CN106559984A - 用于治疗糖尿病的包含长效胰岛素类似物缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防或治疗糖尿病的包含长效胰岛素缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的组合物，及用于治疗糖尿病的方法。更具体而言，长效类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的组合施用，抑制由于胰岛素施用的体重增加及由于促胰岛素肽施用的呕吐与恶心，且还减少胰岛素的所需剂量，由此显著增进药物依从性。此外，本发明涉及在糖尿病患者中施用降低胰脏β细胞副作用的包含长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽类似物缀合物的药物组合物，并涉及降低糖尿病患者胰脏β细胞副作用的方法，该方法包括施用该组合物的步骤。具体而言，本发明的特征在于降低例如与糖尿病进展相关的胰脏β细胞功能异常、胰脏β细胞量降低、脂毒性、或葡萄糖毒性的副作用。

Description

用于治疗糖尿病的包含长效胰岛素类似物缀合物和长效促胰 岛素肽缀合物的组合物
技术领域
本发明涉及有关用于预防或治疗糖尿病的包含长效胰岛素缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的组合物，以及包括施用该组合物步骤的用于治疗糖尿病的方法。
此外，本发明涉及用于在糖尿病患者中降低胰脏β细胞副作用的包含长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的药物组合物，并涉及用于降低糖尿病患者胰脏β细胞副作用的方法，该方法包括施用所述组合物的步骤。具体而言，本发明的特征在于降低副作用，如与糖尿病进展相关的胰脏β细胞功能异常、胰脏β细胞降低、及脂毒性或葡萄糖毒性。
背景技术
胰岛素是由胰脏β细胞分泌的肽，在体内血糖水平(blood glucose level)的控制中起重要作用。与由于胰岛素分泌不足或胰岛素功能异常的血糖水平升高相关的代谢性疾病称为糖尿病。当血糖水平升高是由于胰脏胰岛素分泌衰竭所致时，称为1型糖尿病，而当血糖水平升高是由于体内胰岛素分泌异常或分泌胰岛素的功能异常所致时，称为2型糖尿病。2型糖尿病患者通常用具有化学物质为主要成分的口服降血糖剂来治疗，且在一些情况下，给予其胰岛素；而1型糖尿病患者则基本上需要胰岛素治疗。
目前可用的最常见的胰岛素疗法是在餐前和/或后注射胰岛素。目前，注射用胰岛素是可商购的，且原则上通过皮下注射给予。施用方法视其作用时程而不同。胰岛素注射显示出比经口施用更迅速的降血糖功效，且当经口施用不可行时，胰岛素注射可安全使用。并且，胰岛素的使用无剂量限制。然而，一天三次的长期使用胰岛素会导致例如厌恶注射针、注射装置操作困难、低血糖症、和由于长期使用胰岛素而体重增加的缺点。体重增加可能增加心血管疾病的风险与胰岛素抗性的副作用。同时，已有许多通过维持胰岛素肽药物被人体吸收后的长期、升高的水平来使其功效最大化的努力。例如，长效胰岛素配制剂，例如已开发了Lantus(甘精胰岛素(Insulin glargine)；Sanofi Aventis)和Levemir(地特胰岛素(Insulin detemir)；Novo Nordisk)，其是可商购的。与NPH胰岛素(赫氏中性鱼精蛋白胰岛素(Neutral Protamine Hagedorn))不同，这些长效药物降低了睡眠期间低血糖症的风险，特别是，Levemir或多或少与较少的体重增加相关。然而，这些药物配制剂还具有一天必须给予一次或两次的缺点。
同时，一种促胰岛素肽，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，是由回肠与结肠的L细胞分泌的肠促胰岛素激素。胰高血糖素样肽-1具有增大胰岛素释放及诱发葡萄糖依赖性分泌以防止低血糖发作的功能。由于此特性，其受到关注以作为2型糖尿病的潜在治疗。然而，使用GLP-1作为治疗剂的主要障碍在于其在血浆中少于2分钟的极短半衰期。目前，作为胰高血糖素样肽-1受体激动剂的毒蜥外泌肽-4(exendin-4)是可商购的，其是从吉拉毒蜥(gilamonster)的唾液腺纯化出的胰高血糖素样肽-1类似物。毒蜥外泌肽-4对DPP IV(二肽基肽酶-4)具有抗性，生理活性比胰高血糖素样肽-1高。因此，其具有2至4小时的体内半衰期，比胰高血糖素样肽-1的半衰期长(美国专利No.5,424,286)。然而，用只增强对DPP IV抗性的方法，无法预期其维持足够的生理活性，例如，对于可商购的毒蜥外泌肽-4(艾塞那肽(exenatide))的情形下，仍存在必须对患者施用一天两次的问题，且其施用引起不良事件，如呕吐与恶心，这对患者而言是显著的负担。
这些糖尿病相关的疾病由于胰脏β细胞的功能丧失及细胞凋亡，通常诱发胰脏β细胞量降低，虽然有时间上的差异。
当血糖水平持续增加时，胰脏β细胞基于其功能增强和β细胞量增加而增加胰岛素分泌，从而维持体内血糖水平，但这种分泌增加作用是受限的。即，若维持体内正常血糖水平所需的胰岛素水平大于胰脏β细胞能生产的胰岛素水平，结果最终血糖水平提高，则2型糖尿病的进展变得严重。
临床上，2型糖尿病按照胰岛素抗性、胰岛素分泌降低、和胰脏β细胞功能异常与胰脏β细胞量降低的顺序进展。具体而言，β细胞的功能异常与胰脏β细胞量降低受增加的血脂与葡萄糖所促进。此种血脂与葡萄糖的浓度会诱发脂毒性和/或葡萄糖毒性，因此减弱β细胞的功能以及胰岛素的作用二者，最后使2型糖尿病的预后恶化。因此，抑制脂毒性与葡萄糖毒性可通过β细胞功能与量的保留以及通过胰岛素抗性的改善来显著缓解2型糖尿病的进展。
胰岛素是从胰脏β细胞分泌的肽，其在体内血糖水平的控制中起作用。因此，胰岛素功能的异常和β细胞量(cell mass)的减少与由于体内胰岛素量下降所致的血糖水平增加密切关联。因而，具有降低的胰岛素分泌的糖尿病患者可使用外源胰岛素治疗。根据先前的研究，已知外源胰岛素的施用不仅在改善血糖水平上表现出优异功效，还抑制由于胰脏β细胞过度分泌胰岛素的应激(stress)发生。
然而，外源胰岛素的施用具有诱发体重增加的主要缺点，且此类体重增加涉及血脂水平的增加。因此，很可能使糖尿病的初期发展(progenesis)恶化。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂是一类包括毒蜥外泌肽-4的促胰岛素肽，已知其具有控制血糖水平与降低体重的功效。此外，GLP-1受体激动剂可通过控制β细胞的新生、增殖、与分化以及β细胞的细胞凋亡而增加β细胞量。
实际上，在诱发2型糖尿病的啮齿类动物模型中，已证实GLP-1或毒蜥外泌肽-4的施用刺激β细胞的生长与分化，因而增加β细胞量。然而，GLP-1受体激动剂持续刺激胰脏β细胞中的胰岛素分泌，因此涉及由于β细胞应激增加所致的失能降解的可能性。
为了解决上述问题，发明人提出一种长效蛋白缀合物，其中生理活性多肽通过作为接头的非肽基聚合物以共价键连接至免疫球蛋白Fc区，由此同时维持该蛋白药物的活性并提高其稳定性(韩国专利No.10-0725315)。具体而言，发明人发现各个长效胰岛素缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物发挥显著增加的体内功效(韩国专利No.10-1058209与10-1330868)。
然而，当胰岛素或毒蜥外泌肽-4以维持稳定血糖水平的量注射时，仍存在体重增加、或呕吐与恶心的问题。因此，亟需开发用较低剂量及较不频繁使用的药物对糖尿病显示出优异治疗功效的治疗方法。此外，此类研究集中在增加该生理活性多肽的体内半衰期，而针对能逆转由于胰脏β细胞功能丧失和/或细胞凋亡而使胰脏β细胞量降低的导致患者中糖尿病的不良预后副作用的方法的研究尚未完成。
发明内容
技术问题
本发明人已进行了许多研究与实验以开发同时具有持久治疗功效与降低的不良事件(如呕吐与恶心)的糖尿病治疗剂；及能维持和增加胰脏β细胞功能和量，并为潜在β细胞应激提供安全性的糖尿病治疗剂。本发明人尝试进行同时刺激胰高血糖素样肽-1受体与胰岛素受体的长效毒蜥外泌肽-4缀合物与长效胰岛素类似物缀合物的组合施用。结果他们发现，长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的组合施用增加了体内功效的持续时间与稳定性，且显著降低两种药物的剂量，导致了稳定的血糖水平。他们还发现，其改善由胰高血糖素样肽-1激动剂与毒蜥外泌肽-4或其衍生物诱发的不良事件(如呕吐与恶心)，且长效毒蜥外泌肽-4缀合物的使用降低了由使用胰岛素引起的体重增加。此外，他们发现，其可显著地降低脂毒性与葡萄糖毒性，所述脂毒性与葡萄糖毒性是降低的β细胞功能与量的主要原因，且可缓解糖尿病的进展。基于这些发现，得以完成本发明。
技术方案
本发明的目的在于提供用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包含长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物。
本发明的另一目的在于提供用于预防或治疗糖尿病的方法，该方法包括对罹患糖尿病或处于罹患糖尿病风险的受试者施用该组合物。
本发明的又一目的在于提供用于一种药物组合物，其用于在糖尿病患者中降低一种或多种选自下组的胰脏β细胞副作用：脂毒性、葡萄糖毒性、胰脏β细胞功能异常和胰脏β细胞降低，所述药物组合物包含长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物。
本发明的又一目的在于提供用于在糖尿病受试者中降低一种或多种选自下组的胰脏β细胞副作用的方法：脂毒性、葡萄糖毒性、胰脏β细胞功能异常和胰脏β细胞量降低，该方法包括对罹患糖尿病或处于罹患糖尿病风险的受试者施用所述组合物的步骤。
有利效果
本发明的长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物针对糖尿病表现出优异的治疗效果，具体而言，其组合施用同时刺激胰岛素受体与胰高血糖素样肽-1受体，以改善其功效的体内持续时间与稳定性，并显著降低药物所需剂量并稳定控制血糖于稳定值，从而改善低血糖症及体重增加。此外，其抑制呕吐与恶心，并改善作为糖尿病治疗剂的药物依从性。特别是，其具有显著提高的血液中稳定性及体内功效持续时间，允许降低施用频率，而有助于患者便利性。
此外，根据本发明的长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物表现出优异的糖尿病治疗效果，尤其是当组合施用时，并且同时刺激胰岛素受体与胰高血糖素样肽-1受体，因而增强体内持续时间与稳定性，并进一步通过降低脂毒性与葡萄糖毒性的副作用而提高β细胞功能与增加其量，所述副作用由于糖尿病进展而产生。此外，本发明能提供一种组合物，其中胰岛素制剂的缺点已通过缓解低血糖水平与体重增加而降低。
附图简述
图1是显示糖基化血红蛋白(HbA1c)水平的图，所述水平经测量以检验通过对db/db小鼠组合施用长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的血糖控制(相对于介质，利用Dunnet’s MC检验，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)(相对于长效胰岛素类似物缀合物的单一施用，利用Dunnet’s MC检验，
图2是显示对db/db小鼠组合施用长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物后的体重(BW)变化的图(利用Dunnet’s MC检验，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)(相对于长效胰岛素类似物的单一施用，利用Dunnet’s MC检验，)。
图3是以数值显示通过对db/db组合施用长效胰岛素类似物缀合物(长效胰岛素衍生物缀合物)与长效毒蜥外泌肽-4缀合物，所得的增加β细胞量的效果的图(相对于介质，利用ANOVA检验，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。
图4是显示通过对db/db组合施用12周长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物，血清中的甘油三酯值的图(相对于介质，利用ANOVA检验，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。
图5是显示糖基化血红蛋白(HbA1c)水平的图，该水平经测量以检验通过对db/db小鼠组合施用长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的血糖控制。
最佳模式
在一个方面，本发明提供用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包含具有相似的体内半衰期的长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物。本发明组合物的特征在于长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的组合施用。
具体而言，组合物可为用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括长效胰岛素类似物缀合物及长效促胰岛素肽缀合物，其中胰岛素类似物通过接头或共价键连接至能延长胰岛素类似物的活性持续时间的生物相容性材料；其中促胰岛素肽通过接头或共价键连接至能延长促胰岛素肽的活性持续时间的生物相容性材料。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其用于在糖尿病患者中降低一种或多种选自下组的胰脏β细胞副作用：脂毒性、葡萄糖毒性、胰脏β细胞功能异常和胰脏β细胞量(cell mass)减少，其含有具有相似的体内半衰期的长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物。本发明组合物的特征在于长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物以组合施用。
具体而言，本发明的组合物可以是药物组合物，其用于在糖尿病患者中降低一种或多种选自下组的胰脏β细胞副作用：脂毒性、葡萄糖毒性、胰脏β细胞功能异常和胰脏β细胞量减少，其含有：
长效胰岛素类似物缀合物，其中胰岛素类似物通过接头或共价键连接至能延长胰岛素类似物的活性持续时间的生物相容性材料；及
长效促胰岛素肽缀合物，其中促胰岛素肽通过接头或共价键连接至能延长促胰岛素肽的活性持续时间的生物相容性材料。
本发明的组合物可同时降低脂毒性、葡萄糖毒性、胰脏β细胞功能异常与胰脏β细胞量降低。
由于促胰岛素肽(例如胰岛素类似物与胰高血糖素样肽-1)通过不同作用机制控制血糖水平，仅进行了针对其作为控制血糖水平的治疗剂的用途的研究，其基于发现了在组合施用时它们的功效可被最大化而进行。然而，尚无研究证实，通过脂毒性与葡萄糖毒性的降低与补充作用，组合施用会提高β细胞的功能与量，由此降低单一施用胰岛素或促胰岛素肽会发生的胰脏β细胞的副作用。本发明人首先开发出了上述新用途。
本发明组合物的特征在于，其不仅能降低胰脏β细胞的副作用，还能降低血液中甘油三酯浓度从而降低脂毒性，控制血糖功能从而降低葡萄糖毒性，及维持和/或增加胰脏β细胞量从而抑制糖尿病的进展。因此，本发明组合物能够缓解糖尿病的进展。
上述组合物的特征在于，其在施用了该组合物的糖尿病受试者中改善糖尿病的预后。
在该组合物中，长效促胰岛素肽缀合物:胰岛素类似物缀合物的摩尔比可在1:0.01～1:50的范围。促胰岛素肽缀合物的实例可以是毒蜥外泌肽缀合物，但不限于此。
发明模式
本文所用的术语“长效胰岛素类似物缀合物”或“长效促胰岛素肽缀合物”是指通过共价键或非共价键连接胰岛素类似物或促胰岛素肽与生物相容性材料或载剂所形成的缀合物，相比于未经接合之肽，所述缀合物的形成延长对应胰岛素类似物或促胰岛素肽的活性持续时间。
相比于天然胰岛素，长效胰岛素类似物缀合物的施用降低药物的所需剂量，还减轻不良事件如体重增加、呕吐与恶心。
本发明中，能增加胰岛素类似物与促胰岛素肽的半衰期与生物可利用率或维持其活性的药剂，可以是通过共价键直接结合至胰岛素类似物与促胰岛素肽的载剂，或是指即使不直接形成共价键也能增加胰岛素类似物的体内活性的药剂。
本文所用的术语“生物相容性材料或载剂”是指当其通过共价或非共价键连接至相应的类似物或肽以形成缀合物时，能延长胰岛素类似物或促胰岛素肽的活性持续时间的材料。例如，通过形成缀合物能延长对应类似物或肽的体内半衰期的材料可为根据本发明的生物相容性材料或载剂。能结合至胰岛素类似物与促胰岛素肽的生物相容性材料可通过多种生物相容性材料例示，包括聚乙二醇、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合材料、特定氨基酸序列重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合材料、***、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖类、或聚合物，其形成共价或非共价键以延长体内半衰期。此外，胰岛素类似物或促胰岛素肽与能延长体内半衰期的生物相容性材料间的连接，包括基因重组与使用高或低分子量化合物的体外缀合，但不限于任何连接方法。FcRn结合材料可以是免疫球蛋白Fc区。
本文所用的术语“胰岛素类似物”是指具有天然序列的一个或多个氨基酸变异的肽。
相比于天然胰岛素，胰岛素类似物可以是在胰岛素的B链或A链中具有氨基酸变异，及具有降低的胰岛素效价和/或降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物。天然胰岛素的氨基酸序列如下。
A链：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO:37)
B链：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO:38)
本发明实施例中所用的胰岛素可以是利用基因重组技术产生的胰岛素类似物，但本发明不限于此。该胰岛素包括具有降低的体内外效价和/或降低的胰岛素受体结合能力的所有胰岛素。优选的是，所述胰岛素包括反转胰岛素(inverted insulin)、胰岛素变体、胰岛素片段等，且其可利用固相方法以及基因重组方法来制备，但不限于此。
胰岛素类似物是保留有等同于胰岛素的控制体内血糖水平功能的肽，此类肽包括胰岛素激动剂、衍生物、片段、变体等。
本发明的胰岛素激动剂是指结合至胰岛素受体以显示出等同于胰岛素的生物活性的化合物，其与胰岛素结构无关。
本发明的胰岛素类似物是指相对于天然胰岛素的A链与B链的氨基酸序列具同源性的肽，其可具有通过选自下组的改变而变化的至少一个氨基酸残基：取代(例如α-甲基化、α-羟基化)、缺失(例如脱氨基化)、修饰(例如N-甲基化)、及其组合，并具有调节体内血糖水平的功能。
在本发明中，胰岛素类似物是指结合至胰岛素受体以调节血糖水平的肽模拟物或低或高分子量化合物(即使其氨基酸序列与天然胰岛素无同源性)。
本发明的胰岛素片段是指在胰岛素处添加或缺失了一个或多个氨基酸的片段，其中所述添加的氨基酸可为非天然存在的氨基酸(例如D型氨基酸)，且该胰岛素片段具有调节体内血糖水平的功能。
本发明的胰岛素变体是具有与胰岛素的序列不同的一个或多个氨基酸序列的肽，并且其指保留有调节体内血糖水平功能的肽。
本发明胰岛素的激动剂、衍生物、片段、和变体的各种制备方法可单独或组合使用。例如，本发明包括具有一个或多个不同氨基酸及N末端氨基酸残基脱氨基化，且具有调节体内血糖水平功能的肽。
具体而言，胰岛素类似物的特征可以是一个或多个氨基酸被其他氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸选自下组：B链的位置1、2、3、5、8、10、12、16、23、24、25、26、27、28、29和30处和A链的位置1、2、5、8、10、12、14、16、17、18、19与21处的氨基酸，所述其他氨基酸具体而言是丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸。此外，具有一个或多个氨基酸缺失的胰岛素类似物也可涵盖于本发明范围内，但并非限制所述胰岛素类似物。
优选的胰岛素类似物是这样的胰岛素类似物，其在与生物相容性材料或载剂结合时，具有比天然胰岛素更高的半衰期。所述胰岛素类似物可为公开于韩国专利号2014-0022909与2014-0006938中的胰岛素类似物，但不限于此。
本文所用的术语“长效促胰岛素肽缀合物”是指通过非肽基接头与免疫球蛋白Fc区连接的促胰岛素肽。
本文所用的术语“促胰岛素肽”是指保留有释放胰岛素的功能并刺激胰脏β细胞中的胰岛素合成或表达的肽。具体而言，促胰岛素肽是GLP(胰高血糖素样肽)-1、毒蜥外泌肽-3、或毒蜥外泌肽-4，但不限于此。促胰岛素肽包括天然促胰岛素肽、其前体、其激动剂、其衍生物、其片段、及其变体。
本发明的促胰岛素肽衍生物可包括：其中缺失胰岛素肽N的N末端氨基的去氨基-组氨酰基衍生物，其中用羟基取代氨基的β-羟基咪唑并丙酰基衍生物，其中氨基经两个甲基修饰的二甲基-组氨酰基衍生物；其中用羧基取代N末端氨基的β-羧基咪唑并丙酰基衍生物；或其中缺失N末端组氨酸残基的α碳以只保留咪唑并乙酰基并因此去除氨基的正电荷的咪唑并乙酰基衍生物等。其他N末端氨基突变的衍生物涵盖于本发明范围之内。
在本发明中，促胰岛素肽衍生物可为具有化学突变的N末端氨基或氨基酸残基的毒蜥外泌肽-4衍生物，更具体而言是通过移除或取代存在于毒蜥外泌肽-4的N末端His1残基α碳上的α氨基，或通过移除或取代所述α碳而制备的毒蜥外泌肽-4衍生物。更具体而言是去除了N末端氨基的去氨基-组氨酰基-毒蜥外泌肽-4(DA-毒蜥外泌肽-4)、通过以羟基取代而制备的β-羟基咪唑并丙基-毒蜥外泌肽-4(HY-毒蜥外泌肽-4)、通过以羧基取代而制备的β-羧基咪唑并丙基-毒蜥外泌肽-4(CX-毒蜥外泌肽-4)、通过以两个甲基残基修饰而制备的二甲基-组氨酰基-毒蜥外泌肽-4(DM-毒蜥外泌肽-4)、或去除N末端组氨酸残基的α碳的咪唑并乙酰基-毒蜥外泌肽-4(CA-毒蜥外泌肽-4)，但不限于此。
GLP-1是由小肠分泌的激素，且通常促进胰岛素的生物合成和分泌、抑制升糖素分泌、并促进细胞的葡萄糖摄取。在小肠中，胰高血糖素前体分解为三个肽，即胰高血糖素、GLP-1、和GLP-2。在此，GLP-1是指GLP-1(1-37)，其原本呈不具促胰岛素功能的形式，但随后经处理转变为呈活化的GLP-1(7-37)形式。GLP-1(7-37)的氨基酸序列如下：
GLP-1(7-37)：
HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G(SEQ ID NO:39)
GLP-1衍生物是指表现出与GLP-1氨基酸序列的至少80％氨基酸序列同源性的肽，可呈化学修饰的形式，并表现出至少与GLP-1相等或更高的促胰岛素功能。
GLP-1片段是指呈这样形式的片段，其中天然GLP-1的N末端或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸，其中所添加的氨基酸可能是非天然存在的氨基酸(例如D型氨基酸)。
GLP-1变体是指具有促胰岛素功能的肽，其具有与天然GLP-1的那些不同的一个或多个氨基酸序列。
毒蜥外泌肽-3与毒蜥外泌肽-4是由39个氨基酸组成的促胰岛素肽，其与GLP-1具有53％氨基酸序列同源性。毒蜥外泌肽-3与毒蜥外泌肽-4的氨基酸序列如下：
毒蜥外泌肽-3：
HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID NO:40)
毒蜥外泌肽-4：
HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID NO:41)
毒蜥外泌肽激动剂是指在体内结合毒蜥外泌肽受体，并具有等同于毒蜥外泌肽的生物活性的化合物，其与毒蜥外泌肽的结构无关；毒蜥外泌肽衍生物是指与天然毒蜥外泌肽具有至少80％氨基酸序列同源性并具有促胰岛素功能的肽，其在氨基酸残基上可有一些基团是化学取代的(例如α-甲基化、α-羟基化)、缺失的(例如脱氨基化)、或修饰的(例如N-甲基化)。
毒蜥外泌肽片段是指具有在天然毒蜥外泌肽的N末端或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸并具有促胰岛素功能的片段，其中可能添加非天然存在的氨基酸(例如D型氨基酸)。
毒蜥外泌肽变体是指与天然毒蜥外泌肽具有至少一个不同氨基酸序列的肽，其具有促胰岛素功能，且所述毒蜥外泌肽变体包括其中用丝氨酸或精氨酸取代毒蜥外泌肽-4的位置12处的赖氨酸的肽。
用于毒蜥外泌肽的激动剂、衍生物、片段、和变体的各种制备方法可单独或组合使用。例如，本发明包括具有至少一个不同氨基酸的氨基酸序列、及具有在N末端脱氨基化的氨基酸残基的促胰岛素肽。
在示例性的实施方案中，本发明所用的天然促胰岛素肽与修饰的促胰岛素肽可使用固相合成法合成；而包括天然促胰岛素肽的大部分天然肽可通过重组技术产生。
胰岛素类似物缀合物与促胰岛素肽缀合物可由下式表示：
X-La-F
其中X是胰岛素类似物或促胰岛素肽，其中该胰岛素类似物通过修饰胰岛素的B链或A链的一个或多个氨基酸而制备，L是接头，a是0或自然数(当a为2或更大时，各L是独立的)，F选自聚乙二醇、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、特定氨基酸序列、抗体及其片段、FcRn结合材料、纤连蛋白、糖等。
由于免疫球蛋白Fc区是在体内被代谢的生物可降解多肽，因此其可以安全地用作药物载剂。并且，相比于整个免疫球蛋白分子，免疫球蛋白Fc区具有相对低的分子量，因此其有利于缀合物的制备、纯化与产出。免疫球蛋白Fc区不含因Fab片段，所述Fab片段由于抗体亚型的不同氨基酸序列而是高度不同质性的，因此，可预期所述免疫球蛋白Fc区可大幅增加物质的同质性并且抗原性较低。
本文所用的术语“免疫球蛋白Fc区”是指含有免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)与重链恒定区3(CH3)，而不包含免疫球蛋白的重链与轻链可变区、重链恒定区1(CH1)与轻链恒定区1(CL1)的蛋白。其可进一步在重链恒定区处包含绞链区。并且，只要具有基本相似或比天然免疫球蛋白更佳的生理功能，本发明的免疫球蛋白Fc区可为延长的Fc区，其包含全部或部分重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)，除去重链与轻链可变区。并且，免疫球蛋白Fc区可为在CH2和/或CH3氨基酸序列的相对长的部分中具有缺失的区域。
换言之，本发明的免疫球蛋白Fc区可包含1)CH1域、CH2域、CH3域和CH4域，2)CH1域和CH2域，3)CH1域和CH3域，4)CH2域和CH3域，5)一个或多个域与免疫球蛋白绞链区(或部分绞链区)的组合，及6)重链恒定区与轻链恒定区的各个域的二聚体。
本发明的免疫球蛋白Fc区包括天然氨基酸序列及其序列变体(突变体)。氨基酸序列变体是由于一个或多个氨基酸残基的缺失、***、非保守或保守性取代或其组合，从而不同于天然氨基酸序列的序列。例如在IgG Fc中，已知对于结合而言重要的位置214至238、297至299、318至322、或327至331处的氨基酸残基，可用作供适当的靶标用于修饰。
并且，可能有其他各种变体，包括其中缺失了能形成二硫键的区域的变体、或其中在天然Fc形式的N末端缺失了某些氨基酸残基或对其添加了甲硫氨酸残基的变体。此外，为了移除效应功能，可在补体结合位点发生缺失，如C1q-结合位点与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)位点。制备此类免疫球蛋白Fc区序列衍生物的技术公开于国际专利公告WO97/34631与WO96/32478中。
在蛋白质和肽中通常不改变分子活性的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly，双向均可。
此外，若需要的话，则Fc区可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙酰化、酰胺化等进行修饰。
前述Fc变体是具有与本发明Fc区完全相同的生物活性，或改进的结构稳定性(例如针对热、pH等)的变体。
此外，这些Fc区可从分离自人及其他动物(包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠与豚鼠)的天然形式获得，或可以是从转化的动物细胞或微生物获得的其重组体或衍生物。在此，它们可通过从人或动物生物体分离完整免疫球蛋白并将其用蛋白水解酶处理而获取自天然免疫球蛋白。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化为Fab与Fc区，而胃蛋白酶处理导致pF’c与F(ab)2的生成。这些片段可进行尺寸排阻色谱以分离Fc或pF’c。
免疫球蛋白Fc区可为重组免疫球蛋白Fc区，其是获取自微生物的人来源的Fc区。
此外，免疫球蛋白Fc区可呈具有天然糖链、相比于天然形式增加的糖链、或相比于天然形式减少的糖链的形式，或可呈去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可通过本领域中常见的方法来实现，例如化学法、酶法及使用微生物的遗传工程法。本文中，从Fc区去除糖链导致对补体(c1q)结合亲和力的急剧下降，及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的下降或丧失，由此不诱导不必要的体内免疫反应。就此而论，呈去糖基化或无糖基化形式的免疫球蛋白Fc可更适合本发明目的而作为药物载剂。
如本文所用的，去糖基化是指从Fc区酶促去除糖模块，而无糖基化是指原核生物(优选的是大肠杆菌(E.coli))所产生的无糖基化形式的Fc区。
同时，免疫球蛋白Fc区可来源于人或其他动物(包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠与豚鼠)，特别是来源于人。此外，免疫球蛋白Fc区可为来源于IgG、IgA、IgD、IgE与IgM的Fc区，或是由其组合或其杂合体制造的Fc区。具体而言，其衍生自人血液中最丰富蛋白质中的IgG或IgM，更具体而言，衍生自IgG，已知其增强配体结合蛋白的半衰期。
另一方面，本文所用的术语组合，是指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽之间的连接，以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可由选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段的两个或更多个片段形成。
本文所用的术语“杂合体”是指在单链免疫球蛋白Fc区中，存在编码不同来源的两个或更多个免疫球蛋白Fc片段的序列。在本发明中，可能有各种类型的杂合体。即，杂合体域可由选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc与IgD Fc之CH1、CH2、CH3与CH4的一至四个域组成，并可以包含绞链区。
另一方面，IgG分为IgG1、IgG2、IgG3与IgG4亚型，且本发明包括其组合与杂合体。可使用IgG2与IgG4亚型，更具体而言可使用罕见具有例如补体依赖性细胞毒性(CDC)的效应功能的IgG4的Fc区。即，作为本发明的药物载剂，人IgG4衍生的非糖基化Fc区可用作免疫球蛋白Fc区。人衍生的Fc区比非人衍生的Fc区更为优选，后者可能在人体内充当抗原，并引起例如产生对抗该抗原的新抗体等非期望的免疫反应。
在本发明中，非肽基聚合物是指生物相容性聚合物，其包含由除肽键外的任何共价键彼此连接的两个或更多个重复单元。此类非肽基聚合物可具有两个末端或三个末端。
可用于本发明的非肽基聚合物可选自下组：生物可降解聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化的多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯***、聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)，脂质聚合物，几丁质，透明质酸、及其组合，特别是聚乙二醇。此外，本领域中已知的其衍生物和容易利用本领域中已知方法制备的衍生物可涵盖于本发明范围内。
利用常规的框架内融合法得到的融合蛋白中所用的肽基接头，具有在体内容易被蛋白水解酶切割的缺点，因此如预期无法获得通过载剂增加活性药物血清半衰期的充分功效。然而，在本发明中，可使用非肽基接头以及肽基接头制备缀合物。在非肽基接头中，可使用对蛋白水解酶具有抗性的聚合物，以维持肽的血清半衰期与载剂类似。因此，可使用任何非肽基聚合物而不受限，只要是具有前述功能的聚合物即可，即，对体内蛋白水解酶具有抗性的聚合物。该非肽基聚合物具有范围为1至100kDa，优选为1至20kDa的分子量。
连接至免疫球蛋白Fc区的本发明非肽基聚合物，可为一种聚合物或不同类型聚合物的组合。
用于本发明的非肽基聚合物具有能结合至免疫球蛋白Fc区和蛋白药物的反应性基团。
在非肽基聚合物的两端都具有反应性基团，其优选地选自下组：反应性醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺基丙酸酯、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧甲基、或琥珀酰亚胺基碳酸酯。特别是，当非肽基聚合物在其两端都具有反应性醛基时，能有效地以最少地非特异性反应在两端连接生理活性多肽与免疫球蛋白。通过醛键通过还原性烷基化产生的终产物比通过酰胺键连接的终产物更为稳定。醛反应性基团在低pH选择性地结合至N末端，在高pH(如pH 9.0)结合至赖氨酸残基，以形成共价键。
非肽基聚合物两端的反应性基团可以彼此相同或不同。例如，非肽基聚合物可在一个末端具有马来酰亚胺基，在另一个末端为醛基、丙醛基或丁醛基。当使用两端都具有反应性羟基的聚乙二醇作为非肽基聚合物时，可利用已知的化学反应使羟基活化成为各种反应性基团，或可使用可商购的具有修饰的反应性基团的聚乙二醇，以制备本发明的缀合物。
长效分泌性肽缀合物的种类与制备方法已于韩国专利No.10-1058290、10-1231431和10-1058315中详细说明。
在本发明的一个实施方案中，用PEG修饰咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4(CA毒蜥外泌肽-4)的赖氨酸(Lys)，并将PEG修饰的毒蜥外泌肽-4连接至免疫球蛋白Fc，由此制备长效毒蜥外泌肽-4缀合物(实施例9)。
本发明的此类长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽显著增加体内功效持续时间，且显示出类似的体内半衰期。因此，其组合施用可用于治疗糖尿病。
相比于单一施用，本发明的长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的组合施用能表现出控制血糖水平及改善血脂的优异效果。在本发明的一个实施方案中，证实了长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽(即毒蜥外泌肽-4)缀合物的组合施用能改善脂毒性与葡萄糖毒性，因而维持β细胞量，并进一步抑制糖尿病的进展。这些结果说明，根据本发明的长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的复合组合物，或此类缀合物的组合施用，能显著降低与血脂水平增加相关的脂毒性，及与由于控制血糖水平不足所致的血糖水平上升相关的葡萄糖毒性，其是一些糖尿病患者中单一施用胰岛素或促胰岛素肽后引发的副作用；并且进一步地，通过预防胰脏β细胞功能异常和/或增加胰脏β细胞量，能显著缓解糖尿病的进展，从而导致糖尿病的改善、治疗、和预防并改善糖尿病的预后。
本发明组合物的特征在于长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的组合施用。
当进行本发明的长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的组合施用时，长效胰岛素类似物缀合物作用于胰岛素受体，同时长效促胰岛素肽缀合物作用于胰高血糖素样肽-1受体，从而相比于单一施用，血糖水平下降并维持稳定血糖水平。所述缀合物的组合施用具有降低可由胰岛素单一施用所诱发的低血糖症与体重增加的风险的效果，并且由于促胰岛素肽的作用，还降低总胰岛素的剂量。一个优点是，还能降低促胰岛素肽(例如毒蜥外泌肽-4)的剂量，以防止由毒蜥外泌肽-4的单一施用引起的例如恶心与呕吐的不良作用。使用长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物显著增加了血液半衰期和体内功效的持续时间，从而降低治疗频率，以改善受每日注射之苦的慢性患者的生活质量。因此，其对于治疗糖尿病非常有用。此外，本发明的药物组合物显示出优异的体内功效的持续时间与效价，且在组合施用时，剂量可大幅降低。
此外，不同于传统配制剂，本发明组合物的特征在于能缓解胰脏β细胞功能丧失和胰脏β细胞量的降低，其二者是由于糖尿病患者中发生的胰脏β细胞凋亡所致。通过脂毒性与葡萄糖毒性的下降与互补作用，其能够降低β细胞功能与量的降低，因而抑制糖尿病的进展。由此，本发明的组合物能缓解糖尿病患者中胰脏细胞的副作用。
长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物可以同时、序贯或反向(reversely)施用，并可以有效剂量的适当组合同时施用。具体而言，长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物可分开贮存于个别容器中，然后同时、序贯或反向施用。
此外，作为本发明组合施用的组合物的长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物，可呈糖尿病治疗试剂盒的形式，其包含单一容器中或分开在个别容器中的所述缀合物。试剂盒可包含药学上可接受的载剂及试剂盒的使用说明书。
此外，长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物可分别与促胰岛素肽和胰岛素组合施用。长效胰岛素类似物缀合物可与促胰岛素肽，如GLP-1激动剂(例如艾塞那肽(Exenatide)、利拉鲁肽(Liraglutide)、利西拉来(Lixisenatide))组合施用，并且长效促胰岛素肽缀合物可与胰岛素和胰岛素类似物、基础胰岛素组合施用。
本文所用的术语“糖尿病”是指由胰岛素分泌不足或胰岛素功能异常引起的代谢性疾病。对受试者进行本发明组合物的组合施用以控制血糖水平，由此治疗糖尿病。并且，本发明组合物可用作糖尿病治疗剂，其能维持并增加胰脏β细胞的正常功能和细胞量，并提供针对副作用的安全性(如对潜在β细胞应激)。此外，本发明的组合物能显著降低导致β细胞的功能与量降低的脂毒性与葡萄糖毒性，并能缓解糖尿病的进展。因此，本发明的组合物能显著改善常规药物的副作用。
本文所用的术语“预防”是指所有这样的作用，通过所述作用，糖尿病或胰腺β细胞的副作用的发生经本发明组合物的组合施用而得以遏制或延缓，而术语“治疗”是指所有这样的作用，通过所述作用，糖尿病或胰腺β细胞的副作用的症状经本发明组合物的组合施用而好转或向有利方向改变。糖尿病的治疗和胰腺β细胞的副作用的预防或治疗可应用于可能患有糖尿病的任何哺乳动物，其例子包括人和灵长类动物以及家畜，例如但不限于，牛、猪、羊、马、狗和猫，特别是人。
本文所用的术语“施用(adminstration)”是指利用某种适当方法将预定量的物质引入患者中。只要能到达所期望的组织，组合物可通过任何常见途径施用。涵盖了多种施用模式，包括腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、经口、局部、鼻内、肺内与直肠内，但本发明不限于这些例示性施用模式。然而，由于肽类经口施用后立即消化分解，因此供经口施用组合物的活性成分必须经包衣覆盖或配制，以保护其免于在胃中降解。具体而言，该组合物可以注射用形式施用。此外，长效试剂可使用能运送活性成分进入靶标细胞的某些装置来施用。
此外，本发明的药物组合物可利用一些相关因素来确定，所述因素包括要治疗的疾病类型，施用途径，患者年龄、性别、体重与疾病严重程度，以及作为活性成分的药物的类型。
此外，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载剂。本文所用的术语“药学上可接受的载剂”是指不对生物体引起显著刺激且不消除所施用化合物的生物活性与性质的载剂或稀释剂。对于经口施用，药学上可接受的载剂可包括黏合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、助溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和风味剂。对于注射用制剂，药学上可接受的载剂可包括缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、助溶剂、等张剂和稳定剂。对于局部施用的制剂，药学上可接受的载剂可包括基剂/碱(base)、赋形剂、润滑剂和防腐剂。本发明药物组合物可与上述药学上可接受载剂组合，配制成各种剂型。例如，对于经口施用，药物组合物可配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆或薄片。对于注射用制剂，药物组合物可配制为呈单剂量剂型的安瓿或多剂量容器。药物组合物还可配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊和长效制剂。
另一方面，适用于配制剂的载剂、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、***胶、藻酸盐(alginate)、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。此外，药物配制剂可进一步包含填充剂、抗凝结剂、润滑剂、润湿剂、风味剂和抗菌剂。
在另一方面，本发明提供用于预防或治疗糖尿病的方法，该方法包括对患有糖尿病或处于糖尿病风险的受试者施用包含长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的组合物的步骤。
在一个实施方案中，本发明提供用于在糖尿病患者中降低一种或多种选自下组的胰脏β细胞副作用的方法：脂毒性、葡萄糖毒性、胰脏β细胞功能异常和胰脏β细胞量降低，该方法包括将含有长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的组合物施用于罹患糖尿病的受试者的步骤。
施用步骤可通过长效胰岛素类似物缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合施用来进行，但不限于同时、序贯或反向，并且所述缀合物可以有效剂量的适当组合同时施用。
尽管一周仅施用一次，包含本发明的长效胰岛素类似物缀合物和长效促胰岛素肽缀合物二者的组合物也能表现出血糖水平的优异改善，且不引起体重增加的副作用，因此所述组合物可用于糖尿病的预防或治疗。
在一个实施方案中，本发明提供用于在糖尿病患者中改善和/或降低脂毒性和/或葡萄糖毒性的方法，该方法包括对罹患糖尿病患者施用所述含有长效胰岛素类似物缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合物的步骤。
在一个实施方案中，本发明提供用于改善胰脏β细胞功能和/或保护和/或增加胰脏β细胞量的方法，该方法包括对罹患糖尿病患者施用所述含有长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的组合物的步骤。
下文中，参照实施例更详细地说明本发明。然而，这些实施例仅出于说明目的，本发明不意在受这些实施例的限制。
实施例1：单链胰岛素类似物表达载体的制备
为了制备胰岛素类似物，各类似物在A链或B链中具有一个氨基酸改变，使用可获得的天然胰岛素表达载体作为模板，合成了正向与反向寡核苷酸(表2)，并进行PCR以扩增各个类似物基因。
在A链或B链中经修饰的各氨基酸序列及各个类似物的名称列于下文表1中。即，类似物1在A链的位置1处用丙氨酸取代甘氨酸，而类似物4在B链的位置8处用丙氨酸取代甘氨酸。
表1
类似物 修饰的序列
类似物1 A1G→A
类似物2 A2I→A
类似物3 A19Y→A
类似物4 B8G→A
类似物5 B23G→A
类似物6 B24F→A
类似物7 B25F→A
类似物8 A14Y→E
类似物9 A14Y→N
用于胰岛素类似物扩增的引物列于下表2。
表2
用于胰岛素类似物扩增的PCR在95℃30秒、55℃30秒、和68℃6分钟的条件下进行18个循环。为了将在所述条件下获得的胰岛素类似物片段表达为包涵体，将其各自***至pET22b载体中，如此得到的表达载体分别称为pET22b-胰岛素类似物1至9。所述各表达载体包含处于T7启动子控制下的编码胰岛素类似物1至9的氨基酸序列的核酸，并在宿主细胞中分别将胰岛素类似物表达为包涵体。
胰岛素类似物1至9的DNA序列与蛋白质序列提供于下表3中。
表3
实施例2：重组胰岛素类似物融合肽的表达
在T7启动子控制下表达重组胰岛素类似物。用各个重组胰岛素类似物表达载体转化大肠杆菌(E.coli)BL21-DE3(大肠杆菌B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)gal DE3；Novagen)。依照Novagen推荐的程序进行转化。将用个别重组表达载体转化的单菌落接种于含氨苄青霉素(50/ml)的2X Luria Broth(LB)培养基中，于37℃培养15小时。将重组菌株的各培养液与含30％甘油的2X LB培养基以1:1(v/v)的比例混合，然后将其各以1ml分装至低温保存管中，并贮存于-140℃。将这些样品作为细胞储备物(stocks)以供生产重组融合蛋白。
为了表达重组胰岛素类似物，将各个1小瓶的细胞储备物复苏，然后接种于500ml的2X Luria Broth中，于37℃振荡培养14至16小时。当OD600值达到5.0或更高时，终止培养，并使用该培养液作为种子培养物。将该种子培养物接种至含17L发酵培养基的50L发酵罐(MSJ-U2,B.E.MARUBISHI,Japan)中，以开始最初的批式发酵。培养条件维持于37℃，空气流速20L/min(1vvm)，搅拌速率500rpm以及用氨将pH调整至6.70。当培养液中的营养耗尽时，通过进一步添加补料溶液以分批补料模式进行发酵。利用OD测量来监测细胞生长。OD值高于100或100以上时，以500M的终浓度引入IPTG。引入后，继续进行培养约23至25小时。终止培养后，使用离心机收集重组菌株，并贮存于-80℃备用。
实施例3：重组胰岛素类似物的回收和再折叠
为了将实施例2中所表达的重组胰岛素类似物转变为可溶形式，使细胞破坏，随后再折叠。使100g(湿重)细胞沉淀物重悬于1L的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 9.0)、1mMEDTA(pH 8.0)、0.2M NaCl和0.5％Triton X-100)中。使用微流化处理机M-110EH(ACTechnology Corp.Model M1475C)，在15,000psi操作压力下破坏细胞。使如此破坏的细胞裂解液于7,000rpm和4℃离心20分钟。弃去上清液，使沉淀物重悬于3L洗涤缓冲液(0.5％Triton X-100和50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.2M NaCl、1mM EDTA)中。于7,000rpm和4℃离心20分钟后，使细胞沉淀物重悬于蒸馏水中，随后以相同方式离心。将如此获得的沉淀物重悬于400ml缓冲液(1M甘氨酸、3.78g半胱氨酸-HCl、pH 10.6)中，并于室温搅拌1小时。为了回收如此重悬的重组胰岛素类似物，添加400mL的8M尿素，于40℃搅拌1小时。为了再折叠经溶解的重组胰岛素类似物，于7,000rpm和4℃进行离心30分钟，收集上清液。使用蠕动泵以1000ml/hr的流速对其添加2L蒸馏水，同时于4℃搅拌16小时。
实施例4：阳离子结合色谱纯化
将再折叠的样品加载至已用含45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液平衡的Source S(GE healthcare)柱上，然后在10个柱体积中用0％至100％线性梯度的含0.5M氯化钾和45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液洗脱这些胰岛素类似物蛋白。
实施例5：胰蛋白酶与羧肽酶B处理
使用脱盐柱，从经洗脱的样品去除盐类，并以缓冲液(10mM Tris-HCl、pH 8.0)来交换缓冲液。对于所得的样品蛋白，添加相当于1000摩尔比的胰蛋白酶和相当于2000摩尔比的羧肽酶B，然后在16℃搅拌16小时。使用1M柠檬酸钠(pH 2.0)使pH降至3.5，以终止反应。
实施例6：阳离子结合色谱纯化
将如此反应的样品加载至已用含45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液平衡的Source S(GE healthcare)柱上，然后在10个柱体积中用0％至100％线性梯度的含0.5M氯化钾和45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液洗脱所述胰岛素类似物蛋白。
实施例7：阴离子结合色谱法纯化
使用脱盐柱，从经洗脱的样品去除盐类，并以缓冲液(10mM Tris-HCl、pH 7.5)交换缓冲液。为了从实施例6所得样品分离纯胰岛素类似物，将该样品加载至已用10mM Tris(pH 7.5)缓冲液平衡的阴离子交换柱(Source Q:GE healthcare)上，并在10个柱体积中用0％至100％线性梯度的含0.5M氯化钠的10mM Tris(pH 7.5)缓冲液洗脱胰岛素类似物蛋白。
通过蛋白质电泳(SDS-PAGE)和高压色谱法(HPLC)分析经如此纯化的胰岛素类似物的纯度，并通过肽图谱定位(mapping)与各峰的分子量分析来鉴定氨基酸的修饰。
结果发现，各胰岛素类似物在其氨基酸序列中具有期望的改变。
实施例8：长效胰岛素类似物的制备
在此实施例中，制备天然胰岛素的序列类似物(A链的位置14处为Glu)的长效缀合物作为代表性胰岛素类似物。
使用3.4K ALD2PEG(NOF,Japan)，使胰岛素类似物β链的N端聚乙二醇化；用5mg/ml的胰岛素类似物浓度、以1:4的胰岛素类似物与PEG摩尔比，使胰岛素类似物与PEG在4～8℃反应约2小时。就此而论，反应在pH 6.0的50mM柠檬酸钠和40～60％异丙醇中进行。添加3.0～20.0mM氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)作为还原剂并允许其反应。用SP-HP(GE Healthcare,USA)柱使用含柠檬酸钠(pH 3.0)和乙醇的缓冲液和KCl浓度梯度来纯化反应溶液。
为了制备胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc片段缀合物，将纯化的单-聚乙二醇化胰岛素类似物与免疫球蛋白Fc片段以1:1至1:2的摩尔比在25℃反应12～16小时，总蛋白质浓度约20mg/ml。就此而论，反应缓冲液条件为100mM HEPES，pH 8.2，并对其添加20mM氰基硼氢化钠作为还原剂。因此，制备了在Fc片段的N末端处聚乙二醇化的胰岛素类似物缀合物。
终止反应时，将反应液加载至具有Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液和NaCl浓度梯度的QHP(GE Healthcare，USA)柱上以进行胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc片段缀合物的初步纯化。
此后，使用Source 15ISO(GE Healthcare，USA)作为二级柱以获得胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc片段缀合物。就此而论，使用含Tris-HCl(pH 7.5)的硫酸铵浓度梯度来洗脱胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc片段缀合物。
实施例9：长效毒蜥外泌肽-4缀合物的制备
使用咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4(CA毒蜥外泌肽-4，AP，USA)，使3.4kPropionALD(2)PEG与CA毒蜥外泌肽-4的赖氨酸(Lys)反应。在两个Lys异构物峰中，使用具有较多反应且容易与N端异构物峰区分的最后一个异构物峰(Lys27的位置异构物)用于偶联反应。
反应以1:8的肽:免疫球蛋白Fc的摩尔比，60/的总蛋白浓度，于4℃进行20小时。所述反应在100mM K-P(pH 6.0)的溶液中进行，并添加20mM SCB作为还原剂。通过两个纯化柱纯化偶联反应液。首先，使用SOURCE Q(XK 16mL，Amersham Biosciences)去除大量未参与偶联反应的免疫球蛋白Fc。使用20mM Tris(pH 7.5)和具有盐梯度的1M NaCl，先将结合力相对弱的免疫球蛋白Fc洗脱出来，其后立即洗脱出毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白Fc。通过此第一个纯化程序已将免疫球蛋白Fc一定程度地去除，但由于免疫球蛋白Fc与毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白Fc在离子交换柱中彼此具有类似的结合力，因此不能完全互相分离。因此，基于这两种材料间的疏水性差异，进行二级纯化。在SOURCE ISO(HR 16mL，AmershamBiosciences)中使用20mM Tris(pH 7.5)与1.5M硫酸铵使首次纯化的样品进行偶联，并在逐渐降低的硫酸铵浓度的条件下洗脱样品混合物。在HIC柱中，具有弱结合力的免疫球蛋白Fc先被洗脱，然后具有强结合力的毒蜥外泌肽-4-免疫球蛋白Fc样品较晚被洗脱。由于它们具有显著不同的疏水性，因此比在离子交换柱中更容易彼此分离。
柱：SOURCE Q(XK 16，Amersham Biosciences)
流速：2.0/分钟
梯度：A0→25％70分钟B(A:20mM Tris pH 7.5，B:A+1M NaCl)
柱：SOURCE ISO(HR 16，Amersham Biosciences)
流速：7.0/分钟
梯度：B 100→0％60分钟B(A:20mM Tris pH 7.5，B:A+1.5M硫酸铵)
实施例10：通过长效胰岛素类似物缀合物和长效毒蜥外泌肽-4缀合物的组合施用 在2型糖尿病小鼠中控制血糖与体重变化(Δ体重)的功效
为了测试通过包含实施例8和9制备的长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的这些组合物的施用，或所述长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物组合施用的体内功效，使用了2型糖尿病的db/db小鼠。由于db/db小鼠(BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/OlaHsd小鼠)通过去除瘦蛋白受体显示出类似于人的糖尿病症状，将其用于本实施例中。
使用26G注射器，从8周龄db/db小鼠的尾静脉采取1至2滴血液，然后使用血糖仪(OneTouch Ultra,LifeScan,Inc.,USA)测量血糖水平。根据所测得的血糖(350-600/)来确定糖尿病的诱发。将已诱发糖尿病的小鼠分为G1、G2、G3、G4和G5五组，每组5只或6只小鼠。
这些组分为未处理的对照组(介质)、长效胰岛素类似物缀合物处理组(8.8nmol/kg)、长效毒蜥外泌肽-4缀合物处理组(0.36nmol/kg)、长效胰岛素类似物缀合物(2.2nmol/kg)和长效毒蜥外泌肽-4缀合物(0.36nmol/kg)处理组、以及长效胰岛素类似物缀合物(8.8nmol/kg)和长效毒蜥外泌肽-4缀合物(0.36nmol/kg)处理组。以上述测试材料处理5周后，测量各组的糖基化血红蛋白(HbA1c)水平。糖基化血红蛋白在红细胞中正常地通过葡萄糖与血红蛋白反应而形成。当血糖水平维持高水平时，糖基化血红蛋白水平也增加。小鼠的糖基化血红蛋白水平反映4～5周的平均血糖水平，因此其可用于测量测试材料控制血糖水平的能力。此外，计算测试动物在药物处理前与实验最后一天的体重变化(ΔBW)。
结果，长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的同步处理，显示了糖基化血红蛋白水平的降低(图1)，其相比于长效胰岛素类似物缀合物或长效毒蜥外泌肽-4缀合物的单一施用是显著的改善。此外，虽然胰岛素类似物缀合物的施用剂量降至1/4，但组合施用的效果得到维持。
Δ体重的测量结果显示，长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的同步治疗相比于长效胰岛素类似物缀合物的单一施用显示出缓解体重增加的效果(图2)。此外，当长效胰岛素类似物缀合物的施用剂量降至1/4时，该缓解体重增加的效果显著增加。
这些结果显示，相比于单一施用，本发明的长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的组合施用表现出控制血糖水平的优异效果。此外，即使降低胰岛素类似物缀合物的施用剂量，其通过组合施用的控制血糖水平的效果得到维持。此外，随着长效胰岛素类似物缀合物的施用剂量降至1/4，体重增加显著降低，说明长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的组合施用，由于胰岛素剂量降低而显著降低低血糖症以及体重增加的风险。
实施例11：通过长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的组合施用 在2型糖尿病小鼠中维持β细胞量的功效
为了测试通过施用包含长效胰岛素类似物缀合物(长效胰岛素衍生物缀合物)和长效毒蜥外泌肽-4(长效促胰岛素的实例)缀合物的组合物，或通过组合施用长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的体内功效，使用2型糖尿病的db/db小鼠。
作为用于本实施例中的长效胰岛素衍生物缀合物的胰岛素类似物，使用表1中的类似物8(A14Y→E)并将包括咪唑并-乙酰基毒蜥外泌肽-4(CA毒蜥外泌肽-4)的长效毒蜥外泌肽-4缀合物用作长效促胰岛素肽。用PEG修饰毒蜥外泌肽-4的赖氨酸，并将经PEG修饰的毒蜥外泌肽-4连接至免疫球蛋白Fc以产生长效毒蜥外泌肽-4缀合物。具体而言，CA毒蜥外泌肽-4和胰岛素类似物8以1.01至1:50的摩尔比反应以产生其缀合物。
由于db/db小鼠(BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/OlaHsd小鼠)通过去除瘦蛋白受体显现出类似人的糖尿病症状，将所述小鼠用于本实施例中。
使用26G注射器，从12周龄db/db小鼠的尾静脉采取1至2滴血液，然后使用血糖仪(OneTouch Ultra,LifeScan,Inc.,USA)测量血糖水平。根据所测量的血糖(无糖尿病的正常范围为约100～150mg/dl；并且为了实施例的准确性，选择及使用血糖水平大于350mg/dl的小鼠)来确定糖尿病的诱发。将已诱发糖尿病的小鼠分为G1、G2、G3、G4、G5、G6和G7七组，每组7只或8只小鼠。
这些组分成未处理的对照组(介质)、依剂量(4.2nmol/kg、8.4nmol/kg)的两组长效胰岛素类似物缀合物处理组、长效毒蜥外泌肽-4缀合物处理组(0.36nmol/kg)、长效胰岛素类似物缀合物(4.2nmol/kg)与长效毒蜥外泌肽-4缀合物(0.36nmol/kg)的组合施用组、及长效胰岛素类似物缀合物(8.4nmol/kg)与长效毒蜥外泌肽-4缀合物(0.36nmol/kg)处理组的组合施用组。
以上述剂量以2天为间隔重复施用上述测试材料12周后，测量各组的糖基化血红蛋白(HbA1c)水平。糖基化血红蛋白是正常存在于红细胞中的结合葡萄糖的血红蛋白形式。当血糖水平维持高水平时，糖基化血红蛋白水平也增加。小鼠的糖基化血红蛋白水平反映4～5周的平均血糖水平，因此可用于测量测试材料控制血糖水平的能力。在12周重复药物施用后，从小鼠眶静脉收集血液，从所收集的血清测量血清甘油三酯浓度。在各受试者的剖检后，取胰脏来测量β细胞量。
结果，长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的组合施用显示出糖基化血红蛋白水平的降低(图5)，其相比于长效胰岛素类似物缀合物或长效毒蜥外泌肽-4缀合物的单一施用是显著的改善。
测量了血清中甘油三酯的浓度，结果显示，在长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的组合施用组中，甘油三酯的浓度以剂量依赖性方式降低(图4)。
各药物处理组的β细胞量的比较结果证实，与对照组相比，长效胰岛素类似物缀合物的单一处理组、长效毒蜥外泌肽-4缀合物的单一处理组、及所述两种缀合物的组合施用组表现出增加的β细胞量(图3)。此外，相比于长效胰岛素类似物缀合物或长效毒蜥外泌肽-4缀合物的单一处理组，所述两种药物的组合施用组显示出协同效应。基于这些结果，通过长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的组合施用，降低了脂毒性与葡萄糖毒性。
这些结果显示，相比于单一施用，本发明的长效胰岛素类似物缀合物与长效毒蜥外泌肽-4缀合物的组合施用表现出控制血糖水平与改善血脂的优异效果。这些结果表明，长效胰岛素类似物缀合物和毒蜥外泌肽-4缀合物的组合施用(其是长效促胰岛素肽)能够基于脂毒性和葡萄糖毒性的改善来维持β细胞量并抑制糖尿病进展。此外，这些结果表明，根据本发明的长效胰岛素类似物缀合物与长效促胰岛素肽缀合物的复合组合物，或所述两种缀合物的组合施用，能显著降低与脂质水平增加相关的脂毒性，以及与由于血糖控制不足所致的血糖水平增加相关的葡萄糖毒性，其是单一施用胰岛素或促胰岛素肽后在一些糖尿病患者中产生的副作用；并且进一步通过预防胰脏β细胞功能异常和/或增加胰脏β细胞量能大幅缓解糖尿病的进展，从而导致糖尿病的改善、治疗、和预防并改善糖尿病的预后。
基于以上叙述，本领域技术人员会理解，本发明可在不改变其技术主旨或必要特征情况下，以不同的具体形式实施。因此，应理解的是，上述具体实施方案不是限制性的，而是在所有方面都是说明性的，并且衍生自权利要求书中所限定的主题或其等同物的所有变化和修饰意欲囊括于本发明的范围内。
序列表
<110> 韩美药品株式会社(HANMI PHARM. CO., LTD.)
<120> 用于治疗糖尿病的包含长效胰岛素类似物缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合物
<130> OPA15094
<150> KR10-2014-0065072
<151> 2014-05-29
<160> 41
<170> KopatentIn 2.0
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
cagtagttct ccagctgttc gagggagcag atgctgg 37
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
cagcatctgc tccctcaacc agctggagaa ctac 34
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
gtagttctcc agctggttga gggagcagat gctg 34
<210> 19
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物1
<400> 19
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtgcgat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 20
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物1
<400> 20
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Ala Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 21
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物2
<400> 21
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcgc ggtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 22
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物2
<400> 22
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ala Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 23
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物3
<400> 23
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaacg cgtgcaac 258
<210> 24
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物3
<400> 24
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Ala Cys Asn
85
<210> 25
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物4
<400> 25
ttcgttaacc aacacttgtg tgcgtcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 26
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物4
<400> 26
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Ala Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 27
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物5
<400> 27
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgagcgt tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 28
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物5
<400> 28
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Ala Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 29
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物6
<400> 29
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggcg cgttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 30
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物6
<400> 30
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Ala Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 31
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物7
<400> 31
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcgcgtacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 32
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物7
<400> 32
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 33
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物8
<400> 33
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgaacag 240
ctggagaact actgcaactg a 261
<210> 34
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物8
<400> 34
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 35
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物9
<400> 35
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcaaccag 240
ctggagaact actgcaactg a 261
<210> 36
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似物9
<400> 36
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asn Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素的A链
<400> 37
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 38
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素的B链
<400> 38
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 39
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1(7-37)
<400> 39
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 40
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽-3
<400> 40
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 41
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽-4
<400> 41
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35

Claims (26)

1.一种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包含：
长效胰岛素类似物缀合物，其中胰岛素类似物通过接头或共价键连接至能延长胰岛素类似物的活性持续时间的生物相容性材料；及
长效促胰岛素肽缀合物，其中促胰岛素肽通过接头或共价键连接至能延长促胰岛素肽的活性持续时间的生物相容性材料。
2.一种药物组合物，其用于在糖尿病患者中降低一种或多种选自下组的胰脏β细胞副作用：脂毒性、葡萄糖毒性、胰脏β细胞功能异常和胰脏β细胞量降低，其包含：
长效胰岛素类似物缀合物，其中胰岛素类似物通过接头或共价键连接至能延长胰岛素类似物的活性持续时间的生物相容性材料；及
长效促胰岛素肽缀合物，其中促胰岛素肽通过接头或共价键连接至能延长促胰岛素肽的活性持续时间的生物相容性材料。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述胰岛素类似物是具有天然胰岛素的变异的材料，所述变异选自下组：一个或多个氨基酸的取代、添加、缺失、修饰及其组合。
4.权利要求1或2所述的组合物，其中所述胰岛素类似物具有一个或多个氨基酸的突变或缺失。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述胰岛素类似物特征为一个或多个氨基酸被其他氨基酸取代或所述一个或多个氨基酸的缺失，所述一个或多个氨基酸选自下组：B链的位置1、2、3、5、8、10、12、16、23、24、25、26、27、28、29和30处和A链的位置1、2、5、8、10、12、14、16、17、18、19和21处的氨基酸。
6.权利要求1或2所述的组合物，其中所述促胰岛素肽选下组：GLP-1、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4、其激动剂、其衍生物、其片段、其变体、及其组合。
7.权利要求6所述的组合物，其中所述促胰岛素肽是促胰岛素肽衍生物，其中促胰岛素肽的N末端组氨酸残基用选自下组的物质取代：去氨基-组氨酰基、二甲基-组氨酰基、β-羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙酰基、和β-羧基咪唑并丙酰基。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述促胰岛素肽选下组：天然毒蜥外泌肽-4、其中缺失毒蜥外泌肽-4的N末端胺基的毒蜥外泌肽-4衍生物、其中用羟基取代毒蜥外泌肽-4的N末端胺基的毒蜥外泌肽-4衍生物、其中用二甲基修饰毒蜥外泌肽-4的N末端胺基的毒蜥外泌肽-4衍生物、其中缺失毒蜥外泌肽-4的第一个氨基酸(组氨酸)的α-碳的毒蜥外泌肽-4衍生物、其中用丝氨酸取代毒蜥外泌肽-4的第12个氨基酸(赖氨酸)的毒蜥外泌肽-4变体、和其中用精氨酸取代毒蜥外泌肽-4的第12个氨基酸(赖氨酸)的毒蜥外泌肽-4变体。
9.权利要求1或2所述的组合物，其中所述长效胰岛素类似物缀合物特征为：胰岛素类似物通过作为接头的非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fc区，所述胰岛素类似物中胰岛素A链的位置14处的氨基酸用谷氨酸取代；而所述长效促胰岛素肽缀合物特征为：作为促胰岛素肽的咪唑并乙酰基毒蜥外泌肽-4通过作为接头的非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fc区。
10.权利要求1或2所述的组合物，其中所述生物相容性材料选自下组：聚乙二醇、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合材料、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合材料、体内***或其衍生物、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖类、和聚合物。
11.权利要求10所述的组合物，其中所述胰岛素类似物或促胰岛素肽通过选自下组的接头连接至生物相容性材料：聚乙二醇、脂肪酸、糖类、聚合物、低分子量化合物、核苷酸、及其组合。
12.权利要求1或2所述的组合物，其中所述胰岛素类似物或促胰岛素肽通过接头连接至生物相容性材料，且所述生物相容性材料是FcRn结合材料，其中所述接头是肽接头或选自下组的非肽基接头：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化的多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯***、生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、及其组合。
13.权利要求12所述的组合物，其中所述FcRn结合材料包含免疫球蛋白Fc区。
14.权利要求12所述的组合物，其中所述非肽基接头的各末端分别结合至所述生物相容性材料和所述胰岛素类似物或促胰岛素肽的胺基或硫醇基。
15.权利要求13所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是非糖基化的。
16.权利要求13所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fc区由选自CH1、CH2、CH3、和CH4域的1至4个域组成。
17.权利要求13所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fc区进一步包含绞链区。
18.权利要求13所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fc区为衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、或IgM的Fc区。
19.权利要求13所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fc区为选自下组的不同来源的域的杂合体(hybrids)：IgG、IgA、IgD、IgE、和IgM。
20.权利要求13所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fc区为由相同来源的域组成的单链免疫球蛋白所构成的二聚体或多聚体。
21.权利要求1或2所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。
22.权利要求1或2所述的组合物，其中所述长效胰岛素缀合物长效促胰岛素肽缀合物同时、序贯、或反向(reversely)施用。
23.权利要求2所述的组合物，其中所述组合物抑制糖尿病的进展。
24.权利要求2所述的组合物，其中所述组合物改善罹患糖尿病的受试者的糖尿病预后。
25.一种用于预防或治疗糖尿病的方法，该方法包括对罹患糖尿病或处于罹患糖尿病风险的受试者施用权利要求1所述的组合物。
26.一种用于在不包括人类的糖尿病受试者中降低一种或多种选自下组的胰脏β细胞副作用的方法：脂毒性、葡萄糖毒性、胰脏β细胞功能异常和胰脏β细胞量降低，该方法包括将权利要求2所述的组合物施用于罹患糖尿病或处于罹患糖尿病风险的受试者的步骤。
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