CN107354167A - 高效降解油脂功能基因载体及其构建和应用 - Google Patents

高效降解油脂功能基因载体及其构建和应用 Download PDF

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Abstract

高效降解油脂功能基因载体及其构建和应用涉及基因工程技术领域。基因载体pMAL‑p5X‑lipase为包含有蜡状芽孢杆菌脂肪酶基因lipase的pMAL质粒。其构建过程是通过设计引物扩增蜡状芽孢杆菌中脂肪酶基因lipase片段，并用重组酶将其连接到malE基因下游，进行基因测序，验证基因的完整性。将pMAL‑p5X‑lipase质粒转化到细菌中，在加入油的试管中测定此细菌降解脂肪能力。pMAL载体用于pMAL蛋白融合表达和纯化***，含有Ptac强启动子、MBP起始翻译信号及多克隆位点，能够将目的基因与malE基因(编码MBP蛋白)融合表达。pMAL‑p5X载体含有malE信号肽序列，它将引导融合蛋白穿越质膜，能够以大肠杆菌为宿主菌进行基因表达。

Description

高效降解油脂功能基因载体及其构建和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种高效降解油脂功能基因载体 pMAL-p5X-lipase及其构建和应用。
背景技术
脂肪酶广泛存在于动植物与微生物当中。由于微生物脂肪酶具有种类多、比动物脂肪酶具有更广的作用pH和作用温度范围、便于进行工业生产和获取高纯度制剂等优点而得到广泛应用，特别是在油脂化工和有机合成工业中，酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点。因此微生物脂肪酶已经成为生产脂肪酶的主要来源，关于微生物脂肪酶在工业上的生产也越来越多。然而，在实际应用中存在着酶成本高，活性低，稳定性低等问题，筛选和开发具有新型催化活性和高稳定性的微生物脂肪酶成为当前亟待解决的主要问题，基因工程技术为该问题的解决及该酶的应用改造提供了平台。
发明内容
本发明的目的是提供一个高效降解油脂功能基因载体pMAL-p5X-lipase，及其构建方法。其能够应用于大肠杆菌BL21等菌株中，使细菌降解油脂的效率明显提高。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种高效降解油脂功能基因载体pMAL-p5X-lipase，其为包含有蜡状芽孢杆菌的脂肪酶酶基因lipase的pMAL-p5X质粒。
本发明还提供了高效降解脂肪功能基因载体pMAL-p5X的构建方法，主要通过使用clone smarter technologiesTM试剂盒Seamless Assembly Cloning Kit完成重组反应，其原理如下所图3：
(说明：选用Seamless Assembly Cloning Kit试剂盒的方法将载体pMAL-p5X与脂肪酶基因lipase进行重组构建新的质粒的方法也为本发明的创新，该方法不同于以往采用T4连接酶连接基因片段与载体，可以避免在基因片段中间如果含有酶切位点则会被从中间切断的风险。而且此方法操作简便，省去双酶切、连接等步骤，简化了操作过程。例如，在本例中，外源基因连接到pMAL-p5X载体的位点选择的是NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点，而克隆的脂肪酶基因lipase内部也有NdeⅠ酶切位点，如果用传统的酶切、连接方法，无法将完整的脂肪酶基因lipase克隆到载体上。)
具体操作过程包括以下步骤：(1)线性化载体制备：将pMAL-p5X用NdeⅠ和 EcoRⅠ双酶切获得线性化载体。
(2)脂肪酶DNA片段制备：提取蜡状芽孢杆菌的基因组DNA作为模板。设计蜡状芽孢杆菌中脂肪酶基因lipase的引物(带有载体上***位点的同源序列)，PCR扩增脂肪酶基因lipase。
(3)重组反应：通过加入重组酶，将准备好的线性化载体和lipase基因片段连接起来，得到重组载体。
(4)转化：将构建好的重组载体转入感受态大肠杆菌DH5α中。
(5)阳性重组子的鉴定：挑取克隆菌，进行菌落PCR鉴定，确定重组子后，再提取质粒、测序。
本发明还提供高效降解脂肪功能基因载体pMAL-p5X-lipase的应用：将 pMAL-p5X-lipase质粒转化到大肠杆菌BL21中，在加入油的试管中培养此大肠杆菌降解油脂。
本发明中蜡状芽孢杆菌从普如汀生物技术北京有限公司购入。经鉴定，和蜡状芽孢杆菌NC7401株最为接近。
本发明的有益效果是pMAL-p5X-lipase能够应用于大肠杆菌中，能使降解油脂的细菌的降解效率明显提高，消耗同样的培养基能产生的脂肪酶活力值更高。能够改良现有工业降解油脂的大肠杆菌。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明：
图1是载体pMAL-p5X-lipase的构建方案示意图及其western-blot检测结果； a.重组质粒pMAL-p5X-lipase b.Western blot结果 (70kd的条带符合MBP-liapse融合蛋白，约42kD的条带符合MBP蛋白)
图2是pMAL-p5X-lipase质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中的脂肪酶活性曲线。图3是重组反应原理图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)在NCBI上查找关于蜡状芽胞杆菌脂肪酶的基因序列，再结合pMAL-p5X质粒序列，利用DNAMAN软件，设计出带有载体同源序列的脂肪酶基因的引物。将设计好的引物交给生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成。
设计出来的引物为：
Forward-Primer：ATCGAGGGAAGGATTTCACATATG CGTACTC CTTTATCCTT TGATAAA
Reverse-Primer：TATTTAATTA CCTGCAGGGA ATTCAAAATG AGAAGTCAGA CATGTTTT
(划线部分是载体上的同源序列。)
(2)根据设计好的引物，利用PCR技术扩增脂肪酶基因lipase片段。PCR条件设置：变性95℃30s，复性58℃30s，延伸72℃1分钟，30个循环；50μL体系：25μL 2*HiFi-PCRMaster，22μL ddH2O，1μLDNA模板，2μL上游引物(10μmol/L)，2μL下游引物(10μmol/L)。(即用PCR扩增试剂盒,上海生工)
(3)将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，并在凝胶成像仪下切割回收基因片段，最后将切割片段用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)回收，为35uL基因片段。
(4)将胶回收的片段送往基因测序公司测序，以验证扩增基因的正确性。
(5)使用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切pMAL-p5X载体。
琼脂糖凝胶电泳分离，并在凝胶成像仪下切割载体的线性化片段(约5700bp)，用胶回收试剂盒回收，获得线性化载体约30uL。
(6)从步骤(5)获得线性化的pMAL载体，步骤(3)获得lipase基因，经重组反应得到含有lipase基因片段的pMAL-p5X-lipase质粒10uL：①重组反应：1μL pMAL-p5X Vector，3μLlipase基因片段，1μL ddH2O,5μL Seamless Master Mix；②50℃反应15分钟；③转化：将连接好的质粒取5μL加入100μL的DH5α感受态中，冰中放置30分钟；④42℃水浴 30秒，再在冰中放置2分钟；⑤加入400μL LB培养基(不含抗生素)，37℃200rpm振荡培养60分钟；⑥将菌液200μL倒入含有氨苄的固体LB培养基37℃培养过夜；挑选单菌落放入 100mL含有氨苄的液体LB培养基扩大培养，最后用质粒提取试剂盒(OmegaBio-Tek,USA) 提取质粒。
(7)阳性重组子的鉴定(菌落PCR法)：①挑取大小中等的克隆菌至10μL无菌水中，充分混合，取1μL混合液作为PCR反应的模板：②可使用原来扩增lipase的引物进行菌落PCR③PCR反应条件：变性94℃30s，复性58℃30s，延伸72℃1分钟，30个循环；④取10μL PCR产物电泳鉴定；⑤确认重组子后，将剩下的9μL菌液转接到LB培养基(含氨苄抗生素)，37℃培养过夜；最后用质粒提取试剂盒(OmegaBio-Tek,USA)提取质粒。
(8)将(7)中的质粒在扩增后送往基因公司测序，以验证基因的完整性；
(9)将(8)中已验证后的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，利用GENMED细菌脂肪酶(LIPASE)活性比色法定量检测试剂盒检验其脂肪酶活性。该检测试剂是一种旨在通过底物三丁酸二巯基丙醇受到脂肪酶水解，释放出巯基基团，使用Ellman试剂，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心改良、成功实验证明的。其适用于各种细菌细胞裂解液样品脂肪酶的总活性检测。检测方法如下。
将含有质粒的大肠杆菌接种到LB培养基，37℃过夜培养，制备种子液。
将重组大肠杆菌种子液按1％v/v的量接种到含有10mL培养基(含有100μ g/mL氨苄、0.3％葡萄糖和0.03％V/V橄榄油)的培养瓶中发酵，发酵条件：①37℃，200rpm 培养到OD600nm＝0.6；②加入IPTG诱导剂至浓度为0.2mM，37℃培养。当加入IPTG后 2h提取1mL反应管中菌液样品，使用GENMED细菌脂肪酶(LIPASE)活性比色法定量检测试剂盒测定脂肪酶活性。相同培养(培养基不含氨苄及IPTG)及检测方法同时测定野生大肠杆菌BL21的脂肪酶活性，与重组菌进行对比。
重组菌与野生大肠杆菌BL21的脂肪酶活性对比如图2所示。脂肪酶活性实验效果显示，重组菌与野生大肠杆菌BL21的脂肪酶活性分别为101和56微摩尔DMPTB/分钟。重组菌的脂肪酶活性大幅提高。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
如图1，质粒能够表达MBP-lipase融合蛋白。
1 atgcgtactc ctttatcctt tgataaagat accgccatac tgttagcttc ttgttgtgag
61 ttaacatatg aacaatataa acaaaatggg atttttgaaa taccagatgg ttttcaatat
121 gtacaaggct ttcaaggaaa aaccattcaa acgacagaat ggttcggatt catactagaa
181tctgaggata ccgttattgt agcttttcgc gggacacaaa cagatacaga ctggattatc
241 gattcactcg ttaaccaaaa accatatcca tatgctttaa atagcggaaa tgtccataac
301 ggctttcttt ccatttatga atcttgccga gattctatta tggatatgct cgtatcgtta
361 ccagcccata agaaacttct tgcaaccggt catagcttag gcggcgcact cgctacacta
421 catatactcg atgcgcgtat aaacactgcc ttcgcacagt acggtctgta tacatttgcc
481 tccccaaaag tgggagatat tgcatttcgt aattattata aactacaagt agctagtagc
541 tttcgtttcg tcaacttatt tgatgtcgtt ccacttcttc ctcctcgaaa cataaatttt
601 aatgaccaag actgggaata tgcacacgtt catcacaaca tgacttttac aaaaaacaca
661 aaatctatta caaataatca tgccatgaca acatacaaaa catgtctgac ttctcatttt
721 taa

Claims (6)

1.高效脂肪酶功能基因载体pMAL-p5X-lipase，其特征在于，所述基因载体为包含有蜡状芽孢杆菌脂肪酶基因lipase的pMAL质粒。
2.根据权利要求1所述的高效降解油脂功能基因载体pMAL-p5X-lipase，其特征在于所述蜡状芽孢杆菌为蜡状芽孢杆菌NC7401株。
3.如权利要求1或2所述的高效降解油脂功能基因载体pMAL-p5X-lipase的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计蜡状芽孢杆菌脂肪酶基因lipase的引物，并扩增蜡状芽孢杆菌脂肪酶基因lipase；
(2)回收脂肪酶基因lipase的基因片段，进行测序验证扩增基因的完整性；
(3)使用限制性内切酶Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pMAL-p5X载体，切胶回收，获得线性化载体；
(4)加入重组酶，将准备好的线性化载体和lipase基因片段连接起来，得到含lipase基因片段的重组载体；所述lipase基因通过重组酶技术在酶切位点Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ之间***到线性化载体；
(5)将含lipase基因片段的重组载体，转化DH5α感受态细菌，构建pMAL-p5X-lipase载体。
4.根据权利要求3所述的高效降解脂肪功能基因载体pMAL-p5X-lipase的构建方法，其特征在于，pMAL-p5X-lipase质粒构建后测序，验证基因的完整性及读码框无误。
5.根据权利要求3所述的高效降解油脂功能基因载体pMAL-p5X-lipase的构建方法，其特征在于，步骤(1)中的引物为：Forward-Primer：ATCGAGGGAAGGATTTCACATATG CGTACTCCTTTATCCTT TGATAAA
Reverse-Primer：TATTTAATTA CCTGCAGGGA ATTCAAAATG AGAAGTCAGA CATGTTTT。
6.权利要求1或2所述的高效降解油脂功能基因载体pMAL-p5X-lipase的应用，其特征在于，将降解油脂功能基因载体pMAL-p5X-lipase转化到大肠杆菌中，在加入油的试管中培养此大肠杆菌，用于降解油脂。
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