CN117327631B - 一种改善焦虑抑郁植物乳杆菌株10a-2及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于益生菌领域，提供了一种改善焦虑抑郁植物乳杆菌株10A‑2及其用途，所述植物乳杆菌株10A‑2已在中国普遍微生物保藏中心进行专利菌株保藏，保存号为CCTCCNO：M2023621。该菌株在具备调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收的同时，还有调理并有效地缓解治疗失眠、焦虑、抑郁、改善睡眠质量的功效。每日给予本发明菌株60亿CFU及代谢产物100mg可在肠道繁殖生长过程中可持续性提供内生性必须数量的钴胺素、磷脂酰丝氨酸、乙酰胆碱。对焦虑抑郁症具有预防、缓解、治疗作用，可有效地保持健康的神经***。解决了目前急需对焦虑抑郁症具有良好改善效果的菌剂的问题。
Description
技术领域
本发明属于益生菌领域，特别涉及一种改善焦虑抑郁植物乳杆菌株10A-2及其用途。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
随着生活节奏的加快、工作压力的增大，焦虑抑郁症的患病率增大，给人们的生活、学习和工作造成了严重的影响。焦虑抑郁症又称焦虑性神经症，是以广泛性焦虑症和发作性惊恐状态为主要临床表现，常伴有头晕、胸闷、心悸、呼吸困难、口干、尿频、尿急、出汗、震颤和运动性不安等症，其焦虑并非由实际威胁所引起，或其紧张惊恐程度与现实情况很不相称。抑郁心境的体验可以从病人的言谈举止、表情、姿势中反映出来。抑郁病人多以“情绪低落”、“高兴不起来”、“压抑”、“心情糟透了”、“心烦意乱”、“心里不舒服”、“对任何事提不起兴趣”等词语来描述其在较长一段时间内的心境体验。
益生菌，是一类对宿主健康发挥有益作用的微生物的总称。益生菌可以调节情绪，有缓解抑郁的作用。
微生物群通常是指：生活在人体内或体表的所有微生物，如肠道菌群。肠道细菌可以通过代谢产物影响神经***。大脑和肠道的密切合作，这种连接称为“肠-脑轴（GBA）”，它连接中枢神经***和大脑。人类的肠道会产生数百种神经化学物质，也就是神经递质，供大脑用于心理过程，例如：情绪、记忆和学习等。研究发现，服用益生菌，可以一定程度上改善焦虑和抑郁的状况。但目前急需对焦虑抑郁症具有良好改善效果的菌剂。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种改善焦虑抑郁植物乳杆菌株10A-2及其用途。本发明于2007年10月在广西南宁从新鲜山竹果肉中分离出一株植物乳杆菌，经16srRNA法（16S核糖体RNA基因测序技术）鉴定为植物乳杆菌，该菌株在具备调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收的同时，还有调理并有效地缓解治疗失眠、焦虑、抑郁、改善睡眠质量的功效。每日给予本发明菌株60亿CFU及代谢产物100mg可在肠道繁殖生长过程中持续性提供内生性必须数量的钴胺素、磷脂酰丝氨酸、乙酰胆碱，对焦虑抑郁症具有预防、缓解、治疗作用，可以保持神经***的健康。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种改善焦虑抑郁植物乳杆菌株（Lactobacillus pLantarum）10A-2，所述植物乳杆菌株10A-2已在中国典型培养物保藏中心进行专利菌株保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2023621，保藏日期为2023年04月25日，保藏地址为武汉大学。
本发明的第二个方面，提供了上述的植物乳杆菌株10A-2在制备改善焦虑抑郁症的菌剂中的应用。
本发明的第三个方面，提供了上述的植物乳杆菌株10A-2在制备改善睡眠障碍的菌剂中的应用。
优选的，食用过程中，所述植物乳杆菌株10A-2的摄入量大于60亿CFU/日。
优选的，所述改善包括：对于相关症状具有预防、缓解、治疗作用中的至少一种。
本发明的第四个方面，提供了一种改善焦虑抑郁的菌剂的制备方法，包括：
将上述的植物乳杆菌株10A-2进行扩大培养、一级种子培养、种子罐培养、发酵培养，得到发酵菌液；
将所述发酵菌液离心分别收集发酵植物乳杆菌菌泥及离心后的发酵液，并将所述发酵植物乳杆菌菌泥和离心后的发酵液分别冷冻干燥、粉碎，获得发酵植物乳杆菌菌粉体以及发酵植物乳杆菌代谢物粉体；
将发酵植物乳杆菌菌粉体以及发酵植物乳杆菌代谢物粉体与菌粉载体混合，即得。
优选的，所述发酵植物乳杆菌菌粉体 9份-12份、发酵植物乳杆菌代谢物粉体 4份-6份、菌粉载体 114份-166份。
优选的，所述菌粉载体由如下质量份数的原料组成：微晶纤维素 18份-22份、药用玉米淀粉 80份-120份、菊粉 8份-12份、硬脂酸镁 8份-12份。
优选的，所述一级种子培养的接种量为0.5%-0.6%，以体积比计。
优选的，所述种子罐培养的接种量为0.3%-0.4%，以体积比计。
优选的，所述发酵的接种量为0.3%-0.4%，以体积比计。
优选的，所述离心的转速为10000 r/min -12000r/min。
优选的，所述菌剂的水分含量≤4%，以质量比计。
本发明的有益效果
（1） 本发明的植物乳杆菌株10A-2在具备调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收功能的同时，还有调理并有效地预防、缓解或治疗焦虑抑郁症、改善睡眠质量的功效。每日给予本发明菌株60亿CFU及代谢产物100mg可在肠道繁殖生长过程中，持续性提供内生性必须数量的钴胺素、磷脂酰丝氨酸、乙酰胆碱，对焦虑抑郁症起到有预防、缓解、治疗作用，更好地保持神经***的健康。
（2）本发明的植物乳杆菌活菌及其代谢产物的生产工艺简单、周期短、易操作、使用原材料易得，生产中无三废排放，达到绿色环保生产的要求。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
生产中所使用的设备：菌种培养箱、超净工作台、恒温培养箱、各种试管、三角瓶、种子罐、发酵罐、真空冷冻干燥机、三维搅拌机、低温粉碎机、真空包装机。
实施例1菌株鉴定
从新鲜山竹果肉中分离出一株植物乳杆菌，经16srRNA法鉴定为植物乳杆菌10A-2，菌株的序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2菌株培养
一、扩大菌种培养
对-80℃冰箱保藏的实施例1获得的植物乳杆菌10A-2进行扩大培养，培养基的配制：水苏糖15g、麦芽糖醇3g、牛肉浸粉4g、乙酸钠1.5g、吐温-800.5mL、磷酸二氢钾0.8g、自来水1000mL，pH值调至7（碱液调）。
操作：将以上配方中的原料不分前后的加入到配方中的1000mL水中，搅拌10min使之溶化，然后分装于试管中，每只试管装有5mL，胶塞牛皮纸封口，放在医用消毒器中于0.1MPa-0.12MPa下灭菌20min，培养基制作完成。
接种：在无菌条件下（超净工作台）打开-80℃低温冰箱保存二个植物乳杆菌10A-2的冷冻管室温融化，然后再取以上灭好菌的试管培养基1只，将融化好的二个菌的菌液各取0.5mL加入到试管中，用胶塞牛皮纸封好管口，用手轻轻摇匀，放入恒温培养箱中37℃静置培养16h即可，此称为扩大培养液。
二、一级种子培养
一级种子培养配方：异麦芽酮糖5g、蛋白胨3g、牛肉浸粉2g，精氨酸1.2g、乙酸钠0.5g、苏氨酸1.5g、络氨酸0.3g、吐温-80 1mL、自来水1000mL，pH值自然。
操作：将上述原料不分前后的加入到1000mL自来水中，开动搅拌机，搅拌10min，使全部溶化，此称为一级种子培养液。
将搅拌溶化好的一级种子培养液按用量加入到三角瓶中，然后用6层纱布外加一层牛皮纸包扎好瓶口，放入消毒器中灭菌，灭菌前首先打开消毒器上的排气阀等有少量蒸汽排出时关闭，当医用消毒器上的压力达到0.05MPa时，打开医用消毒器上的排气阀排气6min-8min，然后关闭排气阀，继续加温，当医用消毒器中的蒸汽压力达到0.1MPa-0.12MPa时开始计时，灭菌时间为20min，完毕后离开热源，让其自然降温，当医用消毒器上的压力表归零时，打开医用消毒器，取出灭好菌的培养基放入超净工作台中自然降温，当温度降至37℃时，将以上培养好的扩大菌种液移接到三角瓶灭好菌的培养液中，接种量均为0.5%，即：一级种子培养液100mL，接入扩大培养液为0.5mL，完毕后用原有纱布及牛皮纸将瓶口封好，用手稍加摇动二者混合均匀，然后放恒温箱中在37℃的条件下培养18h即可，此称为一级菌种液。
三、种子罐培养
发酵设备、管道及无菌过滤***的灭菌：
操作：首先打开各进出管道及无菌空气管道阀门，通入0.12MPa-0.14MPa的蒸汽，让蒸汽与管道阀门联通并有少量蒸汽排出，通气40min，然后关闭各进出口管道阀门，备用。
种子罐及发酵罐的空罐灭菌：
关闭各个阀门，打开罐底部的排污阀及罐夹层的排污阀，打开直接蒸汽阀门向管内通入0.12MPa-0.14MPaMPa的蒸汽，当罐内达到121℃时开始计时，灭菌时间为40min，然后关闭罐底部的排污阀及夹层排污阀，罐中温度自然降至37℃备用。
种子罐培养：
配方：异麦芽酮糖2%、酪蛋白胨0.7%、磷酸氢二钾0.1%，丝氨酸0.5%，乙酸钠0.1%、精氨酸0.8%、苯丙氨酸0.6%、吐温-80 0.1%，聚醚消泡剂0.1%、自来水92.4%，pH值自然，各百分数以质量比计。
具体操作：首先将配方中所使用的自来水投入到已空罐灭菌的种子罐中，开动搅拌机，分别加入配方中所需的原料（加入顺序不分前后），然后不停的搅拌并通入蒸汽加温，首先利用罐夹层蒸汽加热到95℃时，再改用直接蒸汽加热，当罐中温度达到121℃时保持20min即可达到灭菌效果，然后关闭蒸汽，开始通过罐夹层的自来水冷却降温，当罐内温度达到37℃时备用，此称为种子培养基。然后将以上培养好的一级菌种液在无菌条件下接种到种子罐中去，接种量分别是罐内培养基的3%，100kg种子罐培养基分别接入一级菌液3kg即可，然后盖好罐上的接种帽开始搅拌培养，培养条件：温度37℃，pH值自然，搅拌转速120r/min，罐压0.05MPa，培养时间12h即可达到要求，如果罐体压力降低，可通入无菌空气保持罐压，罐压过高可用罐顶的放气阀调整，此称为种子罐菌种。
四、发酵培养
配方：异麦芽酮糖2%，酪蛋白胨0.5%，低聚木糖1%，水苏糖1.2%，小麦低聚肽3%，酵母浸粉2%、乙酸钠1%，吐温-80 0.2%，亮氨酸0.3%，脯氨酸0.2%，磷酸氢二钾0.5%，聚醚消泡剂0.1%，自来水69.2%，各百分数以质量比计。
具体操作：首先将配方中所使用的自来水投入到已空罐灭菌的发酵罐中去，开动搅拌机，向发酵罐中投入配方中所使用的原料（加入顺序不分前后），然后通入蒸汽加热。首先利用夹层蒸汽加热到95℃，然后再改用直接蒸汽加热，当罐中温度达到121℃时开始计时，保持30min即可达到灭菌效果，然后通过夹层的自来水冷却降温，当罐中的温度降到37℃时开始接入菌种，接种前首先提高种子罐的罐压力达到0.1MPa，发酵罐的罐压保持0.05MPa，然后打开接种管道阀门，将种子罐培养好的种子罐菌种通过压力差的方式输送至发酵罐中去，然后关闭接种通道阀门。
接种量是每100kg发酵罐中的培养基接入种子罐菌种3kg，培养条件：0h-5h培养温度37℃，搅拌速度120r/min，罐压保持0.05MPa，发酵过程中通过酸、碱自动调控***，保持pH值6，如果罐压降低，可通入无菌空气保持罐压，直至发酵完毕，共发酵25h，然后降温至20℃，此为发酵液。
五、发酵乳杆菌菌泥和发酵液的冷冻干燥
（1）将发酵液抽入到贮罐中进行离心，操作：启动离心机，调整转速10000 r/min，以6kg/min的进料速度离心，离心完毕收集湿菌泥，将收集湿菌泥进行冷冻干燥。
（2）菌泥代谢产物的冷冻干燥
悬菌液的制备：取灭活湿菌泥1000g，加入无菌生理盐水4000毫升，麦芽糊精300g，无水葡萄糖1500g、硫酸锌10g、葡萄糖酸钠40g。
操作：首先取配方中的生理盐水2500mL，加入麦芽糊精搅拌溶化，再加入灭活湿菌泥1000g，再加入配方中剩余的生理盐水及无水葡萄糖及辅料充分搅拌均匀，即称为悬浮液，将悬浮液进行冷冻干燥，最终控制水分含量≤4%，即得到发酵植物乳杆菌菌粉体。
2、离心发酵液的低温浓缩：浓缩条件，真空度0.06MPa，温度55℃-65℃，浓缩至膏状，固形物含量80％，水分含量20％为止（以质量比计），然后加入药用玉米淀粉为载体，混匀后进行真空干燥。取发酵液浓缩膏1000g，加入药用玉米淀粉200g混匀放真空干燥箱中干燥，干燥条件：真空度0.06MPa，温度57℃，干燥时间45h，水分含量3％为合格，然后将其粉碎至100目的粉，密封包装备用，获得发酵植物乳杆菌代谢物粉体。其中，发酵液浓缩膏与药用玉米淀粉混合的质量分数比4.5：1。
菌剂的复配：取100目的发酵植物乳杆菌菌粉体9g、发酵植物乳杆菌代谢物粉体4g、微晶纤维素18g、药用玉米淀粉80g、菊粉8g、硬脂酸镁8g，其中，微晶纤维素、药用玉米淀粉，菊粉、硬脂酸镁为菌粉载体。将以上各物料放入固体搅拌混合机中混合均匀，然后在无菌条件下分装入胶囊中，装瓶或压片即为本发明实施例的组合物成品。
实施例3
与实施例2的不同之处在于，菌剂的复配：取100目的发酵植物乳杆菌菌粉体12g、发酵植物乳杆菌代谢物粉体6g、微晶纤维素22g、药用玉米淀粉120g、菊粉12g、硬脂酸镁12g。
实施例4
与实施例2的不同之处在于，一级种子培养的接种量为0.6%，以体积比计。
实施例5
与实施例2的不同之处在于，所述种子罐培养的接种量为0.4%，以体积比计。
实施例6
与实施例2的不同之处在于，所述发酵培养的接种量为0.4%，以体积比计。
实施例7
与实施例2的不同之处在于，离心的转速为12000r/min。
实施例8
临床试验
1一般资料
选择2020年7月-2021年8月接受本试验药物组合物且具有睡眠障碍、抑郁、焦虑症状的病例（即：焦虑抑郁症患者）共有600人，其中，治疗1组：中老年男性200人，年龄34岁-80岁，平均年龄55岁；治疗2组：中老年女性200人，年龄33岁-82岁，平均年龄56岁；治疗3组：青少年男性100人，年龄15岁-18岁，平均年龄15岁；治疗4组：青少年女性100人，年龄16岁-18岁，平均年龄16岁；对照组200人，平均年龄30岁，作为研究对象。每组患者在性别、年龄、病情类型等基本资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。
2评价标准
改善：情绪反应减弱，睡眠障碍有所缓解，躯体症状减轻。
明显改善：情绪得到控制，睡眠障碍减轻，躯体症状减少。
改善极其明显：情绪趋于稳定，睡眠基本稳定，存在少许躯体症状。
完全改善：情绪稳定，睡眠规律，躯体症状消失。
未改善：症状未明显减轻或加重。
3治疗方法
治疗1组-4组：分别将实施例2制备的植物乳杆菌冻干粉供患者服用，每天睡前一次服用0.3g，每0.3g含活植物乳杆菌60亿CFU及代谢产物100mg。
4结果
经过20天治疗，四组的临床治疗效果对比结果见表1。
表1 对改善焦虑抑郁应用效果
说明：男性200人在服用2天开始统计结果，服用2天有不同年龄的110人感觉焦虑抑郁症情况改善，服用8天后，有152人感觉焦虑抑郁症得到明显改善。服用14天有164人焦虑抑郁症改善极其明显。服用20天有190人的焦虑抑郁症情况完全改善，对事物情绪高涨，对生活中的各方面兴趣增加，能保持心情愉悦、舒畅；共有10人在服用植物乳杆菌未能改善焦虑抑郁症。
女性：200人在服用2天开始统计结果，服用2天有不同年龄的112人感觉焦虑抑郁症情况改善，服用8天后，有159人感觉焦虑抑郁症情况得到明显改善。服用14天有169人焦虑抑郁症情况改善极其明显。服用20天有191人的焦虑抑郁症情况完全改善，对事物情绪高涨，对生活中的各方面兴趣增加，能保持心情愉悦、舒畅；共有9人在服用植物乳杆菌未能改善焦虑抑郁症。
青少年男：100人在服用2天开始统计结果，服用2天有不同年龄的59人感觉焦虑抑郁症情况改善，服用8天后，有69人感觉焦虑抑郁症情况得到明显改善。服用14天有75人焦虑抑郁症改善极其明显。服用20天有92人的焦虑抑郁症情况完全改善，对事物情绪高涨，对生活中的各方面兴趣增加，能保持心情愉悦、舒畅；共有8人在服用植物乳杆菌未能改善焦虑抑郁症。
青少年女：100人在服用2天开始统计结果，服用2天有不同年龄的60人感觉焦虑抑郁症情况改善，服用8天后，有70人感觉焦虑抑郁症情况得到明显改善。服用14天有76人焦虑抑郁症情况改善极其明显。服用20天有93人的焦虑抑郁症情况完全改善，对事物情绪高涨，对生活中的各方面兴趣增加，能保持心情愉悦、舒畅；共有7人在服用植物乳杆菌未能改善焦虑抑郁症。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一株改善焦虑抑郁植物乳杆菌株10A-2，其分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus pLantarum），该菌株已于2023年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，其生物保藏号为CCTCCNO：M2023621。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌株10A-2在制备改善焦虑抑郁症的菌剂中的应用。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌株10A-2在制备改善睡眠障碍的菌剂中的应用。
4.一种改善焦虑抑郁的菌剂的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述的植物乳杆菌株10A-2进行扩大培养、一级种子培养、种子罐培养、发酵培养，得到发酵菌液；
将所述发酵菌液离心分别收集发酵植物乳杆菌菌泥及离心后的发酵液，并将所述发酵植物乳杆菌菌泥和离心后的发酵液分别冷冻干燥、粉碎，获得发酵植物乳杆菌菌粉体以及发酵植物乳杆菌代谢物粉体；
将发酵植物乳杆菌菌粉体以及发酵植物乳杆菌代谢物粉体与菌粉载体混合，即得。
5.如权利要求4所述的改善焦虑抑郁的菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵植物乳杆菌菌粉体 9份-12份、发酵植物乳杆菌代谢物粉体 4份-6份、菌粉载体114份-166份。
6.如权利要求4所述的改善焦虑抑郁的菌剂的制备方法，其特征在于，所述菌粉载体由如下质量份数的原料组成：微晶纤维素18份-22份、药用玉米淀粉80份-120份、菊粉8份-12份、硬脂酸镁8份-12份。
7.如权利要求4所述的改善焦虑抑郁的菌剂的制备方法，其特征在于，所述一级种子培养的接种量为0.5%-0.6%，以体积比计。
8.如权利要求4所述的改善焦虑抑郁的菌剂的制备方法，其特征在于，所述种子罐培养的接种量为0.3%-0.4%，以体积比计。
9.如权利要求4所述的改善焦虑抑郁的菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵的接种量为0.3%-0.4%，以体积比计。
10.如权利要求4所述的改善焦虑抑郁的菌剂的制备方法，其特征在于，所述离心的转速为10000 r/min -12000r/min。
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