CN1174100C

CN1174100C - 用重组生物体生产甘油的方法

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Publication number: CN1174100C
Application number: CNB971812950A
Authority: CN
Inventors: Ba; B·A·布尔图伊斯; ��˹�ٰ��; A·A·加藤拜; S·L·海尼; -H��; A·K·-H·苏; ��˰�װ��޹�˾; R·D·拉雷奥
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co; Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc; EIDP Inc
Priority date: 1996-11-13
Filing date: 1997-11-10
Publication date: 2004-11-03
Anticipated expiration: 2017-11-10
Also published as: ID21555A; DE69739918D1; IL129723A; ZA9710199B; ATE471984T1; WO1998021340A1; AU5430798A; KR20000053212A; KR100674074B1; US20060177915A1; EP0948628A1; JP2001503634A; BR9712942A; MY130130A; CA2267198A1; EP0948628B1; IL129723A0; ES2345469T3; JP4330041B2; CN1244216A

Abstract

提供重组生物体，该重组生物体含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶和/或甘油-3-磷酸酶活性的基因，所述生物体可用于由各种碳底物生产甘油。

Description

用重组生物体生产甘油的方法

发明领域

本发明涉及分子生物学领域和采用重组生物体生产所需要的化合物。更具体地讲，本发明描述了分别表达或同时表达甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)的克隆基因，以提高甘油的生产。

背景

甘油是一种工业上大量需要的化合物，用于化妆品、液体皂、食品、药物、润滑剂、防冻液以及无数其它用途。甘油酯在脂肪和油脂工业中是重要的。

不是所有生物体都具有合成甘油的天然能力。然而，已知一些细菌、藻类和酵母的物种能够产生甘油。细菌地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis)和蕃茄乳杆菌(Lactobacillus lycopersica)合成甘油。发现耐盐藻杜氏藻属(Dunaliella)种和Asteromonas gracilis产生甘油以保护性抗外界高盐浓度(Ben-Amotz等，(1982)Experientia 38：49-52)。同样，各种耐渗透酵母合成甘油作为保护性措施。大多数酵母属(Saccharomyces)菌株在乙醇发酵期间产生一些甘油，并且应用渗透胁迫可以生理性增强合成甘油(Albertyn等，(1994)Mol.Cell.Biol.14，4135-4144)。本世纪初，用加入诸如亚硫酸盐或碱的导向剂(steeringreagent)的酵母属培养物，工业上生产甘油。所述导向剂通过形成无活性复合物阻断或抑制乙醛转化为乙醇；因此，可利用过量的还原性相当物(NADH)或“导向”二羟丙酮磷酸还原，以产生甘油。该方法受限于亚硫酸盐引起的酵母生长的部分抑制。该限制可以通过采用碱得到部分克服，所述碱通过不同的机理形成过量NADH相当物。在该实践中，所述碱启动Cannizarro歧化反应以由两个当量的乙醛产生乙醇和乙酸。

已经从糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)克隆并测序了编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因(DAR1，GPD1)(Wang等，(1994)，J.Bact.176：7091-7095)。将DAR1基因克隆入穿梭载体并用来转化大肠杆菌，该基因在大肠杆菌中的表达产生活性酶。Wang等(同上)认为，DAR1受细胞渗透环境的调节，但是并未提示该基因在重组生物体可以如何用来提高甘油产量。

已经分离了其它甘油-3-磷酸脱氢酶。例如已经从酿酒酵母(S.cerevisiae)克隆并测序分析了sn-甘油-3-磷酸脱氢酶(Larason等，(1993)Mol.Microbiol.，10：1101，(1993))。Albertyn等((1994)Mol.Cell.Biol.，14：4135)指出，从酿酒酵母克隆编码甘油-3-磷酸脱氢酶的GPD1。如同Wang等一样，Albertyn等和Larason等均认识到该基因是渗透敏感性调节的，但是并未提示该基因可以如何用于重组生物体生产甘油。

正如G3DPH一样，已经从酿酒酵母分离甘油-3-磷酸酶，并鉴定该蛋白由GPP1和GPP2基因编码(Norbeck等，(1996)J.Biol.Chem.，271：13875)。像G3DPH编码基因一样，似乎GPP2是渗透诱导的。

没有已知的技术指出由一起表达或分别表达G3PDH/G3P磷酸酶的重组生物体生产甘油。也没有已知的技术指出由具有这两种酶活性的任何野生型生物体生产甘油，所述酶活性不需要对所述细胞施与某种胁迫(盐或渗压剂(osmolyte))。Eustace((1987)，Can.J.Microbiol.，33：112-117))指出用重组DNA技术不能实现甘油生产。这些研究者通过选择性育种技术创造了杂交酵母菌株，该酵母菌株产生甘油的水平高于亲代株；然而，G3PDH活性保持不变或略微降低。

工业上需要能够在生理条件下生产甘油的微生物，尤其是当甘油本身将作为更复杂分解代谢或生物合成途径组成部分的体内底物时，所述途径可能受到渗透胁迫或加入的导向剂的干扰。

所以，上述待解决的问题是如何通过加入或增强一些酶活性引导碳流向产生甘油，特别是分别催化二羟丙酮磷酸转化为甘油-3-磷酸、然后转化为甘油的G3PDH和G3P磷酸酶。先前已经描述了重组生物体的该过程，并且该过程需要分离编码这两种酶的基因及其随后的表达。遇到令人惊奇而未曾预料到的难题是G3P磷酸酶对宿主的毒性，该毒性要求小心控制G3P磷酸酶表达水平以避免生长抑制。

发明概述

本发明提供由重组微生物生产甘油的方法，包括：

(i)用一种表达盒转化合适的宿主细胞，所述表达盒包含：

(a)编码NADH依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶或NADPH依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶的基因；和

(b)编码甘油-3-磷酸酶E.C.3.1.3.21的基因；

(ii)在存在选自单糖、寡糖、多糖和一碳底物的至少一种碳源的情况下培养步骤(i)的转化宿主细胞，由此生产甘油；以及

(iii)回收步骤(ii)中产生的甘油。

优选地，所述合适宿主细胞选自细菌和真菌。更优选地，所述合适宿主细胞选自柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、梭菌属(Clostridium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、毛霉属(Mucor)、球拟酵母属(Torulopsis)、甲基酵母属(Methylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)。最优选地，合适宿主细胞是大肠杆菌或酵母属。另外，所述方法中优选的碳源是葡萄糖，编码NADH依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶或NADPH依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶的基因编码SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含不引起该酶功能特性改变的氨基酸取代、缺失或***。或者编码甘油-3-磷酸酶的基因对应于SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：14所示氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可以包含不引起该酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。

本发明还涉及转化宿主细胞，含有编码甘油-3-磷酸磷酸酶活性的基因。

本发明还涉及选择甘油-3-磷酸脱氢酶基因表达的方法，包括：

(i)选择甘油-3-磷酸脱氢酶基因突变的营养缺陷型菌株，所述营养缺陷型菌株不将二羟丙酮磷酸转变为甘油-3-磷酸，并且需要外源甘油或甘油-3-磷酸用于生长；

(ii)用具有编码甘油-3-磷酸脱氢酶基因的质粒补足营养缺陷型菌株，被补足的营养缺陷型菌株可以在缺少外源甘油或甘油-3-磷酸的条件下生长。

本发明还涉及大肠杆菌pAH 21/DH5α，含有GPP2基因并鉴定命名为ATCC 98187；以及大肠杆菌pDAR1A/AA200，含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶DAR1的基因并鉴定命名为ATCC 98248。

本发明还涉及由重组微生物生产甘油的方法，包括：

(i)用包含编码活性甘油-3-磷酸酶E.C.3.1.3.21的基因的表达盒转化合适的宿主细胞；

(iii)回收步骤(ii)中产生的甘油。

本发明还涉及用编码活性甘油-3-磷酸酶E.C.3.1.3.21的基因转化的微生物。

简述生物保藏和序列表

申请人根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约条款进行了下列生物保藏：

保藏物鉴定参考国际保藏名称保藏日期

大肠杆菌pAH21/DH5α ATCC 98187 1996年9月26日

(含有GPP2基因)

大肠杆菌(pDAR1A/AA200) ATCC 98248 1996年11月6日

(含有DAR1基因)

“ATCC”是指国际性保藏机构美国典型培养物保藏中心，位于12301 Parklaw Drive，Rockville，MD 20852 U.S.A.。所述名称是所保藏材料的保藏号。

根据专利申请中核苷酸序列和氨基酸序列标准表示规则(Decisionof the President of the EPO的附录I和附录II，发表于OJ EPO的增刊第2期，12/1992)和37 C.F.R.1.821-1.825以及附录A和B(包含核苷酸和/或氨基酸序列的申请说明书要求)，申请人提供了23种序列。

详述发明

本发明提供在重组生物体中由发酵碳源生物生产甘油的方法。该方法提供可用于化妆品和制药工业的快速、便宜和环境负责的甘油源。该方法采用含编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和/或甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)克隆的同源或异源基因的微生物。将该微生物与碳源接触并从条件培养基分离甘油。所述基因可以分别或同时掺入宿主微生物以生产甘油。

用于本文的下列术语可以用来解释权利要求书和说明书。

术语“甘油-3-磷酸脱氢酶”和“G3PDH”指的是负责催化二羟丙酮磷酸(DHAP)转化为甘油-3-磷酸(G3P)的酶活性的一种多肽。在体内G3PDH可以是NADH、NADPH或FAD依赖性的。NADH依赖酶(EC1.1.1.8)由几种基因编码，包括GPD1(GenBank Z74071x2)、或GPD2(GenBank Z35169x1)、或GPD3(GenBank G984182)或DAR1(GenBankZ74071x2)。 NADPH依赖酶(EC 1.1.1.94)由gpsA(GenBank U321643、(cds 197911-196892)G466764和L45246)编码。FDA依赖酶(EC 1.1.99.5)由GUT2(GenBank Z47047x23)、或glpD(GenBank G147838)或glpABC(GenBank M20938)编码。

术语“甘油-3-磷酸酶”、“sn-甘油-3-磷酸酶”、或“d，l-甘油磷酸酶”和“G3P磷酸酶”是指负责催化甘油-3-磷酸转化为甘油的酶活性的一种多肽。G3P磷酸酶由GPP1(GenBank Z47047x125)或GPP2(GenBank U18813x11)编码。

术语“甘油激酶”是指根据反应条件负责催化甘油转化为甘油-3-磷酸或甘油-3-磷酸转化为甘油的酶活性的一种多肽。甘油激酶由GUT1(GenBank U11583x19)编码。

术语“GPD1”、“DAR1”、“OSG1”、“D2830”和“YDL022W”彼此通用，是指编码胞质甘油-3-磷酸脱氢酶的基因，其特征为SEQ IDNO：1所示碱基序列。

术语“GPD2”是指编码胞质甘油-3-磷酸脱氢酶的基因，其特征为SEQ ID NO：2所示碱基序列。

术语“GUT2”和“YIL155C”彼此通用，指的是编码线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶的基因，其特征为SEQ ID NO：3所示碱基序列。

术语“GPP1”、“RHR2”和“YIL053W”彼此通用，指的是编码胞质甘油-3-磷酸酶的基因，其特征为SEQ ID NO：4所示碱基序列。

术语“GPP2”、“HOR2”和“YER062C”彼此通用，指的是编码胞质甘油-3-磷酸酶的基因，其特征为SEQ ID NO：5所示碱基序列。

术语“GUT1”是指编码胞质甘油激酶的基因，且特征为SEQ IDNO：6所示其碱基序列。

本文所用的术语“功能”和“酶功能”是指在进行特定化学反应需要改变能量的酶催化活性。这种酶催化活性可以用于平衡反应，在所述平衡反应中在合适条件下完成产物和底物的生成。

术语“多肽”和“蛋白”在本文彼此通用。

术语“碳底物”和“碳源”指能被本发明宿主生物体代谢的碳源，特别是选自单糖、寡糖、多糖和一碳糖底物或它们的混合物的常用碳源。

术语“宿主细胞”和“宿主生物体”是指能够接受外源或异源基因并表达这些基因以产生活性基因产物的微生物。

术语“外源基因”、“外源DNA”、“异源基因”和“异源DNA”全都是指某种生物体的天然遗传物质，该遗传物质已经置于不同宿主生物体内。

术语“重组生物体”和“转化宿主”是指用异源或外源基因转化的任何生物体。本发明的重组生物体表达编码G3PDH和G3P磷酸酶的外源基因，以由合适碳底物生产甘油。

“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码区域之前(5’非编码区)和之后(3’非编码区)的调节序列。术语“天然”和“野生型”基因是指发现于自然界、具有其自身调节序列的基因。

本文所用的术语“编码(encoding)”和“编码(coding)”是指基因通过其转录和翻译机制产生氨基酸序列的过程。编码特定氨基酸序列的方法是指包括可能涉及不引起编码的氨基酸变化的碱基改变的DNA序列、或涉及可能改变一个或一个以上氨基酸的碱基变化但是不影响该DNA序列编码的蛋白功能特性的DNA序列。所以本发明包括特定典型序列以外的其它序列。也设想了基本上不影响所产生蛋白分子功能特性的序列改变，诸如导致沉默变化的缺失、***或替换。例如设想了反映遗传密码简并性、或在指定部位产生化学上相当氨基酸的基因序列中的变化；因此，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可以由编码另一疏水性较低的残基(诸如甘氨酸)或疏水性较高的残基(诸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子代。同样，也可以预期导致一种负电荷残基取代另一负电荷残基(诸如天冬氨酸取代谷氨酸)或者一种正电荷残基取代另一种正电荷残基(诸如赖氨酸取代精氨酸)的变化产生生物学相当的产物。也可以预期，导致该蛋白分子N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化将不改变该蛋白活性。实际上在某些情况下，为了研究改变对该蛋白生物活性的影响，可能最好是制备该序列的突变体。以上提出的各种改变与确定所编码产物生物活性的保留一样，完全是本领域常规技术。此外，该领域技术人员会认识到，本发明包括的序列也根据其与本文所列举的序列在严格杂交条件(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃)下的杂交能力进行定义。

术语“表达”是指由编码该基因产物序列的基因转录以及翻译成为基因产物。

本文所用的术语“质粒”、“载体”和“盒”是指常常携带的基因不是该细胞重要代谢的部分、并且通常是环状双链DNA分子形式的染色体外元件。这类元件可以是得自任何来源的自我复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，上述元件是线性或环形结构的单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已经结合或重结合入一种独特结构中，该独特结构能够将启动子片段和选定基因产物的DNA序列以及合适的3’非翻译序列导入细胞。“转化盒”是指含有外源基因和除了该外源基因外还含有促进特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”是指含有外源基因和除了该外源基因外还含有允许所述基因在外源宿主表达提高的元件的特定载体。

术语“转化”和“转染”指在掺入核酸后细胞中获得新基因。所获得的基因可以整合到染色体DNA中或作为染色体外复制序列导入。术语“转化体”是指转化产生的细胞。

术语“遗传性改变的”指通过转化或突变改变遗传物质的方法。

典型酶途径

设想了通过利用发现于大多数微生物中的甘油生物合成途径，在重组生物体中可以生产甘油。通常在ATP存在下通过己糖激酶使诸如葡萄糖的碳底物转化为葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-磷酸异构酶催化葡萄糖-6磷酸转化为果糖-6磷酸，然后通过6-磷酸果糖激酶的作用转化为果糖-1，6-二磷酸。之后醛缩酶使该二磷酸变为二羟丙酮磷酸(DHAP)。最后NADH依赖性G3PDH将DHAP转化为甘油-3-磷酸，再后甘油-3-磷酸通过G3P磷酸酶脱磷酸为甘油(Agarwal(1990)，Adv.Biochem.Engrg.41：114)。

生产甘油的其它途径

已经提出了由DHAP生产甘油的替代途径(Wang等，(1994)J.Bact.176：7091-7095)。在此提出的途径中，通过特异性或非特异性磷酸酶可以使DHAP脱磷酸产生二羟基丙酮，然后二羟基丙酮通过二羟基丙酮还原酶还原成甘油。已知原核生物和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)中的二羟基丙酮还原酶，并且与合适磷酸酶一起克隆和表达这类活性可以生产甘油。已经提出了由DHAP生产甘油的另一种替代途径(Redkar(1995)，Experimental Mycology，19：241，1995)。在该途径中，DHAP由共同的糖酵解酶—丙糖磷酸异构酶异构化为甘油醛-3-磷酸。甘油醛-3-磷酸脱磷酸成为甘油醛，甘油醛然后由乙醇脱氢酶或NADP依赖性甘油脱氢酶活性还原。克隆和表达构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的磷酸酶和脱氢酶活性使得可以进行甘油生产。

G3PDH和G3P磷酸酶的编码基因

本发明提供适合在宿主细胞表达G3PDH和G3P磷酸酶活性的基因。

已知编码G3PDH的基因。例如，GPD1已经从酵母属分离并且具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列，该碱基序列编码SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列(Wang等，同上)。同样，也已经从酵母属分离由GPD2编码的G3PDH活性，GPD2具有SEQ ID NO：2所示的碱基序列，编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列(Eriksson等，(1995)Mol.Microbiol.，17：95)。

为了本发明目的，设想编码负责G3PDH活性的多肽的任何基因都是合适的，其中所述活性能够催化二羟丙酮磷酸(DHAP)转化为甘油-3-磷酸(G3P)。此外，设想编码分别对应于基因GPD1、GPD2、GUT2、gpsA、glpD和glpABC的α亚单位的SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12所示的G3PDH氨基酸序列的任何基因在本发明中都是有功能的，其中所述氨基酸序列可以包含不改变该酶功能的氨基酸、缺失或加入。本领域技术人员会理解，从其它来源分离的G3PDH的编码基因也将适用于本发明。例如从原核生物分离的基因包括基因库登记号M34393、M20938、L06231、U12567、L45246、L45323、L45324、L45325、U32164、U32689和U39682。从真菌分离的基因包括基因库登记号U30625、U30876和X56162；从昆虫分离的基因包括基因库登记号X61223和X14179；以及从哺乳动物源分离的基因包括基因库登记号U12424、M25558和X78593。

已知G3P磷酸酶的编码基因。例如GPP2已经从酿酒酵母分离并具有SEQ ID NO：5所示的碱基序列，所述碱基序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示(Norbeck等，(1996)，J.Biol.Chem.，271：13875)。

为了本发明目的，编码G3P磷酸酶活性的任何基因均适用于本发明方法，其中所述活性能够催化甘油-3-磷酸转化为甘油。此外，编码分别对应于基因GPP2和GPP1的SEQ ID NO：13和14所示的G3P磷酸酶氨基酸序列的任何基因在本发明中都是有功能的，其中所述氨基酸序列包括包含不改变G3P磷酸酶酶功能的氨基酸取代、缺失或加入的任何氨基酸序列。本领域技术人员会理解，从其它来源分离的G3P磷酸酶编码基因也将适用于本发明。例如用一种或多种以下一般或特异性磷酸酶可以实现甘油-3-磷酸脱磷酸产生甘油，所述磷酸酶如下：碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)[基因库M19159、M29663、U02550或M33965]；酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)[基因库U51210、U19789、U28658或L20566]；甘油-3-磷酸酶(EC 3.1.3.-)[基因库Z38060或U18813x11]；葡萄糖-1-磷酸酶(EC 3.1.3.10)[基因库M33807]；葡萄糖-6-磷酸酶(EC 3.1.3.9)[基因库U00445]；果糖-1，6-二磷酸酶(EC 3.1.3.11)[基因库X12545或J03207]或磷脂酰(phosphotidyl)甘油磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.27)[基因库M23546和M23628]。

已知甘油激酶的编码基因。例如甘油激酶编码基因GUT1已经从酵母分离并测序(Pavlik等(1993)，Curr.Genet.，24：21)，其碱基序列如SEQ ID NO：15所示，该序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。该领域技术人员会理解，尽管本质上甘油激酶催化甘油降解，但是同一甘油激酶在合适的反应能量条件下在甘油的合成中发挥作用，将甘油-3-磷酸转化为甘油。存在通过甘油激酶生产甘油的证据。在厌氧或呼吸抑制的条件下，在存在甘油-3-P和ADP的情况下布氏锥虫(Trypanosoma brucei)产生甘油。该反应在酵解酶体区室发生(Hammond，(1985)，J.Biol.Chem.，260：15646-15654)。

宿主细胞

通过表达G3PDH和G3P磷酸酶重组生产甘油的合适宿主细胞可以是或者原核生物细胞或者真核生物细胞，并且只受其表达活性酶的能力的限制。优选的宿主细胞是那些通常用于生产甘油的细菌、酵母和丝状真菌，例如柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、梭菌属(Clostridium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、气杆菌属(Aerobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、毛霉属(Mucor)、球拟酵母属(Torulopsis)、甲基酵母属(Methylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)。在本发明中优选宿主细胞是大肠杆菌和酵母属。

载体和表达盒

本发明提供适合克隆、转化和表达G3PDH和G3P磷酸酶入合适宿主细胞的各种载体和转化以及表达盒。合适的载体是那些与所用细菌相容的载体。合适的载体可以得自于例如细菌、病毒(诸如噬菌体T7或M-13衍生噬菌体)、质粒、酵母或植物。获得和使用这类载体的方法是本领域技术人员已知的(Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual-第1、2、3卷(Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY，1989))。

通常，上述载体或盒含有指导合适基因转录和翻译的序列、选择标记以及允许自我复制和染色体整合的序列。合适载体包含带有转录起始控制的该基因的5’区，以及包含控制转录终止的该DNA片段的3’区。最优选的是，两种控制区得自与转化的宿主细胞同源的基因。这类控制区不需要得自选作生产宿主的特定物种的天然基因。

可用来在所需要的宿主细胞中驱动G3PDH和G3P磷酸酶基因表达的起始控制区或启动子种类繁多，并是本领域技术人员熟悉的。实际上能够驱动这些基因的任何启动子均适合于本发明，所述启动子包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO和TPI(可用于在酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；以及lac、trp、λP_L、λP_R、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中表达)。

终止控制区也可以得自所述优选宿主的各种天然基因。任选的是，终止位点可以是非必须的；然而假如包括其中是最优选的。

为了有效表达上述例举的(instant)酶，编码该类酶的DNA通过起始密码子可操作性连接至选定的表达控制区，这样表达导致形成合适的信使RNA。

转化合适宿主并表达用于生产甘油的G3PDH和G3P磷酸酶

一旦构建成合适盒后，将其用来转化合适的宿主细胞。通过诸如转化(例如用钙透化细胞、电穿孔)或通过采用重组噬菌体病毒的转染的已知方法，可以将含有G3PDH和/或G3P磷酸酶编码基因的盒导入上述宿主细胞(Sanbrook等，同上)。

正如在一般方法和实施例中全面叙述的一样，在本发明中AH21和DAR1盒用来转化大肠杆菌DH5α。

培养基和碳底物

本发明中的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的碳底物可以包括但不限于单糖(诸如葡萄糖和果糖)、寡糖(诸如乳糖或蔗糖)、多糖(诸如淀粉或纤维素)、或它们的混合物、和可再生原料的非纯化混合物(诸如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜和大麦芽)。此外，所述碳底物也可以是诸如二氧化碳或甲醇的一碳底物，已经证实所述一碳底物代谢转化为关键生化中间体。

已有报道，在甲基营养酵母中(Yamada等(1989)，Agric.Biol.Chem.，53(2)：541-543)和在细菌中(Hunter等(1985)，Biochemistry，24：4148-4155)由一碳源(例如甲醇、甲醛或甲酸盐)生产甘油。这些生物体可以同化从氧化状态的甲烷到甲酸盐范围的一碳化合物，并且生产甘油。该碳同化途径可以通过核酮糖一磷酸、通过丝氨酸或通过木酮糖一磷酸(Gottschalk， Bacterial Metabolism，第二版，Springer-Verlag：纽约(1986))。所述核酮糖一磷酸途径涉及甲酸与核酮糖-5-磷酸缩合形成果糖6碳糖，最终形成三碳产物—甘油醛-3-磷酸。同样，所述丝氨酸途径通过亚甲四氢叶酸将一碳化合物同化入糖酵解途径。

除了一碳和二碳底物外，也已知甲基营养生物体利用诸如甲胺、葡糖胺的许多其它含碳化合物和用于代谢活动的各种氨基酸。例如，已知甲基营养酵母利用甲胺碳源形成海藻糖或甘油(Bellion等(1993)，Microb.Growth Cl Compd.，[Int.Symp.]，第7期，415-32，编辑：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.。出版商：Intercept，Andover，UK)。同样，各种念珠菌属菌种可以代谢丙氨酸或油酸(Sulter等(1990)，Arch.Microbiol.，153(5)：485-9)。因此，在本发明中所用的碳源可以包括种类繁多的含碳底物，并且只受生物体选择的限制。

尽管上述所有碳底物和它们的混合物均适用于本发明，但是优选的碳底物为单糖、寡糖、多糖、一碳底物或它们的混合物。更优选的糖诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、以及诸如甲醇和二氧化碳的一碳底物。作为碳底物最优选葡萄糖。

除了合适的碳源外，发酵培养基必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂以及其它组分，所述组分是本领域技术人员已知、适合培养物生长和促进产生甘油所必须的酶途径的。

培养条件

通常，细胞在合适培养基中于30℃生长。优选的生长培养基为普通工业制备的培养基，诸如Luria Bertani(LB)肉汤、Sabouraud Dextrose(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。也可以采用其它确定成分或合成生长培养基，用于特定微生物生长的合适培养基是微生物学或发酵学领域技术人员已知的。使用已知直接或间接调节分解代谢物阻抑的物质(例如环2’：3’一磷酸腺苷)也可以加入到该反应培养基中。同样，也可以与基因操作结合或作为基因操作的替代方法，使用提高甘油产量的已知酶活性调节物质(例如亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和碱)。

发酵的合适pH范围是pH 5.0-9.0，其中初始状态优选pH范围为6.0-8.0。

在有氧或无氧的条件下进行反应，其中优选无氧或微需氧的条件。

鉴定以及纯化G3PDH和G3P磷酸酶

通过酶检测法测量蛋白G3PDH和G3P磷酸酶的表达水平。G3PDH活性检测依赖于在DHAP转化为G-3-P的过程中的共底物NADH的光谱性质。NADH具有固有的紫外/可见光吸收，可以于340nm分光光度监测其消耗。G3P磷酸酶活性可以通过检测该反应中释放出的无机磷酸盐的任何方法进行检测。最普遍使用的检测方法采用可见光谱测定兰色磷钼酸铵复合物。

鉴定和回收甘油

甘油可以通过对无细胞提取物进行高效液相层析(HPLC)和气相层析/质谱(GC/MS)分析法分析鉴定和定量。优选方法采用无梯度的0.01N硫酸流动相，在分析性离子交换柱上分析发酵培养基。

从发酵培养基回收甘油的方法是本领域技术人员已知的。例如，对所述反应混合物进行以下序贯步骤可以从细胞培养基获得甘油，所述步骤是：过滤、脱水、有机溶剂提取和分级蒸馏(美国专利第2,986,495号)。

通过互补选择转化体

在缺乏有功能的gpsA编码的G3PDH的情况下，大肠杆菌细胞不能合成G3P，这种情况导致膜生物合成的阻断。具有这种阻断的细胞是营养缺陷型的，为了合成膜磷脂需要培养基中存在或者甘油或者G3P。

一种克隆的异源野生型gpsA基因能够互补染色体gpsA突变，以允许于缺乏甘油或G3P的培养基中生长(Wang等(1994)，J.Bact.176：7091-7095)。基于该互补策略，gpsA缺陷细胞只能生长于葡萄糖培养基上，假如gpsA缺陷细胞具有质粒编码的gpsA，就可以允许基于由DHAP合成G3P进行选择。在培养过程中失去重组gpsA质粒的细胞不能合成G3P，而且随后的细胞生长受到抑制。所述互补G3PDH活性不仅可以由gpsA表达，也可以由表达G3PDH活性的其它克隆基因(诸如GPD1、GPD2、GPD3、GUT2、glpD和glpABC)表达。在gpsA缺陷大肠杆菌菌株诸如BB20中可以保持这些互补活性(Cronan等(1974)，J.Bact.，118：598)，缓和采用抗生素选择的需要，并且在大规模的发酵中降低其过高的成本。

为了在酿酒酵母渗透调节突变体中表达和选择，可以采用有关的策略(Larsson等(1993)，Mol.Microbiol.，10：1101-1111)。这些osgl突变体在低水势下不能生长，并且显示甘油生产能力降低和G3PDH活性下降。该osgl盐敏感性缺陷可以由克隆并表达的G3PDH基因补偿。因此，合成甘油的能力同时可以用作所需产生甘油的细胞的选择标记。

实施例

一般方法

磷酸化、连接和转化的方法是本领域技术人员熟知的。适合用于以下实施例的技术可以发现于Sambrook等， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。

适合细菌培养物的保持和生长的材料和方法是本领域技术人员熟知的。适合用于以下实施例的技术可以发现于 Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.BriggsPhillips，编辑)，美国微生物协会，华盛顿(1994)，或发现于 Biotechnology： A Textbook of Industrial Microbiology(Thomas D.Brock，第二版(1989)，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA)。所有用于细菌细胞生长和保持的试剂和材料均从Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma化学公司(St.Louis，MO)获得，除非另外具体说明。

缩写的意义如下：“h”指小时，“min”指分钟，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“L”指升。

细胞株

以下大肠杆菌菌株用于转化和表达G3PDH和G3P磷酸酶。从大肠杆菌遗传保藏中心或由Life Technologies(Gaithersburg，MD)获得菌株。

AA200(garB10 fhuA22 ompF627 fadL701 relA1 pit-10 spoT1 tpi-1phoM510 mcrB1)(Anderson等，(1970)，J.Gen.Microbiol.，62：329)。

BB20(tonA22 ΔphoA8 fadL701 relA1 glpR2 glpD3 pit-10 gpsA20spoT1 T2R)(Cronan等，J.Bact.，118：598)。

DH5α(deoR endA1 gyrA96 hsdR17 recA1 relA1 supE44 thi-1Δ(lacZYA-argFV169)phi80lacZΔM15F)(Woodcock等，(1989)，Nucl.Acids Res.，17：3469)。

鉴定甘油

通过HPLC和/或GC监测葡萄糖转化为甘油。采用标准技术和层析领域技术人员可获得的材料进行分析。一种合适方法采用UV(210nm)和RI检测，使用Waters Maxima 820 HPLC***。将样品注射入装备有Shodex SH-1011P前置柱(6mm×50mm)的Shodex SH-1011柱(8mm×300mm；Waters，Milford，MA)，温度控制于50℃，采用0.01N H₂SO₄作流速为0.5mL/分钟的流动相。当需要定量分析时，将样品注射入装备有Shodex SH-1011P前置柱(6mm×50mm)的Shodex SH-1011柱(8mm×300mm；Waters，Milford，MA)，温度控制于50℃，采用0.01N H₂SO₄作流速为0.69mL/分钟的流动相。当需要定量分析时，用已知量三甲基乙酸作外标制备样品。通常，甘油(RI检测)和葡萄糖(RI检测)的保留时间分别是17.03分钟和12.66分钟。

也通过GC/MS分析甘油。采用DB-WAX柱(30m，0.32mm I.D.，0.25um薄膜厚度，J & W Scientific，Folsom，CA)，气相层析和质谱分析法检测和定量甘油，按以下条件进行：注射器∶分流注射器，1∶15；样品体积：1uL；温度分布型：初始温度150℃保持30秒，40℃/min至180℃，20℃/min至240℃，保持2.5分钟。检测：EI质谱分析法(HewlettPackard 5971，San Fernando，CA)，定量SIM采用离子61m/z和64m/z作为靶离子用于甘油和甘油-d8，以及用离子43m/z作甘油的鉴定离子(qualifier ion)。甘油-d8用作内标。

鉴别甘油-3-磷酸酶GPP

通过在pH为6.5的bis-Tris或MES和镁缓冲液中温育所述提取物和有机磷酸盐底物，进行酶活性检测。所用底物不是1-α-甘油磷酸，就是d，1-α-甘油磷酸。在该检测中所述试剂的终浓度是：缓冲剂(20mM，bis-Tris或50mM MES)；MgCl₂(10Mm)；以及底物(20mM)。如果样品中的总蛋白较低并且用酸猝灭不发生可见的沉淀，则方便地在比色杯中检测样品。该方法包括在含有20mM底物(50μL，200mM)、50mM MES、10mM MgCl₂、pH6.5缓冲液的比色杯中温育酶样品。该最终磷酸酶检测体积为0.5mL。将该含酶样品加入到上述反应混合物中；混合比色杯中内容物，然后将该比色杯置于循环的水浴中，于37℃保持5-120分钟，时间长度取决于酶样品中的磷酸酶活性是否在范围2-0.02U/mL内。通过加入酸性钼酸盐试剂(0.4mL)猝灭该酶反应。在加入FiskeSubbaRaw试剂(0.1mL)和蒸馏水(1.5mL)后，混合上述溶液，并让其显色。10分钟后，让其发生完全显色，采用Cary 219UV/可见光分光光度计于660nm读样品的吸光度。将释放的有机磷酸盐的量与标准曲线相比，该标准曲线是通过采用无机磷原液(0.65mM)和制备无机磷酸盐终浓度范围为0.026-0.130μmol/mL的6个标准品制作的。

分光光度检测法检测甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)活性

下列方法用作Bell等发表方法((1975)，J.Biol.Chem.，250：7153-8)的如下改良法。该方法包括温育比色杯中的酶样品，比色杯中含有0.2mM NADH、2.0mM二羟丙酮磷酸(DHAP)和具有5mM DTT的pH 7.5的0.1M Tris/HCl缓冲液中的酶，总体积为1.0mL，温度为30℃。设定分光光度计以于340nm固定波长监测吸光度变化。以只含缓冲液的比色杯作为该仪器的空白。在将所述酶加到比色杯中后，进行吸光度读数。加入第一种底物NADH(50uL 4mM NADH；吸光度应增加大约1.25AU)以确定本底速率。应观测该本底速率至少3分钟。然后加入第二种底物DHAP(50uL 40mM DHAP)，监测吸光度随时间的变化至少3分钟以确定总速率。从总速率减去本底速率确定G3PDH活性。

质粒构建和菌株构建

克隆和表达甘油-3-磷酸酶以提高大肠杆菌中的甘油生产

由ATCC获得酿酒酵母染色体Vλ克隆6592(基因库，登记号U18813x11)。通过用合成引物(SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)于5’端掺入BamHI-RBS-XbaI位点和于3’端掺入SamI位点，从靶DNAλ克隆进行克隆，从而克隆甘油-3-磷酸磷酸酶(GPP2)基因。所述产物品在SrfI位点亚克隆到pCR-Script(Stratagene，Madison，WI)，以产生含有GPP2的质粒pAH15。为了从pCR-Script SK+中的lac启动子表达，质粒pAH15含有无活性取向的GPP2基因。将得自含有GPP2基因的pAH15的BamHI-SmaI片段***到pBlueScriptII SK+，以产生质粒pAH19。为了从所述lac启动子表达，pAH19含有正确取向的GPP2基因。将得自含有GPP2基因的pAH19的XbaI-PstI片段***到pPHOX2中，以产生质粒pAH21。pAH21/DH5α是表达质粒。

用于在大肠杆菌过量表达DAR1的质粒

采用合成引物(SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19)，通过由酿酒酵母基因组DNA PCR克隆分离DAR1。成功的PCR克隆使NcoI位点置于DAR1的5’端，其中在NcoI中的ATG是DAR1起始密码子蛋氨酸。在DAR1的3’端，在翻译终止子之后导入BamHI位点。用NcoI+BamHI消化所述PCR片段，并克隆到表达质粒pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)中的相同位点，以产生pDAR1A。

为了在DAR1的5’端产生更好的核塘体结合位点，将通过退火合成引物(SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21)获得的SpeI-RBS-NcoI接头***到pDAR1A的NcoI位点，以产生pAH40。为了从pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc启动子表达，质粒pAH40含有正确取向的新的RBS和DAR1基因。将得自pDAR1A的NcoI-BamHI片段和通过退火合成引物(SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23)获得的第二组SpeI-RBS-NcoI接头***到pBC-SK+(Stratagene，Madison，WI)的SpeI-BamHI位点，以产生质粒pAH42。质粒pAH42含有氯霉素抗性基因。

构建用于DAR1和GPP2的表达盒

采用标准分子生物学方法，从上述各个DAR1和GPP2亚克隆装配用于DAR1和GPP2的表达盒。将得自含有核糖体结合位点(RBS)和GPP2基因的pAH19的BamHI-PstI片段***到pAH40，以产生pAH43。将得自含有RBS和GPP2基因的pAH19的BamHI-PstI片段***到pAH42，以产生pAH45。

对GPP2的5’端的核糖体结合位点进行如下修饰。通过将合成引物GATCCAGGAAACAGA(SEQ ID NO：24)和CTAGTCTGTTTCCTG(SEQ ID NO：25)退火到得自含GGP2基因的pAH19的XbaI-PstI片段而获得的BamHI-RBS-SpeI接头***到pAH40的BamHI-PstI位点，以产生pAH48。质粒pAH48含有DAR1基因、修饰后的RBS、和为了从pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc启动子表达而正确取向的GPP2基因。

转化大肠杆菌

采用标准分子生物学技术将本文所述的所有质粒转化到大肠杆菌DH5α中。通过其DNA RFLP图型证实转化体。

实施例1

由用G3PDH基因转化的大肠杆菌生产甘油

培养基

采用用pDAR1A转化的大肠杆菌细胞，用合成培养基无氧或有氧生产甘油。该培养基每升含有：6.0g Na₂HPO₄、3.0g KH₂PO₄、1.0gNH₄Cl、0.5g NaCl、1mL 20％MgSO₄·7H₂O、8.0g葡萄糖、40mg水解酪蛋白氨基酸、0.5ml ％盐酸硫胺素、100mg氨苄青霉素。

生长条件

带有pDAR1A或pTrc99A载体的菌株AA200生长于有氧条件下的50mL培养基中，于37℃在250mL培养瓶中以250rpm震荡培养。在A₆₀₀为0.2-0.3时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷使其终浓度为1mM，并继续温育48小时。为了无氧生长，诱导细胞样品用来装满带盖的Falcon#2054管，并于37℃旋转轻轻混合48小时。通过HPLC分析培养物上清液确定甘油产量。菌株pDAR1A/AA200在无氧条件下培养48小时后产生甘油0.38g/L，在有氧条件下产生甘油0.48g/L。

实施例2

由用G3P磷酸酶基因(GPP2)转化的大肠杆菌生产甘油

培养基

在摇瓶中采用合成phoA培养基以证实在大肠杆菌中的GPP2表达使甘油产生增加。每升phoA培养基含有：Amisoy 12g；硫酸铵0.62g；MOPS 10.5g；柠檬酸钠1.2g；NaOH(1M)10mL；1M MgSO₄ 12mL；100X微量元素12mL；50％葡萄糖，10mL；1％硫胺素，10mL；100mg/mLL-脯氨酸，10mL；2.5mM FeCl₃，5mL；混合磷酸缓冲液，2mL(5mL 0.2MNaH₂PO₄+9mL 0.2M KH₂PO₄)，pH 7.0。对于每升pho培养基，上述100X微量元素含有：ZnSO₄·7H₂O，0.58g；MnSO₄·H₂O，0.34g；CuSO₄·5H₂O，0.49g；CoCl₂·6H₂O，0.47g；H₃BO₃，0.12g；NaMoO₄·2H₂O，0.48g。

摇瓶实验

菌株pAH21/DH5α(含有GPP2基因)和pPHOX2/DH5α(对照)于37℃在250mL摇瓶中的45mL培养基(phoA培养基，50ug/mL羧苄青霉素和1ug/mL维生素B₁₂)中生长。所述培养物在有氧条件(250rpm震摇)下生长24小时。通过HPLC分析培养物上清液确定甘油产量。24小时后pAH21/DH5α的甘油产量为0.2g/L。

实施例3

采用含GPP2和DAR1的重组大肠杆菌由D-葡萄糖生产甘油

于37℃在摇瓶培养物(锥形瓶，液体体积是总体积的1/5)中进行有氧生长，以证实含DH5αpAH43的大肠杆菌产生的甘油增加。

通过来自用抗生素选择的过夜LB/1％葡萄糖培养物的接种，在基本培养基/1％葡萄糖摇瓶中开始培养。基本培养基是：过滤除菌的已知成分培养基，终pH为6.8(HCl)，每升含有：12.6g(NH₄)₂SO₄、13.7gK₂HPO₄、0.2g酵母提取物(Difco)、1g NaHCO₃、5mg维生素B₁₂、5mL改良Balch’s微量元素液(其组成可以发现于一般和分子细菌学方法(P.Gerhardt等编辑，第158页，美国微生物协会，华盛顿，DC(1994))。摇瓶于37℃剧烈震摇过夜温育，之后取样用于上清液的GC分析。24小时后pAH43/DH5α显示的甘油产量为3.8g/L。

实施例4

采用含GPP2和DAR1的重组大肠杆菌由D-葡萄糖生产甘油

实施例4说明由含GPP2和DAR1的重组大肠杆菌DH5α/pAH48生产葡萄糖。

按上述一般方法中所述，构建菌株DH5α/pAH48。

预培养

为了接种到发酵运行(fermentation run)中，进行DH5α/pAH48预培养。预培养的组分和方案列表如下。

预培养培养基

KH₂PO₄ 30.0g/L

柠檬酸 2.0g/L

MgSO₄·7H₂O 2.0g/L

98％H₂SO₄ 2.0mL/L

柠檬酸铁铵 0.3g/L

CaCl₂·2H₂O 0.2g/L

酵母提取物 5.0g/L

微量金属 5.0mL/L

葡萄糖 10.0g/L

羧苄青霉素 100.0mg/L

将上述培养基组分一起混合，并用NH₄OH将其pH调节到6.8。之后将培养基过滤除菌。

按照以下配方使用微量元素：

柠檬酸，一水合物 4.0g/L

MgSO₄·7H₂O 3.0g/L

MnSO₄·H₂O 0.5g/L

NaCl 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.1g/L

CoCl₂·6H₂O 0.1g/L

CaCl₂ 0.1g/L

ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L

CuSO₄·5H₂O 10mg/L

AlK(SO₄)₂·12H₂O 10mg/L

H₃BO₃ 10mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O 10mg/L

NiSO₄·6H₂O 10mg/L

Na₂SeO₃ 10mg/L

Na₂WO₄·2H₂O 10mg/L

培养物开始自从50ul冻藏原液(15％甘油用作冷冻保护剂)接种到2L锥形瓶中的600mL培养基的种子培养物。培养物于30℃在250rpm的摇床中生长大约12小时，然后用来接种发酵罐。

发酵生长

容器

15L搅拌釜发酵罐

培养基

KH₂PO₄ 6.8g/L

柠檬酸 2.0g/L

MgSO₄·7H₂O 2.0g/L

98％H₂SO₄ 2.0mL/L

柠檬酸铁铵 0.3g/L

CaCl₂·2H₂O 0.2g/L

Mazu DF204消泡剂 1.0mL/L

上述组分在发酵罐容器中一并灭菌。用NH₄OH将其pH调升到6.7。酵母提取物(5g/L)和微量金属液(5mL/L)由过滤除菌的原液无菌性加入。由60％饲料加入葡萄糖使其终浓度为10g/L。以100mg/L加入羧苄青霉素。接种后体积为6L。

发酵的环境条件

所述温度控制在36℃，空气流率控制在每分钟6标准升。托持压力控制在0.5巴。搅拌器设定为350rpm。氨水用来控制pH于6.7。控制葡萄糖(60％葡萄糖一水合物)进料速率以保持过量葡萄糖。

结果

发酵运行的结果见表1。

表1

EFT OD550 [葡萄糖] [甘油] 产生的总

(hr) (AU) (g/L) (g/L) 进料的总甘油量(g)

葡萄糖(g)

0 0.8 9.3 25

6 4.7 4.0 2.0 49 14

8 5.4 0 3.6 71 25

10 6.7 0.0 4.7 116 33

12 7.4 2.1 7.0 157 49

14.2 10.4 0.3 10.0 230 70

16.2 18.1 9.7 15.5 259 106

18.2 12.4 14.5 305

20.2 11.8 17.4 17.7 353 119

22.2 11.0 12.6 382

24.2 10.8 6.5 26.6 404 178

26.2 10.9 6.8 442

28.2 10.4 10.3 31.5 463 216

30.2 10.2 13.1 30.4 493 213

32.2 10.1 8.1 28.2 512 196

34.2 10.2 3.5 33.4 530 223

36.2 10.1 5.8 548

38.2 9.8 5.1 36.1 512 233

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：

(A)姓名：E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY

(B)街道：1007 MARKET STREET

(C)城市：WILMINGTON

(D)州：DELAWARE

(E)国家：美国

(F)邮政编码：19898

(G)电话：302-892-8112

(H)传真：302-773-0164

(I)用户电报：6717325

(A)收信人：GENENCOR INTERNATIONAL，INC.

(B)街道：4 CAMBRIDGE PLACE

1870 SOUTH WINTON ROAD

(C)城市：ROCHESTER

(D)州：纽约州

(E)国家：美国

(F)邮政编码：14618

(ii)发明名称：用重组生物体生产甘油的方法

(iii)序列数：25

(iv)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘，3.5英寸

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作***：MICROSOFT WORD FOR WINDOWS 95

(D)软件：MICROSOFT WORD VERSION 7.0A

(v)当前申请数据：

(A)申请号：

(B)提交日期：

(C)分类：

(vi)在先申请数据：

(A)申请号：60/03602

(B)提交日期：1996年11月13日

(C)分类：

(vii)代理律师/代理人资料：

(A)姓名：FLORD，LINDA AXAMETHY

(B)注册号：33，692

(C)参考/档案号：CR-9981-P1

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)顺序特征：

(A)长度：1380个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：1：

CTTTAATTTT CTTTTATCTT ACTCTCCTAC ATAAGACATC AAGAAACAAT TGTATATTGT 60

ACACCCCCCC CCTCCACAAA CACAAATATT GATAATArAA AGATGTCTGC TGCTGCTGAT 120

AGATTAAACT TAACTTCCGG CCACTTGAAT GCTGGTAGAA AGAGAAGTTC CTCTTCTGTT 180

TCTTTGAAGG CTGCCGAAAA GCCTTTCAAG GTTACTGTGA TTGGATCTGG TAACTGGGGT 240

ACTACTATTG CCAAGGTGGT TGCCGAAAAT TGTAAGGGAT ACCCAGAAGT TTTCGCTCCA 300

ATAGTACAAA TGTGGGTGTT CGAAGAAGAG ATCAATGGTG AAAAATTGAC TGAAATCATA 360

AATACTAGAC ATCAAAACGT GAAATACTTG CCTGGCATCA CTCTACCCGA CAATTTGGTT 420

GCTAATCCAG ACTTGATTGA TTCAGTCAAG GATGTCGACA TCATCGTTTT CAACATTCCA 480

CATCAATTTT TGCCCCGTAT CTGTAGCCAA TTGAAAGGTC ATGTTGATTC ACACGTCAGA 540

GCTATCTCCT GTCTAAAGGG TTTTGAAGTT GGTGCTAAAG GTGTCCAATT GCTATCCTCT 600

TACATCACTG AGGAACTAGG TATTCAATGT GGTGCTCTAT CTGGTGCTAA CATTGCCACC 660

GAAGTCGCTC AAGAACACTG GTCTGAAACA ACAGTTGCTT ACCACATTCC AAAGGATTTC 720

AGAGGCGAGG GCAAGGACGT CGACCATAAG GTTCTAAAGG CCTTGTTCCA CAGACCTTAC 780

TTCCACGTTA GTGTCATCGA AGATGTTGCT GGTATCTCCA TCTGTGGTGC TTTGAAGAAC 840

GTTGTTGCCT TAGGTTGTGG TTTCGTCGAA GGTCTAGGCT GGGGTAACAA CGCTTCTGCT 900

GCCATCCAAA GAGTCGGTTT GGGTGAGATC ATCAGATTCG GTCAAATGTT TTTCCCAGAA 960

TCTAGAGAAG AAACATACTA CCAAGAGTCT GCTGGTGTTG CTGATTTGAT CACCACCTGC 1020

GCTGGTGGTA GAAACGTCAA GGTTGCTAGG CTAATGGCTA CTTCTGGTAA GGACGCCTGG 1080

GAATGTGAAA AGGAGTTGTT GAATGGCCAA TCCGCTCAAG GTTTAATTAC CTGCAAAGAA 1140

GTTCACGAAT GGTTGGAAAC ATGTGGCTCT GTCGAAGACT TCCCATTATT TGAAGCCGTA 1200

TACCAAATCG TTTACAACAA CTACCCAATG AAGAACCTGC CGGACATGAT TGAAGAATTA 1260

GATCTACATG AAGATTAGAT TTATTGGAGA AAGATAACAT ATCATACTTC CCCCACTTTT 1320

TTCGAGGCTC TTCTATATCA TATTCATAAA TTAGCATTAT GTCATTTCTC ATAACTACTT 1380

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：2946个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

GAATTCGAGC CTGAAGTGCT GATTACCTTC AGGTAGACTT CATCTTGACC CATCAACCCC 60

AGCGTCAATC CTGCAAATAC ACCACCCAGC AGCACTAGGA TGATAGAGAT AATATAGTAC 120

GTGGTAACGC TTGCCTCATC ACCTACGCTA TGGCCGGAAT CGGCAACATC CCTAGAATTG 180

AGTACGTGTG ATCCGGATAA CAACGGCAGT GAATATATCT TCGGTATCGT AAAGATGTGA 240

TATAAGATGA TGTATACCCA ATGAGGAGCG CCTGATCGTG ACCTAGACCT TAGTGGCAAA 300

AACGACATAT CTATTATAGT GGGGAGAGTT TCGTGCAAAT AACAGACGCA GCAGCAAGTA 360

ACTGTGACGA TATCAACTCT TTTTTTATTA TGTAATAAGC AAACAAGCAC GAATGGGGAA 420

AGCCTATGTG CAATCACCAA GGTCGTCCCT TTTTTCCCAT TTGCTAATTT AGAATTTAAA 480

GAAACCAAAA GAATGAAGAA AGAAAACAAA TACTAGCCCT AACCCTGACT TCGTTTCTAT 540

GATAATACCC TGCTTTAATG AACGGTATGC CCTAGGGTAT ATCTCACTCT GTACGTTACA 600

AACTCCGGTT ATTTTATCGG AACATCCGAG CACCCGCGCC TTCCTCAACC CAGGCACCGC 660

CCCAGGTAAC CGTGCGCGAT GAGCTAATCC TGAGCCATCA CCCACCCCAC CCGTTGATGA 720

CAGCAATTCG GGAGGGCGAA AATAAAACTG GAGCAAGGAA TTACCATCAC CGTCACCATC 780

ACCATCATAT CGCCTTAGCC TCTAGCCATA GCCATCATGC AAGCGTGTAT CTTCTAAGAT 840

TCAGTCATCA TCATTACCGA GTTTGTTTTC CTTCACATGA TGAAGAAGGT TTGAGTATGC 900

TCGAAACAAT AAGACGACGA TGGCTCTGCC ATTGGTTATA TTACGCTTTT GCGGCGAGGT 960

GCCGATGGGT TGCTGAGGGG AAGAGTGTTT AGCTTACGGA CCTATTGCCA TTGTTATTCC 1020

GATTAATCTA TTGTTCAGCA GCTCTTCTCT ACCCTGTCAT TCTAGTATTT TTTTTTTTTT 1080

TTTTTGGTTT TACTTTTTTT TCTTCTTGCC TTTTTTTCTT GTTACTTTTT TTCTAGTTTT 1140

TTTTCCTTCC ACTAAGCTTT TTCCTTGATT TATCCTTGGG TTCTTCTTTC TACTCCTTTA 1200

GATTTTTTTT TTATATATTA ATTTTTAAGT TTATGTATTT TGGTAGATTC AATTCTCTTT 1260

CCCTTTCCTT TTCCTTCGCT CCCCTTCCTT ATCAATGCTT GCTGTCAGAA GATTAACAAG 1320

ATACACATTC CTTAAGCGAA CGCATCCGGT GTTATATACT CGTCGTGCAT ATAAAATTTT 1380

GCCTTCAAGA TCTACTTTCC TAAGAAGATC ATTATTACAA ACACAACTGC ACTCAAAGAT 1440

GACTGCTCAT ACTAATATCA AACAGCACAA ACACTGTCAT GAGGACCATC CTATCAGAAG 1500

ATCGGACTCT GCCGTGTCAA TTGTACATTT GAAACGTGCG CCCTTCAAGG TTACAGTGAT 1560

TGGTTCTGGT AACTGGGGGA CCACCATCGC CAAAGTCATT GCGGAAAACA CAGAATTGCA 1620

TTCCCATATC TTCGAGCCAG AGGTGAGAAT GTGGGTTTTT GATGAAAAGA TCGGCGACGA 1680

AAATCTGACG GATATCATAA ATACAAGACA CCAGAACGTT AAATATCTAC CCAATATTGA 1740

CCTGCCCCAT AATCTAGTGG CCGATCCTGA TCTTTTACAC TCCATCAAGG GTGCTGACAT 1800

CCTTGTTTTC AACATCCCTC ATCAATTTTT ACCAAACATA GTCAAACAAT TGCAAGGCCA 1860

CGTGGCCCCT CATGTAAGGG CCATCTCGTG TCTAAAAGGG TTCGAGTTGG GCTCCAAGGG 1920

TGTGCAATTG CTATCCTCCT ATGTTACTGA TGAGTTAGGA ATCCAATGTG GCGCACTATC 1980

TGGTGCAAAC TTGGCACCGG AAGTGGCCAA GGAGCATTGG TCCGAAACCA CCGTGGCTTA 2040

CCAACTACCA AAGGATTATC AAGGTGATGG CAAGGATGTA GATCATAAGA TTTTGAAATT 2100

GCTGTTCCAC AGACCTTACT TCCACGTCAA TGTCATCGAT GATGTTGCTG GTATATCCAT 2160

TGCCGGTGCC TTGAAGAACG TCGTGGCACT TGCATGTGGT TTCGTAGAAG GTATGGGATG 2220

GGGTAACAAT GCCTCCGCAG CCATTCAAAG GCTGGGTTTA GGTGAAATTA TCAAGTTCGG 2280

TAGAATGTTT TTCCCAGAAT CCAAAGTCGA GACCTACTAT CAAGAATCCG CTGGTGTTGC 2340

AGATCTGATC ACCACCTGCT CAGGCGGTAG AAACGTCAAG GTTGCCACAT ACATGGCCAA 2400

GACCGGTAAG TCAGCCTTGG AAGCAGAAAA GGAATTGCTT AACGGTCAAT CCGCCCAAGG 2460

GATAATCACA TGCAGAGAAG TTCACGAGTG GCTACAAACA TGTGAGTTGA CCCAAGAATT 2520

CCCAATTATT CGAGGCAGTC TACCAGATAG TCTACAACAA CGTCCGCATG GAAGACCTAC 2580

CGGAGATGAT TGAAGAGCTA GACATCGATG ACGAATAGAC ACTCTCCCCC CCCCTCCCCC 2640

TCTGATCTTT CCTGTTGCCT CTTTTTCCCC CAACCAATTT ATCATTATAC ACAAGTTCTA 2700

CAACTACTAC TAGTAACATT ACTACAGTTA TTATAATTTT CTATTCTCTT TTTCTTTAAG 2760

AATCTATCAT TAACGTTAAT TTCTATATAT ACATAACTAC CATTATACAC GCTATTATCG 2820

TTTACATATC ACATCACCGT TAATGAAAGA TACGACACCC TGTACACTAA CACAATTAAA 2880

TAATCGCCAT AACCTTTTCT GTTATCTATA GCCCTTAAAG CTGTTTCTTC GAGCTTTTCA 2940

CTGCAG 2946

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3178个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

CTGCAGAACT TCGTCTGCTC TGTGCCCATC CTCGCGGTTA GAAAGAAGCT GAATTGTTTC 60

ATGCGCAAGG GCATCAGCGA GTGACCAATA ATCACTGCAC TAATTCCTTT TTAGCAACAC 120

ATACTTATAT ACAGCACCAG ACCTTATGTC TTTTCTCTGC TCCGATACGT TATCCCACCC 180

AACTTTTATT TCAGTTTTGG CAGGGGAAAT TTCACAACCC CGCACGCTAA AAATCGTATT 240

TAAACTTAAA AGAGAACAGC CACAAATAGG GAACTTTGGT CTAAACGAAG GACTCTCCCT 300

CCCTTATCTT GACCGTGCTA TTGCCATCAC TGCTACAAGA CTAAATACGT ACTAATATAT 360

GTTTTCGGTA ACGAGAAGAA GAGCTGCCGG TGCAGCTGCT GCCATGGCCA CAGCCACGGG 420

GACGCTGTAC TGGATGACTA GCCAAGGTGA TAGGCCGTTA GTGCACAATG ACCCGAGCTA 480

CATGGTGCAA TTCCCCACCG CCGCTCCACC GGCAGGTCTC TAGACGAGAC CTGCTGGACC 540

GTCTGGACAA GACGCATCAA TTCGACGTGT TGATCATCGG TGGCGGGGCC ACGGGGACAG 600

GATGTGCCCT AGATGCTGCG ACCAGGGGAC TCAATGTGGC CCTTGTTGAA AAGGGGGATT 660

TTGCCTCGGG AACGTCGTCC AAATCTACCA AGATGATTCA CGGTGGGGTG CGGTACTTAG 720

AGAAGGCCTT CTGGGAGTTC TCCAAGGCAC AACTGGATCT GGTCATCGAG GCACTCAACG 780

AGCGTAAACA TCTTATCAAC ACTGCCCCTC ACCTGTGCAC GGTGCTACCA ATTCTGATCC 840

CCATCTACAG CACCTGGCAG GTCCCGTACA TCTATATGGG CTGTAAATTC TACGATTTCT 900

TTGGCGGTTC CCAAAACTTG AAAAAATCAT ACCTACTGTC CAAATCCGCC ACCGTGGAGA 960

AGGCTCCCAT GCTTACCACA GACAATTTAA AGGCCTCGCT TGTGTACCAT GATGGGTCCT 1020

TTAACGACTC GCGTTTGAAC GCCACTTTAG CCATCACGGG TGTGGAGAAC GGCGCTACCG 1080

TCTTGATCTA TGTCGAGGTA CAAAAATTGA TCAAAGACCC AACTTCTGGT AAGGTTATCG 1140

GTGCCGAGGC CCGGGACGTT GAGACTAATG AGCTTGTCAG AATCAACGCT AAATGTGTGG 1200

TCAATGCCAC GGGCCCATAC AGTGACGCCA TTTTGCAAAT GGACCGCAAC CCATCCGGTC 1260

TGCCGGACTC CCCGCTAAAC GACAACTCCA AGATCAAGTC GACTTTCAAT CAAATCTCCG 1320

TCATGGACCC GAAAATGGTC ATCCCATCTA TTGGCGTTCA CATCGTATTG CCCTCTTTTT 1380

ACTCCCCGAA GGATATGGGT TTGTTGGACG TCAGAACCTC TGATGGCAGA GTGATGTTCT 1440

TTTTACCTTG GCAGGGCAAA GTCCTTGCCG GCACCACAGA CATCCCACTA AAGCAAGTCC 1500

CAGAAAACCC TATGCCTACA GAGGCTGATA TTCAAGATAT CTTGAAAGAA CTACAGCACT 1560

ATATCGAATT CCCCGTGAAA AGAGAAGACG TGCTAAGTGC ATGGGCTGGT GTCAGACCTT 1620

TGGTCAGAGA TCCACGTACA ATCCCCGCAG ACGGGAAGAA GGGCTCTGCC ACTCAGGGCG 1680

TGGTAAGATC CCACTTCTTG TTCACTTCGG ATAATGGCCT AATTACTATT GCAGGTGGTA 1740

AATGGACTAC TTACAGACAA ATGGCTGAGG AAACAGTCGA CAAAGTTGTC GAAGTTGGCG 1800

GATTCCACAA CCTGAAACCT TGTCACACAA GAGATATTAA GCTTGCTGGT GCAGAAGAAT 1860

GGACGCAAAA CTATGTGGCT TTATTGGCTC AAAACTACCA TTTATCATCA AAAATGTCCA 1920

ACTACTTGGT TCAAAACTAC GGAACCCGTT CCTCTATCAT TTGCGAATTT TTCAAAGAAT 1980

CCATGGAAAA TAAACTGCCT TTGTCCTTAG CCGACAAGGA AAATAACGTA ATCTACTCTA 2040

GCGAGGAGAA CAACTTGGTC AATTTTGATA CTTTCAGATA TCCATTCACA ATCGGTGAGT 2100

TAAAGTATTC CATGCAGTAC GAATATTGTA GAACTCCCTT GGACTTCCTT TTAAGAAGAA 2160

CAAGATTCGC CTTCTTGGAC GCCAAGGAAG CTTTGAATGC CGTGCATGCC ACCGTCAAAG 2220

TTATGGGTGA TGAGTTCAAT TGGTCGGAGA AAAAGAGGCA GTGGGAACTT GAAAAAACTG 2280

TGAACTTCAT CCAAGGACGT TTCGGTGTCT AAATCGATCA TGATAGTTAA GGGTGACAAA 2340

GATAACATTC ACAAGAGTAA TAATAATGGT AATGATGATA ATAATAATAA TGATAGTAAT 2400

AACAATAATA ATAATGGTGG TAATGGCAAT GAAATCGCTA TTATTACCTA TTTTCCTTAA 2460

TGGAAGAGTT AAAGTAAACT AAAAAAACTA CAAAAATATA TGAAGAAAAA AAAAAAAAGA 2520

GGTAATAGAC TCTACTACTA CAATTGATCT TCAAATTATG ACCTTCCTAG TGTTTATATT 2580

CTATTTCCAA TACATAATAT AATCTATATA ATCATTGCTG GTAGACTTCC GTTTTAATAT 2640

CGTTTTAATT ATCCCCTTTA TCTCTAGTCT AGTTTTATCA TAAAATATAG AAACACTAAA 2700

TAATATTCTT CAAACGGTCC TGGTGCATAC GCAATACATA TTTATGGTGC AAAAAAAAAA 2760

ATGGAAAATT TTGCTAGTCA TAAACCCTTT CATAAAACAA TACGTAGACA TCGCTACTTG 2820

AAATTTTCAA GTTTTTATCA GATCCATGTT TCCTATCTGC CTTGACAACC TCATCGTCGA 2880

AATAGTACCA TTTAGAACGC CCAATATTCA CATTGTGTTC AAGGTCTTTA TTCACCAGTG 2940

ACGTGTAATG GCCATGATTA ATGTGCCTGT ATGGTTAACC ACTCCAAATA GCTTATATTT 3000

CATAGTGTCA TTGTTTTTCA ATATAATGTT TAGTATCAAT GGATATGTTA CGACGGTGTT 3060

ATTTTTCTTG GTCAAATCGT AATAAAATCT CGATAAATGG ATGACTAAGA TTTTTGGTAA 3120

AGTTACAAAA TTTATCGTTT TCACTGTTGT CAATTTTTTG TTCTTGTAAT CACTCGAG 3178

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：816个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

ATGAAACGTT TCAATGTTTT AAAATATATC AGAACAACAA AAGCAAATAT ACAAACCATC 60

GCAATGCCTT TGACCACAAA ACCTTTATCT TTGAAAATCA ACGCCGCTCT ATTCGATGTT 120

GACGGTACCA TCATCATCTC TCAACCAGCC ATTGCTGCTT TCTGGAGAGA TTTCGGTAAA 180

GACAAGCCTT ACTTCGATGC CGAACACGTT ATTCACATCT CTCACGGTTG GAGAACTTAC 240

GATGCCATTG CCAAGTTCGC TCCAGACTTT GCTGATGAAG AATACGTTAA CAAGCTAGAA 300

GGTGAAATCC CAGAAAAGTA CGGTGAACAC TCCATCGAAG TTCCAGGTGC TGTCAAGTTG 360

TGTAATGCTT TGAACGCCTT GCCAAAGGAA AAATGGGCTG TCGCCACCTC TGGTACCCGT 420

GACATGGCCA AGAAATGGTT CGACATTTTG AAGATCAAGA GACCAGAATA CTTCATCACC 480

GCCAATGATG TCAAGCAAGG TAAGCCTCAC CCAGAACCAT ACTTAAAGGG TAGAAACGGT 540

TTGGGTTTCC CAATTAATGA ACAAGACCCA TCCAAATCTA AGGTTGTTGT CTTTGAAGAC 600

GCACCAGCTG GTATTGCTGC TGGTAAGGCT GCTGGCTGTA AAATCGTTGG TATTGCTACC 660

ACTTTCGATT TGGACTTCTT GAAGGAAAAG GGTTGTGACA TCATTGTCAA GAACCACGAA 720

TCTATCAGAG TCGGTGAATA CAACGCTGAA ACCGATGAAG TCGAATTGAT CTTTGATGAC 780

TACTTATACG CTAAGGATGA CTTGTTGAAA TGGTAA 816

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：753个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

ATGGGATTGA CTACTAAACC TCTATCTTTG AAAGTTAACG CCGCTTTGTT CGACGTCGAC 60

GGTACCATTA TCATCTCTCA ACCAGCCATT GCTGCATTCT GGAGGGATTT CGGTAAGGAC 120

AAACCTTATT TCGATGCTGA ACACGTTATC CAAGTCTCGC ATGGTTGGAG AACGTTTGAT 180

GCCATTGCTA AGTTCGCTCC AGACTTTGCC AATGAAGAGT ATGTTAACAA ATTAGAAGCT 240

GAAATTCCGG TCAAGTACGG TGAAAAATCC ATTGAAGTCC CAGGTGCAGT TAAGCTGTGC 300

AACGCTTTGA ACGCTCTACC AAAAGAGAAA TGGGCTGTGG CAACTTCCGG TACCCGTGAT 360

ATGGCACAAA AATGGTTCGA GCATCTGGGA ATCAGGAGAC CAAAGTACTT CATTACCGCT 420

AATGATGTCA AACAGGGTAA GCCTCATCCA GAACCATATC TGAAGGGCAG GAATGGCTTA 480

GGATATCCGA TCAATGAGCA AGACCCTTCC AAATCTAAGG TAGTAGTATT TGAAGACGCT 540

CCAGCAGGTA TTGCCGCCGG AAAAGCCGCC GGTTGTAAGA TCATTGGTAT TGCCACTACT 600

TTCGACTTGG ACTTCCTAAA GGAAAAAGGC TGTGACATCA TTGTCAAAAA CCACGAATCC 660

ATCAGAGTTG GCGGCTACAA TGCCGAAACA GACGAAGTTG AATTCATTTT TGACGACTAC 720

TTATATGCTA AGGACGATCT GTTGAAATGG TAA 753

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：2520个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

TGTATTGGCC ACGATAACCA CCCTTTGTAT ACTGTTTTTG TTTTTCACAT GGTAAATAAC 60

GACTTTTATT AAACAACGTA TGTAAAAACA TAACAAGAAT CTACCCATAC AGGCCATTTC 120

GTAATTCTTC TCTTCTAATT GGAGTAAAAC CATCAATTAA AGGGTGTGGA GTAGCATAGT 180

GAGGGGCTGA CTGCATTGAC AAAAAAATTG AAAAAAAAAA AGGAAAAGGA AAGGAAAAAA 240

AGACAGCCAA GACTTTTAGA ACGGATAAGG TGTAATAAAA TGTGGGGGGA TGCCTGTTCT 300

CGAACCATAT AAAATATACC ATGTGGTTTG AGTTGTGGCC GGAACTATAC AAATAGTTAT 360

ATGTTTCCCT CTCTCTTCCG ACTTGTAGTA TTCTCCAAAC GTTACATATT CCGATCAAGC 420

CAGCGCCTTT ACACTAGTTT AAAACAAGAA CAGAGCCGTA TGTCCAAAAT AATGGAAGAT 480

TTACGAAGTG ACTACGTCCC GCTTATCGCC AGTATTGATG TAGGAACGAC CTCATCCAGA 540

TGCATTCTGT TCAACAGATG GGGCCAGGAC GTTTCAAAAC ACCAAATTGA ATATTCAACT 600

TCAGCATCGA AGGGCAAGAT TGGGGTGTCT GGCCTAAGGA GACCCTCTAC AGCCCCAGCT 660

CGTGAAACAC CAAACGCCGG TGACATCAAA ACCAGCGGAA AGCCCATCTT TTCTGCAGAA 720

GGCTATGCCA TTCAAGAAAC CAAATTCCTA AAAATCGAGG AATTGGACTT GGACTTCCAT 780

AACGAACCCA CGTTGAAGTT CCCCAAACCG GGTTGGGTTG AGTGCCATCC GCAGAAATTA 840

CTGGTGAACG TCGTCCAATG CCTTGCCTCA AGTTTGCTCT CTCTGCAGAC TATCAACAGC 900

GAACGTGTAG CAAACGGTCT CCCACCTTAC AAGGTAATAT GCATGGGTAT AGCAAACATG 960

AGAGAAACCA CAATTCTGTG GTCCCGCCGC ACAGGAAAAC CAATTGTTAA CTACGGTATT 1020

GTTTGGAACG ACACCAGAAC GATCAAAATC GTTAGAGACA AATGGCAAAA CACTAGCGTC 1080

GATAGGCAAC TGCAGCTTAG ACAGAAGACT GGATTGCCAT TGCTCTCCAC GTATTTCTCC 1140

TGTTCCAAGC TGCGCTGGTT CCTCGACAAT GAGCCTCTGT GTACCAAGGC GTATGAGGAG 1200

AACGACCTGA TGTTCGGCAC TGTGGACACA TGGCTGATTT ACCAATTAAC TAAACAAAAG 1260

GCGTTCGTTT CTGACGTAAC CAACGCTTCC AGAACTGGAT TTATGAACCT CTCCACTTTA 1320

AAGTACGACA ACGAGTTGCT GGAATTTTGG GGTATTGACA AGAACCTGAT TCACATGCCC 1380

GAAATTGTGT CCTCATCTCA ATACTACGGT GACTTTGGCA TTCCTGATTG GATAATGGAA 1440

AAGCTACACG ATTCGCCAAA AACAGTACTG CGAGATCTAG TCAAGAGAAA CCTGCCCATA 1500

CAGGGCTGTC TGGGCGACCA AAGCGCATCC ATGGTGGGGC AACTCGCTTA CAAACCCGGT 1560

GCTGCAAAAT GTACTTATGG TACCGGTTGC TTTTTACTGT ACAATACGGG GACCAAAAAA 1620

TTGATCTCCC AACATGGCGC ACTGACGACT CTAGCATTTT GGTTCCCACA TTTGCAAGAG 1680

TACGGTGGCC AAAAACCAGA ATTGAGCAAG CCACATTTTG CATTAGAGGG TTCCGTCGCT 1740

GTGGCTGGTG CTGTGGTCCA ATGGCTACGT GATAATTTAC GATTGATCGA TAAATCAGAG 1800

GATGTCGGAC CGATTGCATC TACGGTTCCT GATTCTGGTG GCGTAGTTTT CGTCCCCGCA 1860

TTTAGTGGCC TATTCGCTCC CTATTGGGAC CCAGATGCCA GAGCCACCAT AATGGGGATG 1920

TCTCAATTCA CTACTGCCTC CCACATCGCC AGAGCTGCCG TGGAAGGTGT TTGCTTTCAA 1980

GCCAGGGCTA TCTTGAAGGC AATGAGTTCT GACGCGTTTG GTGAAGGTTC CAAAGACAGG 2040

GACTTTTTAG AGGAAATTTC CGACGTCACA TATGAAAAGT CGCCCCTGTC GGTTCTGGCA 2100

GTGGATGGCG GGATGTCGAG GTCTAATGAA GTCATGCAAA TTCAAGCCGA TATCCTAGGT 2160

CCCTGTGTCA AAGTCAGAAG GTCTCCGACA GCGGAATGTA CCGCATTGGG GGCAGCCATT 2220

GCAGCCAATA TGGCTTTCAA GGATGTGAAC GAGCGCCCAT TATGGAAGGA CCTACACGAT 2280

GTTAAGAAAT GGGTCTTTTA CAATGGAATG GAGAAAAACG AACAAATATC ACCAGAGGCT 2340

CATCCAAACC TTAAGATATT CAGAAGTGAA TCCGACGATG CTGAAAGGAG AAAGCATTGG 2400

AAGTATTGGG AAGTTGCCGT GGAAAGATCC AAAGGTTGGC TGAAGGACAT AGAAGGTGAA 2460

CACGAACAGG TTCTAGAAAA CTTCCAATAA CAACATAAAT AATTTCTATT AACAATGTAA 2520

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：391个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑结构：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn

1 5 10 15

Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu

20 25 30

Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr

35 40 45

Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe

50 55 60

Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu

65 70 75 80

Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile

100 105 110

Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln

115 120 125

Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His

130 135 140

Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys

165 170 175

Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His

180 185 190

Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly

195 200 205

Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg

210 215 220

Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile

225 230 235 240

Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu

245 250 255

Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly

260 265 270

Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg

275 280 285

Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr

290 295 300

Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr

305 310 315 320

Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln

325 330 335

Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu

340 345 350

Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln

355 360 365

Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu

370 375 380

Glu Leu Asp Leu His Glu Asp

385 390

(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：384个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑结构：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp

1 5 10 15

His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys

20 25 30

Arg Ala Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr

35 40 45

Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile

50 55 60

Phe Glu Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp

65 70 75 80

Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr

85 90 95

Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu

100 105 110

Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His

115 120 125

Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro

130 135 140

His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys

145 150 155 160

Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln

165 170 175

Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu

180 185 190

His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln

195 200 205

Gly Asp Gly Lys Asp Val Asp His Lys Ile Leu Lys Leu Leu Phe His

210 215 220

Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val

245 250 255

Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu

260 265 270

Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser

275 280 285

Lys Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile

290 295 300

Thr Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala

305 310 315 320

Lys Thr Gly Lys Ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly

325 330 335

Gln Ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Arg Glu Val His Glu Trp Leu

340 345 350

Gln Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Phe Pro Ile Ile Arg Gly Ser Leu

355 360 365

Pro Asp Ser Leu Gln Gln Arg Pro His Gly Arg Pro Thr Gly Asp Asp

370 375 380

(2)SEQ ID NO：9的信息：

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(2)SEQ ID NO：10的信息：

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(C)链型：未知

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(ii)分子类型：蛋白质

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(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

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(ii)分子类型：蛋白质

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500

(2)SEQ ID NO：12的信息：

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(ii)分子类型：蛋白质

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Gly Ala Thr Gly Ala Gly Ile Ala Arg Asp Cys Ala Leu Arg Gly Leu

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Asp Ile Leu Leu Arg Glu Gly Glu Lys Leu Ala Pro Val Met Ala Lys

290 295 300

Thr Arg Ile Leu Arg Ala Tyr Ser Gly Val Arg Pro Leu Val Ala Ser

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Asp Asp Asp Pro Ser Gly Arg Asn Leu Ser Arg Gly Ile Val Leu Leu

325 330 335

Asp His Ala Glu Arg Asp Gly Leu Asp Gly Phe Ile Thr Ile Thr Gly

340 345 350

Gly Lys Leu Met Thr Tyr Arg Leu Met Ala Glu Trp Ala Thr Asp Ala

355 360 365

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370 375 380

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Ile Ser Leu Pro Ala Pro Leu Arg Gly Ser Ala Val Tyr Arg His Gly

405 410 415

Asp Arg Thr Pro Ala Trp Leu Ser Glu Gly Arg Leu His Arg Ser Leu

420 425 430

Val Cys Glu Cys Glu Ala Val Thr Ala Gly Glu Val Gln Tyr Ala Val

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Glu Asn Leu Asn Val Asn Ser Leu Leu Asp Leu Arg Arg Arg Thr Arg

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500 505 510

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515 520 525

Gln Gly Leu Cys Gly Leu Glu Lys Glu Gln Lys Asp Ala Leu

530 535 540

(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：250个氨基酸

(B)类型：氨基酸

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(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

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1 5 10 15

Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile Ala Ala

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Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr Phe Asp Ala Glu His

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Val Ile Gln Val Ser His Gly Trp Arg Thr Phe Asp Ala Ile Ala Lys

50 55 60

Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asn Glu Glu Tyr Val Asn Lys Leu Glu Ala

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Glu Ile Pro Val Lys Tyr Gly Glu Lys Ser Ile Glu Val Pro Gly Ala

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Lys Ile Ile Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu Asp Phe Leu Lys Glu

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210 215 220

Gly Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Phe Ile Phe Asp Asp Tyr

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(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：271个氨基酸

(B)类型：氨基酸

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(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

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Ile Gln Thr Ile Ala Met Pro Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys

20 25 30

Ile Asn Ala Ala Leu Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln

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Asp Ala Ile Ala Lys Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asp Glu Glu Tyr Val

85 90 95

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100 105 110

Glu Val Pro Gly Ala Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro

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Lys Glu Lys Trp Ala Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Lys

130 135 140

Lys Trp Phe Asp Ile Leu Lys Ile Lys Arg Pro Glu Tyr Phe Ile Thr

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Gly Arg Asn Gly Leu Gly Phe Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys

180 185 190

Ser Lys Val Val Val Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly

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Lys Ala Ala Gly Cys Lys Ile Val Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu

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260 265 270

(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：709个氨基酸

(B)类型：氨基酸

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(D)拓扑结构：未知

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

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1 5 10 15

Phe Arg Ser Ser Gln Arg Leu Tyr Thr Ser Leu Lys Gln Glu Gln Ser

20 25 30

Arg Met Ser Lys Ile Met Glu Asp Leu Arg Ser Asp Tyr Val Pro Leu

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50 55 60

Asn Arg Trp Gly Gln Asp Val Ser Lys His Gln Ile Glu Tyr Ser Thr

65 70 75 80

Ser Ala Ser Lys Gly Lys Ile Gly Val Ser Gly Leu Arg Arg Pro Ser

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Phe Leu Lys Ile Glu Glu Leu Asp Leu Asp Phe His Asn Glu Pro Thr

130 135 140

Leu Lys Phe Pro Lys Pro Gly Trp Val Glu Cys His Pro Gln Lys Leu

145 150 155 160

Leu Val Asn Val Val Gln Cys Leu Ala Ser Ser Leu Leu Ser Leu Gln

165 170 175

Thr Ile Asn Ser Glu Arg Val Ala Asn Gly Leu Pro Pro Tyr Lys Val

180 185 190

Ile Cys Met Gly Ile Ala Asn Met Arg Glu Thr Thr Ile Leu Trp Ser

195 200 205

Arg Arg Thr Gly Lys Pro Ile Val Asn Tyr Gly Ile Val Trp Asn Asp

210 215 220

Thr Arg Thr Ile Lys Ile Val Arg Asp Lys Trp Gln Asn Thr Ser Val

225 230 235 240

Asp Arg Gln Leu Gln Leu Arg Gln Lys Thr Gly Leu Pro Leu Leu Ser

245 250 255

Thr Tyr Phe Ser Cys Ser Lys Leu Arg Trp Phe Leu Asp Asn Glu Pro

260 265 270

Leu Cys Thr Lys Ala Tyr Glu Glu Asn Asp Leu Met Phe Gly Thr Val

275 280 285

Asp Thr Trp Leu Ile Tyr Gln Leu Thr Lys Gln Lys Ala Phe Val Ser

290 295 300

Asp Val Thr Asn Ala Ser Arg Thr Gly Phe Met Asn Leu Ser Thr Leu

305 310 315 320

Lys Tyr Asp Asn Glu Leu Leu Glu Phe Trp Gly Ile Asp Lys Asn Leu

325 330 335

Ile His Met Pro Glu Ile Val Ser Ser Ser Gln Tyr Tyr Gly Asp Phe

340 345 350

Gly Ile Pro Asp Trp Ile Met Glu Lys Leu His Asp Ser Pro Lys Thr

355 360 365

Val Leu Arg Asp Leu Val Lys Arg Asn Leu Pro Ile Gln Gly Cys Leu

370 375 380

Gly Asp Gln Ser Ala Ser Met Val Gly Gln Leu Ala Tyr Lys Pro Gly

385 390 395 400

Ala Ala Lys Cys Thr Tyr Gly Thr Gly Cys Phe Leu Leu Tyr Asn Thr

405 410 415

Gly Thr Lys Lys Leu Ile Ser Gln His Gly Ala Leu Thr Thr Leu Ala

420 425 430

Phe Trp Phe Pro His Leu Gln Glu Tyr Gly Gly Gln Lys Pro Glu Leu

435 440 445

Ser Lys Pro His Phe Ala Leu Glu Gly Ser Val Ala Val Ala Gly Ala

450 455 460

Val Val Gln Trp Leu Arg Asp Asn Leu Arg Leu Ile Asp Lys Ser Glu

465 470 475 480

Asp Val Gly Pro Ile Ala Ser Thr Val Pro Asp Ser Gly Gly Val Val

485 490 495

Phe Val Pro Ala Phe Ser Gly Leu Phe Ala Pro Tyr Trp Asp Pro Asp

500 505 510

Ala Arg Ala Thr Ile Met Gly Met Ser Gln Phe Thr Thr Ala Ser His

515 520 525

Ile Ala Arg Ala Ala Val Glu Gly Val Cys Phe Gln Ala Arg Ala Ile

530 535 540

Leu Lys Ala Met Ser Ser Asp Ala Phe Gly Glu Gly Ser Lys Asp Arg

545 550 555 560

Asp Phe Leu Glu Glu Ile Ser Asp Val Thr Tyr Glu Lys Ser Pro Leu

565 570 575

Ser Val Leu Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Arg Ser Asn Glu Val Met

580 585 590

Gln Ile Gln Ala Asp Ile Leu Gly Pro Cys Val Lys Val Arg Arg Ser

595 600 605

Pro Thr Ala Glu Cys Thr Ala Leu Gly Ala Ala Ile Ala Ala Asn Met

610 615 620

Ala Phe Lys Asp Val Asn Glu Arg Pro Leu Trp Lys Asp Leu His Asp

625 630 635 640

Val Lys Lys Trp Val Phe Tyr Asn Gly Met Glu Lys Asn Glu Gln Ile

645 650 655

Ser Pro Glu Ala His Pro Asn Leu Lys Ile Phe Arg Ser Glu Ser Asp

660 665 670

Asp Ala Glu Arg Arg Lys His Trp Lys Tyr Trp Glu Val Ala Val Glu

675 680 685

Arg Ser Lys Gly Trp Leu Lys Asp Ile Glu Gly Glu His Glu Gln Val

690 695 700

Leu Glu Asn Phe Gln

705

(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：51个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

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(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

GATACGCCCG GGTTACCATT TCAACAGATC GTCCTT 36

(2)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：34个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：

TTGATAATAT AACCATGGCT GCTGCTGCTG ATAG 34

(2)SEQ ID NO：19的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

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(2)SEQ ID NO：20的信息：

(i)顺序特征：

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(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

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(2)SEQ ID NO：21的信息：

(i)顺序特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：21：

CATGGAATTG TCCTCCTTAC TAGT 24

(2)SEQ ID NO：22的信息：

(i)顺序特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

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(2)SEQ ID NO：23的信息：

(i)顺序特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：23：

CATGGAATTG TCCTCCTTA 19

(2)SEQ ID NO：24的信息：

(i)顺序特征：

(A)长度：15个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“引物”

(iii)假说：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：24：

GATCCAGGAA ACAGA 15

(2)SEQ ID NO：25的信息：

(i)顺序特征：

(A)长度：15个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“引物”

(iii)假说：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：25：

CTAGTCTGTT TCCTG 15

Claims

1.由重组微生物生产甘油的方法，包括：

(i)用一种表达盒转化合适的宿主细胞，所述表达盒包含：

(b)编码甘油-3-磷酸酶E.C.3.1.3.21的基因；以及

(ii)在存在选自单糖、寡糖、多糖和一碳底物的至少一种碳源的情况下培养步骤(i)的转化宿主细胞，由此生产甘油。

2.按照权利要求1的方法，还包括回收步骤(ii)中产生的甘油。

3.按照权利要求1的方法，其中合适宿主细胞选自细菌和真菌。

4.按照权利要求1的方法，其中合适宿主细胞选自柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、梭菌属(Clostridium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、毛霉属(Mucor)、球拟酵母属(Torulopsis)、甲基酵母属(Methylobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)。

5.按照权利要求4的方法，其中合适宿主细胞是大肠杆菌或酵母属。

6.按照权利要求1的方法，其中碳源是葡萄糖。

7.按照权利要求1的方法，其中编码NADH依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶或NADPH依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶的基因编码SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含不引起该酶功能特性改变的氨基酸取代、缺失或***。

8.按照权利要求1的方法，其中编码甘油-3-磷酸酶的基因对应于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可以包含不引起该酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。