CN115838682A

CN115838682A - 一种利用甘露聚糖高效生产2′-岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株

Info

Publication number: CN115838682A
Application number: CN202211543668.1A
Authority: CN
Inventors: 李由然; 丁雪峰; 王勇; 石贵阳
Original assignee: Nanjing Nuoyun Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Nuoyun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-01
Filing date: 2022-12-01
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明公开了一种利用甘露聚糖高效生产2′‑岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株，属于合成生物学和微生物代谢工程技术领域。本发明利用食品安全型微生物地衣芽孢杆菌作为宿主细胞，以具有群体感应效应的启动子表达甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白(E.coli)、磷酸甘露糖变位酶(E.coli)、甘露糖‑1‑磷酸‑鸟苷酸转移酶(E.coli)、GDP‑甘露糖‑4,6‑脱水酶(E.coli)、GDP‑L‑岩藻糖合成酶(E.coli)以及岩藻糖基转移酶(Helicobacterpylori)。重组菌具备利用廉价的甘露聚糖，如魔芋粉，或玉米粉合成2’‑FL的能力。这一新的合成路线与基于葡萄糖、甘油等精细碳源的合成路线相比，生产效率和成本具有明显优势。

Description

一种利用甘露聚糖高效生产2′-岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株

技术领域

本发明提供了一种利用甘露聚糖高效生产2′-岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株，属于合成生物学和微生物代谢工程技术领域。

背景技术

肠道微生物的组成会影响人类健康。母乳是婴儿最重要的食物，其含有的特殊成分，如寡糖、抗体和维生素，通过塑造婴儿肠道微生物组的组成而影响健康。母乳寡糖(HMO)是母乳中的主要可溶性固形物，其中2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)是最丰富的HMOs，占总量的30％。它由L-岩藻糖、D-半乳糖和D-葡萄糖组成。2’-FL的生物活性近年来备受关注，研究者普遍认为它是保障婴儿健康发育的重要因素。深入的研究发现，婴儿虽然难以消化2’-FL，但是它在发育中起着至关重要的作用免疫***，如调节肠道和抑制病原体感染。目前，2’-FL已被美国、欧洲等批准为用于婴儿配方奶粉的益生元。

近年来，研究者已开始广泛地使用微生物发酵法生产2’-FL，主要使用大肠杆菌和酵母等模式微生物。大肠杆菌自身含有2’-FL合成途径的多个基因，如甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶等，易于构建完整的合成途径，因此研究最为广泛。然而大肠杆菌并非食品安全微生物，其所生产的产物应用于食品会存在问题。由于枯草芽孢杆菌是一种食品安全型菌株，研究者已利用这一宿主进行2’-FL合成途径的构建和发酵生产。目前存在的主要问题是，异源基因在枯草芽孢杆菌中表达量较低，造成途径的合成效率不高；另一方面，枯草芽孢杆菌在现有的2’-FL发酵中主要以葡萄糖、甘油等精细碳源为培养基，而使用来源更为广泛和廉价的玉米粉质原料时效果较差。此外，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在规模化生产中都面临着比较严重的噬菌体侵染风险。

地衣芽孢杆菌是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。在工业发酵中地衣芽孢杆菌可发酵的原料种类更广，对噬菌体的抵抗性能更强。现有菌种的2’-FL合成途径均以葡萄糖、果糖或者甘油为起始底物。地衣芽孢杆菌可以分泌甘露聚糖酶，从而分解细胞外的甘露聚糖进行生长代谢。由于甘露糖是2’-FL合成途径的重要中间化合物，直接分解细胞外的甘露聚糖，并将甘露糖转运至细胞内参与2’-FL的合成，在生产效率和成本方面与现有合成路线相比具有明显的优势。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种能在地衣芽孢杆菌中高效表达目的基因的启动子及重组质粒的构建与应用。

本发明通过代谢工程改造，使得地衣芽孢杆菌可以利用魔芋粉这一廉价原料，分解并高效转运甘露糖至细胞内，并以GDP-甘露糖为前体合成GDP-岩藻糖，再通过异源表达岩藻糖基转移酶，得到了高产2’-FL的地衣芽孢杆菌工程菌株。地衣芽孢杆菌合成2’-FL的人工途径以甘露聚糖类底物(魔芋粉、瓜尔豆胶等)及玉米粉作为碳源，利用自身的甘露聚糖酶和玉米粉酶水解获得甘露糖和葡萄糖。葡萄糖作为细胞的能量来源，甘露糖经过磷酸转移***磷酸化后，利用异源表达的磷酸甘露糖变位酶得到六磷酸甘露糖。再分别经过异源表达的甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶和GDP-L-岩藻糖合成酶得到GDP-L-岩藻糖，再利用岩藻糖基转移酶得到2’-FL(图1)。

本发明提供了一株高产2’-FL的地衣芽孢杆菌工程菌株，所述地衣芽孢杆菌工程菌株中过表达甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白(N1)、磷酸甘露糖变位酶(N2)、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶(N3)、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(N4)、GDP-L-岩藻糖合成酶(N5)以及岩藻糖基转移酶(N6)。

在一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌工程菌株过表达了含有甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白的表达框，含有编码磷酸甘露糖变位酶基因的表达框、含有编码甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶基因的表达框、含有编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶基因的表达框、含有编码GDP-L-岩藻糖合成酶基因的表达框以及含有编码岩藻糖基转移酶基因的表达框。

在一种实施方式中，所述甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白来源于大肠杆菌Escherichia coli、磷酸甘露糖变位酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、GDP-L-岩藻糖合成酶来源于大肠杆菌Escherichia coli以及岩藻糖基转移酶来源于幽门螺杆菌Helicobacterpylori。

在一种实施方式中，利用启动子P_lan对基因进行过表达，利用终止子ter终止基因的表达。

在一种实施方式中，所述甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述磷酸甘露糖变位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述GDP-L-岩藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌工程菌株的出发菌株为地衣芽孢杆菌ATCC9945A。

在一种实施方式中，上述地衣芽孢杆菌工程菌以质粒pHY和pHT43为表达载体。

在一种实施方式中，利用质粒pHY表达甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白、磷酸甘露糖变位酶和甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶，利用质粒pHT43表达GDP-甘露糖-4,6-脱水酶，GDP-L-岩藻糖合成酶和岩藻糖基转移酶。

在一种实施方式中，编码甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID

NO.9所示，编码磷酸甘露糖变位酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，编码甘露糖

-1-磷酸-鸟苷酸转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，编码GDP-L-岩藻糖合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，编码岩藻糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

在一种实施方式中，启动子P_lan的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，终止子ter的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种高效合成2’-岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌的构建方法，在地衣芽孢杆菌中含有质粒pHY和pHT43；所述质粒pHY上含有编码甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白的基因、编码磷酸甘露糖变位酶的基因和编码甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶的基因，所述质粒pHT43上含有编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的基因，编码GDP-L-岩藻糖合成酶的基因和编码岩藻糖基转移酶的基因。

在一种实施方式中，所述构建方法包括以下步骤：

(1)以pHY为出发质粒，利用具有群体感应效应的启动子P_lan在质粒pHY上过表达甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白基因，所构建的重组质粒转化大肠杆菌，获得质粒pHY-N1；

(2)以pHY-N1为出发质粒，在其中***含有启动子P_lan、磷酸甘露糖变位酶编码基因和终止子ter的表达框，所构建的重组质粒转化大肠杆菌，获得质粒pHY-N12；

(3)以pHY-N12为出发质粒，在其中***含有启动子P_lan、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶编码基因和终止子ter的表达框，所构建的重组质粒转化大肠杆菌，获得质粒pHY-N123；

(4)以pHT43为出发质粒，在其中***含有启动子P_lan、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因和终止子ter的表达框，所构建的重组质粒转化大肠杆菌，获得质粒pHT-N4；

(5)以pHT43-N4为出发质粒，在其中***含有启动子P_lan、GDP-L-岩藻糖合成酶编码基因和终止子ter的表达框，所构建的重组质粒转化大肠杆菌，获得质粒pHT-N45；

(6)以pHT43-N45为出发质粒，在其中***含有启动子P_lan、岩藻糖基转移酶编码基因和终止子ter的表达框，所构建的重组质粒转化大肠杆菌，获得质粒pHT-N456。

(7)将质粒pHY-N123转化入地衣芽孢杆菌ATCC 9945A中，得到重组菌BLH5。

(8)将质粒pHT-N456转化入地衣芽孢杆菌BLH5中，得到重组菌BLH6。

本发明提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法为利用上述地衣芽孢杆菌工程菌株，在以甘露聚糖为碳源的发酵体系中，发酵生产2’-岩藻糖基乳糖。

在一种实施方式中，所述甘露聚糖包括魔芋粉、瓜尔豆胶。

在一种实施方式中，所述发酵体系中还含有玉米粉和乳糖。

在一种实施方式中，将上述地衣芽孢杆菌工程菌的种子液接种至发酵体系中，通气量控制在0.5vvm，将搅拌与DO偶联控制DO维持在25～35％，转速设置为200～800rpm，发酵10～14h后一次性补加60～80g/L玉米粉和60～80g/L魔芋粉。

在一种实施方式中，种子液的制备方法是将上述地衣芽孢杆菌工程菌于平板上划线，挑取单菌落接种于LB培养基，37℃、250rpm/min培养18～24h，取2ml菌液转接于100mlLB液体培养基中，37℃、250rpm培养18～24h。

本发明还提供了上述地衣芽孢杆菌芽孢杆菌在合成2’-岩藻糖基乳糖或含有2’-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

本发明以地衣芽孢杆菌为出发菌株，利用其能够分泌甘露聚糖酶的特性，通过增强甘露糖的转运能力使菌种可以直接从细胞外高效获取甘露糖，参与到2’-FL的合成路线中。另一方面，采用具有群体感应效应的启动子P_lan表达甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶以及岩藻糖基转移酶，协调了细胞生长与产物合成，提高产物2’-FL生产产量和产率，2’-FL的产量可达98g/L，最大OD₆₀₀为63。地衣芽孢杆菌是食品安全型工业微生物，以廉价的甘露聚糖类原料，如魔芋粉等，作为碳源发酵生产2’-FL；与利用精细碳源，如葡萄糖或甘油的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌相比，本发明的技术方案在生产成本和效率方面具有显著的优势。

附图说明

图1：地衣芽孢杆菌2’-FL合成途径的设计

图2：重组质粒结构图；A，pHYN123表达载体，B，pHTN456表达载体；

图3：重组质粒物理图谱；

图4：发酵上清液中2’-FL的色谱定量分析；

图5：不同培养温度条件下摇瓶中2’-FL含量随时间的变化；

图6：重组菌补料分批发酵生产2’-FL的过程曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

(一)培养基

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L；加入20g/L琼脂粉，以配制LB固体培养基。

摇瓶发酵培养基：蔗糖75g/L、乳糖40g/L、棉籽蛋白30g/L、K₂HPO₄·3H₂O 9.12g/L、KH₂PO₄1.36 g/L、(NH₄)₂HPO₄10 g/L；初始pH 7.5。

发酵培养基：棉籽蛋白30g/L、魔芋粉75g/L、玉米粉75g/L、乳糖80g/L、K₂HPO4·3H₂O9.12g/L、KH₂PO₄1.36 g/L、FeCl₃0.5 g/L、(NH₄)₂HPO₄10 g/L(pH 7.5)。

(二)2’-FL的提取及检测

发酵液于12000r/min离心5min，取上清液经0.22μm膜过滤处理，利用HPLC进行检测。HPLC检测条件：示差折光检测器；色谱柱为Polyamino HILIC 5μm 250*4.6mm(迪马科技,中国)，柱温为40℃；流动相为75％的乙腈水溶液,流速为0.8mL/min；进样量为10μL。

(三)下述实施例中涉及的菌株和引物。

表1本发明中涉及的菌株

表2引物序列

实施例1构建重组地衣芽孢杆菌BLH6

通过重叠延伸PCR将P_lan启动子(核苷酸序列SEQ ID NO.1所示)和木糖异构酶基因的终止子ter终止子(核苷酸序列SEQ ID NO.2所示)分别与甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白(N1)、磷酸甘露糖变位酶(N2)、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶(N3)、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(N4)、GDP-L-岩藻糖合成酶(N5)以及岩藻糖基转移酶(N6)基因片段融合，获得基因表达片段SEQ ID NO.9-14。

分别使用引物对P1-P6扩增基因表达片段SEQ ID NO.9-14，从而在基因片段两端引入酶切位点。PCR反应条件为：95℃预变性5min后进入下一循环94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s,30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。

依次利用限制性酶切位点HindIII，BglII，BglII，SalI(用于连接pHY质粒)将包含N1、N2、N3的表达框以同源重组的方式***质粒，得到pHY-N123(图2)。依次利用限制性酶切位点EcoRI，BamHI，SmaI和SacI(用于连接pHT43质粒)将包含N4、N5、N6的表达框以同源重组的方式***质粒，得到pHT-N456(图2)。每两个相邻的酶切位点之间***一个基因。利用1％琼脂糖凝胶电泳进一步验证质粒的构建情况(图3)。

将成功构建的重组质粒pHY-N123按照文献Li,Y.；Jin,K.；Zhang,L.；Ding,Z.；Gu,Z.；Shi,G.Development of an Inducible Secretory Expression System in Bacilluslicheniformis Based on an Engineered Xylose Operon.Journal ofAgricultural andFood Chemistry 2018,66,9456-9464.的方法导入地衣芽孢杆菌ATCC 9945A中，获得重组地衣芽孢杆菌BLH5。

再将成功构建的重组质粒pHT-N456按照上述相同的方法导入BLH5中，获得重组地衣芽孢杆菌BLH6。

实施例2 2’-FL的摇瓶发酵

将实施例1中构建的重组菌BLH6在LB平板上划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min^-1培养16h-18h作为种子液，取1mL种子液转接于装液量为30mL的摇瓶发酵培养基，控制初始OD为0.5-1，于37℃或42℃、250r·min^-1培养。每隔12h取样，发酵液于4℃、12000r·min^-1条件下离心10min，上清液用于检测产物(图4)。结果如图5所示显示，在42℃培养条件下，36h发酵液中可以积累1.82g/L的2’-FL，在37℃下，36h发酵液中2’-FL的产量为1.52g/L。

实施例3碳源种类及浓度对重组菌表达的影响

将实施例1中构建的重组菌BLH6在LB平板上划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min^-1培养16h-18h作为种子液，取1mL种子液转接于装液量为30mL的摇瓶发酵培养基，控制初始OD为0.5-1，于37℃或42℃、250r·min^-1培养。发酵36h，发酵液于4℃、12000r·min^-1条件下离心10min，上清液用于检测产物。

将摇瓶发酵培养基中的碳源更换为不同浓度的魔芋粉或瓜尔豆胶(浓度分别为30g/L、45g/L、60g/L、75g/L、90g/L)，以探究不同碳源种类及其浓度对重组菌BLH6发酵生产2’-FL的影响。结果如表3所示，以75g/L魔芋粉为碳源，可以获得2’-FL的最大产量为11.32g/L；而以75g/L瓜尔豆胶为碳源，可以获得5.74g/L 2’-FL。这表明重组地衣芽孢杆菌在不同的廉价甘露聚糖类原料作为主要碳源的培养基中都可以较好地生长和合成产物。

表3不同碳源种类及浓度对重组菌发酵的影响

实施例4 20L发酵罐规模2’-FL的生产

将实施例1中构建的重组菌BLH6在LB平板上划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min^-1培养18h-24h作为一级种子液，取2mL一级种子液转接于100mL LB培养基中37℃、250r·min^-1培养18h-24h作为二级种子液，将3瓶2级种子液接种至装液量为15L的发酵培养基的30L发酵罐实施发酵。

发酵温度42℃、初始pH7.5。当发酵过程中pH下降到7.0时通过补加50％氨水使得发酵过程中pH维持在7.0左右，发酵过程中通气量控制在0.5vvm，将搅拌与DO偶联控制DO维持在30％左右，转速上限设置为800rpm。发酵12h后一次性补加75g/L玉米粉和75g/L魔芋粉。

发酵罐规模的补料分批发酵结果如图6所示，在经过了46h的发酵后2’-FL的产量达到98g/L，最大OD₆₀₀为63。

表4发酵罐过程参数

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一株高产2’-FL的地衣芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌工程菌株中过表达甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶以及岩藻糖基转移酶。

2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白来源于大肠杆菌Escherichia coli、磷酸甘露糖变位酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶来源于大肠杆菌Escherichia coli、GDP-L-岩藻糖合成酶来源于大肠杆菌Escherichia coli以及岩藻糖基转移酶来源于幽门螺杆菌Helicobacterpylori。

3.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，利用启动子P_lan对基因进行过表达，利用终止子ter终止基因的表达。

4.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌工程菌株的出发菌株为地衣芽孢杆菌ATCC 9945A，以质粒pHY和pHT43为表达载体。

5.根据权利要求4所述的地衣芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，利用质粒pHY表达甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白、磷酸甘露糖变位酶和甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶，利用质粒pHT43表达GDP-甘露糖-4,6-脱水酶，GDP-L-岩藻糖合成酶和岩藻糖基转移酶。

6.一种高效合成2’-岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，在地衣芽孢杆菌中含有质粒pHY和pHT43；所述质粒pHY上含有编码甘露糖特异性磷酸转移转运蛋白的基因、编码磷酸甘露糖变位酶的基因和编码甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶的基因，所述质粒pHT43上含有编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的基因，编码GDP-L-岩藻糖合成酶的基因和编码岩藻糖基转移酶的基因。

7.一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求1～5任一所述地衣芽孢杆菌工程菌株为发酵菌株，在以甘露聚糖为碳源的发酵体系中，发酵生产2’-岩藻糖基乳糖。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述甘露聚糖包括魔芋粉、瓜尔豆胶。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中还含有玉米粉和乳糖。

10.权利要求1～5任一所述地衣芽孢杆菌芽孢杆菌在合成2’-岩藻糖基乳糖或含有2’-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。