CN110117602B

CN110117602B - 灰树花udp-葡萄糖焦磷酸化酶及其应用

Info

Publication number: CN110117602B
Application number: CN201910429540.4A
Authority: CN
Inventors: 崔凤杰; 陶庭磊; 昝新艺; 孙文敬; 吴喜红
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2039-05-22
Also published as: CN109609525A; CN110117601B; CN110117601A; CN110117602A

Abstract

本发明属于食用菌遗传和基因工程技术领域，具体涉及一种灰树花UDP‑葡萄糖焦磷酸化酶及其应用。本发明通过基因工程技术在灰树花中过表达UDP‑葡萄糖焦磷酸化酶基因或对沉默UDP‑葡萄糖焦磷酸化酶基因，分别显著增加或降低灰树花重组菌中菌丝体量、菌丝体多糖和胞外多糖的产量，并显著影响对灰树花菌丝体多糖和胞外多糖中单糖组成。本发明为掌握灰树花多糖合成/代谢的调控机制和高效发酵生产品质稳定的多糖产品提供研究基础。

Description

灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及其应用

技术领域

本发明属于食用菌遗传和基因工程技术领域，具体涉及一种灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及其应用。

背景技术

微生物多糖是一类具有生物活性的大分子化合物，主要包括细菌多糖和真菌多糖，其对菌体生长有重要作用，且能应用于保健品、化妆品等领域。目前，已有较多研究涉及细菌胞外多糖生物合成途径与基因控制。

食药用真菌多糖是当前国内外研究十分活跃的领域之一。然而，食药用真菌多糖的合成过程极为复杂，参与合成的底物和酶系众多。因此，要实现食药用多糖高效而稳定的合成，还需明确多糖合成相关酶系的功能，并采取具有针对性的代谢调控手段以有效强化其合成。

灰树花（Grifola frondosa）又名贝叶多孔菌，栗子蘑等，日本俗称“舞茸”，隶属层菌纲，非褶菌目，多孔菌科，灰树花属，是一种珍稀的食药两用菌。灰树花肉质鲜嫩，其中以多糖为主的生理活性物质丰富，在免疫调节、抗肿瘤、抗HIV、降血糖等方面具有显著功效。然而有关灰树花多糖（菌丝体多糖和胞外多糖）的合成途径、关键酶系的角色和功能等研究仍是空白，还需全面***的研究。构建能提高灰树花多糖合成量的菌株、重组菌株以及构建方法是目前研究中需要解决的技术问题之一。

发明内容

本发明的目的在于解决上述技术问题之一，本发明提供一种灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因及其应用。

首先，本发明从灰树花菌丝体基因组中克隆得到UDP-葡萄糖焦磷酸化酶编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，保守序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供所述UDP-葡萄糖焦磷酸化酶编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供一种调控灰树花菌体生长和多糖合成的方法，所述的调控方法包括上调或下调菌丝体量和多糖产量的合成量；具体的，所述上调是通过过表达灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的编码基因实现，所述下调是通过基因沉默对灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶编码基因进行沉默实现。

本发明提供了一种重组载体，包括过表达重组载体和基因沉默载体。

所述过表达重组载体用于上调灰树花多糖合成量，所述过表达载体包含所述灰树花UGP编码基因核苷酸序列，如SEQ ID NO .1所示。所述过表达载体是通过扩增UGP编码基因核苷酸序列（SEQ ID NO .1）和构巢曲霉35s启动子（如SEQ ID NO .6所示），经T4 DNA连接酶将2个基因片段进行连接，再通过T4 DNA连接酶与质粒pAN7-1连接获得，所述的过表达载体为pAN7-o-ugp。

所述的基因沉默载体用于下调灰树花多糖合成量，所述基因沉默载体包括灰树花ugp的保守序列（如SEQ ID NO .3所示）、灰树花gpd启动子（如SEQ ID NO .5所示）和构巢曲霉35s启动子（如SEQ ID NO .6所示）。所述基因沉默载体的构建是分别克隆SEQ ID NO .3序列、SEQ ID NO .5序列和SEQ ID NO .6序列，再通过T4 DNA连接酶将三个基因片段进行连接，质粒pAN7-1 经BamI和HindIII酶切，然后通过T4 DNA连接酶将基因片段和酶切质粒片段连接获得反向双元启动子沉默UDP-葡萄糖焦磷酸化酶编码基因保守区域的载体，根据本发明的实施例之一，所述的基因沉默载体为pAN7-ugp-dual。

本发明还提供一种重组工程菌，所述重组工程菌包含已构建的基因沉默载体或过表达载体。所述重组工程菌是通过制备不完全酶解的灰树花原生质体，并采用电击转化法将所述的重组载体转化该原生质体得到。

其中，所述的制备不完全酶解的灰树花原生质体是通过将培养的灰树花菌丝体经0.2-0.8 M甘露醇溶液洗涤后，加入0.5-4.0% (w/v) 丝状真菌破壁酶液在25-45℃条件下酶解1-5h，离心收集酶解后的不溶物，经过滤去除未酶解的菌丝，收集得到原生质体。

所述的电击转化法将基因沉默载体或过表达载体转入原生质体，是将基因沉默载体pAN7-ugp-dual或基因过表达载体pAN7-o-ugp与灰树花原生质体混匀后，在设置电场强度为0.5-3.5kV/cm，电容15-45μF和电阻200-600Ω等条件下电击2.0-8.0ms后，依次涂布到选择性再生CYM培养基（潮霉素100μg/mL）抗性平板，28^oC培养筛选获得稳定遗传的ugp沉默或ugp过表达的灰树花转化子（GF-i-ugp和GF-o-ugp）。

本发明还提供一种调控灰树花菌体生长和多糖合成量的方法，采用所述重组工程菌（GF-i-ugp和GF-o-ugp），以淀粉、秸秆等水解液、或以葡萄糖等为碳源，配制种子培养基和发酵培养基。

其中，所述碳源浓度为5.0~100.0 g/L。将所述的重组工程菌接种至种子培养基，培养制备种子液，进而将工程菌种子液以5.0%-15.0%的接种量接种到含有发酵培养基的摇瓶或发酵罐；所述发酵罐培养条件：20℃-30℃，通气量0.5-2.0 vvm，搅拌转速50 -500rpm，培养3-10d；所述摇瓶条件为：20 -30℃，转速80 -200 rpm，培养3-10d。

在此条件下，基因沉默的灰树花重组工程菌（GF-i-ugp）的菌丝体量和多糖产量明显下降，过表达的灰树花重组工程菌（GF-o-ugp）菌丝体量和多糖产量明显增加，表明UDP-葡萄糖焦磷酸化酶显著影响了灰树花菌丝体生长和多糖合成。另外，灰树花沉默重组菌GF-i-ugp的菌丝体多糖中***糖Ara、甘露糖Man、葡萄糖Glu和半乳糖Gal的含量分别为2.7-5.4%、30.6-45.7%、47.6-62.88%和1.1-3.5%，胞外多糖中的葡萄糖含量为97%以上；而ugp过表达菌株GF-o-ugp的菌丝体多糖中***糖Ara、甘露糖Man、葡萄糖Glu和半乳糖Gal的含量分别为1.5-2.4%、25.2-35.7%、55.8-71.2%和0.3-1.4%，其胞外多糖中的葡萄糖含量为99%以上；这也表明，对UDP-葡萄糖焦磷酸化酶进行基因沉默或过表达，均影响了灰树花菌丝体多糖和胞外多糖中单糖的组成和比例。

本发明采用过表达技术或基因沉默等方法正负调控UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因在灰树花中的表达量，明确了UGP显著影响在菌丝体生长、多糖合成量以及多糖中的单糖组成比例等。特别是，ugp基因过表达可使灰树花重组菌中菌丝体量、菌丝体多糖和胞外多糖的产量均提高了20%以上，为后期靶向合成多糖提供技术基础和方法指导。

附图说明

图1为灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）gDNA序列和cDNA序列的克隆结果；图中，M：DNA Maker，1-4为UGP gDNA扩增结果，5-8为UGP cDNA扩增结果。

图2为灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的沉默载体构建示意图。

图3为灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的过表达载体构建示意图。

图4灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因沉默和基因过表达的重组菌株与对照菌株在PDA平板上生长对比结果。

图5灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因沉默和基因过表达的灰树花重组菌在25-L发酵罐条件下发酵合成多糖的结果（A:对照菌株GF-WT；B：过表达重组菌GF-o-ugp；C:基因沉默重组菌GF-i-ugp；D:菌丝体多糖和胞外多糖产量）。

具体实施方式

以下结合具体实施例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明，以下实施例中使用的质粒、PCR 试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。但本发明的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。

本实施例中涉及到的灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）编码基因序列如SEQ IDNO .1所示，所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。

所述UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的cDNA序列如SEQ ID NO .4所示；UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因保守序列、克隆灰树花gpd启动子和构巢曲霉35s启动子的序列分别为SEQ IDNO .3、SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6所示。

实施例1:灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶编码基因的克隆

离心收集灰树花GF02（购自美国模式培养物库，American type culturecollection，ATCC ® 60301™）培养菌丝体，迅速加入液氮研磨成细粉，通过植物或者真菌基因组提取试剂盒提取基因组。

根据UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因UGP序列（GenBank ID：A0H81_11820

）及其上下游500bp设计引物，分别为：

UGP-F(SEQ ID NO .7)：5'-ATCTCCCTTTCCTCTACCCATC-3'，

UGP-R(SEQ ID NO .8) ：5'-GATCAGAAGACAGGGTCCAACA-3'。

以已经公布的灰树花的基因组（GenBank assembly accession：GCA_001683735.1）为模板，采用上述引物扩增基因全长，PCR 反应程序：94 ℃预变性 3 min；94℃变性20 s，退火 30 s，退火温度52℃，72 ℃延伸（时间由目的基因长度决定），反应 35个循环；采用 1%琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 扩增产物，再用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收目的基因片段（如图1所示）测序，然后将测序获得UGP基因序列，在NCBI中进行BLAST比对，确认其为编码灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因序列。

将培养和收集灰树花GF02菌丝体迅速在液氮中研成粉末状提取总RNA。根据RACE技术，使用TAKARA 3’-FULL RACE Core Set V2.0试剂盒（Takara Code：D314）并设计特异性引物3RACE1(SEQ ID NO .9)：5'-TGTTGTGGACCAGAGCAT-3'，3RACE2(SEQ ID NO .10)：5'-ACTCGTTTCCTGCCTGTG -3'，以灰树花总RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增获得UGP基因3’cDNA特异片段，根据已经得到的灰树花基因特异片段，使用TAKARA 5’-FULL RACE Kit（Takara Code：D315）试剂盒并设计特异性引物5RACE1(SEQ ID NO .11)：5' -ACAGGCAGGAAACGAGTA-3'，5RACE2(SEQ ID NO .12)：5'-GATGCGTTGTCCTTCGTT-3'，经去磷酸化反应，去帽子反应、5'RACE Adaptor的连接以及反转录反应之后的cDNA为模板，PCR扩增获得UGP基因5’cDNA特异片段，经拼接得到UGP基因完整的cDNA序列见SEQ ID NO .4。

实施例2：构建灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因沉默载体pAN7-ugp-dual

根据实施例1中克隆得到的灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因序列，根据同源区域设计上下游引物分别为：

EUGP-F (SEQ ID NO .13)：

5'-CGGGGTACC TCAACACTCACGAGGATACGCT-3' ，

EUGP-R(SEQ ID NO .14)：

5'-GCTCTAGA GCGCCCAAGTTGTCAGAGTT-3'。

以实施例1中得到的灰树花cDNA为模板PCR扩增获得灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的保守序列。

根据灰树花gpd基因序列（GenBank：A0H81_05461），设计GPD启动子引物为：

gpd-F(SEQ ID NO .15)：5'-cgggatcccgttcgcattacacacattg-3'；

gpd-R(SEQ ID NO .16)：5'-ggggtaccactggtgggtacaaatgacg-3'。

以实施例1中得到的灰树花总DNA为模板PCR扩增目的基因。

根据质粒pAN7-1（购于湖南丰晖生物科技有限公司）中构巢曲霉35s启动子序列SEQ ID NO .6，设计35s启动子引物为：

35s -F(SEQ ID NO .17)：5'- CCCAAGCTTGATTTCGGCACGGCTACG-3'；

35s -R(SEQ ID NO .18)：5'- GCTCTAGAAAAGCTGCCTACCAGGGACT-3'。

以质粒pAN7-1为模板PCR扩增目的基因。

将灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶进行Kpn I和Xba I酶切，灰树花gpd基因启动子进行BamH I和Kpn I酶切，构巢曲霉35s启动子进行Xba I和Hind III酶切，并将质粒pAN7-1进行BamH I和Hind III酶切。将各酶切产物通过T4 DNA连接酶获得双向启动子沉默UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因保守区域的载体pAN7-UGP-dual（载体构建示意图如图2所示）。

实施例3：构建UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因过表达载体pAN7-o-ugp

与实施例2类似，根据实施例1中克隆得到的灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因序列，根据同源区域设计上下游引物分别为：

UGP-F (SEQ ID NO .19)：

5'–CGGGATCCATCTCCCTTTCCTCTACCCATC-3'，

UGP-R(SEQ ID NO .20)：

5'-GCTCTAGAGATCAGAAGACAGGGTCCAACA-3'。

以灰树花cDNA为模板PCR扩增获得灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的编码基因ugp。

35s -F(SEQ ID NO .17)：5'- CCCAAGCTTGATTTCGGCACGGCTACG-3'；

35s -R(SEQ ID NO .18)：5'- GCTCTAGAAAAGCTGCCTACCAGGGACT-3。

以质粒pAN7-1为模板PCR扩增目的基因。

分别将ugp进行BamH I和Xba I酶切，构巢曲霉35s启动子进行Xba I和Hind III酶切，并将质粒pAN7-1 进行BamH I和Hind III酶切，将各酶切产物通过T4 DNA连接酶，转化E. coli Top10，进行PCR验证和测序验证，获得UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因过表达载体pAN7-o-ugp（载体构建示意图如图3所示）。

实施例4：不完全酶解制备灰树花原生质体

收集灰树花PDA液体培养所得菌丝体，组织粉碎机无菌条件下处理1min，以10%接种量接种于100mL PDB培养基，28℃静置培养4d后，5000g离心15min收集不溶物；用0.6M甘露醇溶液洗涤2次，加入1mL 2%丝状真菌破壁酶液，30℃酶解4h。将酶解液以5000g离心15min收集不溶物，无菌过滤得到酶解的原生质体；将制备的原生质体加入50mL再生CYM培养基（葡萄糖 20g、蛋白胨 2g、酵母膏2g、七水硫酸镁 0.5g、磷酸氢二钾 1.0g、磷酸二氢钾0.46g、琼脂 20g，潮霉素100μg/mL）中混匀，倒入平板，28℃培养再生。

实施例5：灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因沉默重组菌GF- i-ugp的构建

取10μg质粒pAN7-UGP-dual和1mL灰树花原生质体重悬液至电转杯中，放置1min后电转，电转条件为：电场强度为2.5kV/cm，电容25μF和电阻400Ω等条件下电击4ms后，倒入选择性再生CYM培养基（潮霉素100μg/mL）和潮霉素抗性平板上，28℃条件培养筛选获得灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因沉默重组菌GF-i-ugp。如图4所示，相对于出发菌株CK，重组菌GF-i-ugp在PDA平板上生长明显变缓。

实施例6：构建UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因过表达的灰树花重组菌GF-o-ugp

取10μg过表达载体pAN7-o-ugp和1mL灰树花原生质体重悬液至电转杯中，放置1min后电转，电转条件为：电场强度为3.0kV/cm，电容20μF和电阻450Ω等条件下电击5ms后，到选择性再生CYM培养基（潮霉素100μg/mL）和潮霉素抗性平板上，28℃条件培养筛选获得灰树花UGP过表达重组菌GF-o-ugp，如图4所示，相对于出发菌株CK和UGP沉默重组菌GF-i-ugp，重组菌GF-o-ugp在PDA平板上生长明显速度显著增强。

实施例7：灰树花重组菌GF- i-ugp和GF-o-ugp 25-L的发酵

制备斜面培养基(g/L)：土豆200，葡萄糖 20，蛋白胨5，KH₂PO₄ 1.5，MgSO₄·7H₂O0.75，pH自然。该培养基用于菌种保藏及活化；

一级种子培养基为(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨5，KH₂PO₄ 1.5，MgSO₄·7H₂O 0.75，pH自然；

二级种子培养基为(g/L)：葡萄糖 30，蛋白胨6，KH₂PO₄ 3，MgSO₄·7H₂O 1.5，pH自然；

发酵培养基为(g/L)：葡萄糖 60，蛋白胨6，KH₂PO₄ 6，MgSO₄·7H₂O 1，大豆油50mL，pH自然。

分别切取5 mm×5 mm的新鲜培养的灰树花重组菌GF- i-ugp和GF-o-ugp菌丝块置于斜面培养基上，于28 ℃的恒温培养箱中培养7d。接入10块5 mm×5 mm 重组菌菌块，装液量为75/250 mL，28℃、150 rpm摇床培养3d，制得一级种子液。将一级种子液接种于二级种子培养基中，接种量10%(v/v)，装液量150/500 mL，摇床(28℃，150 rpm)培养3d，获得二级种子液。

将培养好的二级种子液以10%的接种量，接种至25L发酵罐中，装液量60%，控制温度28℃，培养7d，控制搅拌转速和通气量分别为90rpm和0.8vvm。取发酵醪，10000g离心10min后，得到灰树花菌丝体，蒸馏水反复洗涤菌体，冷冻干燥后称量计算菌丝体干重；上清液经浓缩后使用95%乙醇按体积比1:3沉淀；10000g离心收集醇沉物，干燥至恒重，即为所产胞外多糖并称重；取菌丝体50g，90℃热水提取2h后离心取上清液，浓缩后使用95%乙醇按体积比1:3沉淀；10000g离心收集醇沉物，经50℃真空干燥至恒重，即为所产菌丝体多糖并称重。经发酵7d后，灰树花原始菌株WT菌体量为24.9g/L，胞外多糖产量为1.52g/L；而灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因沉默重组菌GF-i-ugp的菌体量仅为4.3 g/L，菌丝体得率0.0156 g/g（菌丝体干重），胞外多糖产量为0.23g/L；而UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因过表达菌株GF-o- ugp的菌体量增加到35.2 g/L，菌丝体得率0.0627 g/g（菌丝体干重），胞外多糖产量为1.84g/L (如图5)。这也表明，对UDP-葡萄糖焦磷酸化酶进行基因沉默或过表达，均对灰树花菌丝体生长和多糖合成产生直接而显著的影响。

分别称取30 mg菌丝体多糖和胞外多糖样品，加入3 mL 72% H₂SO₄，30℃水浴60min后，加入8.4 mL蒸馏水，于121℃水解1h。称取水解后的样品乙酰化进行GC分析。灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因沉默重组菌GF i-ugp菌丝体多糖中***糖Ara、甘露糖Man、葡萄糖Glu和半乳糖Gal的含量分别为2.76%、35.62%、57.64%和2.14%，其葡萄糖组成达97%以上；而UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因过表达菌株GFo-ugp菌丝体多糖中***糖Ara、甘露糖Man、葡萄糖Glu和半乳糖Gal的含量分别为1.54%、37.22%、65.44%和0.87%，其葡萄糖组成达99%以上。基因沉默或过表达UDP-葡萄糖焦磷酸化酶显著影响对灰树花菌丝体多糖和胞外多糖中单糖组成。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因及其应用

<150> 201910022178.9

<151> 2019-01-10

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1990

<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 1

atgcgcaatg agctcaacag gctcgtgaac accgtctccg atcctgccac gaagaaggca 60

cgtcgtgttg ctgaaccagt cggggaagca ctattactga atgagttaat ttcccaactg 120

ttctacaggc atcgacacag agatgcagtc attcttctat ctcttcacgc gttacctcgc 180

agagaaggca caaagcaagg agctgttagt caatctcgat tcctttcatt tgtctcattc 240

aagctgacaa gatcactttc tcatcttgaa gtgtctggga ccgtatcaag tcccctgcgg 300

ctgatcagat tgttccctac gataacctcc cgacagcgat cgacccgcaa tcccttaaca 360

agctcgccgt gctcaaggtc aatggtggtc ttggtacctc tatgggtgag tgtctttgcg 420

tgtctttgcc tgcacactgc ttaccgtaat gtcgcaggaa tgactggcgc gaaaagcgct 480

ctcgaggtca aggacgacat gaccttcctg gacctcaccg tgcgccagat cgaacatctg 540

aacacgactc accgtgtcga cgtgcccctc atcctgatga cgtccttcaa cactcacgag 600

gatacgctcc gaatcatcaa gaaatacgcg aaccagcaac tgcgtatcac gactttcaac 660

cagtcgcgct atcctcgtat cgacaaggag acgcttctgc ctgccccgaa gaacgcgaat 720

gacgagaaga ctaagtggta tcctcctggt cacggtgact tgtacaacgc gcttctgcac 780

tctggcgtgc ttgatcagct gctcgcggag ggcaaggagt acctcttcgt gtccaactct 840

gacaacttgg gcgctgtgta agtgtttatt gtggtccatc agtatgttgc gataactgac 900

gtttattgtg acttagtgtg gaccagagca tccttcagca catgattgac acgaacgcgg 960

aattcattat ggaggtcacc gacaagacca aggccgacgt caaggtaacg ttgatctagc 1020

gcgactacac cacaactcag acactaacgt tgtcccaaaa gggtggtact ctcattgact 1080

atgaagggaa tgttcagctc ctggagattg cacaagtccc ctccgaacat gtcgaagagt 1140

tcaagtcggt ccgaaagttc aagatcttta acaccaataa cttgtggatc aacctgaagg 1200

gtatgtattc atcttgttca atcttggctt tgtgtagttc taagtacctc atttcttagc 1260

tctcaagcgc gtcatggaga acgatggcat ggagctcgag attattgtaa accccaaggt 1320

cacagaggac ggccactcgg tcgtccattg aaacggccgc tggagctgcg atcaagcact 1380

tcaggaacgc gcacggcatc aacgtccccc gtactcgttt cctgcctgtg aagagctgtt 1440

ctgacttgct cctaatcaag agtgacatct attcgctaga acacggacag ctcgtgatca 1500

gtgagaacag gatgttcggg accacgcctg tcatcaagtt gggtgaccac ttcaagaagg 1560

tcagtctggg cgttctgatt gaattgtgcg gggttaatga tgtacaatca atgtgtagat 1620

tgcgcaattc cagaagcgct tcaagaagat ccccaagatc attgaattgg atcatcttac 1680

ggtaaccggt gatgtctact ttggacggaa cgttacgtta cgggggaccg tcattggtga 1740

gcattcaaca tttgtggttt cagcctgaca ttctgctgat attgtatcta gtcgtcgcga 1800

acgaaggaca acgcatcgat attccggacg gctgtgtgct cgagaacagt gagtgattaa 1860

cttttctgtg accggtggtt tctaatcctt ttgatcccca ggattgttgt ccggcaatct 1920

caccatgacc gtaagtcttt ggcgtccgct gcgtttgctt attacttact tgacaatgca 1980

ggagctatga 1990

<210> 2

<211> 450

<212> PRT

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 2

Met Arg Asn Glu Leu Asn Arg Leu Val Asn Thr Val Ser Asp Pro Ala

1 5 10 15

Thr Lys Lys Ala Arg Ile Asp Thr Glu Met Gln Ser Phe Phe Tyr Leu

20 25 30

Phe Thr Arg Tyr Leu Ala Glu Lys Ala Gln Ser Lys Glu Leu Val Trp

35 40 45

Asp Arg Ile Lys Ser Pro Ala Ala Asp Gln Ile Val Pro Tyr Asp Asn

50 55 60

Leu Pro Thr Ala Ile Asp Pro Gln Ser Leu Asn Lys Leu Ala Val Leu

65 70 75 80

Lys Val Asn Gly Gly Leu Gly Thr Ser Met Gly Met Thr Gly Ala Lys

85 90 95

Ser Ala Leu Glu Val Lys Asp Asp Met Thr Phe Leu Asp Leu Thr Val

100 105 110

Arg Gln Ile Glu His Leu Asn Thr Thr His Arg Val Asp Val Pro Leu

115 120 125

Ile Leu Met Thr Ser Phe Asn Thr His Glu Asp Thr Leu Arg Ile Ile

130 135 140

Lys Lys Tyr Ala Asn Gln Gln Leu Arg Ile Thr Thr Phe Asn Gln Ser

145 150 155 160

Arg Tyr Pro Arg Ile Asp Lys Glu Thr Leu Leu Pro Ala Pro Lys Asn

165 170 175

Ala Asn Asp Glu Lys Thr Lys Trp Tyr Pro Pro Gly His Gly Asp Leu

180 185 190

Tyr Asn Ala Leu Leu His Ser Gly Val Leu Asp Gln Leu Leu Ala Glu

195 200 205

Gly Lys Glu Tyr Leu Phe Val Ser Asn Ser Asp Asn Leu Gly Ala Val

210 215 220

Val Asp Gln Ser Ile Leu Gln His Met Ile Asp Thr Asn Ala Glu Phe

225 230 235 240

Ile Met Glu Val Thr Asp Lys Thr Lys Ala Asp Val Lys Gly Gly Thr

245 250 255

Leu Ile Asp Tyr Glu Gly Asn Val Gln Leu Leu Glu Ile Ala Gln Val

260 265 270

Pro Ser Glu His Val Glu Glu Phe Lys Ser Val Arg Lys Phe Lys Ile

275 280 285

Phe Asn Thr Asn Asn Leu Trp Ile Asn Leu Lys Ala Leu Lys Arg Val

290 295 300

Met Glu Asn Asp Gly Met Glu Leu Glu Ile Ile Val Asn Pro Lys His

305 310 315 320

Phe Arg Asn Ala His Gly Ile Asn Val Pro Arg Thr Arg Phe Leu Pro

325 330 335

Val Lys Ser Cys Ser Asp Leu Leu Leu Ile Lys Ser Asp Ile Tyr Ser

340 345 350

Leu Glu His Gly Gln Leu Val Ile Ser Glu Asn Arg Met Phe Gly Thr

355 360 365

Thr Pro Val Ile Lys Leu Gly Asp His Phe Lys Lys Ile Ala Gln Phe

370 375 380

Gln Lys Arg Phe Lys Lys Ile Pro Lys Ile Ile Glu Leu Asp His Leu

385 390 395 400

Thr Val Thr Gly Asp Val Tyr Phe Gly Arg Asn Val Thr Leu Arg Gly

405 410 415

Thr Val Ile Val Val Ala Asn Glu Gly Gln Arg Ile Asp Ile Pro Asp

420 425 430

Gly Cys Val Leu Glu Asn Arg Leu Leu Ser Gly Asn Leu Thr Met Thr

435 440 445

Glu Leu

450

<210> 3

<211> 269

<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 3

ttcaacactc acgaggatac gctccgaatc atcaagaaat acgcgaacca gcaactgcgt 60

atcacgactt tcaaccagtc gcgctatcct cgtatcgaca aggagacgct tctgcctgcc 120

ccgaagaacg cgaatgacga gaagactaag tggtatcctc ctggtcacgg tgacttgtac 180

aacgcgcttc tgcactctgg cgtgcttgat cagctgctcg cggagggcaa ggagtacctc 240

ttcgtgtcca actctgacaa cttgggcgc 269

<210> 4

<211> 1353

<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 4

atgcgcaatg agctcaacag gctcgtgaac accgtctccg atcctgccac gaagaaggca 60

cgcatcgaca cagagatgca gtcattcttc tatctcttca cgcgttacct cgcagagaag 120

gcacaaagca aggagcttgt ctgggaccgt atcaagtccc ctgcggctga tcagattgtt 180

ccctacgata acctcccgac agcgatcgac ccgcaatccc ttaacaagct cgccgtgctc 240

aaggtcaatg gtggtcttgg tacctctatg ggaatgactg gcgcgaaaag cgctctcgag 300

gtcaaggacg acatgacctt cctggacctc accgtgcgcc agatcgaaca tctgaacacg 360

actcaccgtg tcgacgtgcc cctcatcctg atgacgtcct tcaacactca cgaggatacg 420

ctccgaatca tcaagaaata cgcgaaccag caactgcgta tcacgacttt caaccagtcg 480

cgctatcctc gtatcgacaa ggagacgctt ctgcctgccc cgaagaacgc gaatgacgag 540

aagactaagt ggtatcctcc tggtcacggt gacttgtaca acgcgcttct gcactctggc 600

gtgcttgatc agctgctcgc ggagggcaag gagtacctct tcgtgtccaa ctctgacaac 660

ttgggcgctg ttgtggacca gagcatcctt cagcacatga ttgacacgaa cgcggaattc 720

attatggagg tcaccgacaa gaccaaggcc gacgtcaagg gtggtactct cattgactat 780

gaagggaatg ttcagctcct ggagattgca caagtcccct ccgaacatgt cgaagagttc 840

aagtcggtcc gaaagttcaa gatctttaac accaataact tgtggatcaa cctgaaggct 900

ctcaagcgcg tcatggagaa cgatggcatg gagctcgaga ttattgtaaa ccccaagcac 960

ttcaggaacg cgcacggcat caacgtcccc cgtactcgtt tcctgcctgt gaagagctgt 1020

tctgacttgc tcctaatcaa gagtgacatc tattcgctag aacacggaca gctcgtgatc 1080

agtgagaaca ggatgttcgg gaccacgcct gtcatcaagt tgggtgacca cttcaagaag 1140

attgcgcaat tccagaagcg cttcaagaag atccccaaga tcattgaatt ggatcatctt 1200

acggtaaccg gtgatgtcta ctttggacgg aacgttacgt tacgggggac cgtcattgtc 1260

gtcgcgaacg aaggacaacg catcgatatt ccggacggct gtgtgctcga gaacagattg 1320

ttgtccggca atctcaccat gaccgagcta tga 1353

<210> 5

<211> 966

<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 5

tcgggatccc cgtcgcatta cacacattgt tcgaacatgt acagagagtt tgacagacaa 60

aacagtaaca cttgtttcga gagagacgct cgtagctaaa cccgatgtcc gaagaggacc 120

ctccccacgc gagtccgcaa gatgaatgcg acagttggtt gccacgagca cagagagcgg 180

caaataccct cgagtcatcg tacggagctt gtcaatccag caaatgtaca cgagcatggc 240

aggatccaat cgtaattagg tggctgagat ctgaccaccg agaatgtgcg ccctagggga 300

tgagtaaacg cacgtttgcg cgtgaatcag cgatgatgct gtacggtggt gcttagagat 360

acgaaaagtt gcaagtgaac gtaaatggag gaaagggact ggttgggaat attcatgaca 420

agctggctag aacaagtcgg aaatctagtc tgaggcaaag ccaccagcgg agagccgttc 480

gcggccttgc ggtgacagtc gggcaacggc cggaagctgc ccggtgtaat catccatctt 540

agataacgat caccacccca ccctataaga cccctctcca tctctgctct tctccccatc 600

cttcgtctcc aaaaccatta tcctcagcaa tgccagtgag tcctgcagac aatctgcatc 660

gtcttcgagc atccgtctca cccgtggttt tcacaggtca aggtcggaat caacgggtgc 720

gtcggctgtg ggtgtgtgaa cgttcagact gattaatacc gtttctcgtg tcgccctact 780

ccagcttcgg taagaacttg catatttgct ggcttcgccg tgctcacggc agtgtgtagg 840

tcgcattggc cgtattgtgc tccgtaatgc tctcctcaac cccgaaatcg aggtcgtcgc 900

tgtgaacgag tgcgtattag ttgatcccca cccaatctcc actgacgtca tttgtaccca 960

ccagta 966

<210> 6

<211> 977

<212> DNA

<213> 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400> 6

gatttcggca cggctacgga agacggagaa gccaccttca gtggactcga gtaccattta 60

attctatttg tgtttgatcg agacctaata cagcccctac aacgaccatc aaagtcgtat 120

agctaccagt gaggaagtgg actcaaatcg acttcagcaa catctcctgg ataaacttta 180

agcctaaact atacagaata agataggtgg agagcttata ccgagctccc aaatctgtcc 240

agatcatggt tgaccggtgc ctggatcttc ctatagaatc atccttattc gttgacctag 300

ctgattctgg agtgacccag agggtcatga cttgagccta aaatccgccg cctccaccat 360

ttgtagaaaa atgtgacgaa ctcgtgagct ctgtacagtg accggtgact ctttctggca 420

tgcggagaga cggacggacg cagagagaag ggctgagtaa taagccactg gccagacagc 480

tctggcggct ctgaggtgca gtggatgatt attaatccgg gaccggccgc ccctccgccc 540

cgaagtggaa aggctggtgt gcccctcgtt gaccaagaat ctattgcatc atcggagaat 600

atggagcttc atcgaatcac cggcagtaag cgaaggagaa tgtgaagcca ggggtgtata 660

gccgtcggcg aaatagcatg ccattaacct aggtacagaa gtccaattgc ttccgatctg 720

gtaaaagatt cacgagatag taccttctcc gaagtaggta gagcgagtac ccggcgcgta 780

agctccctaa ttggcccatc cggcatctgt agggcgtcca aatatcgtgc ctctcctgct 840

ttgcccggtg tatgaaaccg gaaaggccgc tcaggagctg gccagcggcg cagaccggga 900

acacaagctg gcagtcgacc catccggtgc tctgcactcg acctgctgag gtccctcagt 960

ccctggtagg cagcttt 977

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atctcccttt cctctaccca tc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatcagaaga cagggtccaa ca 22

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgttgtggac cagagcat 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actcgtttcc tgcctgtg 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acaggcagga aacgagta 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gatgcgttgt ccttcgtt 18

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggggtacct caacactcac gaggatacgc t 31

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctctagagc gcccaagttg tcagagtt 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgggatcccg ttcgcattac acacattg 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggggtaccac tggtgggtac aaatgacg 28

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cccaagcttg atttcggcac ggctacg 27

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctctagaaa agctgcctac cagggact 28

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgggatccat ctccctttcc tctacccatc 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gctctagaga tcagaagaca gggtccaaca 30

Claims

1. UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的编码基因在调控灰树花菌体生长和多糖合成量中的用途，所述UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的碱基序列如SEQ ID NO .1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.一种调控灰树花菌体生长和多糖合成量的培养方法，其特征在于，所述方法通过发酵培养重组工程菌实现；

当上调灰树花多糖合成量时，所述重组工程菌包含过表达载体为pAN7-o-ugp，所述过表达载体是通过扩增SEQ ID NO .1所示的UGP编码基因核苷酸序列和SEQ ID NO .6所示的构巢曲霉35s启动子，经T4 DNA连接酶将2个基因片段进行连接，再通过T4 DNA连接酶与质粒pAN7-1连接获得；

当下调灰树花多糖合成量时，所述重组工程菌包含基因沉默载体pAN7-ugp-dual，所述基因沉默载体包括如SEQ ID NO .3所示的灰树花ugp的保守序列、如SEQ ID NO .5所示的灰树花gpd启动子和如SEQ ID NO .6所示的构巢曲霉35s启动子，经T4 DNA连接酶将3个基因片段进行连接，再通过T4 DNA连接酶与质粒pAN7-1连接获得。