기 표 1에 나타내었다.
Sample no. 1 2 3
코팅원료

 5 중량% 덱스트린 5 중량% 덱스트린 무처리
6 중량% 젤라틴 12 중량% 콜라겐
20 중량% 자일리톨 20 중량% 자일리톨
상기 조성의 3중 코팅에 따른 락토바실러스 펜토서스 KF340의 안정성 증진 효과를 평가하기 위해, 실험군 1은 5 중량%의 덱스트린, 6 중량%의 젤라틴, 및 20 중량%의 자일리톨 농도가 되도록 각 원료를 증류수에 용해하고 121℃에서 15분 동안 멸균한 후 실온에서 냉각시켰다. 다음으로 회수균체에 동중량의 5 중량% 덱스트린 수용액을 첨가하고 균체를 균질화 한 후 1시간 동안 정치하여 1차 코팅하였다. 1차 코팅된 균체에 6 중량% 젤라틴 수용액을 회수균체의 100 중량부 대비 25 중량부가 되도록 첨가하고 균질화한 후 1시간 동안 정치하여 2차 코팅한 후, 20 중량% 자일리톨 수용액을 회수균체의 100 중량부 대비 25 중량부가 되도록 첨가하고 균체를 균질화 한 후 1시간 동안 정치하여 3차 코팅을 실시하였다. 실험군 2는 5 중량%의 덱스트린, 12 중량%의 콜라겐, 및 20 중량%의 자일리톨 농도가 되도록 각 원료를 증류수에 용해하고 121℃에서 15분 동안 멸균한 후 실온에서 냉각시켰다. 다음으로 회수균체에 동중량의 5 중량% 덱스트린 수용액을 첨가하고 균체를 균질화 한 후 1시간 동안 정치하여 1차 코팅하였다. 1차 코팅된 균체에 12 중량% 콜라겐 수용액을 회수균체의 100 중량부 대비 25 중량부가 되도록 첨가하고 균질화한 후 1시간 동안 정치하여 2차 코팅한 후, 20 중량% 자일리톨 수용액을 회수균체의 100 중량부 대비 25 중량부가 되도록 첨가하고 균체를 균질화 한 후 1시간 동안 정치하여 3차 코팅을 실시하였다. 이때, 대조군(3번 샘플)으로는 아무 원료도 처리하지 않음으로써 코팅 처리를 하지 않은 동일 균체를 이용하였다.
상기 원료들을 처리하여 3중 코팅하거나 코팅 처리하지 않은 균체들은 하기 조건에 따라 약 66시간 동안 동결건조 하였다. 보다 구체적으로 -38℃에서 5시간 이상 유지하여 예비동결 하였고, -38℃에서 -10℃의 온도로 동결건조를 실시한 후 최종 25℃에서 종료한 후 유지하였다. 상기 방법에 따라 3중 코팅과 동결건조를 실시하여 얻은 락토바실러스 펜토서스 KF340의 최종 원료 사진을 도 1(실험군 1) 및 도 2(실험군 2)에 나타내었고, 상기 3중 코팅된 균체를 주사전자현미경(SEM)으로 촬영한 사진을 도 3(실험군 1) 및 도 4(실험군 2)에 나타내었다.
이후 상기 샘플들을 대상으로 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 안정성 증진여부를 다양한 측면에서 평가하였다.
실시예 3. 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 저장안정성 평가
본 발명에 따른 원료로 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340의 저장안정성을 평가하기 위해, 상기 표 1의 샘플들을 실시예 2의 방법에 따라 준비한 후 각각 4, 25, 및 40℃ 조건에서 4주 동안 저장하면서 2주 간격으로 생균수를 측정하였다. 생균수를 측정하기 위해 각 보관온도에서 저장한 균체들을 멸균 식염수로 현탁한 다음, MRS(Difco) 고체 배지에 희석배율에 따라 분주 및 도말한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하여 콜로니 숫자를 측정하였다. 이때 생존율(%)은 [(4주차의 Log 지수값/0주차의 Log 지수값) X 100]으로 나타내었다.
상기 샘플들을 각각 4, 25, 및 40℃에서 보관한 결과, 하기 표 2 내지 4에 각각 나타낸 바와 같이, 코팅 처리를 하지 않은 대조군은 모든 온도조건에서 3중 코팅한 실험군 1 및 2의 균체에 비해 낮은 생존율을 나타내었다. 또한, 보관 온도가 높아질수록 균체의 감소비율이 증가하는 경향을 보였는데, 이는 기존 보고들과 유사한 결과이며, 보관온도가 높아질수록 아무것도 처리하지 않은 대조군과 3중 코팅 샘플의 생존율 차이가 크게 증가한다는 점에서 본 발명에 따른 3중 코팅 공정이 상기 균주의 저장안정성을 크게 향상시킴을 확인할 수 있었다.
실험군 1 실험군 2 대조군
0주 3.9 X 108 (CFU/㎎) 4.0 X 108 (CFU/㎎) 1.2 X 108 (CFU/㎎)
2주 1.9 X 108 (CFU/㎎) 3.0 X 108 (CFU/㎎) 2.5 X 107 (CFU/㎎)
4주 2.2 X 108 (CFU/㎎) 2.9 X 108 (CFU/㎎) 3.1 X 107 (CFU/㎎)
4주차 경과시 생존율(%) 97.1(%) 98.4(%) 92.6(%)
실험군 1 실험군 2 대조군
0주 3.9 X 108 (CFU/㎎) 4.0 X 108 (CFU/㎎) 1.2 X 108 (CFU/㎎)
2주 9.9 X 107 (CFU/㎎) 9.7 X 107 (CFU/㎎) 1.3 X 106 (CFU/㎎)
4주 4.6 X 107 (CFU/㎎) 8.3 X 107 (CFU/㎎) 5.1 X 106 (CFU/㎎)
4주차 경과시 생존율(%) 89.2(%) 92.1(%) 82.9(%)
실험군 1 실험군 2 대조군
0주 3.9 X 108 (CFU/㎎) 4.0 X 108 (CFU/㎎) 1.2 X 108 (CFU/㎎)
2주 1.1 X 107 (CFU/㎎) 5.4 X 106 (CFU/㎎) 1.7 X 103 (CFU/㎎)
4주 5.5 X 106 (CFU/㎎) 4.5 X 106 (CFU/㎎) 4.5 X 103 (CFU/㎎)
4주차 경과시 생존율(%) 78.5(%) 77.3(%) 45.1(%)
실시예 4. 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 내산성 평가
본 발명에 따른 원료로 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340의 내산성을 평가하기 위해, 상기 표 1의 샘플들을 실시예 2의 방법에 따라 준비한 후 각각 pH 2.0 및 2.5의 인공위액을 가하여 30분, 60분 및 120분 동안 반응시킨 뒤 멸균 식염수로 10배씩 희석하여 MRS(Difco) 고체 배지에 희석배율에 따라 분주 및 도말하였다. 이후 37℃에서 48시간 동안 배양하여 콜로니 숫자를 측정하였으며, 이때 생존율(%)은 [(인공위액 노출 후 Log 지수값/초기 Log 지수값) X 100]으로 나타내었다.
그 결과, 하기 표 5 및 표 6에 각각 나타낸 바와 같이, 인공위액(pH 용액)에 노출된 시간이 증가함에 따라 균체의 생존율이 감소하는 경향을 보였고, pH 2.0 및 pH 2.5 조건에서 모두 코팅 처리를 하지 않은 대조군에 비하여 3중 코팅한 실험군 1 및 2에서 높은 생존율을 나타내었다. 또한, pH 2.5 조건에서는 98% 이상, pH 2.0의 산성 환경에서도 약 94% 이상의 생존율을 유지하는 것을 볼 때 아무것도 처리하지 않은 경우에 비해 3중 코팅 방법이 상대적으로 내산성을 크게 증가 시킨다는 것을 확인하였다.
실험군 1 실험군 2 대조군
0분 1.4 X 108 (CFU/㎎) 2.3 X 108 (CFU/㎎) 1.7 X 107 (CFU/㎎)
30분 1.3 X 108 (CFU/㎎) 1.8 X 108 (CFU/㎎) 2.1 X 107 (CFU/㎎)
60분 1.9 X 108 (CFU/㎎) 1.9 X 108 (CFU/㎎) 6.1 X 106 (CFU/㎎)
120분 9.2 X 107 (CFU/㎎) 8.3 X 107 (CFU/㎎) 4.8 X 106 (CFU/㎎)
120분 경과시 생존율(%) 97.8(%) 94.6(%) 92.5(%)
실험군 1 실험군 2 대조군
0분 1.4 X 108 (CFU/㎎) 2.3 X 108 (CFU/㎎) 1.4 X 107 (CFU/㎎)
30분 1.7 X 108 (CFU/㎎) 3.2 X 108 (CFU/㎎) 1.4 X 107 (CFU/㎎)
60분 2.0 X 108 (CFU/㎎) 1.8 X 108 (CFU/㎎) 1.5 X 107 (CFU/㎎)
120분 1.7 X 108 (CFU/㎎) 1.9 X 108 (CFU/㎎) 6.7 X 106 (CFU/㎎)
120분 경과시 생존율(%) 101.2(%) 98.8(%) 94.4(%)
실시예 5. 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 내담즙성 평가
본 발명에 따른 원료로 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340의 내담즙성을 평가하기 위해, 상기 표 1의 샘플들을 실시예 2의 방법에 따라 준비한 후 담즙 용액(Bile extract 0.3%, 2.0%)을 가하여 30분, 60분 및 120분 동안 반응시킨 뒤 멸균 식염수로 10배씩 희석하여 MRS(Difco) 고체 배지에 희석배율에 따라 분주 및 도말하였다. 37℃에서 48시간 동안 배양하여 콜로니 숫자를 측정한 후, 이때 생존율(%)은 [(담즙산 노출 후 Log 지수값/초기 Log 지수값) X 100]으로 나타내었다.
0.3% 및 2.0%의 담즙 용액과 반응시킨 결과, 하기 표 7 및 8에 각각 나타낸 바와 같이, 담즙 용액(Bile extract)에 대한 노출시간이 증가함에 따라 균체들의 생존율이 감소하는 경향을 보였고, 상기 각각의 담즙 용액에서 모두 코팅 처리를 하지 않은 대조군과 비교할 때 3중 코팅한 실험군 1 및 2에서 높은 생존율이 나타나는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 아무것도 처리하지 않은 경우에 비해 3중 코팅 방법이 상대적으로 내담즙성을 크게 증가 시킨다는 것을 알 수 있었다.
실험군 1 실험군 2 대조군
0분 1.6 X 108 (CFU/㎎) 2.0 X 108 (CFU/㎎) 3.1 X 107 (CFU/㎎)
30분 1.2 X 108 (CFU/㎎) 5.5 X 107 (CFU/㎎) 3.0 X 106 (CFU/㎎)
60분 3.1 X 107 (CFU/㎎) 2.4 X 107 (CFU/㎎) 5.8 X 106 (CFU/㎎)
120분 6.3 X 107 (CFU/㎎) 3.8 X 107 (CFU/㎎) 2.6 X 106 (CFU/㎎)
120분 경과시 생존율(%) 95.1(%) 91.4(%) 85.7(%)
실험군 1 실험군 2 대조군
0분 1.6 X 108 (CFU/㎎) 2.0 X 108 (CFU/㎎) 3.1 X 107 (CFU/㎎)
30분 2.3 X 107 (CFU/㎎) 2.1 X 107 (CFU/㎎) 4.0 X 106 (CFU/㎎)
60분 2.1 X 107 (CFU/㎎) 4.1 X 107 (CFU/㎎) 2.4 X 106 (CFU/㎎)
120분 2.1 X 107 (CFU/㎎) 8.2 X 107 (CFU/㎎) 3.3 X 106 (CFU/㎎)
120분 경과시 생존율(%) 89.3(%) 95.4(%) 87.1(%)
실시예 6. 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 소화효소에 대한 안정성 평가
본 발명에 따른 원료로 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340의 소화효소에 대한 안정성을 평가하기 위해, 상기 표 1의 샘플들을 실시예 2의 방법에 따라 준비한 후 소화효소 용액 즉, 0.2% 판크레아틴(pancreatin) 및 100 unit/mL의 알파-아밀라아제(α-amylase)를 각각 첨가하여 30분, 60분, 및 120분 동안 반응시킨 뒤 멸균 식염수로 10배씩 희석하여 MRS(Difco) 고체 배지에 희석배율에 따라 분주 및 도말하였다. 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 콜로니 숫자를 측정하였으며, 이때 생존율(%)은 [(소화효소 용액 노출 후 Log 지수값/초기 Log 지수값) X 100]으로 나타내었다.
상기 샘플들을 각각 판크레아틴 및 아밀라아제와 반응시킨 결과, 하기 표 9 및 표 10에 나타낸 바와 같이, 모든 균체들의 생존율이 높게 나타났고, 코팅 처리를 하지 않은 대조군의 경우에도 약 95% 이상의 생존율이 확인되어 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 자체가 판크레아틴과 아밀라아제에 대한 저항성이 매우 높은 것을 알 수 있었다. 그러나 코팅을 하지 않은 대조군 보다는 3중 코팅한 실험군 1 및 2의 생존율이 약 100%로 유지된다는 점에서 3중 코팅 처리가 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 소화효소에 대한 안정성을 보다 향상시키는 것을 알 수 있었다.
실험군 1 실험군 2 대조군
0분 2.2 X 108 (CFU/㎎) 2.1 X 108 (CFU/㎎) 2.8 X 107 (CFU/㎎)
30분 2.3 X 108 (CFU/㎎) 2.5 X 108 (CFU/㎎) 2.7 X 107 (CFU/㎎)
60분 2.7 X 108 (CFU/㎎) 3.2 X 108 (CFU/㎎) 3.2 X 107 (CFU/㎎)
120분 2.3 X 108 (CFU/㎎) 2.0 X 108 (CFU/㎎) 1.1 X 107 (CFU/㎎)
120분 경과시 생존율(%) 100.3(%) 99.9(%) 94.8(%)
실험군 1 실험군 2 대조군
0분 2.8 X 108 (CFU/㎎) 1.9 X 108 (CFU/㎎) 2.2 X 107 (CFU/㎎)
30분 3.0 X 108 (CFU/㎎) 3.1 X 108 (CFU/㎎) 1.5 X 107 (CFU/㎎)
60분 2.9 X 108 (CFU/㎎) 3.6 X 108 (CFU/㎎) 2.1 X 107 (CFU/㎎)
120분 2.7 X 108 (CFU/㎎) 4.0 X 108 (CFU/㎎) 1.5 X 107 (CFU/㎎)
120분 경과시 생존율(%) 99.8(%) 104.0(%) 97.9(%)
실시예 7. 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 열안정성 평가
본 발명에 따른 원료로 3중 코팅한 락토바실러스 펜토서스 KF340의 열에 대한 안정성을 평가하기 위해, 상기 표 1의 샘플들을 실시예 2의 방법에 따라 준비한 후 40℃, 50℃, 및 70℃로 온도를 맞춘 멸균 식염수를 각 샘플에 가하여 항온수조 내에서 10분 및 30분 동안 동일한 온도로 유지시킨 후 멸균 식염수로 10배씩 희석하여 MRS(Difco) 고체 배지에 희석배율에 따라 분주 및 도말하였다. 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 콜로니 숫자를 측정하였으며, 이때 생존율(%)은 [(열처리 후 Log 지수값/초기 Log 지수값) X 100]으로 나타내었다.
각각 40℃, 50℃, 및 70℃ 조건에서의 열안정성 평가 결과, 하기 표 11 내지 표 13에 나타낸 바와 같이, 40℃ 조건에서는 코팅 처리를 하지 않은 대조군에서도 96% 이상, 3중 코팅샘플의 생존율은 약 100%로 유지되는 것을 통해 40℃ 조건에서 락토바실러스 펜토서스 KF340의 높은 열안정성을 확인하였다. 50℃ 조건에서는 코팅을 하지 않은 대조군이 약 85%의 생존율을 유지하며 3중 코팅샘플의 경우 약 88%이상의 생존율을 나타내어 비교적 생존율에 있어서 큰 차이는 나타나지 않았다. 그러나 코팅처리에 따른 열안정성 차이는 70℃ 고온 조건에서 보다 두드러지게 나타나 코팅 처리 하지 않은 대조군이 30분의 열처리 과정을 거친 후 생균이 확인되지 않은 것과 달리 3중 코팅샘플의 균체 생존율을 약 20-40%까지 크게 향상시킨다는 점에서 큰 의의를 갖는다. 따라서 이전의 결과들을 종합하여 볼 때 락토바실러스 펜토서스 KF340의 3중 코팅 샘플은 외부 환경으로부터 균주를 보호함으로써 보관온도에 따른 저장안정성, 내산성, 내담즙성, 소화효소에 대한 안정성, 및 열안정성을 전반적으로 향상시키는 것을 알 수 있었다.
실험군 1 실험군 2 대조군
0분 8.4 X 107 (CFU/㎎) 1.8 X 108 (CFU/㎎) 1.9 X 107 (CFU/㎎)
10분 2.1 X 108 (CFU/㎎) 2.4 X 108 (CFU/㎎) 1.2 X 107 (CFU/㎎)
30분 2.0 X 108 (CFU/㎎) 2.1 X 108 (CFU/㎎) 1.0 X 107 (CFU/㎎)
30분 경과시 생존율(%) 104.7(%) 100.9(%) 96.4(%)
실험군 1 실험군 2 대조군
0분 8.4 X 107 (CFU/㎎) 1.8 X 108 (CFU/㎎) 1.9 X 107 (CFU/㎎)
10분 4.2 X 107 (CFU/㎎) 1.3 X 108 (CFU/㎎) 3.6 X 106 (CFU/㎎)
30분 2.2 X 107 (CFU/㎎) 1.8 X 107 (CFU/㎎) 1.6 X 106 (CFU/㎎)
30분 경과시 생존율(%) 92.7(%) 87.9(%) 85.1(%)
실험군 1 실험군 2 대조군
0분 1.6 X 108 (CFU/㎎) 1.6 X 108 (CFU/㎎) 1.1 X 107 (CFU/㎎)
10분 5.5 X 103 (CFU/㎎) 4.0 X 103 (CFU/㎎) 7.3 X 103 (CFU/㎎)
30분 5.0 X 101 (CFU/㎎) 1.7 X 103 (CFU/㎎) -
30분 경과시 생존율(%) 20.7(%) 39.2(%) 0.0(%)
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (14)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 안정성이 증진된 유산균의 제조방법으로서,
    상기 안정성에는 보관온도에 따른 저장안정성, 내산성, 내담즙성, 소화효소에 대한 안정성 및 열안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 유산균의 제조방법:
    (a) 유산균에 1 중량% 내지 15 중량% 농도의 덱스트린(dextrin)을 첨가하고 균질화 하여 1차 코팅하는 단계;
    (b) 상기 1차 코팅된 유산균에 1 중량% 내지 15 중량% 농도의 젤라틴(gelatin), 또는 5 중량% 내지 20 중량% 농도의 콜라겐(collagen)을 첨가하고 균질화 하여 2차 코팅하는 단계; 및
    (c) 상기 2차 코팅된 유산균에 10 중량% 내지 30 중량% 농도의 자일리톨(xylitol)을 첨가하고 균질화 하여 3차 코팅하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 덱스트린은 3 중량% 내지 7 중량% 농도인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 젤라틴은 4 중량% 내지 7 중량% 농도인 것, 또는 콜라겐은 10 중량% 내지 15 중량% 농도인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 자일리톨은 15 중량% 내지 25 중량% 농도인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium sp.) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus sp.) 속, 락토코커스(Lactococcus sp.) 속, 엔테로코커스(Enterococcus sp.) 속, 페디오코커스(Pediococcus sp.) 속, 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 속, 및 비셀라(Weissella sp.) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 상기 덱스트린은 유산균 균체 100 중량부 대비 10 중량부 내지 100 중량부의 비율로 혼합하여 1차 코팅하는 단계;
    상기 (b) 단계에서 상기 젤라틴 또는 콜라겐은 유산균 균체 100 중량부 대비 0.5 중량부 내지 50 중량부의 비율로 혼합하여 2차 코팅하는 단계; 및
    상기 (c) 단계에서 상기 자일리톨은 유산균 균체 100 중량부 대비 0.5 중량부 내지 50 중량부의 비율로 혼합하여 3차 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
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  13. 삭제
  14. 삭제
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