CN117510646A - 一种双功能融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种双功能融合蛋白及其用途，所述双功能融合蛋白包括Fc片段，Fc片段一端连接有GLP1多肽或其类似物，另一端连接有APJ受体的配体，所述APJ受体的配体为Elabela多肽片段，GLP1多肽或其类似物和APJ受体的配体均通过连接肽与Fc片段连接。所述双功能融合蛋白在动物疾病模型中证实能有效降低糖尿病小鼠的血糖水平和体重，并且能提高心衰大鼠的心脏功能，因此具有显著的抗糖尿病和抗心力衰竭作用，能在控制血糖的同时治疗糖尿病性心脏病。

Description

一种双功能融合蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种双功能融合蛋白及其用途。
背景技术
由于人口老龄化和生活方式的改变，糖尿病患病率正在逐渐增加。糖尿病分为1型(T1DM)和2型(T2DM)糖尿病，大多数患者是T2DM。根据国际糖尿病联合会糖尿病最近的估计，2021年的糖尿病患者人数超过5.37亿成年人，预计到2045年将达到7.83亿(1)。.糖尿病的流行给卫生***和社会带来了严重的经济负担。全球糖尿病治疗费用，在2021年为9660亿美元，预计到2045年将达到超过1万亿美元。糖尿病大大增加了糖尿病心脏病的风险。糖尿病性心脏病包括冠状动脉疾病(CAD)、心脏自主神经病变(CAN)和糖尿病性心肌病(DCM)，这些疾病的特征是心肌的分子、结构和功能变化和心脏功能障碍，最终会导致心力衰竭(HF)。在DM患者中，HF的患病率在9％至22％之间，比一般人群高4倍，在≥60岁的DM患者中患病率甚至更高。在糖尿病患者中，心功能不全在临床上通常是无症状的，并且经常直到疾病的后期才被发现。即使在无症状、血压正常的糖尿病控制良好的患者中，50％被认为表现出一定程度的心功能不全。人们普遍认为，糖尿病心脏的标志之一是左心室(LV)舒张功能障碍，还包括心脏纤维化、心脏肥大至冠状动脉微血管灌注障碍。导致糖尿病性心脏病的机制是多因素的，包括代谢紊乱、炎症、ROS/氧化应激、
另一方面，HF是新发T2DM发病机制的主要危险因素。在一包括射血分数降低的HF(HFrEF)和保留射血分数(HFpEF)的HF病人队列研究中糖尿病的发病为10％至47％.另外，高达60％的HF患者存在胰岛素抵抗，HF患者中糖尿病的发病率约为相近年龄人群的两倍以上。HF患者发生糖尿病的风险因素包括体重指数和腰围升高、吸烟史、血糖或HbA1c升高、收缩压升高、HF持续时间较长、利尿剂治疗和心脏功能衰竭程度。糖尿病性心肌病HF患者的死亡率高于单独患有糖尿病或HF的患者。因此，糖尿病性心脏病患者是一个独特而庞大的患者群体，需要专门的治疗对策和医疗护理。
胰高血糖素样肽(Glucagon-like peptide)，包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和胰高血糖素样肽-2(GLP-2)，二者均来源于胰高血糖素原(Proglucagon)，胰高血糖素原由158个氨基酸组成，可被切割成不同的肽链。因为GLP-1具有促进胰岛素分泌，保护胰岛β细胞，抑制胰高血糖素分泌，抑制胃排空，降低食欲的药理作用，临床可用于二型糖尿病和肥胖症的治疗。然而，GLP1不能直接用作药物，因为它被DPP4切割并在体内迅速降解。原生GLP-1的半衰期非常短，约为1-2分钟，由两个原因引起：(a)二肽基肽酶-4(DPP-4)的降解作用和(b)肾脏消除。完整的以及降解灭活的GLP-1代谢物通过肾脏迅速从循环中清除。制药公司通过改变GLP1的氨基酸序列位点和结构制成GLP1类似物,这种类似物保留GLP1生理功能,但半衰期显著延长,可以用于临床用途。目前由已有多个GLP1类似物上市。GLP1类似物通过激活GLP1受体来抗糖尿病。
Apelin受体(Apelin receptor，APJ)是一种G蛋白偶联受体，其内源性配体包括Elabela(ELA)和Apelin，其中Elabela是近年来发现的一种新型APJ配体肽，在心血管发育和心血管疾病中起着关键作用。作为一种新的激素肽，Elabela通过激活APJ受体呈现心脏保护活性,Elabela替代治疗可能成为治疗心脏病的有效方法。此外，Elabela可以促进人胚胎干细胞分化，并且增强心肌收缩力，促进心肌细胞的形成，增加心脏收缩能力。Elabela广泛表达于肾脏和血管内皮细胞中并且显著改善多种肺动脉高压模型，提示Elabela替代治疗其可能在高血压的治疗中具有一定的前景。Elabela是一个32个氨基酸的短肽可以被降解为ELA21,ELA14,ELA11。这些降解片段都具有生理活性.ELA 21的体内半衰期为13分钟但与IgG-Fc融合以后的体内半衰期为44个小时,该融合蛋白有显著的抗心力衰竭、肾脏保护作用、和抗炎症作用。
发明内容
现在技术上还没有一种分子能够同时激活GLP1受体和APJ其受体用于治疗糖尿病性心脏病。鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种双功能融合蛋白及其用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种双功能融合蛋白，所述双功能融合蛋白包括Fc片段，Fc片段一端连接有GLP1多肽或其类似物，另一端连接有APJ受体的配体，所述APJ受体的配体为Elabela多肽片段。所述双功能融合蛋白能激活GLP1R和APJ受体，将GLP1-Elabela双功能融合蛋白命名为ACF210。
在本发明的某些实施方式中，GLP1多肽或其类似物和APJ受体的配体通过连接肽(linker)与Fc片段连接。
在本发明的某些实施方式中，Fc片段选自IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的Fc片段。
所述GLP1类似物选自贝那鲁肽、艾塞那肽、利拉鲁肽、利西那肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽或索马鲁肽。
在本发明的某些实施方式中，所述Elabela多肽片段选自Elabela-21、Elabela-14、或Elabela-11。
所述双功能融合蛋白还包括信号肽，所述信号肽与GLP1多肽或其类似物连接。
本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码所述双功能融合蛋白。
本发明还提供一种表达载体，所述表达载体含有上述的核酸分子。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的表达载体。
本发明还提供一种双功能融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
a)在表达条件下，培养如上所述宿主细胞，从而表达双功能融合蛋白；
b)分离并纯化步骤a)所述的双功能融合蛋白。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的上述的双功能融合蛋白和一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
本发明还提供上述的双功能融合蛋白、药物组合物在制备预防、治疗糖尿病、肥胖症、肾功能损害和/或心血管疾病药物中的用途。
本发明还提供所述双功能融合蛋白或药物组合物在制备具有以下任一种或多种功能的产品中的用途：
1)激活GLP1受体；
2)活化APJ受体；
3)降低血糖；
4)减少尿量；
5)减少尿葡萄糖；
6)减少尿蛋白；
7)降低食物摄入量；
8)降低体重；
9)提高心脏射血分数或心脏缩短分数；
10)降低血液中BNP或TnT含量。
如上所述，本发明的双功能融合蛋白及其用途，具有以下有益效果：ACF210融合蛋白在动物疾病模型中证实能有效降低糖尿病小鼠的血糖水平和体重，并且能提高心衰大鼠的心脏功能，缩小心脏梗死的面积，因此具有显著的抗糖尿病和抗心力衰竭作用，能在控制血糖的同时治疗糖尿病性心脏病。
附图说明
图1显示为本发明的ACF210融合蛋白结构示意图。
图2显示为ACF210、Fc-ELA21和Trulicity的剂量-效应反应曲线。
图3显示为本发明的ACF210给药db/db小鼠模型后空腹血糖数据，Vehicle为溶剂对照，ACF210为ELA21-Fc-GLP1融合蛋白，数据为平均值+s.e.
图4显示为本发明的ACF210给药后糖尿病小鼠尿容量、尿中葡萄糖和蛋白质的***结果。
图5显示为本发明的ACF210对糖尿病小鼠食物摄入量和体重的影响。
图6显示为本发明的ACF210对大鼠心肌梗死模型中心脏射血分数(EF)和心脏缩短分数(FS)的影响。
图7显示为本发明的ACF210对大鼠心肌梗死模型中心脏损伤和心力衰竭血清标志物的影响。
具体实施方式
本发明提供一种双功能融合蛋白，所述双功能融合蛋白包括Fc片段，Fc片段一端连接有GLP1多肽或其类似物，另一端连接有APJ受体的配体，所述APJ受体的配体为Elabela多肽片段。所述双功能融合蛋白能激活GLP1R和APJ受体，本发明中将Fc片段一端连接有GLP1多肽或其类似物，另一端连接有Elabela多肽片段的GLP1-Elabela双功能融合蛋白命名为ACF210。
在本发明的某些实施方式中，所述Fc片段N末端连接有GLP1多肽或其类似物，C末端连接有APJ受体的配体。
在本发明的某些实施方式中，GLP1多肽或其类似物和APJ受体的配体通过连接肽(linker)与Fc片段连接。术语“连接肽(连接子)”是指可以连接两个多肽序列的短肽，一般是长度为2-30个氨基酸的肽。所述连接肽可以是本领域中各种适用于形成多肽的连接肽，例如，所述连接肽可以是(G4S)3linker。在一种实施方式中，所述GLP1多肽或其类似物通过第一连接肽(linker1)与Fc片段连接，第一连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：GGGGGGGSGGGGSGGGGSA在另一种实施方式中，所述APJ受体的配体通过第二连接肽(linker2)与Fc片段连接，第二连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：GGGGGSGGGGSGGGGS。
在本发明的某些实施方式中，Fc片段选自IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的Fc片段。所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一种实施方式中，所述Fc片段选自IgG4的Fc片段，Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO.3)
所述GLP1类似物选自贝那鲁肽、艾塞那肽、利拉鲁肽、利西那肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽或索马鲁肽。
在一种实施方式中，所述GLP1类似物选自杜拉鲁肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVK。
人类Elabela基因位于4号染色体GRCh38.p12，含有3个外显子，该基因编码的前体蛋白由54个氨基酸组成，后经高尔基体剪切形成32个氨基酸的成熟多肽。Elabela蛋白含有2个双精氨酸序列，该结构可被弗林蛋白酶识别和切割进而将Elabela-32蛋白切割成大小不等的Elabela多肽片段。根据氨基酸个数的长短来命名不同长度的多肽片段，分别为：Elabela-32(即Ela32)、Elabela-21(即Ela21)、Elabela-14(即Ela14)、Elabela-11(即Ela11)。
在本发明的某些实施方式中，所述Elabela多肽片段选自Elabela-21、Elabela-14或Elabela-11。在一种实施方式中，所述Elabela多肽片段选自Elabela-21，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：LRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP。
所述双功能融合蛋白还包括信号肽，所述信号肽与GLP1多肽或其类似物连接。
如本文所用，术语“信号肽”是指在蛋白质一端存在的可使蛋白质靶向分泌途径的肽。在mRNA的翻译之后，信号肽在易位之后裂解成内质网。信号肽还被称为信号序列、前导序列或前导肽。通常，信号肽是较短(例如，5-30、5-25、5-20、5-15或5-10个氨基酸长)肽。信号肽可存在于蛋白质的N-末端。在融合蛋白上并入信号肽可促进蛋白质的分泌和/或产生。
用于本发明的适合的信号肽可以是源自不同真核和原核蛋白质、具体地说分泌的蛋白质的异质序列。在一些实施方案中，适合的信号肽是富含亮氨酸的序列。适合的信号肽可源自人生长激素(hGH)、免疫球蛋白重链、血清白蛋白前蛋白原、Igκ轻链前体、天青杀素前蛋白原、半胱氨酸蛋白酶抑素S前体、胰蛋白酶原2前体、钾通道阻断剂、α-芋螺毒素lp1.3、α-芋螺毒素、α-半乳糖苷酶、纤维素、天冬氨酸蛋白酶猪笼草蛋白酶(nepenthesin)-1、酸性壳多糖酶、K28前原-毒素、杀伤毒素zygocin前体以及霍乱毒素。
在一种实施方式中，所述信号肽的序列如SEQ ID NO.6所示：MGWSCIILFLVATATGVHS。
在一种实施方式中，所述双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在糖尿病和心力衰竭动物模型中，所述双功能融合蛋白表现出显著的抗糖尿病活性和心脏保护活性。
本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码所述双功能融合蛋白。
所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本领域技术人员知晓，编码上述融合蛋白氨基酸序列的核酸分子可以适当引入替换、缺失、改变、***或增加来提供一个核酸分子的同系物。
本发明还提供一种表达载体，所述表达载体含有上述的核酸分子。
本发明中，术语“表达载体”是指包含适当的调控序列，例如启动子、终止子、增强子等的本领域的常规表达载体，所述表达载体可以是病毒或质粒。所述表达载体例如为、pcDNA3.1(+)、pDHFR或pTT5。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的表达载体。
本发明中，术语“宿主细胞”为本领域常规的各种宿主细胞，只要能使载体稳定地自行复制，且所携带的核酸分子可被有效表达即可。其中所述宿主细胞选自原核表达细胞或真核表达细胞。所述宿主细胞例如选自：COS、CHO、CHO-K1、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)、TG1、BL21(DE3)、293F细胞或293E细胞。
本发明还提供一种双功能融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
a)在表达条件下，培养如上所述宿主细胞，从而表达双功能融合蛋白；
b)分离并纯化步骤a)所述的双功能融合蛋白。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的上述的双功能融合蛋白和一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
本发明中，术语“有效量”是指本发明的药物组合物施用患者后，在治疗的个体中产生预期效果的量或剂量，该预期效果包括个体病症的改善。
“药学上可接受的”是指当分子本体或药物组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中，除非特别说明，药物组合物的剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
本发明还提供上述的双功能融合蛋白、药物组合物在制备预防、治疗糖尿病、肥胖症、肾功能损害和/或心血管疾病药物中的用途。
所述心血管疾病选自心力衰竭、心肌病、冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)、心律失常。所述心力衰竭包括急性或者慢性心力衰竭、射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)、射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)。
在一较佳实施方式中，所述心血管疾病为糖尿病性心脏病，即糖尿病患者所并发或伴发的心脏病。所述糖尿病性心脏病包括冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病性心肌病、心律失常、糖尿病性心力衰竭。
本发明还提供所述双功能融合蛋白或药物组合物在制备具有以下任一种或多种功能的产品中的用途：
1)激活GLP1受体；
2)活化APJ受体；
3)降低血糖；
4)减少尿量；
5)减少尿葡萄糖；
6)减少尿蛋白；
7)降低食物摄入量；
8)降低体重；
9)提高心脏射血分数或心脏缩短分数；
10)降低血液中BNP或TnT含量。
本发明还提供一种治疗糖尿病、肥胖症、肾功能损害和/或心血管疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的所述双功能融合蛋白或药物组合物。
“受试者”包括但不限于动物，优选为哺乳动物；所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述哺乳动物包括例如人、非人灵长类动物(例如猴)、小鼠、猪、牛、山羊、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、马、猴、绵羊或其他非人哺乳动物；非哺乳动物，包括例如非哺乳动物脊椎动物，例如鸟(例如鸡或鸭)或鱼，以及非哺乳动物无脊椎动物。
对某种状态的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻某种状态，降低某种状态发生或发展的速度，减少发展出某种状态的风险，预防或延迟与某种状态相关的症状发展，减少或终止与某种状态相关的症状，产生某种状态的完全或部分的逆转，治愈某种状态，或以上的组合。
本发明中的“治疗有效量”或“有效剂量”是指，某种药物有效治疗相关疾病或减轻疾病状态的剂量或浓度。例如，对于本发明中公开的双功能融合蛋白来说，治疗有效量是在该剂量或浓度下，该双功能融合蛋白可以是激活GLP1受体、活化APJ受体、降低血糖、减少尿量、减少尿葡萄糖、减少尿蛋白、降低食物摄入量、降低体重、提高心脏射血分数或心脏缩短分数、降低血液中BNP或TnT含量或减轻任何与糖尿病、肥胖症、肾功能损害、心血管疾病相关的症状或标记，预防或延缓糖尿病、肥胖症、肾功能损害和/或心血管疾病的发展，或以上的某些组合。
具体的，在向受试者施用时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。
在一些实施方式中，本文描述的方法可以进一步联合给予一种或多种另外的疗法(例如，一种或多种另外的治疗剂和/或一种或多种治疗方案)。
在一些实施方式中，施用方式例如为皮下注射、静脉注射、口服、呼吸吸入等途径。
在一些实施方式中，施用频率可以每天一次、2天一次、一周一次、一个月一次或几个月一次等。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1 GLP1-Elabela双功能融合蛋白ACF210的设计及制备
1.ACF210的设计
图1为ACF210的结构示意图，如图所示，免疫球蛋白IgG的Fc片段为结构骨架，GLP1多肽类似物和Elabela(简称ELA)多肽片段分别位于Fc的N-末端和C-末端，GLP1或ELA与Fc骨架之间各自设计了一段连接区段(linker)，分泌信号肽位于整个融合蛋白的N-端。整个ACF210融合蛋白的组成，从N端开始，依次是分泌信号肽、GLP1类似物、第一连接肽(GGGGGGGSGGGGSGGGGSA)、IgG4-Fc片段、第二连接肽(GGGGGSGGGGSGGGGS)、ELA21肽片段，其中ELA21肽片段为Elabela家族的一个多肽。所述融合蛋白ACF210的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，不同的下划线依次代表融合蛋白中分泌信号肽、GLP1类似物、第一连接肽、IgG4-Fc片段、第二连接肽、ELA21肽片段的氨基酸序列；所述融合蛋白ACF210的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。
ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTGGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATAGCCATGGCGAAGGTACATTTACCTCTGACGTATCTTCGTACCTCGAAGAGCAGGCAGCTAAGGAGTTCATTGCATGGCTGGTCAAAGGTGGCGGAGGCGGCGGAGGTTCAGGTGGAGGCGGATCTGGAGGCGGCGGTTCTGCCGAATCAAAATACGGTCCACCTTGCCCACCATGCCCTGCTCCTGAGTTCCTTGGCGGCCCTAGCGTCTTCCTGTTCCCACCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTCGTAGTAGATGTTAGTCAGGAGGACCCCGAAGTCCAATTTAATTGGTACGTGGACGGTGTCGAGGTGCATAATGCCAAGACTAAACCTCGAGAGGAACAGTTCAATAGCACATACCGCGTGGTATCAGTGTTGACCGTCCTCCACCAAGACTGGTTGAACGGAAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGACTGCCATCATCTATCGAGAAAACTATCTCCAAGGCTAAAGGTCAGCCTAGGGAGCCCCAGGTTTACACCCTGCCTCCCTCGCAAGAAGAGATGACTAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGCCTGGTCAAAGGATTTTACCCATCTGACATTGCTGTTGAATGGGAAAGTAACGGACAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACACCACCTGTACTGGATTCCGACGGCAGTTTCTTCCTGTATTCACGACTGACCGTTGACAAATCACGTTGGCAAGAGGGCAACGTCTTCTCCTGTAGCGTGATGCATGAGGCACTGCACAACCACTACACCCAAAAATCCTTGTCCCTGTCACTCGGTGGAGGTGGTGGCTCCGGCGGCGGTGGATCTGGCGGTGGCGGCAGTCTCCGTAAACACAACTGCCTGCAACGCCGTTGCATGCCATTGCATAGCCGAGTGCCTTTTCCCTAATAG(SEQ ID NO.8)
2.融合蛋白ACF210的制备
融合蛋白ACF210的制备为现有技术，本申请中融合蛋白ACF210委托第三方机构药明生物完成，示例的制备过程如下：ACF210融合蛋白分子的DNA序列通过DNA分子克隆技术被克隆进pcDNATM3.1(+)(V79020,ThermoFisher)哺乳动物基因表达质粒中，克隆后通过测序验证序列的准确性。序列正确后进行大规模的表达质粒制备，获得足够的质粒DNA。将质粒用聚乙烯亚胺(PEI)转染CHO-K1细胞，在CHO-K1细胞中进行融合蛋白的大量表达，扩大培养至3L后进行重组蛋白的瞬时表达。在培养第11天时收取培养上清液，上清液中蛋白浓度为1.2g/L。上清液通过以10，000×g离心澄清40分钟，并通过0.45μm和0.22μm过滤器无菌过滤。过滤液用Protein A亲和层析(MabSelect SuRe resin,GE Healthcare Life Science)和SEC-HPLC纯化。将SEC洗脱液与50mM His，125mM Arg，pH5.5缓冲液交换缓冲液以获得最终产物，检测纯度超过98％。获得的融合蛋白用于体外和体内实验或治疗。
实施例2体外GLP-1R受体和APJ受体激活实验验证ACF210融合蛋白具备GLP1和Elabela双重功能
为了验证按照ACF210融合蛋白具有激活GLP1R和APJR的双重活性，首先在体外把ACF210(GLP1-Fc-ELA21)与单药融合蛋白Fc-ELA21和Trulicity(GLP1-Fc)进行体外生物学活性比较。Trulicity是Eli Lilly制药公司的一款业已上市的融合蛋白药品，是GLP-1多肽类似物与Fc片段的融合蛋白。Trulicity是GLP1R的激动剂，Trulicity通过与GLP1R受体结合后导致腺苷酸环化酶的活化，该酶的活化提高细胞内cAMP含量。Fc-ELA21也是一融合蛋白，是ELA21多肽与Fc片段的融合蛋白。ELA21多肽属于Elabela家族，是APJ受体的激动剂，APJ受体活化后可以抑制腺苷酸环化酶的活性，从而降低cAMP水平，所以可以用检测细胞内cAMP浓度来分析不同受体被激活的状态。
ACTOne终点测定(BD Biosciences)法是检测细胞内cAMP含量的常用检测方法。检测用的工具细胞HEK-293细胞在稳定表达环状核苷酸门控(CNG)通道蛋白基础之上同时表达GLP1R受体，或APJ受体，在不同的融合蛋白作用下，HEK-293细胞内的cAMP含量会发生相应的改变。
首先将HEK293细胞在37℃、5％CO2、含有10％热灭活胎牛血清和1μg/mL嘌呤霉素Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)中培养。细胞通过温和胰蛋白酶消化收获并以每孔50,000个细胞的密度接种在聚-D-赖氨酸包被的96孔细胞培养板(BD生物涂层)中培养过夜。第二天，将BD ACTOne膜电位染料加入每个孔中，并将板在室温下保存2小时。实验时，首先将细胞与DPBS或不同浓度的配体孵育60分钟。使用Ft/F0的比率绘制剂量反应曲线(Ft表示激动剂加入后60分钟的荧光强度，F0表示化合物添加前的荧光强度)。然后通过剂量反应曲线计算EC50值，即引起50％最大效应的浓度值，来表示GLP1-Fc,Fc-ELA和ACF210的受体激活活性，各种试剂的剂量-效应反应曲线如图2所示。结果显示ACF210对APJ受体的激活和阳性对照Fc-ELA21类似，ACF210激活GLP1R的活性与阳性对照Trulicity相当；具体数值如表1，可以看出Fc-ELA只能激活APJ受体，Trulicity只能激活GLP1受体，而ACF210具有双重活性，既能激活GLP1R，也可以活化APJ受体。
表1 ACF210融合蛋白激活GLP-1R受体和APJ受体的活性
融合蛋白 GLP1受体(EC50) APJ受体(EC50)
Fc-ELA21 No activity 148.5μg/ml
GLP-Fc/Trulicity 1.6μg/ml No activity
GLP1-Fc-ELA21/ACF210 2.8μg/ml 75.47μg/ml
实施例3 ACF210在db/db小鼠模型的体内药效学验证
动物实验方案得到IACUC委员会批准。db/db小鼠是糖尿病研究中常用的动物模型，因此用来进行ACF210的体内药效学研究。动物实验步骤如下：
(1)db/db mice 5周龄适应环境一周，平均非禁食血糖超过16.7mmol/L可以开始实验。
(2)Day-6到Day-5：20只动物放入代谢笼中，小鼠在笼内可以自由走动获取食物和饮水，收集24小时尿液，检测尿糖及尿微量白蛋白。
(3)Day-3：测定20只动物的体重，动物禁食6小时后血糖(动物禁食时，同时换笼)，下颌采血110μL，收集血浆(EDTA抗凝,7000rpm,4℃,10min)，储存在-80℃，血糖仪检测血糖(血糖将进行连续两次检查，若两次检测结果差值大于10％，将进行第三次检测，最后结果取检测平均值)。
(4)Day-1：动物按照体重、禁食血糖、尿糖、尿微量白蛋白随机分成4组，每组10只，数值相对偏高或偏低的动物不参与之后的实验。
(5)给药：从Day 1到Day 29，每隔一天给一次药，首次给药在Day 1，末次给药在Day29，皮下给药，给药体积是5mL/kg，给药位置从颈背部皮肤到臀部皮肤，连续两次给药的位置不同。
(6)Day 1和Day 29：动物早上换笼，禁食，禁食6小时后，检测动物给药前0min的血糖，以及给药后30min,1hr,2hr,3hr和6hr血糖，血糖仪检测血糖。
(7)Day1,8,16,24：检测动物的体重和耗食量。
(8)Day 8,16,24：动物早上禁食换笼，禁食6小时后，血糖仪检测血糖(所有血糖检测环境将在相同的情况下进行)。
(9)Day 26到Day 27：称重和称耗食量后，动物放入代谢笼中，小鼠在笼内可以自由走动获取食物和饮水，收集24小时尿液，检测尿糖及尿微量白蛋白。实验过程中未见药物有明显毒副作用。无动物死亡发生。
实验结果如下：
1.ACF210在体内疾病动物模型db/db小鼠降低血糖作用
如图3所示，所有实验动物的初始平均血糖浓度为440mg/dL，在实验期给药处理的29天中，给予ACF210处理的小鼠的血糖相对维持在实验初始的水平，与未受处理的对照小鼠的血糖水平有显著性差别，说明ACF210在db/db小鼠模型有显著的抗高血糖作用。
2.ACF210改善糖尿病小鼠肾功能
如图4所示，ACF210在db/db小鼠具有减少尿量、减少尿葡萄糖、减少尿蛋白作用。说明ACF210在维护肾小球滤过率的同时，显著降低尿糖和尿蛋白，肾小球的滤过功能得到明显的保护。
3.ACF210抑制食欲降低体重作用。
GLP1正常情况下能作用于胃肠道控制能量摄入，可以延长食物在胃里的储留时间，抑制食欲，从而降低体重。
如图5所示，AFC210显著抑制食物摄入(左)并减少体重(右)。这些作用说明ACF210中GLP1的作用得到充分发挥。
实施例4 ACF210在心肌梗死大鼠模型的体内药效学验证
通过冠状动脉左前降支结扎手术制造心肌梗塞模型，具体步骤如下：6周龄SD大鼠在麻醉状态下接受冠状动脉左前降支结扎手术制造心肌梗塞模型。将大鼠置于手术台上并用异氟醚麻醉(吸入2％)，胸部打开后，将心脏掏出胸腔，找到左前降支LAD冠状动脉用5/0丝缝线结扎，然后放回心脏，去除空气和血液后关闭胸腔。以心电图ST段上升T波倒置确认手术成功。
1.心脏输出分数和心脏收缩分数的检测
术后1周大鼠随机分为ACF210(1mg/kg/day)和vehicle组治疗。心动超声测量动物在治疗前和治疗后每周进行心动超声测量。用M导联直接测定左心室内径舒张期(LVIDd)和收缩期内径(LDIDs)和左心室射血分数(LVEF)。心缩分数(FS)由如下公式计算FS＝(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100％。
结果如图6所示，对照组动物LVEF和FS指数手术后显著下降，并在以后的几周内维持在低水平，表明动物心力衰竭。接受ACF210治疗的大鼠心脏功能都维持在接近正常的水平，表明ACF210在大鼠心肌梗死模型中能减轻心衰程度，ACF210有显著的抗心力衰竭作用。
2.心脏和心力衰竭标志物的检测
术后1周大鼠随机分为ACF210(1mg/kg/day)和vehicle组治疗。在ACF210或溶媒治疗前，治疗期间每周收集大鼠血清。用ELISA测定心脏和心力衰竭标志物BNP(rat BNPELISA kit,MSKbio,China)、损伤标志物TnT(Rat Tn-T ELISA kt,mlbio,China).
结果如图7所示，在心肌梗塞后对照组大鼠BNP和TnT浓度逐渐增加，ACF210治疗组虽然也有所升高，但升高幅度显著减少，说明ACF210有治疗心力衰竭作用和心脏损伤保护作用。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (17)

1.一种双功能融合蛋白，其特征在于，所述双功能融合蛋白包括Fc片段，Fc片段一端连接有GLP1多肽或其类似物，另一端连接有APJ受体的配体，所述APJ受体的配体为Elabela多肽片段。
2.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述APJ受体的配体为apelin，和/或，所述Fc片段N末端连接有GLP1多肽或其类似物，C末端连接有APJ受体的配体。
3.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，GLP1多肽或其类似物和APJ受体的配体均通过连接肽与Fc片段连接；优选的，所述GLP1多肽或其类似物通过第一连接肽与Fc片段连接，第一连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述APJ受体的配体通过第二连接肽与Fc片段连接，第二连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述Fc片段选自IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的Fc片段；优选的，所述Fc片段选自IgG4的Fc片段；优选的，Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述GLP1类似物选自贝那鲁肽、艾塞那肽、利拉鲁肽、利西那肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽或索马鲁肽；优选的，所述GLP1类似物选自杜拉鲁肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述Elabela多肽片段选自Elabela-21、Elabela-14或Elabela-11；优选的，所述Elabela多肽片段选自Elabela-21，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
7.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述双功能融合蛋白还包括信号肽，所述信号肽与GLP1多肽或其类似物连接；优选的，所述信号肽的序列如SEQ ID NO.6所示。
8.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
9.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-8任一所述的双功能融合蛋白。
10.根据权利要求9所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。
11.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求9或10所述的核酸分子。
12.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求11所述的表达载体。
13.权利要求1-8任一所述的双功能融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
a)在表达条件下，培养如权利要求12所述的宿主细胞，从而表达双功能融合蛋白；
b)分离并纯化步骤a)所述的双功能融合蛋白。
14.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-8任一所述的双功能融合蛋白和药学上可接受的载体或辅料。
15.权利要求1-8任一所述的双功能融合蛋白、权利要求14所述的药物组合物在制备预防、治疗糖尿病、肥胖症、肾功能损害和/或心血管疾病药物中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病选自心力衰竭、、冠心病、心肌病、心律失常。
17.权利要求1-8任一所述的双功能融合蛋白或权利要求14所述的药物组合物在制备具有以下任一种或多种功能的产品中的用途：
1)激活GLP1受体；
2)活化APJ受体；
3)降低血糖；
4)减少尿量；
5)减少尿葡萄糖；
6)减少尿蛋白；
7)降低食物摄入量；
8)降低体重；
9)提高心脏射血分数或心脏缩短分数；
10)降低血液中BNP或TnT含量。
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