CN117402843A - 一种来源于日本裂殖酵母yFS275的酮还原酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于日本裂殖酵母yFS275的酮还原酶及其应用。本发明公开的酮还原酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其突变体具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。本发明提供的酮还原酶及其突变体可以高效催化4‑氯乙酰乙酸乙酯转化为(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，且其突变体具有较高的耐有机溶剂性能。
Description
技术领域
本发明属于功能酶筛选技术领域，涉及一种来源于日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)yFS275的酮还原酶及其突变体、编码它们的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和重组细胞，以及它们的制备方法及其在制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
背景技术
(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((R)-CHBE)是一种重要的手性醇，氯原子被三甲胺取代并碱解后生成的中间体是用于制备L-左旋肉碱及其衍生盐等(例如L-左旋肉碱酒石酸盐类)的重要前体物质，而L-左旋肉碱作为药剂、食品添加剂(如添加至婴幼儿三期配方奶粉)、运动健身饮品等被广泛应用，凸显了(R)-CHBE作为其制备前体的重要意义。(R)-CHBE的制备通常依赖于合成的手性催化剂催化4-氯乙酰乙酸乙酯转化得到。然而，这样的工艺存在着使用合成相对困难的由稀有金属制备的催化剂，并且成本较高的问题。因此，人们意图采用发酵和生物转化的形式实现全细胞***进行生产。
酮还原酶可以催化4-氯乙酰乙酸乙酯转化为(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，在催化过程中需要用到还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作为辅因子。目前通过发酵和生物转化还没有实现(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的大规模生产，且在现有酶催化反应中需要添加一定量的有机溶剂，然而生物酶的蛋白质结构对有机溶剂的耐受情况多有不同且有限，所以仍然需要寻求一种(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯基因工程菌株使得其能表达具有较高催化活性并且对有机溶剂有相对较高的耐受性的酮还原酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酮还原酶及其突变体，从而解决现有的酮还原酶催化合成(R)-CHBE中存在的酶活性和有机溶剂耐受性不高的问题。
具体地，本发明从日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)yFS275菌株中获得酮还原酶KREDSJ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，并通过易错PCR技术进一步对其突变，得到一种在酶活性和有机溶剂耐受性方面得到显著改善的酮还原酶突变体KREDSJ-M，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQID NO:4所示。
在第一方面，本发明提供一种具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的酮还原酶。
本发明提供的上述酮还原酶可以人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达，如使用重组技术从原核生物(大肠杆菌)中表达获得。
在一些实施方案中，上述酮还原酶是通过将含有其编码基因的重组载体转化导入大肠杆菌表达宿主(例如E.coli BL21(DE3))构建重组的基因工程菌株，然后进行培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到酮还原酶。
在第二方面，本发明提供一种编码上述酮还原酶的核酸分子，其具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
本发明提供的上述核酸分子通常可以通过使用PCR仪扩增或人工合成的方法获得。
在第三方面，本发明提供上述酮还原酶的突变体，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其催化活力、有机溶剂耐受性以及转化率与上述酮还原酶相比有进一步提高。与SEQ ID NO:1所示的酮还原酶的氨基酸序列相比，该突变体具有如下突变：第28位的L突变为S，第95位的N突变为S，第175位的F突变为V、第240位的Y突变为H、第280位的R突变为G。
本发明提供的上述突变体可人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到，如使用重组技术从原核生物(大肠杆菌)中表达获得。
在一些实施方案中，上述突变体是通过将含有其编码基因的重组载体转化进入大肠杆菌表达宿主(例如E.coli BL21(DE3))构建重组基因工程菌，然后进行培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到酮还原酶突变体。
在第四方面，本发明提供一种编码上述酮还原酶突变体的核酸分子，其具有SEQID NO:4所示的核苷酸序列。
本发明提供的上述核酸分子通常可以通过使用PCR仪扩增或人工合成的方法获得。
第五方面，本发明提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子。
在一些实施方案中，上述重组载体为pET-KREDSJ或pET-ΔKREDSJ-M57，分别是将编码上述酮还原酶的核酸分子或上述酮还原酶突变体的核酸分子替换pET-28a(+)的BamHI和HindIII酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。
在第六方面，本发明提供一种重组细胞，其包含上述任一所述的重组载体。
在一些实施方案中，所述重组细胞经诱导后表达上述酮还原酶或酮还原酶的突变体。
在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括如下：
将所述重组载体转化到表达宿主细胞中，经培养并添加诱导剂诱导表达，得到表达上述酮还原酶或酮还原酶的突变体。
进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述表达宿主细胞为原核生物生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌表达宿主E.coliBL21(DE3)。
在一些实施方案中，所述重组细胞为重组菌SE和重组菌57，重组细胞可以是重组基因工程菌。重组基因工程菌表达酮还原酶或其突变体时所使用的培养基可以是本领域可以使重组基因工程菌生长并表达本发明的酮还原酶或其突变体的培养基，优选TB培养基。
培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组基因工程菌株正常生长即可，并于18℃条件下诱导表达酮还原酶及其突变体。
在第七方面，本发明提供一种酮还原酶或其突变体的制备方法，包括：
对上述任一所述的重组细胞进行培养并加入诱导剂诱导，得到培养物；
从所述培养物中分离上述酮还原酶或酮还原酶突变体；
其中，对重组细胞进行培养并诱导的方法、将酮还原酶及其突变体从培养物中分离出来的方法均为本领域的常规方法。
在第八方面，本发明提供上述酮还原酶、上述任一所述的核酸分子、上述酮还原酶的突变体、上述重组载体、上述重组细胞和上述方法制备的酮还原酶及其突变体在制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
在第九方面，本发明提供一种(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的制备方法，包括：以上述酮还原酶、上述酮还原酶突变体、上述重组细胞或上述方法制备得到的酮还原酶或其突变体作为催化剂，对4-氯乙酰乙酸乙酯进行催化反应，使其转化为(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯可进一步用于左旋肉碱及其衍生盐的制备。
在一些实施方案中，上述催化反应中，温度为25-35℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃，或这些数值中的任意二者之间的数值或者范围，优选30℃作为反应温度；初始pH 6.0-7.0，可以使用Tris或HCl(如500mM的Tris和1M的盐酸)调节反应的pH，例如调到6.8。
所述催化反应包含4-氯乙酰乙酸乙酯、异丙醇和NADH；
4-氯乙酰乙酸乙酯的浓度为100-200g/L，例如100g/L、120g/L、140g/L、160g/L、180g/L、200g/L，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选200g/L；
异丙醇的体积百分数为2-3％，例如2.0％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3.0％，或这些数字中的任意二者之间的数值或范围，优选3.0％；
NADH的浓度为1-10mM，例如1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选5mM；
在一些实施方案中，上述催化反应中，包括使用上述任一所述的重组细胞对4-氯乙酰乙酸乙酯进行催化反应，生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；
具体地，可以以上述重组细胞或其冻干粉作为催化剂进行全细胞催化生产(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，催化剂如果是冻干粉时，用量为0.1-0.3g/g 4-氯乙酰乙酸乙酯，优选0.25g/g4-氯乙酰乙酸乙酯，如果是重组细胞，用量可以是500-700μL菌液/ml反应体系，其中菌液的OD600为1.8-2.2，例如600μLOD600为2的菌液/ml反应体系。
应当理解的是，本发明所述的酮还原酶KREDSJ或其突变体KREDSJ-M可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的酮还原酶KREDSJ或其突变体KREDSJ-M或重组细胞制备成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。
本发明的酮还原酶及其突变体可以高效催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，尤其是其突变体，在适宜条件下，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，转化率为78.4％，酶活为181.7U/L，是原始酶的1.192倍，并且在有机溶剂异丙醇中的耐受性也相较原始酶更好。
附图说明
图1为4-氯乙酰乙酸乙酯标准品的气相色谱图。
图2为(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯标准品的气相色谱图。
图3为反应液的气相色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域常规操作，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)yFS275在文献“Ren L,McleanJ R,Hazbun T R,et al.Systematic Two-Hybrid and Comparative Proteomic AnalysesReveal Novel Yeast Pre-mRNA Splicing Factors Connected to Prp19[J].Plos One,2011,6(2):e16719-e16719”中公开过，公众可从万华化学集团股份有限公司获得。
pET-28a(+)为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，产品目录号为B540183。
实施例1：酮还原酶的基因序列的获得
1、提取日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)yFS275的基因组DNA。
2、以步骤1获得的基因组DNA为模板，以引物1(5’-ggatccatgttgaccgtctacgg-3’,SEQ ID NO:5)和引物2(5’-aagcttttaagcagaagcagcgg-3’,SEQ ID NO:6)为引物对进行PCR，获得含有酮还原酶基因的PCR扩增片段，其中，酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，其编码的酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2：利用易错PCR技术获得酮还原酶突变体的基因序列
以实施例1获得的PCR扩增片段为模板，以引物1和引物2为引物对进行如下易错PCR，共获得酮还原酶基因的96个突变体。
易错PCR反应体系：10×扩增缓冲液5μl，4种dNTP混合物(2.5mmol/L)各4μl，引物各50pmol，模板DNA 1.5μg，Taq DNA聚合酶0.5μL，Mg2+7mmol/L，加双蒸水至50μl。
PCR反应程序：(1)预变性：94℃3min；(2)变性：94℃30s；退火：58℃30s；延伸：72℃1.5min；共循环35次；(3)后延伸：72℃10min；(4)4℃保温。
实施例3：酮还原酶基因的克隆和表达菌株的构建
1、BamHI和HindIII双酶切实施例1获得的含有酮还原酶基因的PCR扩增片段，得到基因片段；BamHI和HindIII双酶切pET-28a(+)，得到载体片段；将基因片段和载体片段连接得到重组表达质粒，将其命名为pET-KREDSJ，将该质粒送测序，结果与预期一致。
2、将步骤1获得的重组表达质粒pET-KREDSJ通过热激转入E.coli DH5α感受态细胞中，涂布含有35μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，培养得到相应的单克隆菌株，将其命名为SD，再经过扩增和质粒提取，得到pET-KREDSJ质粒，将得到的质粒通过化学转化的方式转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，涂布含有35μg/mL卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，得到表达酮还原酶的重组菌SE。
实施例4：酮还原酶突变体基因的克隆和表达菌株的构建
按照实施例3的方法，利用实施例2获得的酮还原酶基因的96个突变体分别构建重组质粒pET-ΔKREDSJ-M1至pET-ΔKREDLH-M96，并获得表达酮还原酶突变体的重组菌1-重组菌96。
实施例5：高通量筛选得到具有高催化效率的酮还原酶突变体
将实施例3和4中经过PCR验证正确的重组菌分别在5mL TB培养基中培养，同时加入0.5mM终浓度的IPTG于18℃诱导蛋白表达，12h后测量菌液的OD600值，并用水稀释菌液使得OD600值为2左右。取稀释后的菌液分别加入深孔96孔板中进行反应，在反应体系中加入600μL菌液，总反应体系为1.0ml，包含200mg的4-氯乙酰乙酸乙酯、体积百分含量为3.0％的异丙醇、5mM NADH，PBS补足体积，使用盐酸将初始pH调整为6.8。将孔板反应体系于30℃、120rpm混合器中孵育5h，反应结束后加入200μL浓度为2M的HCl终止反应。
反应结束后，取样品于4000rpm离心20min，取上清50μL加入200μL纯水混匀，然后选定340nm波长测定吸光度。
将吸光度最低的反应液所对应的菌株(重组菌57)进行质粒提取，提取后的质粒测序，得到编码酮还原酶突变体的基因序列如SEQ ID NO:4所示，其编码的酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。与SEQ ID NO:1所示的酮还原酶的氨基酸序列相比，该酮还原酶突变体具有如下突变：第28位的L突变为S，第95位的N突变为S，第175位的F突变为V、第240位的Y突变为H、第280位的R突变为G。
4-氯乙酰乙酸乙酯和NADH在酮还原酶的催化下生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和NAD+的反应式如下所示：
实施例6：酶的制备及酶活测定
分别将实施例3获得的重组菌SE和实施例5筛选得到的重组菌57进行扩大培养，扩大培养后将发酵液经离心(8000rpm，10min)、细胞破碎、冷冻干燥处理，制备得到酮还原酶(原始酶)和其突变体(突变体酶)的冻干粉并于-80℃保存。
酶活力单位(U)定义为：在实施例5的反应条件下(冻干粉的终浓度为0.25g/g 4-氯乙酰乙酸乙酯)，每分钟催化生成1μmol(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯或每分钟消耗1μmol底物4-氯乙酰乙酸乙酯定义为1个酶活力单位。
原始酶和突变体酶的酶活分别为152.43U/L和181.7U/L，相比于原始酶，突变体酶的酶活是其1.192倍，通过气相色谱分析底物4-氯乙酰乙酸乙酯的残余量可以得到两种酶的转化率分别为71.5％和78.4％。气相色谱的具体检测条件如下：
反应液离心取上清300μL，加入600μL乙酸乙酯混合均匀后离心，取上层装入样品瓶并至于样品架进行气相色谱检测；气相色谱柱为安捷伦DB-5毛细管柱，载气为氮气，氢离子检测器；进样量为1μL；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，柱温箱温度为90℃；氮气载气的柱流速为1mL/min。
4-氯乙酰乙酸乙酯标准品和(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯标准品的气相色谱图分别如图1和图2所示，4-氯乙酰乙酸乙酯的出峰时间为6.598min，(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的出峰时间为7.022min。
反应液的气相色谱图如图3所示，(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的出峰时间为7.022min，4-氯乙酰乙酸乙酯的出峰时间为6.598min。
实施例7：酶有机溶剂耐受性测试
取少量实施例6中得到的原始酶和突变体酶的冻干粉，按照实施例5中的反应条件，并按表1调整异丙醇的体积百分含量后进行反应，反应结束时两种酶在不同浓度异丙醇条件下的转化率如表1所示。
表1
结果表明，突变体酶具有较好的有机溶剂异丙醇的耐受性，具体地，异丙醇的加入范围在0-15％之间，转化率均可到70％以上，与原始酶相比具有更好的耐受性；当异丙醇添加比例为15％时，原始酶的转化率降低到54.1％，而突变体酶的转化率还在70％以上。
序列
SEQ ID NO:1
MLTVYGAKKNAWAVVTGATDGIGKEYALQLAKAGFNIVIVSRNPEKLSRVAQEITEAYRVEVQTYVIDYKIATAATFQKLAEFLKPFQVTVLVNNVGLSHNMPVSFSETTEQEMDDIMQINCFGTLHTTKAVLPSMLEQRRSNKNGPRCLILTMGSFAGLLPSPYLSTYAGSKAFLANWSASLAEEVKKEGIDVWCYQSYLVCSAMSKVRRPTATIPTPKNFVREALGSIGVQRGGNQPYISQPFPSHAALSWVLEQAASRVKGFVVAQVAAMHLSIRSRALRKQAREQQKAKETAASA
SEQ ID NO:2
atgttgaccgtctacggtgcgaagaaaaatgcttgggcagtggtaacgggtgccacggacggtattggcaaggaatacgccttacaacttgccaaggctggcttcaacatcgtgattgttagtcgtaatcccgaaaaattgagccgtgttgctcaggaaatcacggaggcctatcgtgttgaggtccaaacatatgtgatcgactacaaaattgctacggctgccactttccaaaagcttgctgagttcctgaagccattccaggtgaccgtactcgtaaacaacgtcgggttgtctcacaacatgcctgtgagtttcagtgaaaccaccgaacaagagatggatgacattatgcaaatcaactgttttggcacacttcataccactaaggccgtccttcctagcatgttggaacaacgtcgtagcaacaagaatggacctcgctgcctcattttgactatgggttctttcgctggtctgcttccctcgccttatctgtctacgtacgctggttctaaggctttcttggccaactggtctgcttccctggccgaagaggtcaagaaggagggcattgatgtttggtgctaccaatcttatcttgtctgctctgccatgtccaaggtccgtcgccctactgctactattcccactcccaagaactttgtccgcgaggcactgggcagcattggcgtccaacgcggtggtaaccagccctacatcagtcagccattcccctctcatgccgctctcagctgggttctcgaacaagctgccagtcgtgtgaaaggtttcgtcgttgctcaagtcgctgctatgcacttgagcattcgttcccgtgcccttcgcaagcaggctcgcgagcaacagaaggccaaggagaccgctgcttctgcttaa
SEQ ID NO:3
MLTVYGAKKNAWAVVTGATDGIGKEYASQLAKAGFNIVIVSRNPEKLSRVAQEITEAYRVEVQTYVIDYKIATAATFQKLAEFLKPFQVTVLVNSVGLSHNMPVSFSETTEQEMDDIMQINCFGTLHTTKAVLPSMLEQRRSNKNGPRCLILTMGSFAGLLPSPYLSTYAGSKAVLANWSASLAEEVKKEGIDVWCYQSYLVCSAMSKVRRPTATIPTPKNFVREALGSIGVQRGGNQPHISQPFPSHAALSWVLEQAASRVKGFVVAQVAAMHLSIRSGALRKQAREQQKAKETAASA
SEQ ID NO:4
atgttgaccgtctacggtgcgaagaaaaatgcttgggcagtggtaacgggtgccacggacggtattggcaaggaatacgcctcacaacttgccaaggctggcttcaacatcgtgattgttagtcgtaatcccgaaaaattgagccgtgttgctcaggaaatcacggaggcctatcgtgttgaggtccaaacatatgtgatcgactacaaaattgctacggctgccactttccaaaagcttgctgagttcctgaagccattccaggtgaccgtactcgtaaacagcgtcgggttgtctcacaacatgcctgtgagtttcagtgaaaccaccgaacaagagatggatgacattatgcaaatcaactgttttggcacacttcataccactaaggccgtccttcctagcatgttggaacaacgtcgtagcaacaagaatggacctcgctgcctcattttgactatgggttctttcgctggtctgcttccctcgccttatctgtctacgtacgctggttctaaggctgtcttggccaactggtctgcttccctggccgaagaggtcaagaaggagggcattgatgtttggtgctaccaatcttatcttgtctgctctgccatgtccaaggtccgtcgccctactgctactattcccactcccaagaactttgtccgcgaggcactgggcagcattggcgtccaacgcggtggtaaccagccccacatcagtcagccattcccctctcatgccgctctcagctgggttctcgaacaagctgccagtcgtgtgaaaggtttcgtcgttgctcaagtcgctgctatgcacttgagcattcgttccggtgcccttcgcaagcaggctcgcgagcaacagaaggccaaggagaccgctgcttctgcttaa
Claims (10)
1.一种酮还原酶，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的酮还原酶的核酸分子，其具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的酮还原酶的突变体，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
4.编码权利要求3所述的酮还原酶的突变体的核酸分子，其具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其包含权利要求2或4所述的核酸分子。
6.一种重组细胞，其包含权利要求5所述的重组载体。
7.一种酮还原酶或其突变体的制备方法，其包括以下步骤：
1)对权利要求6所述的重组细胞进行培养，并诱导酮还原酶或其突变体表达；
2)从1)得到的培养物中分离权利要求1所述的酮还原酶或权利要求3所述的酮还原酶的突变体。
8.权利要求1所述的酮还原酶、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的酮还原酶的突变体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组细胞和/或权利要求7所述的方法制备得到的酮还原酶或其突变体在制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
9.一种(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备方法，包括以下步骤：以权利要求1所述的酮还原酶、权利要求3所述的酮还原酶的突变体、权利要求6所述的重组细胞和/或权利要求7所述的方法制备得到的酮还原酶或其突变体作为催化剂，催化4-氯乙酰乙酸乙酯转化为(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述催化的反应温度为25-35℃，pH6.0-7.0，反应体系包含4-氯乙酰乙酸乙酯、异丙醇和NADH；
4-氯乙酰乙酸乙酯的终浓度为100-200g/L；
异丙醇的体积百分含量为2-3％；
NADH的终浓度为1-10mM。
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