RU2741345C2

RU2741345C2 - Белки с двойной функцией и содержащая их фармацевтическая композиция

Info

Publication number: RU2741345C2
Application number: RU2018118025A
Authority: RU
Inventors: Дзун Хван КИМ; Сеиоунг ЛИМ; Миндзи СЕО; Хиун Хо ЧОИ; ДоХун КИМ; Ми Киеонг ДЗУ; Дзу-Йоунг ПАРК; Сеул Ги КИМ; Сангмиоун ЛИМ; Дзонг Гиун КИМ; Су Йоун НАМ
Original assignee: Юхан Корпорейшн
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2021-01-25
Also published as: CN116333160A; CA3003115A1; CN115925979A; BR112018008805A2; BR112018008805A8; RU2018118025A3; WO2017074123A1; RU2018118025A; ZA201802003B; KR20170049320A; HK1257373A1; AU2016346870A1; MX2018005193A; US20220002368A1; US11136364B2; US20200024318A1; JP2019500013A; AU2016346870B2; EP3368555A1; EP3368555A4

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам с двойной функцией на основе фактора роста фибробластов 21 (FGF21), и может быть использовано в медицине для лечения FGF21-ассоциированных расстройств. Слитый белок содержит мутантный FGF21, Fc-область иммуноглобулина и биологически активный белок, представляющий собой глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) или его мутант. В конструкции слитого белка мутантный белок FGF21 связан с областью Fc иммуноглобулина через линкер, где линкер представляет собой пептид, состоящий из 10-30 аминокислотных остатков, где линкер соединен с С-концом области Fc иммуноглобулина и N-концом мутантного белка FGF21. При этом слитый белок содержит последовательно соединенные с N-конца к C-концу биологически активный белок, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21. Также предложены нуклеиновая кислота, экспрессионный вектор и клетка-хозяин для получения указанного слитого белка рекомбинантным путем. Изобретение обеспечивает получение слитого белка на основе FGF21 и GLP-1, с улучшенными сроком действия in vivo, стабильностью и фармакологической эффективностью. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 10 табл., 11 пр., 21 ил.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к белку с двойной функцией, включающему биологически активный белок и мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21), и содержащей его фармацевтической композиции.

Предшествующий уровень техники

Глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) является инкретиновым гормоном, состоящим из 31 аминокислоты, секретируемым L-клетками в желудочно-кишечном тракте при стимуляции пищей и т.д. Его биологические эффекты являются результатом внутриклеточной передачи сигнала через рецептор GLP-1, сопряженный с G-белком рецептор, экспрессирующийся в тканях-мишенях, таких как β-клетки в поджелудочной железе, головной мозг и т.д. GLP-1, секретируемый в кровь, имеет очень короткое время полужизни менее 2 минут, что вызвано утратой активности по причине расщепления аминокислот на N-конце ферментом дипептидилпептидазой-4 (DPP-4). Т.к. GLP-1 стимулирует секрецию инсулина в β-клетках поджелудочной железы с учетом уровня глюкозы в крови, он обладает выраженным эффектом снижения уровня глюкозы в крови, не вызывая гипогликемию. Кроме того, введение GLP-1 приводит к потере массы тела в различных моделях на животных и людях, что, как известно, вызвано снижением потребления пищи по причине подавления аппетита. GLP-1 индуцирует пролиферацию β-клеток и повышает их жизнеспособность посредством ингибирования гибели клеток, вызванной токсичностью гликолипидов, с помощью рецептора GLP-1, экспрессирующегося в β-клетках поджелудочной железы. Избыточная секреция глюкагона повышает уровень глюкозы в крови, что, как известно, является одной из причин гипергликемии у диабетиков. Кроме того, известно, что GLP-1 действует на α-клетки поджелудочной железы, ингибируя повышение уровня глюкозы в крови натощак посредством ингибирования секреции протеинкиназа A (PKA)-специфичного глюкагона.

Экзендин-4 является клинически важным агонистом рецептора GLP-1. Экзендин-4 является полипептидом из 39 аминокислотных остатков и, как правило, продуцируется в слюнных железах ящерицы-ядозуба. Известно, что аминокислотная последовательность экзендина-4 имеет гомологию 52% с GLP-1 и взаимодействует с рецептором GLP-1 у млекопитающих (Thorens et al. (1993) Diabetes 42:1678-1682). Показано, что экзендин-4 стимулирует секрецию инсулина инсулин-продуцирующими клетками in vitro, и индукция высвобождения инсулина инсулин-продуцирующими клетками является более сильной, чем в случае GLP-1 в эквимолярных условиях. Хотя экзендин-4 сильно стимулирует секрецию инсулина со снижением уровней глюкозы в крови у грызунов и людей с периодом действия, большим, чем у GLP-1, экзендин-4 демонстрирует антигенность у млекопитающих, лишенных GLP-1, т.к. в случае таких животных он имеет неизвестные эпитопы.

Способность GLP-1 и аналогов экзендина-4 (например, лираглутида и Byetta) улучшать контроль глюкозы у людей подтверждена клинически. Сообщают, что GLP-1 повышает массу β-клеток посредством ингибирования апоптоза и индукции пролиферации. Кроме того, также сообщают, что GLP-1 действует как желудочно-кишечный гормон, ингибирующий секрецию кислоты желудочного сока и эвакуацию из желудка, одновременно повышая сигналы насыщения, таким образом, снижая аппетит. Такие эффекты GLP-1 могут объяснить потерю веса, наблюдаемую при введении аналогов GLP-1 пациентам с диабетом 2 типа. Кроме того, GLP-1 демонстрирует кардиопротективные эффекты после ишемии у грызунов.

Были предприняты различные попытки разработать аналоги GLP-1 длительного действия. Клинически подтвержденные аналоги GLP-1 длительного действия включают дулаглутид (WO 2005/000892) и албиглутид (WO 2003/059934). Дулаглутид является слитым с Fc аналогом GLP-1, и албиглутид является слитым с альбумином аналогом GLP-1, оба из них имеют фармакокинетические профили, позволяющие осуществлять введение раз в неделю. Оба лекарственных средства обладают исключительными эффектами снижения уровня глюкозы в крови и снижения массы тела при введении раз в неделю, а также гораздо более удобны в терминах лечения по сравнению с Byetta и лираглутидом.

При этом, фактор роста фибробластов 21 (FGF21), синтезируемый в печени, является гормоном, который, как известно, играет важную роль в гомеостазе глюкозы и липидов. FGF21 оказывает фармакологическое действие в печени, адипоцитах, β-клетках поджелудочной железы, гипоталамусе в головном мозге и мышечных тканях, где экспрессируются FGF21-специфичный рецептор, т.е. рецептор FGF, и комплекс β-klotho. Сообщают, что в моделях различных диабетических и метаболических заболеваний на не являющихся человеком приматах и мышах FGF21 может снижать уровни глюкозы в крови инсулин-зависимым образом, снижать массу тела и концентрации триглицеридов и липопротеинов низкой плотности (LDL) в крови. Кроме того, по причине эффекта улучшения чувствительности к инсулину FGF21 обладает потенциалом для разработки в качестве нового терапевтического средства от диабета и ожирения (см. WO2003/011213).

Таким образом, для разработки нового противодиабетического лекарственного средства на основе FGF21 предпринимали попытки улучшить его биологическую активность и стабильность in vivo, конструируя мутантов FGF21 на основе последовательности FGF21 дикого типа посредством замены, инсерции и делеции некоторых аминокислот (см. WO2010/065439). Однако, т.к. FGF21 имеет очень короткое время полужизни, трудно использовать его напрямую в качестве биотерапевтического средства (Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635). Время полужизни FGF21 in vivo составляет от 1 до 2 часов у мышей и от 2,5 до 3 часов у обезьян. Таким образом, для использования FGF21 в качестве терапевтического средства от диабета в его существующей форме необходимо ежедневное введение.

Сообщают о различных подходах в попытке повысить время полужизни рекомбинантных белков FGF21 in vivo. Одним таким примером является соединение полиэтиленгликоля (PEG), т.е. полимерного материала, с FGF21 для повышения его молекулярной массы и, таким образом, ингибирования почечной экскреции и повышения времени удержания in vivo (см. WO2012/066075). Другим подходом для улучшения времени полужизни является его слияние с жирной кислотой, связывающейся с альбумином человека (см. WO2012/010553). Дополнительным примером попыток повышения времени полужизни при сохранении фармакологической активности, эквивалентной активности FGF21 дикого типа, является получение антитела-агониста, специфически связывающегося с рецептором FGF человека в отдельности или в комплексе с β-klotho (см. WO2012/170438). В другом примере время полужизни улучшали, получая слитые белки длительного действия, в которых Fc-область IgG связывали с молекулой FGF21 (см. WO2013/188181).

Среди различных технологий, доступных для создания лекарственных средств длительного действия, широко используют технологию слияния с Fc, т.к. она обладает меньшим количеством недостатков, таких как индуцирование иммунного ответа или токсичность, чем другие подходы, при одновременном повышении времени полужизни in vivo. Для разработки Fc-слитого белка FGF21 в качестве терапевтического лекарственного средства длительного действия необходимо удовлетворить следующие условия.

Во-первых, необходимо минимизировать снижение активности in vitro, вызываемое слиянием. И N-конец, и C-конец FGF21 вносят свой вклад в активность FGF21. В связи с этим, известно, что активности слитых белков FGF21 в значительной степени варьируются в зависимости от локализации слияния. Таким образом, активности Fc-слитых белков FGF21, в которые встроены мутации FGF21, можно изменять в зависимости от наличия/отсутствия или локализации слияния. Во-вторых, фармакокинетический профиль, позволяющий осуществлять введение раз в неделю у людей, необходимо реализовывать посредством повышения времени полужизни in vivo с помощью слияния. В-третьих, учитывая, что после введения биофармацевтических средств можно ожидать иммуногенности у большинства пациентов, необходимо минимизировать риск иммуногенности из-за линкера для слияния или мутации. В-четвертых, не должно быть проблем со стабильностью, вызванных положением слияния или встраиванием мутации. В-пятых, в зависимости от изотипа слитого иммуноглобулина могут возникать нежелательные иммунные ответы, необходимо решение проблем с такими ответами.

Уже описана попытка разработать слитый белок длительного действия посредством соединения Fc-области иммуноглобулина G (IgG) с молекулой FGF21 (см. WO 2013/188181). Известно, что в случае структуры Fc-FGF21, в которой Fc слита с N-концом FGF21 дикого типа, но нет четких различий в активности in vitro по сравнению с FGF21 дикого типа, время полужизни будет очень коротким по причине деградации белка in vivo. Для решения этой проблемы предпринимались попытки улучшить время полужизни in vivo посредством встраивания мутаций в конкретные участки FGF21 для противодействия деградации белка. Однако при встраивании множества мутаций может повышаться риск иммуногенности. И наоборот, известно, что в случае структуры FGF21-Fc, в которой Fc слита с C-концом молекулы FGF21, наблюдают значительное снижение активности, вызванное слиянием в этом участке, по сравнению со структурой Fc-FGF21.

Комбинированное введение GLP-1 и FGF21 может обладать синергическим действием по сравнению с раздельным введением, зависящим от механизмов действия и тканей-мишеней в организме, и ожидают потенциально исключительную противодиабетическую эффективность и дополнительные преимущества. Эффекты комбинированного введения GLP-1 и FGF21 или белка GLP-1/FGF21 с двойной функцией уже исследованы и описаны (см. WO 2010/142665 и WO 2011/020319).

Для разработки белка с двойной функцией, содержащего GLP-1 и FGF21, необходимо решить различные проблемы. Т.к. GLP-1 дикого типа и FGF21 дикого типа имеют очень короткое время полужизни in vivo, их необходимо вводить по меньшей мере один раз в сутки, даже если их разрабатывали в виде терапевтических средств. Таким образом, для разработки белка с двойной функцией длительного действия в целях улучшения удобства для пациентов необходимы технологии длительного действия, такие как слияние с Fc. В лекарственном средстве с двойной функцией для двух мишеней GLP-1 и FGF21 встраивание мутаций необходимо для поддержания активности и стабильности in vivo каждого лекарственного средства, и необходимо решать проблемы, связанные с изменениями активности, структуры или стабильности, вызванными каждой мутацией. Лечебные эффекты двух мишеней GLP-1 и FGF21 должны быть хорошо сбалансированы, и для этой цели необходим дизайн лекарственного средства, в котором учитывают активности in vitro, фармакокинетические профили, фармакологическую эффективность в моделях на животных, а также клиническую оценку эффективности у людей. Белок с двойной функцией имеет структуру, которая не может существовать в организме человека, и является структурно сложной по сравнению со слитым белком для одной мишени. Кроме того, т.к. для баланса двух мишеней необходимы мутации или конструирование линкера, может повышаться вероятность образования комплексов агрегатов, и для предотвращения этого может потребоваться дальнейшее конструирование белка. Кроме того, потенциальная иммуногенность может повышаться по причине новых мутантных последовательностей или структур комплексов, и эту проблему необходимо решать или избегать ее.

Авторы настоящего изобретения стремились улучшить стабильность, фармакокинетические профили и фармакологическую эффективность белков с двойной функцией, включающих мутантные белки GLP-1 и мутантные белки FGF21, и обнаружили, что стабильность, фармакокинетические профили и фармакологическую эффективность белков с двойной функцией можно улучшать, если мутантный белок GLP-1 подвергают слиянию с Fc-областью иммуноглобулина, а новый мутантный белок FGF21 подвергают слиянию с ним, таким образом, осуществляя настоящее изобретение.

Описание изобретения

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является получение белка с двойной функцией, включающего биологически активный белок и мутантный белок FGF21 с улучшенными фармакокинетическими параметрами, высокой стабильностью, низкой вероятностью образования комплексов агрегатов и сниженной потенциальной иммуногенностью.

Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, включающей белок с двойной функцией, для профилактики или лечения FGF21-ассоциированных нарушений.

Дополнительной целью настоящего изобретения является получение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок с двойной функцией, экспрессирующего вектора, включающего молекулу нуклеиновой кислоты, и клетки-хозяина, включающей экспрессирующий вектор.

Решение проблемы

Настоящее изобретение относится к белку с двойной функцией, содержащему мутантный белок FGF21, биологически активный белок или его мутант или фрагмент и Fc-область иммуноглобулина, где мутантный белок FGF21 содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из следующих мутаций (1)-(7):

(1) замены аминокислот в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 68);

(2) замены аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 69);

(3) замены аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 70);

(4) замены аминокислоты в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

(5) замены аминокислоты в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

(6) замены аминокислоты в положении 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E вместе с одной или несколькими из указанных выше мутаций (1)-(5); и

(7) мутации от 1 до 10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белок с двойной функцией, для лечения диабета, ожирения, дислипидемии, метаболического синдрома, неалкогольного ожирения печени, неалкогольного стеатогепатита или сердечно-сосудистых заболеваний.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей белок с двойной функцией, экспрессирующему вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, и клетке-хозяину, содержащей экспрессирующий вектор.

Полезные эффекты изобретения

Белок с двойной функцией по настоящему изобретению, полученный посредством соединения биологически активного белка и мутантного белка FGF с Fc-областью иммуноглобулина, обладает улучшенной фармакологической эффективностью, сроком действия in vivo и стабильностью белка. Кроме того, фармацевтическую композицию, включающую белок с двойной функцией с качестве активного ингредиента, можно использовать в качестве терапевтического средства от диабета, ожирения, дислипидемии, метаболического синдрома, неалкогольного ожирения печени, неалкогольного стеатогепатита или сердечно-сосудистых заболеваний.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1A-1C являются графиками, на которых представлены активности in vitro слитых белков, включающих мутантные белки FGF21 (далее в настоящем описании обозначаемые как "мутантный слитый белок FGF21"), при использовании линии клеток HEK293, в которой β-klotho человека гиперэкспрессирован. Ни один из мутантных слитых белков FGF21 не демонстрировал значительное снижение активности по причине встраивания мутации.

Фиг. 2A и 2B являются графиками, на которых представлены активности in vitro мутантных слитых белков FGF21 с различными линкерами, соединяющими N-конец FGF21 с Fc-областью, при использовании линии клеток HEK293, в которой β-klotho человека гиперэкспрессирован. Ни один из мутантных слитых белков FGF21 не демонстрировал значительное снижение активности, хотя наблюдали небольшие различия в активности в зависимости от последовательности линкера.

Фиг. 3 является графиком, на котором представлены активности in vitro RGE (Amgen), Fc-FGF21 (Lilly) и DFD1 при использовании линии клеток HEK293, в которой β-klotho человека гиперэкспрессирован. DFD1 и RGE (Amgen) обладают схожими активностями, в то время как Fc-FGF21 (Lilly) обладает активностью in vitro, в два раза превосходящую активность других белков.

На фиг. 4 представлена стабильность DFD4 и DFD13 для подтверждения эффекта мутации EIRP в FGF21 в отношении стабильности слитого белка. Подтверждали, что DFD13 ассоциирован с меньшей долей высокомолекулярных агрегатов (HMW %) на начальной стадии и более чем через 2 недели по сравнению с DFD4, что свидетельствует о том, что встраивание мутации EIRP улучшает стабильность мутантного слитого белка FGF21, таким образом, значительно снижая HMW %.

На фиг. 5 представлена концентрация каждого белка в крови с течением времени в течение 96 часов после подкожного введения мутантных слитых белков FGF21. Данные представлены в виде средних значений и стандартного отклонения.

На фиг. 6 представлены уровни глюкозы в крови в модели на мышах ob/ob после однократной подкожной инъекции DFD18, DFD72, DFD74 или Fc-FGF21 (Lilly). Все из DFD18, DFD72 и DFD74 имели эффект непрерывного снижения уровня глюкозы в крови. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего (S.E.M.).

На фиг. 7 представлены графики, на которых показаны изменения массы тела в модели на мышах ob/ob со дня введения до 14-го дня после однократной подкожной инъекции DFD18, DFD72, DFD74 или Fc-FGF21 (Lilly). Все из DFD18, DFD72 и DFD74 имели эффект снижения массы тела по сравнению с группой, которой вводили PBS. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.

На фиг. 8 представлены графики, на которых показаны изменения уровней гликированного гемоглобина в модели на мышах ob/ob в день введения (1-ый день) и 16-ый день после однократной подкожной инъекции DFD18, DFD72, DFD74 или Fc-FGF21 (Lilly). Все из DFD18, DFD72 и DFD74 снижали уровни гликированного гемоглобина на 16-ый день по сравнению с уровнями в день введения. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.

На фиг. 9 представлены уровни глюкозы в крови в модели на мышах HFD/STZ после однократной подкожной инъекции DFD72 или DFD74. DFD72 и DFD74 имели эффект непрерывного снижения уровня глюкозы в крови. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.

На фиг. 10 представлены изменения массы тела животных в модели на мышах HFD/STZ со дня введения до 14-го дня после однократной подкожной инъекции DFD72 или DFD74. DFD72 и DFD74 имели эффект снижения массы тела по сравнению с группой, которой вводили PBS. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.

На фиг. 11 представлены графики, на которых показаны изменения уровней гликированного гемоглобина в модели на мышах HFD/STZ в 1-ый день и 13-ый день после однократной подкожной инъекции DFD72 или DFD74. Наблюдали, что DFD72 и DFD74 вызывали большее снижение уровней гликированного гемоглобина по сравнению с группой, которой вводили PBS. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.

На фиг. 12 представлены изменения массы тела, измеряемые в модели алиментарного ожирения на мышах со дня введения до 14-го дня после однократного введения DFD18. DFD18 имел достоверный эффект в отношении снижения массы тела. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.

Фиг. 13 является графиком, на котором представлены активности GLP-1 in vitro белков с двойной функцией в зависимости от шарниров, соединяющих C-конец мутантов GLP-1 и GLP-1 с Fc-областью, при использовании линии клеток CHO, в которой рецептор GLP-1 человека гиперэкспрессирован. Как правило, белок с двойной функцией, включающий последовательность GLP-1 (A2G) (DFD23), демонстрирует в 2-3 раза более низкую активность, чем другие белки с двойной функцией, включающие другие мутантные последовательности GLP-1. Не наблюдали значимых различий в активностях GLP-1 среди белков с двойной функцией, включающих мутантные последовательности, за исключением последовательности GLP-1 (A2G).

На фиг. 14 представлены графики, на которых показаны активности GLP-1 в DFD59, DFD69, DFD112 и DFD114 и активности FGF21 в DFD69, DFD112 и DFD114. Активности in vitro GLP-1 в трех белках с двойной функцией (DFD69, DFD112 и DFD114) и Fc-слитом мутанте GLP-1, не включающем FGF21 (DFD59), измеряли с использованием линии клеток CHO, в которой рецептор GLP-1 человека гиперэкспрессирован. Три белка с двойной функцией демонстрировали схожие значения EC₅₀, и Fc-слитый мутант GLP-1 (DFD59) демонстрировал приблизительно в 2 раза более высокую активность, чем белки с двойной функцией. Активности in vitro белков с двойной функцией в зависимости от мутантов FGF21 измеряли с использованием линии клеток HEK293, в которой β-klotho человека гиперэкспрессирован. Подтверждали, что у трех белков с двойной функцией активности in vitro FGF21-части были схожими.

На фиг. 15 представлены концентрации белков в крови в зависимости от времени в течение 240 часов после подкожного введения белков с двойной функцией. Данные представлены в виде средних значений и стандартного отклонения.

На фиг. 16 представлены уровни глюкозы в крови в модели на мышах db/db после однократной подкожной инъекции DFD114 или DFD59 и однократной подкожной инъекции комбинации DFD59 и DFD74. В группах, которым вводили белки с двойной функцией, наблюдали более выраженные эффекты снижения уровней глюкозы в крови, чем в группах, которым вводили белки с одной функцией. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего (S.E.M.).

На фиг. 17 представлены графики, на которых показаны изменения массы тела в модели на мышах db/db со дня введения до 14-го дня после однократной подкожной инъекции DFD114 или DFD59 и однократной подкожной инъекции комбинации DFD59 и DFD74. В группах, которым вводили белки с двойной функцией, наблюдали более выраженные эффекты снижения массы тела, чем в группах, которым вводили белки с одной функцией. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего (S.E.M.).

На фиг. 18 представлены графики, на которых показаны изменения уровней гликированного гемоглобина в модели на мышах db/db в день введения (1-ый день) и 16-ый день после однократной подкожной инъекции DFD114 или DFD59 и однократной подкожной инъекции комбинации DFD59 и DFD74. В группах, которым вводили белки с двойной функцией, наблюдали более выраженные эффекты снижения уровней гликированного гемоглобина, чем в группах, которым вводили белки с одной функцией или их комбинацию. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.

На фиг. 19 представлены уровни глюкозы в крови в модели на мышах HFD/STZ после однократной подкожной инъекции DFD114, DFD59, DFD74 или DFD72 и однократной подкожной инъекции комбинации DFD59 и DFD74. В группах, которым вводили белки с двойной функцией, наблюдали более выраженные эффекты снижения уровней глюкозы в крови, чем в группах, которым вводили белки с одной функцией. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего (S.E.M.).

На фиг. 20 представлены изменения массы тела в модели на мышах HFD/STZ со дня введения до 14-го дня после однократной подкожной инъекции DFD59, DFD72, DFD74 или DFD114 и однократной подкожной инъекции комбинации DFD59 и DFD74. В группах, которым вводили белки с двойной функцией, наблюдали более выраженные эффекты снижения массы тела, чем в группах, которым вводили белки с одной функцией. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего (S.E.M.).

На фиг. 21 представлены изменения уровней гликированного гемоглобина в модели на мышах HFD/STZ в день введения (1-ый день) и 16-ый день после однократной подкожной инъекции DFD59, DFD72, DFD74 или DFD114 и однократной подкожной инъекции комбинации DFD59 и DFD74. В группах, которым вводили белки с двойной функцией, наблюдали более выраженные эффекты снижения уровней гликированного гемоглобина, чем в группах, которым вводили белки с одной функцией или их комбинацию. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.

Лучший способ осуществления изобретения

Далее в настоящее изобретение будет описано более подробно.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к белку с двойной функцией, содержащему мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21), биологически активный белок или его мутант или фрагмент и Fc-область иммуноглобулина, где мутантный белок FGF21 содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из следующих мутаций (1)-(7):

(1) замены аминокислот в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 68) (далее в настоящем описании обозначаемой как "EIRP");

(2) замены аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 69) (далее в настоящем описании обозначаемой как "TGLEAV");

(3) замены аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 70) (далее в настоящем описании обозначаемой как "TGLEAN");

(7) мутацию от 1 до 10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.

Белок FGF21 дикого типа, гормон, как известно, играющий важную роль в гомеостазе глюкозы и липидов, может являться белком, полученным из млекопитающих, таких как люди, мыши, свиньи, обезьяны и т.д., предпочтительно - из людей. Более предпочтительно, белок FGF21 дикого типа может являться белком FGF21 человека дикого типа, имеющим аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.

Мутация, включенная в мутантные белки FGF21, предпочтительно, может являться любой из мутаций EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N; комбинацией любой из мутаций TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N и мутации EIRP; комбинацией любой из мутаций EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N и мутации A180E; или комбинацией любой из мутаций TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N, мутации EIRP и мутации A180E. Кроме того, мутантные белки FGF21 могут иметь конформацию, в которой от 1 до 10 аминокислот на N-конце или C-конце делетированы относительно белка FGF21 дикого типа. Более предпочтительно, мутантные белки FGF21 могут включать аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 6-23. Еще более предпочтительно, мутантные белки FGF21 могут включать аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 6-23 и дополнительно имеющую конформацию, в которой от 1 до 10 аминокислот на N-конце или C-конце делетированы относительно белка FGF21 дикого типа.

В белке с двойной функцией, аминокислотный остаток N в мутантном белке FGF21, встроенный посредством мутации, может быть гликозилированным.

Биологически активный белок может являться белком, выбранным из группы, состоящей из инсулина, C-пептида, лептина, глюкагона, гастрина, желудочного ингибиторного полипептида (GIP), амилина, кальцитонина, холецистокинина, пептида YY, нейропептида Y, морфогенетического белка кости-6 (BMP-6), морфогенетического белка кости-9 (BMP-9), оксинтомодулина, окситоцина, глюкагон-подобного пептида-1 (GLP-1), глюкагон-подобного пептида-2 (GLP-2), иризина, белка 5, содержащего фибронектиновый домен типа III (FNDC5), апелина, адипонектина, C1q и белка, родственного фактору некроза опухоли (семейство CTRP), резистина, висфатина, оментина, ретинол-связывающего белка-4 (RBP-4), глицентина, ангиопоэтина, интерлейкина-22 (ИЛ-22), экзендина-4 и соматотропина. Предпочтительно, биологически активный белок может являться белком, выбранным из GLP-1, его мутанта и экзендина-4.

Белок GLP-1 является инкретиновым гормоном, состоящим из 31 аминокислоты, секретируемым L-клетками в желудочно-кишечном тракте при стимуляции пищей, и т.д. Например, белок GLP-1 может быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42.

Мутант GLP-1 может быть представлен, например, любой аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 43-46.

В рамках изобретения, термины "Fc-область", "Fc-фрагмент" или "Fc" относятся к белку, включающему константную область тяжелой цепи 1 (CH1), константную область тяжелой цепи 2 (CH2) и константную область тяжелой цепи 3 (CH3) иммуноглобулина, но не включающему вариабельные области тяжелых и легких цепей и константную область легкой цепи 1 (CL1) иммуноглобулина. Кроме того, в рамках изобретения, термин "мутант Fc-области" относится к белку, полученному посредством замены части аминокислот в Fc-области или комбинирования Fc-областей разных типов.

Fc-область иммуноглобулина может являться целой Fc-областью, составляющей антитело, ее фрагментом или мутантом Fc-области. Кроме того, Fc-область включает молекулу в форме мономера или мультимера и дополнительно может включать шарнирную область константной области тяжелой цепи. Мутанта Fc-области можно модифицировать для предотвращения расщепления по шарнирной области. Кроме того, шарнирная последовательность Fc может содержать замену в некоторых аминокислотных последовательностях для снижения антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Кроме того, часть аминокислотной последовательности шарнирной последовательности Fc можно заменять для ингибирования перестройки Fab-области. Можно удалять остаток лизина на C-конце Fc.

Предпочтительно, Fc-область иммуноглобулина может являться любой из Fc-областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgD или гибридной Fc, являющейся их комбинацией. Кроме того, гибридная Fc может включать область IgG4 и область IgD. Кроме того, гибридная Fc-область может включать часть шарнирной последовательности и CH2 Fc IgD и последовательности CH2 и CH3 Fc IgG4.

Кроме того, Fc-фрагмент по настоящему изобретению может находиться в форме гликозилированной цепи дикого типа, более гликозилированной цепи, чем цепь дикого типа, менее гликозилированной цепи, чем дикого типа, или дегликозилированной цепи. Повышение или снижение гликозилирования или удаление гликозилированной цепи можно осуществлять общепринятым, известным в этой области способом, таким как химический способ, ферментативный способ и способ генетической инженерии с использованием микроорганизмов.

Предпочтительно, Fc-область иммуноглобулина может быть представлена аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 24-26, 47 и 48.

Белок с двойной функцией может включать биологически активный белок, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, соединенные в этом порядке с N-конца к C-концу. Кроме того, белок с двойной функцией может включать мутантный белок FGF21, Fc-область иммуноглобулина и биологически активный белок, соединенные в этом порядке с N-конца к C-концу. Предпочтительно, белок с двойной функцией может включать биологически активный белок, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, соединенные в этом порядке с N-конца к C-концу.

Кроме того, белок с двойной функцией может включать мутантный белок GLP-1, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, соединенные в этом порядке с N-конца к C-концу. Кроме того, белок с двойной функцией может включать мутантный белок FGF21, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок GLP-1, соединенные в этом порядке с N-конца к C-концу. Предпочтительно, белок с двойной функцией может включать мутантный белок GLP-1, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, соединенные в этом порядке с N-конца к C-концу.

Кроме того, белок с двойной функцией дополнительно может включать линкер.

Белок с двойной функцией может находиться в форме, в которой мутантный белок FGF21 напрямую соединяют с N-концом или C-концом Fc-области иммуноглобулина или мутантный белок FGF21 соединяют с Fc-областью иммуноглобулина через линкер.

В таком случае, линкер можно соединять с N-концом, C-концом или свободным радикалом Fc-фрагмента, а также можно соединять с N-концом, C-концом или свободным радикалом мутантного белка FGF21. Если линкер является пептидным линкером, соединение можно осуществлять через любую область. Например, линкер можно соединять с C-концом Fc-области иммуноглобулина и N-концом мутантного белка FGF21 для получения слитого белка Fc-области иммуноглобулина и мутантного белка FGF21.

Кроме того, белок с двойной функцией по настоящему изобретению может находиться в форме, в которой биологически активный белок соединяют с N-концом Fc-области иммуноглобулина в слитом белке.

Если линкер и Fc экспрессируют раздельно, а затем соединяют, линкер может являться сшивающим средством, известным в этой области. Неограничивающие примеры сшивающего средства могут включать 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, имидоэфиры, включая сложный эфир N-гидроксисукцинимида, такой как 4-азидосалициловая кислота, и дисукцинимидиловые сложные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан.

Кроме того, линкер может являться пептидом. Предпочтительно, линкер может являться пептидом, состоящим из 10-30 аминокислотных остатков.

Кроме того, к концу линкера можно дополнительно присоединять аланин. Предпочтительно, линкер может являться пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 2-5.

Белок с двойной функцией может находиться в форме, в которой димер или мультимер мутантных белков FGF21, в котором соединены один или несколько мутантных белков FGF21, соединяют с Fc-областью иммуноглобулина. Кроме того, белок с двойной функцией может находиться в форме димера или мультимера, в котором соединяют две или более Fc-области иммуноглобулина, где к Fc-областям иммуноглобулина прикреплен мутантный белок FGF21.

Кроме того, белок с двойной функцией может являться пептидом, предпочтительно, имеющим аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 58-67. Более предпочтительно, белок с двойной функцией может являться пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 65, 66 или 67.

Мутантный белок FGF21 может дополнительно включать мутацию от 1 до 10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа. Иммуногенность можно прогнозировать общепринятым, известным в этой области способом. Например, потенциальную иммуногенность белка можно подвергать скринингу, например, способами iTope™ и TCED™.

Кроме того, мутацию для минимизации иммуногенности можно встраивать общепринятым, известным в этой области способом. Например, если иммуногенность наблюдают при осуществлении анализа EpiScreen™ для оценки потенциальной иммуногенности, аминокислотные последовательности, индуцирующие иммуногенность, можно идентифицировать посредством картирования T-клеточных эпитопов и конструировать мутантов с минимизированной иммуногенностью посредством прогнозирования in silico.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белок с двойной функцией для лечения FGF21-ассоциированных нарушений.

В рамках изобретения, термин "FGF21-ассоциированное нарушение" может включать ожирение, диабет типа I и типа II, панкреатит, дислипидемию, неалкогольное ожирение печени (NAFLD), неалкогольный стеатогепатит (NASH), резистентность к инсулину, гиперинсулинемию, нарушение толерантности к глюкозе, гипергликемию, метаболический синдром, инфаркт миокарда, гипертензию, сердечно-сосудистые заболевания, атеросклероз, болезнь периферических артерий, инсульт, сердечную недостаточность, ишемическую болезнь сердца, заболевание почек, осложнения диабета, невропатию, гастропарез, нарушение, ассоциированное с серьезной инактивирующей мутацией рецептора инсулина и другие нарушения обмена веществ. Предпочтительно, FGF21-ассоциированное нарушение может являться диабетом, ожирением, дислипидемией, метаболическим синдромом, неалкогольным ожирением печени, неалкогольным стеатогепатитом или сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Кроме того, фармацевтическая композиция дополнительно может включать фармацевтический носитель. Фармацевтический носитель может являться любым носителем при условии, что он является нетоксичным материалом, подходящим для доставки антител пациентам. Например, в качестве носителя можно включать дистиллированную воду, спирт, жиры, воски и неактивные твердые вещества. В фармацевтическую композицию также можно включать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества (буферные средства, дисперсанты). В этих составах концентрация белка с двойной функцией может в значительной степени варьироваться.

В частности, фармацевтическая композиция может содержать материал для изменения, поддержания или сохранения pH, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, адсорбции или проникающей способности композиции. Неограничивающие примеры подходящего материала для составления могут включать аминокислоты (например, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), противомикробные средства, антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, сульфит натрия или бисульфит натрия), буферные средства (например, борат, бикарбонаты, Трис-HCl, цитрат, фосфат или другие органические кислоты), объемообразующие средства (например, маннит или глицин), хелатирующие средства (например, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА)), комплексообразователи (например, кофеин, поливинилпирролидон, β-циклодекстрин или гидроксипропил-β-циклодекстрин), наполнители, моносахариды, дисахариды и другие углеводы (например, глюкозу, маннозу или декстрин), белки (например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулин), красители, ароматизаторы, дилюенты, эмульгаторы, гидрофильные полимеры (например, поливинилпирролидон), низкомолекулярные полипептиды, солеобразующие противоионы (например, натрий), консерванты (например, хлорид бензалкония, бензойную кислоту, салициловую кислоту, тиомерсал, фенилэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновую кислоту или пероксид водорода), растворители (например, глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахарные спирты (например, маннит или сорбит), суспендирующие средства, поверхностно-активные вещества или увлажнители (например, плюроники; PEG; сложный эфир сорбитана; полисорбат, например, полисорбат 20 или полисорбат 80; тритон; трометамин; лецитин; холестерин или тилоксапол), стабилизаторы (например, сахарозу или сорбит), добавки для роста (например, галиды щелочных металлов, предпочтительно, хлорид натрия или хлорид калия; или маннит, сорбит), средства для доставки, дилюенты, эксципиенты и/или фармацевтические вспомогательные средства.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения FGF21-ассоциированных нарушений, включающему введение белка с двойной функцией индивидууму, нуждающемуся в такой профилактике или лечении. Этот способ, в частности, включает введение эффективного количества белка с двойной функцией по настоящему изобретению млекопитающему, имеющему симптом диабета, ожирения, дислипидемии, метаболического синдрома, неалкогольного ожирения печени, неалкогольного стеатогепатита или сердечно-сосудистых заболеваний, являющихся FGF21-ассоциированными нарушениями.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить любым путем. Композицию по настоящему изобретению можно вводить животному напрямую (например, местно, с помощью введения в области ткани посредством инъекции, трансплантации или с помощью местного введения) или системно (например, с помощью перорального или парентерального введения) любыми подходящими способами. Если композицию по настоящему изобретению вводят парентерально посредством внутривенного, подкожного, глазного, интраперитонеального, внутримышечного, перорального, ректального, интраорбитального, интрацеребрального, внутричерепного, интраспинального, внутрижелудочкового, интратекального, интрацистернального, интракапсулярного, интраназального или аэрозольного введения, композиция, предпочтительно, является водной или может включать часть физиологически приемлемой жидкой суспензии или раствора. Таким образом, носитель или наполнитель можно добавлять в композицию и вводить пациенту, т.к. он является физиологически приемлемым. Таким образом, физиологически приемлемый физиологический раствор, как правило, можно включать в составы в качестве носителя, подобного физиологической жидкости.

Кроме того, частота введения может варьироваться в зависимости от фармакокинетических параметров белка с двойной функцией в составах, подлежащих использованию. Как правило, лечащие врачи будут вводить композицию до достижения желаемого эффекта. Таким образом, композицию можно вводить в виде однократной дозы, по меньшей мере двух доз с временным интервалом (которые могут содержать или не содержать одинаковое количество целевого белка с двойной функцией) или вводить посредством непрерывной инъекции с помощью трансплантируемого устройства или катетера. Специалисты в этой области могут осуществлять точное добавление подходящей вводимой дозы общепринятым образом, и это соответствует объему работ, обычно ими выполняемому.

Кроме того, предпочтительная однократная доза белка с двойной функцией у людей может находиться в диапазоне от 0,01 мкг/кг до 100 мг/кг массы тела, и более предпочтительно - от 1 мкг/кг до 10 мг/кг массы тела. Хотя оно является оптимальным количеством, однократная доза может варьироваться в зависимости от заболевания, подлежащего лечению, или наличия/отсутствия побочных эффектов. Несмотря на это, оптимальную вводимую дозу можно определять, осуществляя общепринятый эксперимент. Введение белка с двойной функцией можно осуществлять с помощью периодической болюсной инъекции, внешнего резервуара (например, мешка для внутривенного введения) или непрерывного внутривенного, подкожного или интраперитонеального введения из внутреннего источника (например, биодеградируемого имплантата).

Кроме того, белок с двойной функцией по настоящему изобретению можно вводить индивидууму-реципиенту вместе с другими биологически активными молекулами. Оптимальную комбинацию белка с двойной функцией и других молекул, лекарственные формы и оптимальные дозы можно определять с помощью общепринятого эксперимента, хорошо известного в этой области.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей белок с двойной функцией.

В рамках изобретения термин "выделенная молекула нуклеиновой кислоты" относится к молекуле нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, отделенной от по меньшей мере приблизительно 50% белков, липидов, углеводов или других материалов, обнаруживаемых в природе при выделении тотальных нуклеиновых кислот из клетки-источника; функционально связанной с полинуклеотидом, с которым не связана в природе; или являющейся частью более крупной полинуклеотидной последовательности и не встречающейся в природе. Предпочтительно, в выделенных молекулах нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, по существу, отсутствуют какие-либо другие контаминирующие нуклеиновые кислоты или другие загрязнения, обнаруживаемые в природном окружении и препятствующие использованию нуклеиновых кислот в получении полипептидов или лечении, диагностике, профилактике или исследованиях.

В таком случае выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белок с двойной функцией, могут иметь отличающиеся друг от друга последовательности по причине вырожденности генетического кода. Кроме того, при условии, что выделенная нуклеиновая кислота может приводить к получению белка с двойной функцией, выделенную нуклеиновую кислоту можно соответствующим образом модифицировать или можно добавлять нуклеотид на N-конец или C-конец выделенной нуклеиновой кислоты в соответствии с желаемыми целями.

Выделенная нуклеиновая кислота может включать, например, нуклеотидную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 71-80.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты.

В рамках изобретения термин "экспрессирующий вектор" относится к вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, подходящую для трансформации клетки-хозяина и направляющую или контролирующую экспрессию встраиваемой гетерогенной последовательности нуклеиновой кислоты. Экспрессирующий вектор включает линейную нуклеиновую кислоту, плазмиду, фагмиду, космиду, РНК-вектор, вирусный вектор и его аналоги. Неограничивающие примеры вирусного вектора включают ретровирус, аденовирус и аденоассоциированный вирус.

В рамках изобретения, термин "экспрессия гетерогенной последовательности нуклеиновой кислоты" или "экспрессия" целевого белка относится к транскрипции встраиваемой последовательности ДНК, трансляции транскрипта мРНК и продукции Fc-слитого белка, антитела или фрагмента антитела.

Применимым экспрессирующим вектором может являться RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) или его мутант. Применимый экспрессирующий вектор может включать промотор цитомегаловируса человека (CMV) для стимуляции длительной транскрипции гена-мишени в клетке млекопитающего и последовательность сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста для повышения уровня посттранскрипционной стабильности РНК. В примере варианта осуществления настоящего изобретения экспрессирующий вектор является pAD15, представляющим собой модифицированный вектор RcCMV.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащему экспрессирующий вектор.

В рамках изобретения термин "клетка-хозяин" относится к прокариотической клетке или эукариотической клетке, в которую можно встраивать рекомбинантный экспрессирующий вектор. В рамках изобретения, термин "трансформированный" или "трансфицированный" относится к встраиванию нуклеиновой кислоты (например, вектора) в клетку с помощью различных технологий, известных в этой области.

Подходящую клетку-хозяина можно трансформировать или трансфицировать с использованием последовательности ДНК по настоящему изобретению и ее можно использовать для экспрессии и/или секреции целевого белка. Примеры подходящей клетки-хозяина, которую можно использовать в настоящем изобретении, включают иммортализованные гибридомные клетки, миеломные клетки NS/0, клетки 293, клетки яичника китайского хомяка (CHO), клетки HeLa, клетки CAP (клетки, полученные из амниотической жидкости человека) и клетки COS.

Далее в настоящем описании примеры вариантов осуществления настоящего изобретения будут подробно представлены со ссылкой на примеры. Однако эти примеры настоящего изобретения можно модифицировать во множество различных форм, и объем настоящего изобретения не следует считать ограниченным примерами, приведенными в настоящем описании.

Способ по изобретению

Пример получения 1. Получение и очистка слитого белка, содержащего мутантный белок FGF21

Пример получения 1-1. Получение экспрессирующих векторов для экспрессии мутантных белков FGF21

Для улучшения стабильности, активности и фармакокинетических профилей FGF21 в структуре Fc-FGF21, осуществляли исследования мутаций FGF21.

В частности, конструировали мутантные белки для области LLLE (аминокислоты в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21), области GPSQG (аминокислоты в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21) и участка A180, которые, как ожидают, будут в значительной степени влиять на активности белка с учетом анализа 3-мерной структуры белков FGF21.

Положение, информация о последовательности, цель и ожидаемый эффект каждой мутации, встраиваемой в белок FGF21, приведены в таблице 1 ниже (в таблице 1, N относится к гликозилированному аспарагину (N)). Кроме того, мутантные белки FGF21, включающие мутации, описанные в таблице 1, приведены в таблице 2 ниже.

[Таблица 1]

Последовательность	Положение	Исходная последовательность	Мутантная последовательность	Цель	Ожидаемый эффект
EIRP	98-101	LLLE	EIRP	Замена последовательностью FGF19	Улучшение стабильности и фармакокинетики
TGLEAV	170-174	GPSQG	TGLEAV	Замена последовательностью FGF19	Улучшение фармакокинетики
TGLEAN	170-174	GPSQG	TGLEAN	Замена последовательностью FGF19 и добавление N-гликозилирования	Улучшение фармакокинетики
G170N	170	G	N	Точечная мутация и добавление N-гликозилирования	Улучшение фармакокинетики
G174N	174	G	N	Точечная мутация и добавление N-гликозилирования	Улучшение фармакокинетики
A180E	180	A	E	Точечная мутация	Улучшение фармакокинетики

[Таблица 2]

SEQ ID NO	Последовательность мутантного белка FGF21
6	FGF21 (EIRP)
7	FGF21 (TGLEAV)
8	FGF21 (TGLEAN)
9	FGF21 (G170N)
10	FGF21 (G174N)
11	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
12	FGF21 (EIRP, TGLEAN)
13	FGF21 (EIRP, G170N)
14	FGF21 (EIRP, G174N)
15	FGF21 (EIRP, A180E)
16	FGF21 (TGLEAV, A180E)
17	FGF21 (TGLEAN, A180E)
18	FGF21 (G170N, A180E)
19	FGF21 (G174N, A180E)
20	FGF21 (EIRP, TGLEAV, A180E)
21	FGF21 (EIRP, TGLEAN, A180E)
22	FGF21 (EIRP, G170N, A180E)
23	FGF21 (EIRP, G174N, A180E)

Получали экспрессирующие векторы для экспрессии аминокислот из трех компонентов: носителя для слияния, линкера и мутанта FGF21 в этом порядке с N-конца к C-концу. Код материала для каждого мутантного слитого белка FGF21, последовательность мутации, встраиваемой в FGF21, последовательность носителя для слияния и последовательность линкера приведены в таблице 3 ниже (в таблице 3 N относится к гликозилированному аспарагину (N)).

[Таблица 3]

SEQ ID NO	Код материала	Последовательность мутации FGF21	Носитель для слияния	Последовательность линкера
27	DFD1	EIRP, TGLEAV	hyFc (SEQ ID NO: 26)	C (SEQ ID NO: 2)
28	DFD3	TGLEAV	hyFc (SEQ ID NO: 26)	AKA (SEQ ID NO: 3)
29	DFD4	TGLEAV	hyFc (SEQ ID NO: 26)	GS3 (SEQ ID NO: 4)
30	DFD5	TGLEAN	hyFc (SEQ ID NO: 26)	GS3 (SEQ ID NO: 4)
31	DFD6	G170N	hyFc (SEQ ID NO: 26)	GS3 (SEQ ID NO: 4)
32	DFD6 (E. coli)	G170N	hyFc (SEQ ID NO: 26)	GS3 (SEQ ID NO: 4)
33	DFD7	G174N	hyFc (SEQ ID NO: 26)	GS3 (SEQ ID NO: 4)
34	DFD9	нет	hyFc (SEQ ID NO: 26)	GS3 (SEQ ID NO: 4)
35	DFD13	EIRP, TGLEAV	hyFc (SEQ ID NO: 26)	GS3 (SEQ ID NO: 4)
36	DFD18	EIRP, TGLEAV, A180E	hyFc (SEQ ID NO: 26)	GS3 (SEQ ID NO: 4)
37	DFD72	EIRP, TGLEAN, A180E	hyFc (SEQ ID NO: 26)	GS3 (SEQ ID NO: 4)
38	DFD73	EIRP, G170N	hyFc (SEQ ID NO: 26)	GS3 (SEQ ID NO: 4)
39	DFD74	EIRP, G170N, A180E	hyFc (SEQ ID NO: 26)	GS3 (SEQ ID NO: 4)
40	RGE (Amgen)	L98R, P171G, A180E	Мутант IgG1Fc	GS3 (SEQ ID NO: 4)
41	Fc-FGF21 (Lilly)	X	Мутант IgG4Fc (SEQ ID NO: 25)	GS3A (SEQ ID NO: 5)

Для получения мутантных слитых белков FGF21 нуклеотидные последовательности, кодирующие каждый из мутантных белков FGF21, синтезировали, консультируясь с Bioneer Corporation (Korea), с учетом аминокислотной последовательности каждого белка. Последовательности для ферментов рестрикции NheI и NotI добавляли на 5'-конец и 3'-конец нуклеотидных последовательностей, кодирующих каждый из мутантных белков FGF21, и рядом с последовательностью для фермента рестрикции на 5'-конце встраивали инициаторный кодон для трансляции белка и лидерную последовательность (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA), способную приводить к секреции экспрессируемого белка вне клетки. Терминирующий кодон встраивали рядом с нуклеотидной последовательностью, кодирующей каждый из мутантных слитых белков FGF21. Нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый из мутантных слитых белков FGF21, клонировали в экспрессирующий вектор pTrans-empty с использованием двух ферментов рестрикции NheI и NotI. Экспрессирующий вектор pTrans-empty, имеющий простую структуру, включающую промотор CMV, точку начала репликации из pUC, точку начала репликации из SV40 и ген резистентности к ампициллину, приобретали в CEVEC Pharmaceuticals (Germany).

В случае слитых белков DFD6 (E. coli) и RGE (Amgen) нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый слитый белок, встраивали в экспрессирующий вектор pET30a для экспрессии в E. coli.

Пример получения 1-2. Конструирование плазмидной ДНК для экспрессии мутантных слитых белков FGF21

E. coli трансформировали с использованием каждого из экспрессирующих векторов, сконструированных, как описано в примере получения 1-1, для получения большого количества плазмидной ДНК для использования в экспрессии. Клетки E. coli, клеточные стенки которых ослабляли, трансформировали с использованием каждого экспрессирующего вектора посредством теплового шока, и трансформанты высевали на чашки с LB для получения колонии. Полученными таким образом колониями инокулировали среды LB, культивировали при 37°C в течение 16 часов и каждую культуру E. coli, содержащую каждый экспрессирующий вектор, получали в объеме 100 мл. Полученные таким образом E. coli центрифугировали для удаления среды для культивирования, а затем добавляли растворы P1, P2, P3 (QIAGEN, кат. №:12963) для разрушения клеточных стенок, таким образом, получая суспензию ДНК, в которой белки и ДНК разделены. Плазмидную ДНК выделяли из полученной таким образом суспензии ДНК с использованием колонки для очистки ДНК Qiagen. Элюированную плазмидную ДНК идентифицировали посредством электрофореза в агарозном геле и измеряли концентрации и чистоту с использованием устройства Nanodrop (Thermo scientific, Nanodrop Lite). Полученную таким образом ДНК использовали для экспрессии.

Пример получения 1-3. Экспрессия слитых белков в CAP-T-клетках

Линии клеток человека трансфицировали с использованием каждого типа плазмидной ДНК, полученного, как описано в примере получения 1-2. Каждый тип плазмидной ДНК трансдуцировали в CAP-T-клетки (CEVEC), которые культивировали в среде PEM (Life technologies), с использованием раствора PEI (Polyplus, кат. №:101-10N). Смешанный раствор ДНК и раствора PEI смешивали с суспензией клеток, культивируемой при 37°C в течение 5 часов, с использованием среды для экспрессии Freestyle293 (Invitrogen) и добавляли среду PEM. После культивирования при 37°C в течение 5-7 дней культуру центрифугировали для удаления клеток и получали супернатант, включающий мутантные слитые белки FGF21.

Пример получения 1-4. Экспрессия и очистка мутантных слитых белков FGF21 в E. coli

E. coli штамма BL21 (DE3) трансформировали с использованием каждой плазмидной ДНК, экспрессирующей слитые белки DFD6 (E. coli) и RGE (Amgen). Трансформированными E. coli, экспрессирующими каждый слитый белок, инокулировали 20 мл сред LB, культивировали при 37°C в течение 15 часов со встряхиванием, а затем частью сред для культивирования инокулировали 100 мл сред LB и культивировали при 37°C в течение 16 часов со встряхиванием. После завершения культивирования культуру центрифугировали для получения осадков E. coli, а затем клетки разрушали с использованием клеточного дезинтегратора высокого давления для получения телец включения.

Полученные тельца включения очищали посредством промывки и элюции, с последующим рефолдингом белков. В частности, полученные тельца включения 2-3 раза промывали буферным раствором (pH 8,0), содержащим 0,5% Triton X-100, 50 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА и 0,1 M NaCl, для удаления бактериальных белков, а затем ресуспендировали в 8 M буфере с мочевиной, содержащем 8 M мочевину, 50 мМ Трис и 1 мМ DTT. Т.к. белки в 8 M буфере с мочевиной полностью денатурировали, рефолдинг белков осуществляли следующим образом.

Сначала 8 M буфер с мочевиной постепенно разводили 20 мМ глициновым буфером (pH 9,0) для удаления мочевины и, начиная с концентрации 2 M, добавляли CuSO₄ до концентрации 80 мкМ для индуцирования стабильного фолдинга белка. Белок, завершивший рефолдинг, суспендировали в буфере PBS (pH 7,4), и суспензию фильтровали через фильтр 0,22 мкм для удаления примесей, а затем нагружали на колонку для аффинной хроматографии с протеином A. Колонку промывали 1-кратным буфером PBS (pH 7,4), а затем белки элюировали с использованием 100 мМ глицинового буфера (pH 3,0) для получения слитого белка DFD6 (E. coli).

В случае слитого белка RGE (Amgen) белок, завершивший рефолдинг, суспендировали в 50 мМ буфере Трис (pH 8,0), суспензию фильтровали через фильтр 0,22 мкм для удаления примесей, а затем нагружали на колонку с анионообменной смолой (POROS® HQ 50 мкм, Thermo Fisher Scientific). Колонку промывали 50 мМ буфером Трис (pH 8,0), а затем 50 мМ буфер Трис (pH 8,0) вводили с градиентом концентрации для элюции слитого белка RGE (Amgen). Слитый белок RGE (Amgen), полученный с помощью анионообменной смолы, смешивали с сульфатом аммония до концентрации 1 M, а затем очищали с использованием колонки для хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (фенилсефароза FF, GE Healthcare). В частности, колонку промывали 50 мМ буфером Трис (pH 8,0), содержащим 1 M сульфата аммония, 50 мМ буфер Трис (pH 8,0) вводили с градиентом концентрации и анализировали элюированные фракции посредством электрофореза в 10% Трис-глициновом геле. Гель окрашивали кумасси бриллиантовым голубым R при осторожном встряхивании, собирали фракции, содержащие мутантный слитый белок FGF21 с высокой чистотой, а затем подвергали диализу их в течение ночи при 4°C с использованием конечного буферного раствора (1-кратный PBS, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4). После завершения диализа полученный стоковый раствор белка концентрировали при 3000 об./мин. с использованием центрифужного фильтра с отсечкой по молекулярной массе 30000 при 4°C. Концентрацию мутантного слитого белка FGF21 измеряли посредством количественного анализа BCA.

Пример получения 1-5. Очистка мутантных слитых белков FGF21

Колонку для аффинной хроматографии с протеином A (GE Healthcare) уравновешивали 1-кратным буфером PBS (pH 7,4). Супернатант культуры, включающий каждый мутантный слитый белок FGF21, полученный, как описано в примере получения 1-3, фильтровали с использованием фильтра 0,2 мкм, а затем нагружали на колонку для аффинной хроматографии с протеином A. Колонку промывали 1-кратным буфером PBS (pH 7,4), а затем белки элюировали с использованием 100 мМ глицинового буфера (pH 3,0). Слитые белки, полученные посредством аффинной хроматографии, очищали с использованием колонки с анионообменной смолой (POROS® HQ 50 мкм, Thermo Fisher Scientific). Колонку с анионообменной смолой уравновешивали 50 мМ буфером Трис (pH 8,0) перед элюцией мутантных слитых белков FGF21 из колонки. В частности, после промывки колонки 50 мМ буфером Трис (pH 8,0), 50 мМ буфер Трис (pH 8,0) распределяли по градиенту концентрации и анализировали элюированные фракции. Каждую элюированную фракцию анализировали с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC-ВЭЖХ) и собирали фракции, включающие мутантные слитые белки FGF21 с высокой чистотой. Концентрирование и количественный анализ осуществляли способами, описанными в примере получения 1-4.

Экспериментальный пример 1. Активности слитых белков in vitro

Экспериментальный пример 1-1. Эффект мутаций FGF21 в отношении активности белка

Измеряли активности in vitro слитых белков DFD4, DFD5, DFD6, DFD6 (E. coli), DFD7, DFD9, DFD13, DFD18, DFD72, DFD73 и DFD74, полученных, как описано в примере получения 1.

В частности, активности слитых белков FGF21 in vitro оценивали с использованием линии клеток HEK293 (Yuhan Corporation, Korea), которую модифицировали для гиперэкспрессии β-klotho человека, корецептора FGF21. Для оценки активности концентраты, содержащие слитые белки, полученные, как описано в примерах получения 1-4 и 1-5, подвергали 3-кратному серийному разведению в концентрации 3 мкМ. После культивирования в условиях дефицита сыворотки в течение 5 часов линию клеток, гиперэкспрессирующих β-klotho человека, обрабатывали разведенными слитыми белками в течение 20 минут, а затем лизировали посредством добавления буфера для цитолиза (Cisbio/кат. № 64ERKPEG) с перемешиванием при 60 об./мин. в течение 30 минут при комнатной температуре. Раствор лизата клеток смешивали с антителами (Cisbio/кат. № 64ERKPEG), с помощью которых можно определять регулирующую внеклеточный сигнал киназу (ERK) и фосфорилированную ERK, и смесь держали при комнатной температуре в течение 2 часов. Флуоресценцию определяли с использованием флуорометрического детектора (TECAN/GENiosPro). Измеряли активности слитых белков, сравнивая их значения EC₅₀.

Как показано на фиг. 1A-1C, подтверждали, что активности in vitro слитых белков, полученных посредством встраивания последовательностей мутаций в белок FGF21 дикого типа, не ингибировались, и активности каждого слитого белка были схожими друг с другом. Также подтверждали, что, когда образец DFD6 (E. coli) экспрессировали в E. coli, а образец DFD6 экспрессировали в клетках животного, активности in vitro слитых белков, полученных посредством встраивания мутации N-гликозилирования в белок FGF21 дикого типа, не ингибировались.

Экспериментальный пример 1-2. Эффект последовательности линкера в отношении активности белка

Измеряли активности in vitro слитых белков DFD1, DFD3, DFD4 и DFD13, полученных, как описано в примере получения 1.

В частности, активности слитых белков FGF21 измеряли с использованием концентратов, содержащих слитые белки, полученные, как описано в примере получения 1-5, способами, описанными в экспериментальном примере 1-1. Результаты представлены на фиг. 2A и 2B.

Подтверждали, что ни один из мутантных слитых белков FGF21 не демонстрировал значимое снижение активности, хотя наблюдали небольшое различие в активности в зависимости от последовательности линкера, как показано на фиг. 2A и 2B.

Экспериментальный пример 1-3. Результаты экспериментов для DFD1, RGE (Amgen) и Fc-FGF21 (Lilly)

Измеряли активности in vitro слитого белка DFD1, полученного в примере получения 1, и контрольных белков RGE (Amgen) и Fc-FGF21 (Lilly).

В частности, активности слитых белков FGF21 измеряли с использованием концентратов, содержащих слитые белки, полученные, как описано в примере получения 1-5, и контрольные белки, способами, описанными в экспериментальном примере 1-1. Результаты представлены на фиг. 3.

Подтверждали, что DFD1 и RGE (Amgen) имели схожую активность in vitro, в то время как Fc-FGF21 (Lilly) имел активность in vitro, в два раза превосходящую активность других белков, как показано на фиг. 3.

Экспериментальный пример 2. Оценка стабильности слитых белков

Экспериментальный пример 2-1. Экспериментальный способ оценки стабильности

Для измерения количества агрегатов белка на начальной стадии получения образца высокомолекулярные агрегаты (%HMW) количественно анализировали способом эксклюзионной хроматографии (SEC-ВЭЖХ). Результаты представлены на фиг. 4.

В частности, для способа SEC-ВЭЖХ использовали колонку TosoHaas модели TSK-GEL G3000SW_XL. Колонку уравновешивали, пропуская через нее буферный раствор (1-кратный PBS, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4) при скорости потока 1 мл/мин. Стоковые растворы белков DFD4 и DFD13, полученные в примерах получения 1-5, концентрировали до целевой концентрации 20 мг/мл или выше при 3000 об./мин. с использованием центрифужного фильтра с отсечкой по молекулярной массе 30000 при 4°C. После измерения концентрации каждого образца посредством количественного анализа BCA образцы разводили буферным раствором (1-кратный PBS, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4) до конечной концентрации 20 мг/мл. Для измерения начального %HMW DFD4 и DFD13 20 мг/мл образцов разводили буферным раствором (1-кратный PBS, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4) до конечной концентрации 1 мг/мл и каждый образец в объеме 100 мкл анализировали с помощью колонки для SEC-ВЭЖХ.

Для оценки стабильности каждого образца измеряли %HMW образцов способом SEC-ВЭЖХ на 4-ый, 8-ой и 14-ый день при их хранении при 5°C, 25°C и 37°C в течение двух недель.

Как показано на фиг. 4, подтверждали, что DFD13 содержит меньшее количество высокомолекулярных агрегатов (HMW %) на начальной стадии и в течние до 2 недель по сравнению с DFD4, что свидетельствует о том, что встраивание мутации EIRP улучшает стабильность мутантного слитого белка FGF21, таким образом, значимо снижая HMW %.

Экспериментальный пример 2-2. Результаты исследования стабильности

Для исследования эффектов мутации EIRP, встраиваемой в исходную последовательность LLLE (98-101) FGF21, в отношении стабильности измеряли стабильность DFD4 (SEQ ID NO: 29) и DFD13 (SEQ ID NO: 35) способами, описанными в экспериментальном примере 2-1. Результаты анализа начального образца (начальная стадия; день 0) и образцов DFD4 и DFD13, которые хранили в течение 4, 8 и 14 дней, приведены в таблице 4 ниже (в таблице 4, N.D. означает "не определено").

[Таблица 4]

Стабильность DFD4 и DFD13 в течение 2 недель при концентрации 20 мг/мл (%HMW)

	DFD4			DFD13
День	5°C	25°C	37°C	5°C	25°C	37°C
0	0,91			0,56
4	4,25	11,64	5,12	0,36	0,34	0,84
8	6,16	9,99	4,87	N.D.	N.D.	N.D.
14	8,15	8,83	4,71	N.D.	N.D.	0,32

Как показано в таблице 4, количество %HMW на начальной стадии (день 0) составляло 0,91% в случае DFD4 и 0,56% в случае DFD13. Через 2 недели количество %HMW повышалось до 8,83% в случае DFD4 при хранении при 25°C, но этого не наблюдали в случае DFD13. Показано, что DFD13 имеет меньшую долю %HMW на начальной стадии и через 2 недели по сравнению с DFD4, что свидетельствует о том, что доля %HMW в случае мутантного слитого белка FGF21 значимо снижается в результате встраивания мутации EIRP.

Экспериментальный пример 3. Фармакокинетическая оценка слитых белков

Экспериментальный пример 3-1. Экспериментальный способ фармакокинетической оценки

Самцов мышей ICR возрастом шесть недель, приобретенных в Orient BIO (Korea), разделяли на группы (n=3/время забора крови) так, чтобы они имели схожие средние значения массы тела за день до введения лекарственного средства, и им однократно подкожно вводили соответствующий образец в количестве 1 мг/кг (2 мг/кг в случае RGE). Затем образцы крови собирали через 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 и 96 часов после инъекции, соответственно. Концентрацию интактного полноразмерного белка FGF21 в крови измеряли с использованием набора для ELISA интактного FGF21 человека (F1231-K01, Eagle Biosciences, USA), имеющего иммунореактивность в отношении N-конца и C-конца белка FGF21. Измеряли концентрации образцов в крови, собранных до 96 часов после подкожной инъекции мышам каждого слитого белка, и вычисляли фармакокинетические параметры каждого образца.

Экспериментальный пример 3-2. Оценка фармакокинетической активности

Фармакокинетические параметры вычисляли с учетом графика, на котором представлены концентрации каждого белка в крови относительно времени после подкожного введения слитых белков мышам (фиг. 5). Данные представлены в таблице 5 ниже.

[Таблица 5]

Параметры	DFD4	DFD5	DFD6	DFD7	DFD9	DFD13	DFD18	DFD72	DFD73	DFD74	DFD6 (E.coli)	RGE*
T_max(часы)	12	12	12	4	4	12	12	8	8	8	8	12
C_max(нг/мл)	1288	1732	2868	696	384	1070	3428	2962	3296	3996	1399	9921
AUC_{последняя} (нг⋅ч/мл)	25856	40706	100107	14118	4656	28785	104230	115977	123511	206634	37269	325747
Время полужизни (часы)	5,5	8,0	14,9	19,7	17,4	7,1	11,0	14,4	16,6	26,0	9,1	12,9

Фармакокинетический профиль каждого слитого белка сравнивали и оценивали с учетом значения площади под кривой (AUC), свидетельствующего о степени воздействия лекарственного средства.

Как показано в таблице 5, после сравнения DFD4 с DFD13 и DFD6 с DFD73 определяли, что встраивание последовательности EIRP приводило к приблизительно 10-20% повышению значения AUC. При сравнении DFD9 с DFD4 определяли, что встраивание TGLEAV приводило к приблизительно 6-кратному повышению значения AUC.

Кроме того, мутации TGLEAN, G170N и G174N сконструированы для увеличения времени полужизни посредством включения N-гликозилирования на C-конце FGF21, который, как известно, подвергается протеолизу in vivo. Подтверждали повышение AUC по причине включения N-гликозилирования, сравнивая мутантов с каждым контрольным материалом. Для подтверждения эффекта улучшения AUC по причине включения N-гликозилирования значение AUC DFD6 (E. coli), продуцируемого E. coli, не имеющего гликозилирования, сравнивали со значением для DFD6, продуцируемого линией клеток человека. DFD6, продуцируемый линией клеток человека, демонстрировал 3-кратное или более высокое повышение значения AUC по сравнению с DFD6 (E. coli), продуцируемым E. coli, что свидетельствует об улучшении фармакокинетического профиля по причине гликозилирования.

A180E является мутацией, описываемой в WO 2009/149171, принадлежащем Amgen Inc. Если в мутанты DFD13 или DFD73, включающие мутацию TGLEAV или G170N, соответственно, дополнительно встраивали мутацию A180E, получаемый мутант DFD18 или DFD74, соответственно, демонстрировал приблизительно 2-3-кратное дополнительное повышение значения AUC.

В целом, подтверждали улучшение фармакокинетических параметров посредством встраивания различных мутаций и их комбинаций, по сравнению с DFD9, слитым белком FGF21 дикого типа. Слитым белком, демонстрировавшим наиболее улучшенное значение AUC, являлся DFD74, содержащий мутации EIRP, G170N и A180E, в случае которого наблюдали приблизительно 45-кратное улучшение значения AUC по сравнению с DFD9. Кроме того, если рассматривать RGE (Amgen) в дозе 2 мг/кг массы тела, DFD74 может иметь более высокую степень воздействия лекарственного средства по сравнению с RGE. Общие эффекты улучшения фармакокинетики по причине мутаций представлены в таблице 6 ниже.

[Таблица 6]

Последовательность мутации	Положение мутации	Контрольный материал по сравнению с улучшенным материалом	Оценка фармакокинетических параметров
EIRP	98-101	DFD4 по сравнению с DFD13	Улучшение AUC
EIRP	98-101	DFD6 по сравнению с DFD73	Улучшение AUC
TGLEAV	170-174	DFD9 по сравнению с DFD4	Улучшение AUC
TGLEAN	170-174	DFD9 по сравнению с DFD5	Улучшение AUC
G170N	170	DFD9 по сравнению с DFD6	Улучшение AUC
G170N	170	DFD6 (E. coli) по сравнению с DFD6	Улучшение AUC
G174N	174	DFD9 по сравнению с DFD7	Улучшение AUC
A180E	180	DFD13 по сравнению с DFD18	Улучшение AUC
A180E	180	DFD73 по сравнению с DFD74	Улучшение AUC

Экспериментальный пример 4. Оценка активности слитых белков у мышей ob/ob

Экспериментальный пример 4-1. Экспериментальный способ оценки активности у мышей ob/ob

Мышей ob/ob, отличающихся гипергликемией, резистентностью к инсулину, гиперфагией, жировым гепатозом и ожирением по причине генетической недостаточности лептина, широко используют для исследования диабета 2 типа. Самцов мышей ob/ob (Harlan, USA) приобретали в Raonbio (Korea). Эти мыши имели возраст от 5 до 6 недель на момент получения и от 8 до 9 недель на момент введения лекарственного средства после 3 недель адаптации. Мышей разделяли на группы (n=8/группу) так, чтобы они имели схожие средние значения массы тела и уровни глюкозы в крови из хвостовой вены за день до введения лекарственного средства (день 0), и образцы вводили однократно подкожно, каждый в своей соответствующей дозировке. В качестве наполнителя вводили фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS, Gibco, USA) и измеряли концентрацию глюкозы в крови с использованием глюкометра GlucoDr (All Medicus, Korea). Уровни глюкозы не натощак и массу тела измеряли каждый день до 14-го дня после введения. Также в каждой группе измеряли уровни гликированного гемоглобина перед введением и после тестирования. Уровни гликированного гемоглобина вычисляли с использованием набора DCA 2000 HbA1c (Siemens, 5035C).

Экспериментальный пример 4-2. Оценка активности у мышей ob/ob

Изменения уровней глюкозы не натощак в крови и массы тела у самцов мышей ob/ob определяли после однократной подкожной инъекции 30 или 100 нмоль/кг DFD18 и DFD72 или 10, 30 или 100 нмоль/кг DFD74.

Подтверждали, что все из DFD18, DFD72 и DFD74 имели эффект снижения уровня глюкозы в крови в зависимости от дозы. При сравнении трех средств в высокой дозе 100 нмоль/кг DFD72 и DFD74 демонстрировали улучшенный эффект снижения уровня глюкозы в крови по сравнению с DFD18 (фиг. 6). Кроме того, Fc-FGF21 (Lilly), используемый при тестировании в качестве контрольного материала, являлся менее эффективным в снижении уровня глюкозы в крови по сравнению с DFD18, DFD72 и DFD74 при одинаковом уровне дозы (30 нмоль/кг).

Что касается эффекта снижения массы тела, при сравнении трех средств в высокой дозе 100 нмоль/кг DFD72 являлся наиболее эффективным у мышей ob/ob, приводя к приблизительно 6% снижению массы тела, DFD18 являлся следующим по эффективности, а затем следовал DFD74 (фиг. 7).

По окончании теста измеряли уровни гликированного гемоглобина, свидетельствующие о средних значениях уровня глюкозы в крови, и анализировали изменения среднего уровня глюкозы в крови в каждой тестируемой группе. Все исследуемые группы, за исключением контрольной группы, которой вводили контрольный белок Fc-FGF21 (Lilly), демонстрировали отрицательные значения различий в значениях перед введением и после тестирования, что подтверждает эффективность тестируемых белков в снижении уровня глюкозы в крови по сравнению с контрольным материалом (фиг. 8).

Экспериментальный пример 5. Оценка активности слитых белков у мышей HFD/STZ

Экспериментальный пример 5-1. Экспериментальный способ оценки активности у мышей HFD/STZ

Эффекты мутантных слитых белков FGF21 в отношении снижения уровня глюкозы в крови и массы тела сравнивали и оценивали на другой модели диабета, мышах HFD/STZ. Общепринятые модели алиментарного ожирения на мышах (индуцируемого использованием диеты с 60 ккал% с высоким содержанием жира на мышах C57BL/6 в течение восьми или более недель) обладают слабыми гипергликемическими и диабетическими признаками, хотя они имеют резистентность к инсулину. Мыши HFD/STZ, которые могут компенсировать недостатки общепринятых моделей алиментарного ожирения на мышах, способны образовывать дисфункциональные β-клетки в поджелудочной железе, имеют сниженную секрецию инсулина в результате диеты с высоким содержанием жира (HFD) и введения низкого количества стрептозотоцина (STZ) и, таким образом, применимы для фармакологических исследований диабета 2 типа.

В частности, для получения модели на мышах HFD/STZ мышей C57BL/6 (Japan SLC) держали на диете с 60 ккал% с высоким содержанием жира в течение четырех недель, а затем интраперитонеально вводили 50 мг/кг STZ (Sigma, 85882) ежедневно в течение 3 дней для индуцирования дисфункции β-клеток поджелудочной железы. После использования диеты с высоким содержанием жира еще в течение 2 недель мышей с уровнями глюкозы не натощак в крови 200 мг/дл или выше использовали для тестирования. Мышей разделяли на группы (n=6/группу) так, чтобы они имели схожие средние значения массы тела и уровни глюкозы в крови из хвостовой вены за день до введения лекарственного средства (день 0), и образцы однократно подкожно вводили, каждый в своей соответствующей дозировке. В качестве наполнителя вводили фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS, Gibco, USA) и измеряли концентрацию глюкозы в крови с использованием глюкометра GlucoDr (All Medicus, Korea). Уровни глюкозы не натощак и массу тела измеряли ежедневно до 14-го дня после введения. Уровни гликированного гемоглобина также измеряли в каждой группе перед введением и после тестирования. Уровни гликированного гемоглобина вычисляли с использованием набора DCA 2000 HbA1c (Siemens, 5035C).

Экспериментальный пример 5-2. Оценка активности у мышей HFD/STZ

Определяли изменения уровней глюкозы не натощак в крови и массы тела с течением у самцов мышей HFD/STZ после однократной подкожной инъекции 10 нмоль/кг DFD72 или DFD74.

Что касается изменений уровней глюкозы не натощак в крови, подтверждали, что DFD72 и DFD74 обладали схожими эффектами снижения уровней глюкозы в крови, и эффект снижения уровня глюкозы в крови сохранялся до 10-го дня после введения, а затем утрачивался в результате метаболизма лекарственных средств после 10-го дня (фиг. 9). DFD72 демонстрировал более длительный эффект, чем DFD74 в терминах изменений уровней глюкозы не натощак в крови после 10-го дня после введения.

Что касается эффекта снижения массы тела по причине введения мутантных белков FGF21, подтверждали, что DFD72 и DFD74 обладали схожими эффектами снижения массы тела на приблизительно 5%, и эффект исчезал после 10-го дня после введения (фиг. 10).

По окончании тестирования измеряли уровни гликированного гемоглобина, свидетельствующие о среднем значении уровня глюкозы в крови, и анализировали изменения среднего уровня глюкозы в крови в каждой тестируемой группе. В то время как в группе, которой вводили наполнитель, наблюдали повышение уровней гликированного гемоглобина на 0,25, в группе, которой вводили DFD74, наблюдали повышение на 0,1, а в группе, которой вводили DFD72, - снижение на 0,27 (фиг. 11).

Экспериментальный пример 6. Активность слитых белков у мышей с алиментарным ожирением

Экспериментальный пример 6-1. Экспериментальный способ оценки активности у мышей с алиментарным ожирением

Оценивали эффект снижения массы тела DFD18, мутантного слитого белка FGF21, у мышей с алиментарным ожирением. Для модели алиментарного ожирения мышей C57BL/6J приобретали в Central Lab. Animal Inc. и держали на диете с высоким содержанием жира, включающей 60 ккал% жира (корм для исследования), в течение от 8 до 12 недель. Мышей разделяли на группы (n=8/группу) так, чтобы они имели схожие средние значения массы тела за один день до введения лекарственного средства (день 0), а затем однократно подкожно вводили 30 нмоль/кг образцов. Изменения массы тела сравнивали с группой, которой вводили наполнитель (PBS).

Экспериментальный пример 6-2. Активность белка у мышей с алиментарным ожирением

Что касается изменений массы тела с течением времени в модели алиментарного ожирения на мышах после однократного введения 30 нмоль/кг DFD18, подтверждали, что эффект снижения массы тела сохранялся к 10-му дню после введения, и максимальное снижение массы (на приблизительно 18%) наблюдали на 11-ыйдень после введения, что сохранялось к 14-му дню (фиг. 12).

Пример получения 2. Получение и очистка белков с двойной функцией

Пример получения 2-1. Получение экспрессирующих векторов для экспрессии белков с двойной функцией

Для определения эффектов последовательности мутантного белка GLP-1 и последовательности слитого с ним Fc-шарнира в отношении активности in vitro, фармакокинетических профилей и фармакологической эффективности конструировали различные последовательности Fc-слитых мутантных белков GLP-1. Последовательности мутантных белков GLP-1 приведены в таблице 7 ниже, а последовательности Fc-слитых мутантов GLP-1 приведены в таблице 8.

[Таблица 7]

SEQ ID NO	Последовательность мутантного белка GLP-1
43	GLP-1(A2G)
44	GLP-1(GE)
45	GLP-1(GG)
46	GLP-1(GEG)

[Таблица 8]

SEQ ID NO	Fc-слитый мутантный белок GLP-1
49	DFD52: GLP1(A2G)-HyFc5
50	DFD53: GLP1(A2G)-HyFc40
51	DFD54: GLP1(GE)-HyFc5
52	DFD55: GLP1(GE)-HyFc40
53	DFD56: GLP1(GG)-HyFc5
54	DFD57: GLP1(GG)-HyFc40
55	DFD58: GLP1(GEG)-HyFc5
56	DFD59: GLP1(GEG)-HyFc40

В таблице 8 HyFc5 относится к SEQ ID NO: 47, а HyFc40 относится к SEQ ID NO: 48.

Для исследования эффектов последовательностей мутантных белков GLP-1 и мутантных белков FGF21, последовательности Fc-шарнира, слитого с мутантами GLP-1, последовательности линкера, соединяющего FGF21 мутантные белки и Fc, в отношении активности in vitro, фармакокинетических профилей и фармакологической эффективности конструировали различные последовательности белков с двойной функцией. Последовательности белков с двойной функцией, включающих мутантные белки GLP-1 и мутантные белки FGF21, приведены в таблице 9 ниже. Каждый белок с двойной функцией содержит мутантный белок GLP-1, Fc-область иммуноглобулина, линкер и мутантный белок FGF21, соединенные в этом порядке с N-конца к C-концу.

[Таблица 9]

SEQ ID NO	Код материала	Последовательность мутантного белка GLP-1	Носитель для слияния	Последовательность линкера	Изменения в последовательности FGF21
58	DFD23	GLP-1(A2G)	hyFc40 (SEQ ID NO: 48)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
59	DFD24	GLP-1(GE)	hyFc5 (SEQ ID NO: 47)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
60	DFD25	GLP-1(GE)	hyFc40 (SEQ ID NO: 48)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
61	DFD26	GLP-1(GG)	hyFc5 (SEQ ID NO: 47)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
62	DFD27	GLP-1(GG)	hyFc40 (SEQ ID NO: 48)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
63	DFD28	GLP-1(GEG)	hyFc5 (SEQ ID NO: 47)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
64	DFD29	GLP-1(GEG)	hyFc40 (SEQ ID NO: 48)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
65	DFD69	GLP-1(GEG)	hyFc40 (SEQ ID NO: 48)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV, A180E)
66	DFD112	GLP-1(GEG)	hyFc40 (SEQ ID NO: 48)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAN, A180E)
67	DFD114	GLP-1(GEG)	hyFc40 (SEQ ID NO: 48)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, G170N, A180E)

В частности, нуклеотидные последовательности, кодирующие каждый из белков с двойной функцией, синтезировали после консультации с Bioneer Corporation (Korea) с учетом аминокислотной последовательности каждого белка. Последовательности для ферментов рестрикции NheI и NotI добавляли на 5'-конец и 3'-конец нуклеотидных последовательностей, кодирующих каждый из белков с двойной функцией, и рядом с последовательностью для фермента рестрикции на 5'-конце встраивали инициаторный кодон для трансляции белка и лидерную последовательность (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA), делающую возможной секрецию экспрессируемого белка вне клетки. Терминирующий кодон встраивали рядом с нуклеотидной последовательностью, кодирующей каждый из белков с двойной функцией. Нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый из белков с двойной функцией, клонировали в экспрессирующий вектор pTrans-empty с использованием двух ферментов рестрикции NheI и NotI. Экспрессирующий вектор pTrans-empty, имеющий простую структуру, включающую промотор CMV, точку начала репликации из pUC, точку начала репликации из SV40 и ген устойчивости к ампициллину, приобретали в CEVEC Pharmaceuticals (Germany).

Пример получения 2-2. Конструирование плазмидной ДНК для экспрессии Fc-слитого мутанта GLP-1 и белков с двойной функцией

E. coli трансформировали с использованием каждого из экспрессирующих векторов, сконструированных, как описано в примере получения 2-1, для получения большого количества плазмидной ДНК для использования в экспрессии. Клетки E. coli, клеточные стенки которых ослаблены посредством теплового шока, трансформировали с использованием каждого экспрессирующего вектора, и трансформанты высевали на чашки с LB для получения колоний. Полученными таким образом колониями инокулировали среды LB, культивировали при 37°C в течение 16 часов и каждую культуру E. coli, содержащую каждый экспрессирующий вектор, получали в объеме 100 мл. Полученные таким образом E. coli центрифугировали для удаления среды для культивирования, а затем добавляли растворы P1, P2, P3 (QIAGEN, кат. №:12963) для разрушения клеточных стенок, таким образом, получая суспензию ДНК, в которой белки и ДНК разделены. Плазмидную ДНК выделяли из полученной таким образом суспензии ДНК с использованием колонки для очистки ДНК Qiagen. Элюированную плазмидную ДНК идентифицировали посредством электрофореза в агарозном геле и измеряли концентрации и чистоту с использованием устройства Nanodrop (Thermo scientific, Nanodrop Lite). Полученную таким образом ДНК использовали для экспрессии.

Пример получения 2-3. Экспрессия Fc-слитых мутантов GLP-1 и белков с двойной функцией в CAP-T-клетках

Линии клеток человека трансформировали с использованием каждой плазмидной ДНК, полученной в примере получения 2-2. Каждый тип плазмидной ДНК трансдуцировали в CAP-T-клетки (CEVEC), которые культивировали в среде PEM (Life technologies), с использованием раствора PEI (Polyplus, кат. №:101-10N). Смешанный раствор ДНК и раствора PEI смешивали с суспензией клеток, культивируемой при 37°C в течение 5 часов, с использованием среды для экспрессии Freestyle293 (Invitrogen) и добавляли среду PEM. После культивирования при 37°C в течение 5-7 дней культуру центрифугировали для удаления клеток и получали супернатант, содержащий каждый белок.

Пример получения 2-4. Очистка Fc-слитых мутантов GLP-1 и белков с двойной функцией

Колонку для аффинной хроматографии с протеином A (GE Healthcare) уравновешивали 1-кратным буфером PBS (pH 7,4). Супернатант культуры, включающий каждый из Fc-слитых мутантов GLP-1 и белков с двойной функцией, полученных, как описано в примере получения 2-3, фильтровали с использованием фильтра 0,2 мкм, а затем нагружали на колонку для аффинной хроматографии с протеином A. Колонку промывали 1-кратным буфером PBS (pH 7,4) а затем белки элюировали с использованием 100 мМ глицинового буфера (pH 3,0). Белки, полученные посредством аффинной хроматографии, очищали с использованием колонки с анионообменной смолой (POROS® HQ 50 мкм, Thermo Fisher Scientific). Колонку с анионообменной смолой уравновешивали 50 мМ буфером Трис (pH 8,0) перед нагрузкой на нее белков, элюированных из колонки для аффинной хроматографии.

После промывки колонки 50 мМ буфером Трис (pH 8,0) 50 мМ буфер Трис (pH 8,0) распределяли по градиенту концентрации и анализировали элюированные фракции. Каждую элюированную фракцию анализировали с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC-ВЭЖХ), собирали фракции, включающие Fc-слитые мутанты GLP-1 и белки с двойной функцией с высокой чистотой, и подвергали их диализу в течение ночи при 4°C с использованием конечного буферного раствора (1-кратный PBS, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4). После завершения диализа полученный стоковый раствор белка концентрировали при 3000 об./мин. с использованием центрифужного фильтра с отсечкой по молекулярной массе 30000 при 4°C. Концентрацию каждого белка измеряли посредством количественного анализа BCA.

Экспериментальный пример 7. Активность белков с двойной функцией in vitro

Экспериментальный пример 7-1. Активность DFD23, DFD24, DFD25, DFD26, DFD27, DFD28 и DFD29

Измеряли GLP-1-активности in vitro белков с двойной функцией DFD23, DFD24, DFD25, DFD26, DFD27, DFD28 и DFD29. В частности, для оценки GLP-1-активности белков с двойной функцией приобретали и использовали линию клеток CHO (Eurofins, HTS163C2), гиперэкспрессирующую рецептор GLP-1 человека. Для оценки активности образцы, содержащие слитые белки (стоковые растворы белков, полученные, как описано в примере получения 2-4; далее в настоящем описании обозначаемые как "образец") подвергали 4-кратному серийному разведению при концентрации 25 нМ. После обработки линии клеток CHO, гиперэкспрессирующей рецептор GLP-1 человека, в течение 30 минут измеряли продуцируемый внутриклеточный цАМФ (Cisbio, 62AM4PEB). Активность каждого белка оценивали, сравнивая значения EC₅₀.

Как показано на фиг. 13, белок с двойной функцией, содержащий последовательность GLP-1 (A2G), демонстрировал активность приблизительно в 2-3 раза более низкую, чем у белков с двойной функцией, содержащих другие мутантные последовательности GLP-1. Не наблюдали значимых различий GLP-1-активности между белками с двойной функцией, содержащими последовательности мутаций, за исключением последовательности GLP-1 (A2G).

Экспериментальный пример 7-2. Активности DFD59, DFD69, DFD112 и DFD114

Измеряли GLP-1-активности in vitro белков с двойной функцией DFD69, DFD112 и DFD114, полученных, как описано в примере получения 2, и DFD59 (Fc-слитый мутант GLP-1). В частности, для оценки GLP-1-активности белков с двойной функцией приобретали и использовали линию клеток CHO (Eurofins, HTS163C2), гиперэкспрессирующую рецептор GLP-1 человека. Для оценки активности образец, содержащий каждый из слитых белков, подвергали 4-кратному серийному разведению при концентрации 25 нМ. После обработки линии клеток CHO, гиперэкспрессирующей рецептор GLP-1 человека, в течение 30 минут измеряли продуцируемый внутриклеточный цАМФ (Cisbio, 62AM4PEB).

Как показано на фиг. 14, активность каждого белка оценивали, сравнивая значения EC₅₀. Три белка с двойной функцией демонстрировали схожие значения EC₅₀, и DFD59 (содержащ no FGF21 мутант) демонстрировал активность, приблизительно в 2 раза превосходящую активность белков с двойной функцией.

Затем измеряли активности in vitro FGF21-части в DFD69, DFD112 и DFD114. В частности, активности in vitro FGF21-части в белках с двойной функцией оценивали с использованием линии клеток HEK293, гиперэкспрессирующей β-klotho человека (корецептор FGF21). Для оценки активности образцы, содержащие каждый из белков с двойной функцией, подвергали 3-кратному серийному разведению при концентрации 3 мкМ. После культивирования в условиях недостатка сыворотки в течение 5 часов, линию клеток HEK293, гиперэкспрессирующих β-klotho человека, обрабатывали в течение 20 минут перед лизисом клеток посредством добавления буфера для цитолиза (Cisbio/кат. № 64ERKPEG) с перемешиванием при 60 об./мин. в течение 30 минут при комнатной температуре. Раствор лизата клеток смешивали с антителами, с помощью которых можно определять ERK и фосфорилированную ERK, и смесь держали при комнатной температуре в течение 2 часов. Флуоресценцию определяли с использованием флуорометрического детектора (TECAN/GENiosPro). Измеряли активности, сравнивая их значения EC₅₀.

Подтверждали, что активности in vitro FGF21-части белков с двойной функцией DFD69, DFD112 и DFD114 являлись схожими, как показано на фиг. 14.

Экспериментальный пример 8. Фармакокинетическая оценка белков с двойной функцией

Экспериментальный пример 8-1. Экспериментальный способ фармакокинетической оценки

Самцов мышей ICR возрастом шесть недель, приобретенных в Orient BIO (Korea), разделяли на группы (n=3/время забора крови) так, чтобы они имели схожие средние значения массы тела за один день до введения лекарственного средства, и им однократно подкожно вводили соответствующий образец в объеме 1 мг/кг. Образцы крови собирали через 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 и 240 часов после инъекции, соответственно. Измеряли концентрацию каждого белка с двойной функцией в крови, отдельно учитывая FGF21-часть и GLP-1-Fc-часть. Концентрацию интактной полноразмерной FGF21-части белка с двойной функцией в крови измеряли с использованием набора для ELISA интактного FGF21 человека (F1231-K01, Eagle Biosciences, USA), имеющего иммунореактивность в отношении N-конца и C-конца белка FGF21. Кроме того, концентрацию активной GLP-1-Fc-части белка с двойной функцией в крови измеряли с использованием антитела, имеющего иммунореактивность в отношении N-конца GLP-1 и Fc, что определяли посредством анализа ELISA. Измеряли концентрации FGF21- и GLP-1-Fc-частей каждого белка в образцах крови, собранных в течение до 240 часов после однократной подкожной инъекции мышам каждого белка, и вычисляли фармакокинетические параметры каждого белка.

Экспериментальный пример 8-2. Результаты исследования фармакокинетической активности

Фармакокинетические параметры FGF21- и GLP-1-Fc-частей белков с двойной функцией вычисляли с учетом концентрации каждого активного вещества в крови с течением времени после однократного подкожного введения мышам каждого белка (фиг. 15). Данные представлены в таблице 10 ниже.

[Таблица 10]

	Определение FGF21			Определение GLP-1-Fc
Параметр	DFD69	DFD112	DFD114	DFD59	DFD69	DFD112	DFD114
T_max(часы)	8	8	24	4	4	8	4
C_max(нг/мл)	2715	3619	3711	5202,1	3234	4454	3616
AUC_{последняя}(нг⋅ч/мл)	100907	144395	222504	182852	149083	189338	171687
Время полужизни (часы)	13,4	14,2	39,9	20,7	23,3	24,7	27,2

Как показано в таблице 10, в случаев фармакокинетических параметров FGF21-части DFD114 демонстрировал наибольшую степень воздействия лекарственного средства (AUC) и время полужизни, и DFD112 являлся следующим по значению AUC, а затем DFD69. DFD114 проявлял приблизительно 2-кратное или более высокое повышение значения AUC по сравнению с DFD69. В случае фармакокинетики GLP-1-Fc-части четыре белка (DFD59, DFD69, DFD112 и DFD114), содержащие одинаковую мутантную последовательность GLP-1, демонстрировали схожие значения AUC.

Экспериментальный пример 9. Оценка активности у мышей db/db

Экспериментальный пример 9-1. Способ оценки активности у мышей db/db

Мышей db/db, отличающихся гипергликемией, резистентностью к инсулину, гиперфагией, жировым гепатозом и ожирением по причине генетической недостаточности рецептора лептина и проявляющих более серьезную гипергликемию и ожирение, чем мыши ob/ob, широко используют для исследования диабета 2 типа. Самцов мышей db/db (Harlan, USA) приобретали в Raonbio (Korea). Эти мыши имели возраст от 5 до 6 недель на момент получения и от 8 до 9 недель на момент введения лекарственного средства после 3 недель адаптации. Мышей разделяли на группы (n=6/группу) так, чтобы они имели схожие средние значения массы тела и уровни глюкозы в крови из хвостовой вены за один день до введения лекарственного средства (день 0), и образцы вводили однократно подкожно, каждый в своей соответствующей дозировке. Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS, Gibco, USA) вводили в качестве наполнителя и измеряли концентрацию глюкозы в крови с использованием глюкометра GlucoDr (All Medicus, Korea). Уровни глюкозы не натощак и массу тела измеряли ежедневно до 14-го дня после введения. Также в каждой группе измеряли уровни гликированного гемоглобина перед введением и после тестирования. Уровни гликированного гемоглобина вычисляли с использованием набора DCA 2000 HbA1c (Siemens, 5035C).

Экспериментальный пример 9-2. Оценка активности у мышей db/db

Изменения уровней глюкозы не натощак в крови и массы тела у самцов мышей db/db определяли после однократной подкожной инъекции 10 или 30 нмоль/кг белка с двойной функцией DFD114, однократной подкожной инъекции 30 нмоль/кг белка GLP-1-Fc длительного действия с одной функцией DFD59, и комбинированного введения 30 нмоль/кг DFD59 и DFD74(являющихся белками с одной функцией GLP-1-Fc и Fc-FGF21, соответственно) для сравнения эффекта белка с двойной функцией DFD114 с комбинированным введением белков с одной функцией Fc-FGF21 и GLP-1-Fc.

Белок GLP-1-Fc длительного действия DFD59 вызывал значительное снижение уровней глюкозы в крови к 1-ому дню после введения, но снижение уровня глюкозы в крови уменьшалось после 2-го дня, и уровень глюкозы в крови был схож с уровнем в группе, которой вводили наполнитель, после 40-го дня. В то же время, в группе, которой вводили DFD114, наблюдали исключительные эффекты снижения уровня глюкозы в крови к 3-му дню после введения, и эффекты снижения уровня глюкозы в крови исчезали быстрее после 4-го дня после введения в дозе 10 нмоль/кг, чем при дозе 30 нмоль/кг, что свидетельствует о дозозависимых различиях длительности эффекта снижения уровня глюкозы в крови. В группах, которым осуществляли комбинированное введение каждого белка, наблюдали наиболее длительные эффекты снижения уровней глюкозы в крови по сравнению с эффектами в других группах, что свидетельствует о том, что комбинация GLP-1 и FGF21 обладала исключительным эффектом контроля уровня глюкозы в крови (фиг. 16).

Что касается эффекта снижения массы тела, в группах, которым вводили комбинацию DFD59 и DFD74, наблюдали наиболее выраженные эффекты снижения массы тела, и в группе, которой вводили 30 нмоль/кг DFD114, также наблюдали исключительный эффект снижения массы тела (фиг. 17).

По окончании тестирования измеряли уровни гликированного гемоглобина, свидетельствующие о среднем значении уровня глюкозы в крови, и анализировали изменения среднего уровня глюкозы в крови в каждой тестируемой группе. Как показано на фиг. 18, в группе, которой вводили наполнитель, наблюдали повышенные уровни гликированного гемоглобина по окончании тестирования по сравнению с группой до введения, и в группе, которой вводили DFD59, наблюдали схожее повышение. В группе, которой вводили 30 нмоль/кг DFD114, наблюдали наибольшее снижение уровней гликированного гемоглобина, и группа, в которой осуществляли комбинированное введение, была следующей по эффективности, затем следовала группа, которой вводили 10 нмоль/кг DFD114. При оценке белков посредством их сравнения с учетом снижения уровней гликированного гемоглобина в каждой исследуемой группе подтверждали, что белок с двойной функцией DFD114 демонстрировал более сильный эффект снижения уровня глюкозы в крови, чем белок с одной функцией GLP-1-Fc или Fc-FGF21 в отдельности.

Экспериментальный пример 10. Активность слитых белков у мышей HFD/STZ

Экспериментальный пример 10-1. Экспериментальный способ оценки активности у мышей HFD/STZ

Эффекты белков с двойной функцией в отношении снижения уровня глюкозы в крови и массы тела сравнивали и оценивали на другой модели диабета, мышах HFD/STZ.

Общепринятые модели алиментарного ожирения на мышах (индуцируемого использованием диеты с 60 ккал% с высоким содержанием жира на мышах C57BL/6 в течение восьми или более недель) обладают слабыми гипергликемическими и диабетическими признаками, хотя они имеют резистентность к инсулину. Мыши HFD/STZ, которые могут компенсировать недостатки общепринятых моделей алиментарного ожирения на мышах, способны образовывать дисфункциональные β-клетки в поджелудочной железе, имеют сниженную секрецию инсулина в результате диеты с высоким содержанием жира (HFD) и введения низкого количества стрептозотоцина (STZ) и, таким образом, применимы для фармакологических исследований диабета 2 типа. Для получения модели на мышах HFD/STZ мышей C57BL/6 держали на диете с 60 ккал% с высоким содержанием жира в течение четырех недель, а затем интраперитонеально вводили 50 мг/кг STZ (Sigma, 85882) ежедневно в течение 3 дней для индуцирования дисфункции β-клеток поджелудочной железы. После использования диеты с высоким содержанием жира еще в течение 2 недель мышей с уровнями глюкозы не натощак в крови 200 мг/дл или выше выбирали для тестирования. Мышей разделяли на группы (n=6/группу) так, чтобы они имели схожие средние значения массы тела и уровни глюкозы в крови из хвостовой вены за один день до введения лекарственного средства (день 0), и образцы однократно подкожно вводили, каждый в своей соответствующей дозировке. В качестве наполнителя вводили фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS, Gibco, USA) и измеряли концентрацию глюкозы в крови с использованием глюкометра GlucoDr (All Medicus, Korea). Уровни глюкозы не натощак и массу тела измеряли ежедневно до 14-го дня после введения. Уровни гликированного гемоглобина также измеряли в каждой группе перед введением и после тестирования. Уровни гликированного гемоглобина вычисляли с использованием набора DCA 2000 HbA1c (Siemens, 5035C).

Экспериментальный пример 10-2. Активность у мышей HFD/STZ

Определяли изменения уровней глюкозы не натощак в крови и массы тела с течением у самцов мышей HFD/STZ после однократной подкожной инъекции 3 нмоль/кг или 10 нмоль/кг белка с двойной функцией DFD114, 10 нмоль/кг Fc-слитого мутанта GLP-1 DFD59, или 10 нмоль/кг каждого из Fc-слитых мутантов FGF21 DFD72 и DFD74. DFD59 и DFD74 также однократно подкожно инъецировали в количестве 10 нмоль/кг каждого для сравнения эффекта комбинированного введения белков с одной функцией с эффектом белка с двойной функцией.

Как показано на фиг. 19, что касается изменений уровней глюкозы в крови до 4-го дня, введение DFD72 и DFD74 (белков FGF21 длительного действия с одной функцией) приводило к более медленному снижению уровня глюкозы в крови, в то время как DFD114 (белок длительного действия, включающий GLP-1), DFD59 и комбинированное введение DFD59 и DFD74 приводило к более быстрому снижению уровня глюкозы в крови с 1-го дня после введения. Аналогично результатам у мышей db/db, DFD59 демонстрировал выраженное снижение уровня глюкозы в крови на ранней стадии, но снижение уровня глюкозы в крови медленно исчезало после 4-го дня. В случае DFD114 наблюдали схожий профиль при низкой дозе 3 нмоль/кг. В группах, которым вводили 10 нмоль/кг DFD114, DFD72, DFD74 и осуществляли комбинированное введение, наблюдали схожие профили уровня глюкозы в крови не натощак.

Что касается эффекта снижения массы тела, в группе, в которой осуществляли комбинированное введение DFD59 и DFD74, наблюдали наиболее выраженный эффект снижения массы тела (от 7 до 8%), и в группе, которой вводили 10 нмоль/кг DFD114, также наблюдали исключительный эффект снижения массы тела (приблизительно 6%) (фиг. 20). В группе, которой вводили DFD59, наблюдали снижение массы тела на 5% в 1-ый день после введения, но эффект исчезал после 2-го дня и становился схожим с эффектом в группе, которой вводили наполнитель, после 7-го дня. В группе, которой вводили каждый из белков FGF21 длительного действия с одной функцией DFD72 и DFD74, наблюдали более медленное снижение массы тела на 4-5% до 7-го дня после введения, и эффект исчезал после 10-го дня.

По окончании тестирования измеряли уровни гликированного гемоглобина, свидетельствующие о среднем значении уровня глюкозы в крови, и анализировали изменения среднего уровня глюкозы в крови в каждой тестируемой группе (фиг. 21). В группе, которой вводили наполнитель, наблюдали повышение уровней гликированного гемоглобина по окончании тестирования по сравнению с группой до введения, и в группе, которой вводили DFD59, наблюдали схожее повышение. В отличие от этого, в группе, которой вводили DFD114, наблюдали снижение уровней гликированного гемоглобина дозозависимым образом, и в группе, которой вводили 10 нмоль/кг DFD114, наблюдали наиболее выраженный эффект в отношении снижения уровней гликированного гемоглобина (-0,42%). В группе, в которой осуществляли комбинированное введение DFD59 и DFD74, наблюдали сниженные уровни гликированного гемоглобина (-0,38%), схожие с уровнями в случае DFD114. В случае белков FGF21 длительного действия с одной функцией наблюдали, что DFD72 превосходил DFD74. Сравнивая белки с учетом снижения уровней гликированного гемоглобина в каждой группе, подтверждали, что белок с двойной функцией DFD114 превосходил белки GLP-1-Fc и Fc-FGF21 с одной функцией.

Экспериментальный пример 11. Прогнозирование и оценка иммуногенности

Экспериментальный пример 11-1. Способ прогнозирования иммуногенности и результаты

Для прогнозирования потенциальной иммуногенности белков с двойной функцией осуществляли анализ иммуногенности in silico для каждого белка.

В частности, потенциальную иммуногенность белков с двойной функцией быстро подвергали скринингу способами iTope™ и TCED™ (Prediction of immunogenicity of therapeutic proteins: validity of computational tools, BioDrugs, 2010). В соответствии с двумя способами, T-клеточный эпитоп можно прогнозировать точнее по сравнению с аналитическим способом in silico, зависящим исключительно от анализа связывания MHC класса II.

Экспериментальный пример 11-2. Способ оценки иммуногенности ex vivo и результаты

Для оценки потенциальной иммуногенности белков с двойной функцией осуществляли анализ EpiScreen™ (Increased brain bio-distribution and chemical stability and decreased immunogenicity of an engineered variant of GDNF, Exp Neurol, 2015).

При определении иммуногенности можно идентифицировать аминокислотные последовательности, вызывающие иммуногенность, посредством картирования T-клеточных эпитопов и можно конструировать и получать деиммунизированных мутантов с минимизированной иммуногенностью посредством прогнозирования in silico для переоценки иммуногенности.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> YUHAN CORPORATION

<120> БЕЛКИ С ДВОЙНОЙ ФУНКЦИЕЙ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ

<130> PCB608054YUH

<150> KR 2015-0150576

<151> 2015-10-28

<160> 80

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 181

<212> Белок

<213> FGF21 человека

<400> 1

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 2

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 2

Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly

1 5 10 15

Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu

20 25 30

<210> 3

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 3

Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala

1 5 10 15

<210> 6

<211> 181

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 6

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 7

<211> 182

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 7

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 8

<211> 182

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 8

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 9

<211> 181

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 9

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 10

<211> 181

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 10

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 11

<211> 182

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 11

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 12

<211> 182

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 12

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 13

<211> 181

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 13

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 14

<211> 181

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 14

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 15

<211> 181

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 15

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 16

<211> 182

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 16

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 17

<211> 182

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 17

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 18

<211> 181

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 18

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 19

<211> 181

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 19

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 20

<211> 182

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 20

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 21

<211> 182

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 21

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 22

<211> 181

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 22

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 23

<211> 181

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 23

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 24

<211> 229

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fc IgG4 человека

<400> 24

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 25

<211> 228

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Fc IgG4 человека

<400> 25

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly

225

<210> 26

<211> 223

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант гибридной Fc

<400> 26

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220

<210> 27

<211> 435

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный вариант FGF21, соединенный с гибридной Fc

<400> 27

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala

210 215 220

Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly

225 230 235 240

Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu His Pro Ile

245 250 255

Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg

260 265 270

Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile

275 280 285

Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser

290 295 300

Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly

305 310 315 320

Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr

325 330 335

Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile

340 345 350

Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro

355 360 365

Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg

370 375 380

Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro

385 390 395 400

Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser

405 410 415

Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser

420 425 430

Tyr Ala Ser

435

<210> 28

<211> 422

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 28

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala

210 215 220

Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly

225 230 235 240

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

245 250 255

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

260 265 270

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

275 280 285

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

290 295 300

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

305 310 315 320

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

325 330 335

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

340 345 350

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

355 360 365

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

370 375 380

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

385 390 395 400

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

405 410 415

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

420

<210> 29

<211> 420

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 29

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro

405 410 415

Ser Tyr Ala Ser

420

<210> 30

<211> 420

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 30

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg Ser Pro

405 410 415

Ser Tyr Ala Ser

420

<210> 31

<211> 419

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 31

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Ala Ser

<210> 32

<211> 419

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 32

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Ala Ser

<210> 33

<211> 419

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 33

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Ala Ser

<210> 34

<211> 419

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 34

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu

325 330 335

Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Ala Ser

<210> 35

<211> 420

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 35

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu

325 330 335

Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro

405 410 415

Ser Tyr Ala Ser

420

<210> 36

<211> 420

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 36

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu

325 330 335

Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro

405 410 415

Ser Tyr Glu Ser

420

<210> 37

<211> 420

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 37

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu

325 330 335

Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg Ser Pro

405 410 415

Ser Tyr Glu Ser

420

<210> 38

<211> 419

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 38

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu

325 330 335

Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Ala Ser

<210> 39

<211> 419

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 39

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln

245 250 255

Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu

260 265 270

Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu

290 295 300

Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu

325 330 335

Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu

340 345 350

Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro

355 360 365

Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu

370 375 380

Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser

385 390 395 400

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser

405 410 415

Tyr Glu Ser

<210> 40

<211> 423

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> REG (Amgen)

<400> 40

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly

245 250 255

Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu

260 265 270

Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp

275 280 285

Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val

290 295 300

Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro

305 310 315 320

Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser

325 330 335

Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu

340 345 350

Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg

355 360 365

Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu

370 375 380

Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro

385 390 395 400

Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Gly Ser Gln Gly

405 410 415

Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

420

<210> 41

<211> 424

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FGF21, соединенный с Fc(lilly)

<400> 41

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

225 230 235 240

Gly Gly Ser Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe

245 250 255

Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln

260 265 270

Thr Glu Cys His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala

275 280 285

Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro

290 295 300

Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln

305 310 315 320

Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala

325 330 335

Cys Ser Phe Arg Glu Asp Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln

340 345 350

Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asp Lys Ser Pro

355 360 365

His Arg Lys Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro

370 375 380

Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln

385 390 395 400

Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Arg Leu Val Glu Pro Ser

405 410 415

Gln Leu Arg Ser Pro Ser Phe Glu

420

<210> 42

<211> 31

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1

<400> 42

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 43

<211> 31

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1

<400> 43

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 44

<211> 31

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1

<400> 44

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 45

<211> 31

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1

<400> 45

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly

20 25 30

<210> 46

<211> 31

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1

<400> 46

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly

20 25 30

<210> 47

<211> 245

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибридная Fc5

<400> 47

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His

20 25 30

Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

35 40 45

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

50 55 60

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

65 70 75 80

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

85 90 95

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

100 105 110

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

115 120 125

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

130 135 140

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

145 150 155 160

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

165 170 175

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

180 185 190

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

195 200 205

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

210 215 220

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Gly Lys

245

<210> 48

<211> 233

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибридная Fc40

<400> 48

Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu

1 5 10 15

Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

20 25 30

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

35 40 45

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

50 55 60

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

65 70 75 80

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

85 90 95

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

100 105 110

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

115 120 125

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

130 135 140

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

165 170 175

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

195 200 205

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

210 215 220

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

225 230

<210> 49

<211> 276

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1, соединенный с гибридной Fc5

<400> 49

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 50

<211> 264

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1, соединенный с гибридной Fc40

<400> 50

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 51

<211> 276

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1, соединенный с гибридной Fc5

<400> 51

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 52

<211> 264

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1, соединенный с гибридной Fc40

<400> 52

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 53

<211> 276

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1, соединенный с гибридной Fc5

<400> 53

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 54

<211> 264

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1, соединенный с гибридной Fc40

<400> 54

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 55

<211> 276

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1, соединенный с гибридной Fc5

<400> 55

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 56

<211> 264

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант GLP-1, соединенный с гибридной Fc40

<400> 56

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 57

<211> 275

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Дулаглутид

<400> 57

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

50 55 60

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly

275

<210> 58

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(A2G)-HyFc40-GS3-FGF21 (EIRP, TGLEAV)

<400> 58

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 59

<211> 473

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GE)-HyFc5-GS3-FGF21 (EIRP, TGLEAV)

<400> 59

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly

290 295 300

Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr

305 310 315 320

Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala

325 330 335

Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly

340 345 350

Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg

355 360 365

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys

370 375 380

Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser

385 390 395 400

Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly

420 425 430

Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro

435 440 445

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu

450 455 460

Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

465 470

<210> 60

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GE)-HyFc40-GS3-FGF21 (EIRP, TGLEAV)

<400> 60

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 61

<211> 473

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GG)-HyFc5-GS3-FGF21 (EIRP, TGLEAV)

<400> 61

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly

290 295 300

Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr

305 310 315 320

Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala

325 330 335

Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly

340 345 350

Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg

355 360 365

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys

370 375 380

Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser

385 390 395 400

Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly

420 425 430

Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro

435 440 445

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu

450 455 460

Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

465 470

<210> 62

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GG)-HyFc40-GS3-FGF21 (EIRP, TGLEAV)

<400> 62

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 63

<211> 473

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GEG)-HyFc5-GS3-FGF21 (EIRP, TGLEAV)

<400> 63

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly

290 295 300

Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr

305 310 315 320

Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala

325 330 335

Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly

340 345 350

Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg

355 360 365

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys

370 375 380

Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser

385 390 395 400

Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly

420 425 430

Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro

435 440 445

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu

450 455 460

Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

465 470

<210> 64

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21 (EIRP, TGLEAV)

<400> 64

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 65

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21 (EIRP, TGLEAV, A180E)

<400> 65

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

450 455 460

<210> 66

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21 (EIRP, TGLEAN, A180E)

<400> 66

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

450 455 460

<210> 67

<211> 460

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21 (EIRP, G170N, A180E)

<400> 67

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

450 455 460

<210> 68

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 68

Glu Ile Arg Pro

1

<210> 69

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 69

Thr Gly Leu Glu Ala Val

1 5

<210> 70

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант FGF21

<400> 70

Thr Gly Leu Glu Ala Asn

1 5

<210> 71

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Молекула нуклеионовой кислоты, кодирующая DFD23

<400> 71

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttatc tggaaggaca ggccgctaag 60

gagtttatcg catggctcgt caaaggcaga ggcgaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380

tcc 1383

<210> 72

<211> 1419

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Молекула нуклеионовой кислоты, кодирующая DFD24

<400> 72

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaaga gggaggaaca ccggacgggg cggggaagag 120

aagaagaaag aaaaggagaa ggaagagcag gaggagagag aaaccaaaac acccgagtgt 180

cccagtcaca ctcagcctct gggagtgttt ctcttcccac ctaagcccaa ggataccctt 240

atgatttcta ggacacctga ggtgacctgc gtcgttgtgg acgtgagtca agaggaccca 300

gaggtccagt ttaactggta tgttgacggc gtggaagtgc ataatgcaaa aactaaaccc 360

cgcgaggaac aattcaattc aacctaccgg gtcgtttctg tgttgacagt gctgcatcaa 420

gattggctga acgggaagga gtataagtgt aaagtcagta ataagggact cccctctagt 480

atcgaaaaaa ctatttcaaa ggccaaaggc cagcctagag agccacaggt gtacaccctt 540

cctccatccc aagaggagat gacaaagaac caggtgtctc tgacttgtct cgtgaagggg 600

ttctacccta gtgacatcgc tgtcgaatgg gagtcaaacg gacagccaga gaataattat 660

aagacaactc ctcccgttct ggattctgac ggcagcttct ttctgtactc taggcttact 720

gtggacaaaa gtcgctggca agaagggaac gtcttttcat gttctgttat gcacgaggcc 780

ttgcacaatc attatacaca gaagtctctg agtctctcac tgggcaaagg cgggggaggc 840

agcgggggag gcgggtccgg aggcggggga tctcatccca tccctgactc cagtcctctc 900

ctgcaattcg ggggccaagt ccggcagcgg tacctctaca cagatgatgc tcagcagaca 960

gaagcccacc tggagatcag ggaggatggg accgtggggg gcgctgctga ccagagcccc 1020

gaaagtctcc tgcagctgaa agccttgaag cctggagtta ttcaaatctt gggagtcaag 1080

actagtaggt tcctgtgcca gcggccagat ggggccctgt atggatctct ccattttgac 1140

cctgaggcct gcagcttccg ggaggagatc agacccgacg gatacaatgt ttaccagtcc 1200

gaagcccacg gcctccctct gcatctgccc gggaacaagt ctcctcaccg ggaccctgcc 1260

cccagaggac ctgctcgctt cctgccactc ccaggcctgc cccccgcatt gcctgagcca 1320

cccggaatcc tggcccccca gccccctgat gtgggatcct ctgaccctct gagcatggtg 1380

acaggcctgg aggccgtgag aagccccagc tacgcttcc 1419

<210> 73

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Молекула нуклеионовой кислоты, кодирующая DFD25

<400> 73

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaaga ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380

tcc 1383

<210> 74

<211> 1419

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Молекула нуклеионовой кислоты, кодирующая DFD26

<400> 74

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttatc tggaaggaca ggccgctaag 60

gagtttatcg catggctcgt caaaggcggc ggcaggaaca ccggacgggg cggggaagag 120

aagaagaaag aaaaggagaa ggaagagcag gaggagagag aaaccaaaac acccgagtgt 180

cccagtcaca ctcagcctct gggagtgttt ctcttcccac ctaagcccaa ggataccctt 240

atgatttcta ggacacctga ggtgacctgc gtcgttgtgg acgtgagtca agaggaccca 300

gaggtccagt ttaactggta tgttgacggc gtggaagtgc ataatgcaaa aactaaaccc 360

cgcgaggaac aattcaattc aacctaccgg gtcgtttctg tgttgacagt gctgcatcaa 420

gattggctga acgggaagga gtataagtgt aaagtcagta ataagggact cccctctagt 480

atcgaaaaaa ctatttcaaa ggccaaaggc cagcctagag agccacaggt gtacaccctt 540

cctccatccc aagaggagat gacaaagaac caggtgtctc tgacttgtct cgtgaagggg 600

ttctacccta gtgacatcgc tgtcgaatgg gagtcaaacg gacagccaga gaataattat 660

aagacaactc ctcccgttct ggattctgac ggcagcttct ttctgtactc taggcttact 720

gtggacaaaa gtcgctggca agaagggaac gtcttttcat gttctgttat gcacgaggcc 780

ttgcacaatc attatacaca gaagtctctg agtctctcac tgggcaaagg cgggggaggc 840

agcgggggag gcgggtccgg aggcggggga tctcatccca tccctgactc cagtcctctc 900

ctgcaattcg ggggccaagt ccggcagcgg tacctctaca cagatgatgc tcagcagaca 960

gaagcccacc tggagatcag ggaggatggg accgtggggg gcgctgctga ccagagcccc 1020

gaaagtctcc tgcagctgaa agccttgaag cctggagtta ttcaaatctt gggagtcaag 1080

actagtaggt tcctgtgcca gcggccagat ggggccctgt atggatctct ccattttgac 1140

cctgaggcct gcagcttccg ggaggagatc agacccgacg gatacaatgt ttaccagtcc 1200

gaagcccacg gcctccctct gcatctgccc gggaacaagt ctcctcaccg ggaccctgcc 1260

cccagaggac ctgctcgctt cctgccactc ccaggcctgc cccccgcatt gcctgagcca 1320

cccggaatcc tggcccccca gccccctgat gtgggatcct ctgaccctct gagcatggtg 1380

acaggcctgg aggccgtgag aagccccagc tacgcttcc 1419

<210> 75

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Молекула нуклеионовой кислоты, кодирующая DFD27

<400> 75

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttatc tggaaggaca ggccgctaag 60

gagtttatcg catggctcgt caaaggcggc ggcgaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380

tcc 1383

<210> 76

<211> 1419

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Молекула нуклеионовой кислоты, кодирующая DFD28

<400> 76

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc gggaggaaca ccggacgggg cggggaagag 120

aagaagaaag aaaaggagaa ggaagagcag gaggagagag aaaccaaaac acccgagtgt 180

cccagtcaca ctcagcctct gggagtgttt ctcttcccac ctaagcccaa ggataccctt 240

atgatttcta ggacacctga ggtgacctgc gtcgttgtgg acgtgagtca agaggaccca 300

gaggtccagt ttaactggta tgttgacggc gtggaagtgc ataatgcaaa aactaaaccc 360

cgcgaggaac aattcaattc aacctaccgg gtcgtttctg tgttgacagt gctgcatcaa 420

gattggctga acgggaagga gtataagtgt aaagtcagta ataagggact cccctctagt 480

atcgaaaaaa ctatttcaaa ggccaaaggc cagcctagag agccacaggt gtacaccctt 540

cctccatccc aagaggagat gacaaagaac caggtgtctc tgacttgtct cgtgaagggg 600

ttctacccta gtgacatcgc tgtcgaatgg gagtcaaacg gacagccaga gaataattat 660

aagacaactc ctcccgttct ggattctgac ggcagcttct ttctgtactc taggcttact 720

gtggacaaaa gtcgctggca agaagggaac gtcttttcat gttctgttat gcacgaggcc 780

ttgcacaatc attatacaca gaagtctctg agtctctcac tgggcaaagg cgggggaggc 840

agcgggggag gcgggtccgg aggcggggga tctcatccca tccctgactc cagtcctctc 900

ctgcaattcg ggggccaagt ccggcagcgg tacctctaca cagatgatgc tcagcagaca 960

gaagcccacc tggagatcag ggaggatggg accgtggggg gcgctgctga ccagagcccc 1020

gaaagtctcc tgcagctgaa agccttgaag cctggagtta ttcaaatctt gggagtcaag 1080

actagtaggt tcctgtgcca gcggccagat ggggccctgt atggatctct ccattttgac 1140

cctgaggcct gcagcttccg ggaggagatc agacccgacg gatacaatgt ttaccagtcc 1200

gaagcccacg gcctccctct gcatctgccc gggaacaagt ctcctcaccg ggaccctgcc 1260

cccagaggac ctgctcgctt cctgccactc ccaggcctgc cccccgcatt gcctgagcca 1320

cccggaatcc tggcccccca gccccctgat gtgggatcct ctgaccctct gagcatggtg 1380

acaggcctgg aggccgtgag aagccccagc tacgcttcc 1419

<210> 77

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Молекула нуклеионовой кислоты, кодирующая DFD29

<400> 77

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380

tcc 1383

<210> 78

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Молекула нуклеионовой кислоты, кодирующая DFD69

<400> 78

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgag 1380

tcc 1383

<210> 79

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Молекула нуклеионовой кислоты, кодирующая DFD112

<400> 79

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggcca acagaagccc cagctacgag 1380

tcc 1383

<210> 80

<211> 1380

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Молекула нуклеионовой кислоты, кодирующая DFD114

<400> 80

cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60

gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120

agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180

ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240

gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300

gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360

tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420

agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480

agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540

tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600

aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660

ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720

tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780

tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840

cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900

tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960

gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020

gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080

ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140

gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200

aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260

ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320

tcctctgacc ctctgagcat ggtgaaccct tcccagggca gaagccccag ctacgagtcc 1380

1380

<---

Claims

1. Слитый белок для лечения расстройств, связанных с FGF21, выбранных из группы, состоящей из диабета, ожирения, дислипидемии, метаболического синдрома, неалкогольной жировой болезни печени, неалкогольного стеатогепатита и сердечно-сосудистых заболеваний, содержащий мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21), биологически активный белок, представляющий собой глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) или его мутант и Fc-область иммуноглобулина, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой любую из Fc-областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgD или гибридный Fc, содержащий их комбинацию,

где мутантный белок FGF21 содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из следующих мутаций (1)-(3) и (5):

(3) замены аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 70); и

где мутантный белок FGF21 связан с областью Fc иммуноглобулина через линкер, где линкер представляет собой пептид, состоящий из 10-30 аминокислотных остатков, где линкер соединен с С-концом области Fc иммуноглобулина и N-концом мутантного белка FGF21,

где белок FGF21 дикого типа в (1)-(3) и (5) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и,

где слитый белок содержит биологически активный белок, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, соединенные в этом порядке с N-конца к C-концу.

2. Слитый белок по п.1, где аминокислотный остаток N мутантного белка FGF21, встроенным посредством мутации, является гликозилированным.

3. Слитый белок по п.1, где мутант GLP-1 имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 43-46.

4. Слитый белок по п.1, где мутантный белок FGF21 имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 6-8, 10-17, 19-23.

5. Слитый белок по п.1, где линкер имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 2-5.

6. Слитый белок по п.1, где гибридная Fc содержит область IgG4 и область IgD.

7. Слитый белок по п.1, где с помощью линкера дополнительно соединяют Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21.

8. Слитый белок по п.7, где линкер соединяют с C-концом Fc-области иммуноглобулина и N-концом мутантного белка FGF21.

9. Слитый белок по п.7, где линкер имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 2-5.

10. Слитый белок по п.1, где слитый белок имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 65.

11. Слитый белок по п.1, где слитый белок имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 66.

12. Слитый белок по п.1, где слитый белок имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 67.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество слитого белка по любому из пп.1-12 и фармацевтически приемлемый носитель для лечения расстройств, связанных с FGF21, выбранных из диабета, ожирения, дислипидемии, метаболического синдрома, неалкогольного ожирения печени, неалкогольного стеатогепатита и сердечно-сосудистых заболеваний.

14. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.1-12.

15. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.14.

16. Клетка-хозяин для экспрессии и/или секреции слитого белка по любому из пп.1-12, содержащая экспрессирующий вектор по п.15, где клетки не являются человеческими эмбриональными клетками.